Summary
Descemet's Stripping Only एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया है जिसमें फ्यूच एंडोथेलियल कॉर्नियल डिस्ट्रॉफी के परिणामस्वरूप केंद्रीय कॉर्नियल गुट्टा वाले रोगियों में एंडोथेलियल परत को पुनर्जीवित करने के लिए परिधीय कोशिकाओं के लिए डेसेमेट की झिल्ली छीन ली जाती है। हम ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) द्वारा प्रेरित त्वरित उपचार के साथ डिस्ट्रोफिक मानव कॉर्निया पूर्व विवो में डीएसओ का अनुकरण करने वाली उपन्यास पद्धति प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
Fuchs एंडोथेलियल कॉर्नियल डिस्ट्रॉफी (FECD) बेकार कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीईसी) के परिणामस्वरूप होता है और वर्तमान में पूरे कॉर्निया या डेसेमेट की झिल्ली के प्रत्यारोपण द्वारा इलाज किया जाता है। ओकुलर सर्जरी में हाल के विकास ने डेसेमेट के स्ट्रिपिंग ओनली (डीएसओ) की स्थापना की है, एक सर्जिकल तकनीक जिसमें गुट्टा-घने डेसेमेट की झिल्ली के एक केंद्रीय सर्कल को चिकनी स्ट्रोमा पर सीईसी के प्रवास के लिए अनुमति देने के लिए हटा दिया जाता है, कॉर्निया में कार्य और दृष्टि को बहाल किया जाता है। जबकि यह संभावित उपचार विकल्प नेत्र अनुसंधान के क्षेत्र में उच्च रुचि का है, डीएसओ के कोई सफल पूर्व वीवो मॉडल स्थापित नहीं किए गए हैं और नैदानिक डेटा सीमित है। यह काम मानव दाता कॉर्निया में डीएसओ का अनुकरण करने वाला एक उपन्यास घाव भरने वाला मॉडल प्रस्तुत करता है। मानव इंजीनियर FGF1 (NM141) की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि उपचार ने प्रवास की उत्तेजना और सीईसी के प्रसार के माध्यम से उपचार को तेज कर दिया। इस खोज की पुष्टि मानव कॉर्निया के 11 जोड़े में की गई थी, जिसमें आंखों के बैंकों द्वारा रिपोर्ट किए गए डिस्ट्रॉफी के संकेतों के साथ यह सत्यापित करने के लिए कि इन परिणामों को डीएसओ प्रक्रिया की लक्षित आबादी के रूप में फ्यूच के डिस्ट्रोफी वाले रोगियों में दोहराया जा सकता है।
Introduction
Fuchs endothelial Corneal Dystrophy (FECD) कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीईसी) में खोए हुए पंप फ़ंक्शन और डेसेमेट की झिल्ली की सतह पर कोलेजन और अन्य बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन के अत्यधिक बिल्डअप की विशेषता वाली एक बीमारी है, जो कॉर्नियल गुट्टा1 बनाती है। एफईसीडी के लिए एकमात्र ज्ञात उपचार अलग-अलग रूपों में एंडोथेलियल केराटोप्लास्टी है, जिनमें से सभी अस्वीकृति और एंडोथेलियल सेल हानिके जोखिम के साथ आते हैं। जबकि नेत्र शल्य चिकित्सा में प्रगति ने इन प्रक्रियाओं को समय के साथ कम आक्रामक बनने में सक्षम बनाया है, प्रत्यारोपण का कोई भी रूप अस्वीकृति के जोखिम और आजीवन स्टेरॉयड उपयोग की संभावना के साथ आता है, जो अपने स्वयं के सहवर्ती प्रतिकूल घटनाओं के साथ एक उपचार है। इसके अलावा, वैश्विक दाता ऊतक की कमी ऐसी हैकि प्रत्येक 70 रोगियों के लिए केवल एक दाता कॉर्निया उपलब्ध है। इन चुनौतियों को देखते हुए, शोधकर्ता और चिकित्सक सर्जिकल तरीकों की खोज कर रहे हैं जो दाता ऊतक की आवश्यकता से पूरी तरह से बचते हैं। इन प्रयोगात्मक तकनीकों में से एक Descemet's Stripping Only (DSO) या Descemetorhexis बिना एंडोथेलियल केराटोप्लास्टी (DWEK) है, जिसमें कॉर्निया के केंद्र में स्थानीयकृत गुट्टा के साथ FECD रोगियों में ग्राफ्ट प्लेसमेंट के बिना Descemet की झिल्ली का एक केंद्रीय 4 मिमी सर्कल होता है। गुट्टा को हटाने से स्वस्थ परिधीय कोशिकाओं को अंदर की ओर स्थानांतरित करने और एंडोथेलियल मोनोलेयर में सुधार करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, अंततः स्ट्रोमल एडिमा को उलट दिया जाता है और दृष्टि में सुधार होता है। इस अवधारणा को मूल रूप से केस स्टडीज की एक श्रृंखला में वर्णित किया गया था जिसमें रोगियों ने सर्जरी की थी जो डेसेमेट की झिल्ली की टुकड़ी से जटिल थी, लेकिन सीईसी पुनर्जनन अभी भी 4,5,6,7 हुआ था। हालांकि इस विधि के कई फायदे हैं, उपचार प्रक्रिया लंबी और असंगत है, क्योंकि कुछ रोगियों को बचाव प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है यदि सर्जरीके बाद के महीनों में कोई उपचार नहीं देखा जाता है। इन कारणों से, एक दवा जो तेजी से प्रवास और सीईसी के प्रसार को उत्तेजित करती है, एफईसीडी रोगियों की वसूली प्रक्रिया में फायदेमंद हो सकती है जो डीएसओ से गुजरचुके हैं।
हाल के कई अध्ययनों ने डीएसओ से गुजरने वाले रोगियों के लिए पूरक उपचार के रूप में रॉक इनहिबिटर का मूल्यांकन किया है, और पाया कि इलाज किए गए रोगियों को तेजी से ठीक किया गया और डीएसओ समूह में केवल 9,10,11 समूह की तुलना में उच्च केंद्रीय एंडोथेलियल सेल घनत्व (ईसीडी) था। हालांकि, छोटे नमूना आकार और खुराक regimens के बीच अंतर के कारण, इस सेटिंग में ROCK inhibitors की प्रभावकारिता को बेहतर ढंग से समझने के लिए अधिक डेटा की आवश्यकता होती है।
फाइब्रोब्लास्ट विकास कारकों को भी कॉर्नियल एंडोथेलियम के पुनर्जनन को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है, दोनों इन विट्रो में गोजातीय सीईसी के साथ, और12,13 में विवो में। eFGF1 (NM141) FGF-1 का एक इंजीनियर संस्करण है जिसमें अणु को स्थिर करने के लिए कई अमीनो एसिड प्रतिस्थापन होते हैं, जैसा कि देशी FGF-1 के विपरीत होता है, जिसमें बहुत कम आधा जीवन14,15 होता है। हमने पहले ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) की क्षमता का प्रदर्शन किया है ताकि चौथाई मानव कॉर्निया16 में सीईसी एक्स वीवो के प्रसार को प्रोत्साहित किया जा सके। इस अध्ययन ने सामान्य और डिस्ट्रोफिक कॉर्निया दोनों में डीएसओ के पहले सफल पूर्व वीवो मॉडल की स्थापना करके उस काम में सुधार करने की मांग की ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) जैसे सहायक उपचार इस आवेदन में उपचार में तेजी लाते हैं।
Protocol
इस काम में विषयों की पहचान के बिना मौजूदा नमूनों का उपयोग किया गया था और 45 सीएफआर 46.101 (बी) (4) के तहत आईआरबी अनुमोदन से छूट दी गई है।
मानव दाता कॉर्निया अमेरिका भर में विभिन्न नेत्र बैंकों से प्राप्त किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)। कॉर्निया को व्यक्तिगत रूप से आंखों के बैंकों द्वारा डिस्ट्रोफिक का न्याय किया गया था, जैसे कि गुट्टे, प्लियोमोर्फिज्म, पॉलीमेगाथिज्म, और / या स्पेकुलर मूल्यांकन पर कम ईसीडी जैसे निष्कर्षों के आधार पर। चित्रा 1 घाव निर्माण के दौरान कॉर्निया में ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग प्रस्तुत करता है, तुरंत स्ट्रिपिंग के बाद, और संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद।
चित्रा 1: घाव निर्माण के दौरान कॉर्निया का प्रतिनिधित्व करने वाला आरेख, तुरंत पोस्ट-स्ट्रिपिंग, और संस्कृति में 14 दिनों के बाद जैसा कि ट्रिपैन ब्लू द्वारा कल्पना की गई थी। इन टाइमपॉइंट्स के बीच दाग वाले क्षेत्र में कमी को उपचार के स्तर को निर्धारित करने के लिए मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
1. घाव निर्माण
- बाँझ संदंश का उपयोग करते हुए, मीडिया से कॉर्निया को हटा दें और अवशिष्ट मीडिया और सेल मलबे को हटाने के लिए 1x पीबीएस में कुल्ला करें। कुल्ला करने के बाद, कॉर्निया एंडोथेलियल साइड को पेट्री डिश के ढक्कन पर रखें।
- एक welled पकवान में Trypan ब्लू के पिपेट 30 μL. ट्रिपैन ब्लू में एक नया 4 मिमी बायोप्सी पंच डुबोएं और किसी भी अतिरिक्त को टैप करें।
- दोनों हाथों का उपयोग करके, पंच को कॉर्निया के केंद्र के ऊपर रखें और इसे सीधे एंडोथेलियल सतह पर कम करें, न्यूनतम दबाव लागू करें।
- कॉर्निया पर स्थिति या दबाव को बदलने के बिना, पंच को एक हाथ में स्थानांतरित करें और नए मुक्त हाथ के साथ संदंश के लिए पहुंचें। कॉर्निया को जगह में रखने के लिए संदंश का उपयोग करें, जबकि धीरे-धीरे बायोप्सी पंच को लगभग 90 डिग्री आगे और पीछे कई बार घुमाएं।
- पंच को कॉर्निया से सीधे ऊपर उठाएं और एक तरफ सेट करें।
- अतिरिक्त ट्रिपैन ब्लू को हटाने के लिए 1x पीबीएस में एक बार फिर से कुल्ला करें।
2. Descemet है अलग करना
- एक पेट्री डिश ढक्कन पर कॉर्निया को विच्छेदन दायरे में स्थानांतरित करें।
नोट: कॉर्निया को 5 मिनट से अधिक समय तक सूखा न छोड़ें। यदि प्रक्रिया को पूरा करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है, तो एंडोथेलियम को फिर से हाइड्रेट करने के लिए 1x पीबीएस में फिर से कुल्ला करें। - घुमावदार संदंश के साथ जगह में कॉर्निया को पकड़ते हुए, बायोप्सी पंच द्वारा छोड़े गए ट्रिपैन ब्लू की अंगूठी के साथ एक तेज 30 जी सुई की नोक को हल्के से खींचकर डेसेमेट की झिल्ली को स्कोर करें। अंतर्निहित स्ट्रोमा को बाधित करने से बचने के लिए न्यूनतम दबाव का उपयोग करें।
- एक Sinskey हुक के साथ, कोमल स्कूपिंग गतियों का उपयोग करने के लिए उठाने और घाव किनारे के चारों ओर Descemet झिल्ली वापस छील, घाव के केंद्र की ओर काम कर रहा है.
नोट: Descemet झिल्ली बहुत कम प्रतिरोध के साथ आना चाहिए. यदि कठिनाई का अनुभव किया जाता है, तो एक संभावना स्ट्रोमा को खींच रही है। यदि ऐसा होता है, तो घाव के किनारे के साथ एक नए बिंदु से उठाते हुए फिर से शुरू करें। - एक बार जब डेसेमेट की झिल्ली का अधिकांश हिस्सा स्ट्रोमा से अलग हो जाता है, तो झिल्ली को हटाने और अलग करने के लिए गोरोवॉय संदंश का उपयोग करें।
- झिल्ली के किसी भी शेष टुकड़े के लिए छीन क्षेत्र की जांच करें और Gorovoy संदंश के साथ निकालें।
3. Trypan ब्लू धुंधला
नोट: Descemet के स्ट्रिपिंग के बाद, घाव क्षेत्र की कल्पना करने के लिए Trypan ब्लू के साथ कॉर्निया दाग।
- जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए एक पेट्री डिश ढक्कन पर कॉर्निया वापस और 0.01% (डब्ल्यू / वी) CaCl 2 औरMgCl 2 युक्त 1x PBS में कुल्ला सेल मलबे को हटाने के लिए और बरकरार Descemet झिल्ली के लिए शेष CECs के तंग पालन की सुविधा के लिए।
- एक अच्छी तरह से पकवान में कॉर्निया रखें और 30 सेकंड के लिए एंडोथेलियल परत पर ट्रिपैन ब्लू के पिपेट 30 μL।
- कॉर्निया को धीरे से रॉक करने के लिए संदंश का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पूरी एंडोथेलियल सतह को कवर किया गया है।
- 0.01% (डब्ल्यू / वी) CaCl 2 औरMgCl 2 के साथ 1x PBS में अतिरिक्त ट्रिपैन ब्लू को कुल्ला करें और दिन 0 टाइमपॉइंट के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सना हुआ कॉर्निया छवि करें।
- सुनिश्चित करें कि कॉर्निया संतुलित है जैसे कि प्रकाश समान रूप से पूरे समय में प्रेषित होता है और स्थिति टाइमपॉइंट्स में प्रतिकृति होती है।
नोट: संदंश का उपयोग कॉर्निया को रखने के लिए किया जा सकता है, जबकि यदि आवश्यक हो तो इमेजिंग करते समय।
- सुनिश्चित करें कि कॉर्निया संतुलित है जैसे कि प्रकाश समान रूप से पूरे समय में प्रेषित होता है और स्थिति टाइमपॉइंट्स में प्रतिकृति होती है।
4. संस्कृति अवधि
- OptiMEM से मिलकर कम सीरम मीडिया युक्त एक छह अच्छी तरह से प्लेट में संस्कृति कॉर्निया; 1x इंसुलिन, transferrin, और सेलेनियम; 1x एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक; 0.02 मिलीग्राम / एमएल CaCl2; 0.2 मिलीग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड; और 0.8% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम. अकेले कम-सीरम मीडिया के 8 एमएल में बाएं कॉर्निया को संस्कृति करें, और 100 एनजी / एमएल ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) के साथ पूरक कम-सीरम मीडिया के 8 एमएल में दाएं कॉर्निया।
- दैनिक मीडिया परिवर्तन के साथ 14 दिनों के लिए 6% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- दिन 3, 6, 9, 12, और 14 पर ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग प्रक्रिया को दोहराएं, और धुंधला होने के तुरंत बाद प्रत्येक कॉर्निया को छवि दें। सभी टाइमपॉइंट्स में कैमरा सेटिंग्स को सुसंगत रखना सुनिश्चित करें।
- दिन 12 पर, दोनों नियंत्रण और eFGF1 (NM141) के लिए 10 μM EdU जोड़ें- पूरक मीडिया और लेबल कोशिकाओं के लिए 48 ज के लिए इनक्यूबेट। EdU के साथ मीडिया को नवीनीकृत करें दिन 13 पर फिर से जोड़ा गया।
- दिन 14 पर, EdU, Trypan दाग और छवि कॉर्निया के अतिरिक्त के बाद 48 घंटे हमेशा की तरह, CaCl 2 औरMgCl 2 के साथ 1x PBS के बजाय, कैल्शियम को Alizarin लाल दाग के साथ बातचीत करने से रोकने के लिए कुल्ला के लिए सादे 1x PBS का उपयोग करें।
5. Alizarin लाल धुंधला
- दिन 14 पर, 0.9% खारा समाधान में 5% Alizarin लाल तैयार करें।
नोट: Alizarin लाल खारा समाधान में पूरी तरह से भंग नहीं होगा. संयोजन पर, भंवर समाधान और कम से कम 1 ज के लिए रॉक। भंवर एक बार फिर से और undissolved कणों को हटाने के लिए उपयोग करने से पहले फ़िल्टर। - एक बार ट्रिपैन स्टेनिंग और इमेजिंग पूरा हो जाने के बाद, कॉर्निया को एक वेलेड डिश में स्थानांतरित करें और प्रत्येक कॉर्निया की एंडोथेलियल सतह पर 200 μL Alizarin Red जोड़ें।
- 2 मिनट के लिए दाग, फिर 1x PBS के एक पेट्री डिश में प्रत्येक कॉर्निया कुल्ला करने के लिए अतिरिक्त Alizarin लाल को हटाने के लिए एक छह अच्छी तरह से प्लेट में रखने से पहले दो 5 मिनट धोने के लिए 1x PBS के 8 mL के साथ पूर्व से भरा.
- दूसरे धोने के बाद, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक कॉर्निया के छीन क्षेत्र को छवि दें।
नोट: ट्रिपैन इमेजिंग के विपरीत, कॉर्निया को 1x पीबीएस में छोड़ दिया जा सकता है ताकि प्रक्रिया के दौरान उन्हें सूखने से रोकने के लिए एलिसारिन धुंधला हो सके।
6. निर्धारण और permeabilization
- एक बार Alizarin छवियों पर कब्जा कर लिया गया है, एक 12 अच्छी तरह से प्लेट के लिए कॉर्निया हस्तांतरण और 0.05% Tween-20 (PBS-T) युक्त 1x PBS के 4 मिलीलीटर में 30 मिनट के लिए धोने के लिए 30 मिनट के लिए फिक्सेशन से पहले ऊतक से किसी भी कण को हटाने के लिए।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4% पीएफए के 4 मिलीलीटर में कॉर्निया को ठीक करें।
- 1% ट्राइटन एक्स -100 युक्त 1x पीबीएस के 4 मिलीलीटर में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें, फिर 30 मिनट के लिए सादे 1x पीबीएस के 4 एमएल में तीन बार धोएं।
7. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
- 2% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन और 2% बकरी सीरम युक्त 1x PBS के 4 mL में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कॉर्निया को ब्लॉक करें।
- 2.5 μg / mL प्राथमिक एंटीबॉडी माउस एंटी-ZO-1 युक्त ब्लॉकिंग समाधान के 1 मिलीलीटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, फिर 30 मिनट के लिए 1x पीबीएस के 4 एमएल में तीन बार धोएं।
नोट: प्लेट एंटीबॉडी धुंधला के दौरान झुकाया जा सकता है ताकि आवश्यक अभिकर्मकों की मात्रा को कम किया जा सके। बस सुनिश्चित करें कि पूरा कॉर्निया पूरी तरह से एंटीबॉडी समाधान में डूबा हुआ है। - 0.88 मिलीग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड, 0.26 मिलीग्राम / एमएल क्यूएसओ 4, और 2.5 μM एलेक्सा फ्लोर488 एज़ाइड युक्त कॉकटेल का उपयोग करके ईडीयू क्लिक-आईटी प्रतिक्रिया करें।
- प्रतिक्रिया घटक तैयार करें
- 88 मिलीग्राम एस्कॉर्बिक एसिड और भंवर को भंग होने तक 1x पीबीएस के 500 μL जोड़ें।
- 44 मिलीग्राम CuSO 4 और भंवर को भंग होने तक विआयनीकृत पानी के840 μL जोड़ें।
- इस क्रम में 1x PBS के 6 mL में निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़कर कॉकटेल तैयार करें, प्रत्येक अतिरिक्त के बाद मिश्रण करने के लिए ट्यूब को उलटें: एस्कॉर्बिक एसिड समाधान के 30 μL, CuSO 4 समाधान के 30 μL, और फिर एलेक्सा फ्लोर488 के 15 μL
नोट: एक बार तैयार होने के बाद, यह समाधान प्रकाश संवेदनशील है। प्रोटोकॉल के शेष के लिए, कॉर्निया को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए जब भी संभव हो। - प्रत्येक कॉर्निया के लिए EdU प्रतिक्रिया कॉकटेल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया करें।
- प्रतिक्रिया घटक तैयार करें
- प्रत्येक कॉर्निया में 10 μg / mL Hoechst 33342 के 4 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करें, फिर प्रत्येक 30 मिनट के लिए 1x PBS-T में तीन बार धोएं।
- 2 μg / mL एलेक्सा फ्लोर 555 लेबल बकरी विरोधी माउस IgG लेबल वाले ब्लॉकिंग समाधान के 1 मिलीलीटर में इनक्यूबेट 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए, फिर 30 मिनट प्रत्येक के लिए 1x PBS-T में तीन बार धोएं।
- माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिए 1x पीबीएस के 4 मिलीलीटर में 4 मिलीलीटर में कॉर्निया को स्टोर करें, जिसमें 1% एंटी / एंटी, 0.1% सिप्रोफ्लोक्सासिन और 0.1% एम्फोटेरिसिन बी।
- Confocal इमेजिंग प्रदर्शन करते समय, ग्लास स्लाइड पर बढ़ते माध्यम के 200 μL में पूरे कॉर्निया माउंट करें, जिसमें कवरस्लिप को समतल करने के लिए नीचे टेप किया गया था।
8. Trypan छवि विश्लेषण
- एनआईएच के ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर ImageJ का उपयोग करके सभी छवि विश्लेषण करें। खोलें > फ़ाइल का उपयोग करके कोई छवि खोलें और छवि > > रंग थ्रेशोल्ड समायोजित करें क्लिक करें.
- केवल नीली श्रेणी को शामिल करने के लिए "ह्यू" स्लाइडर का उपयोग करें और ऊपरी "चमक" स्लाइडर को बाईं ओर सभी तरह से समायोजित करें ताकि दाग वाले क्षेत्र में से अधिक को शामिल किया जा सके।
नोट:: यदि यह क्रिया शामिल करने के लिए Trypan दाग नहीं हैं जो छवि के कुछ हिस्सों के कारण होता है, तो "चमक" स्लाइडर को इसके मूल स्तर पर वापस किया जा सकता है। - धीरे-धीरे ऊपरी "संतृप्ति" स्लाइडर को समायोजित करें जब तक कि थ्रेशोल्डिंग सही रूप से दाग वाले क्षेत्र को रेखांकित न करे।
नोट:: यह इस प्रक्रिया के दौरान संदर्भित करने के लिए खुला मूल छवि की एक प्रतिलिपि है करने के लिए उपयोगी है। - रंग थ्रेशोल्ड मेनू के भीतर चयन करें बटन पर क्लिक करें, फिर चुने गए घाव के बाहर के क्षेत्रों का चयन करने के लिए चयन ब्रश टूल का उपयोग करें।
- पिक्सेल में दाग क्षेत्र की रिपोर्ट करने के लिए > माप का विश्लेषण करें क्लिक करें.
- संपादन > का उपयोग करके सभी का चयन करें चयन > कोई नहीं का चयन करें और लिम्बस को यथासंभव बारीकी से फिट करने के लिए अंडाकार चयन उपकरण का उपयोग करें, फिर पिक्सेल में कॉर्निया के क्षेत्र की रिपोर्ट करने के लिए > माप का विश्लेषण करें क्लिक करें।
नोट:: चमक अस्थायी रूप से लिम्बस के विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता करने के लिए चालू किया जा सकता है यदि छवि का यह हिस्सा बहुत अंधेरा है। - रिकॉर्ड क्षेत्र मूल्यों और पूरे कॉर्निया के क्षेत्र से दाग क्षेत्र को विभाजित करें, फिर प्रतिशत दाग की गणना करने के लिए 100 से गुणा करें।
- प्रत्येक छवि के लिए इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं, फिर तीन मापों का औसत लें।
9. सांख्यिकीय विश्लेषण
- एक बार जब सभी छवियों का विश्लेषण किया जाता है, तो अवशिष्ट अनहेल्ड क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए दिन 0 पर दागे गए प्रतिशत से दिन 14 पर दागे गए औसत प्रतिशत को विभाजित करें। 14 दिनों में ठीक किए गए छीन क्षेत्र के प्रतिशत की गणना करने के लिए इस राशि को 100% से घटाएं।
- नियंत्रण और उपचार समूहों के बीच प्रतिशत चंगा मूल्यों की तुलना करने के लिए एक युग्मित टी-परीक्षण का उपयोग करें।
Representative Results
यह प्रयोग शुरू में सामान्य शोध कॉर्निया के 10 जोड़े में किया गया था, क्योंकि वे सबसे आसानी से उपलब्ध हैं। एक बार विधि को सफल होने के लिए दिखाया गया था, तो अध्ययन को डिस्ट्रोफिक कॉर्निया के 11 जोड़े में दोहराया गया था- जैसे कि स्पेकुलर मूल्यांकन के आधार पर आंखों के बैंकों द्वारा लेबल किया गया था- एफईसीडी रोगी आबादी के कॉर्निया प्रतिनिधि में ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए। अधिक नैदानिक प्रासंगिकता के लिए, वर्तमान कार्य में शामिल आंकड़े डिस्ट्रोफिक कॉर्निया से एकत्र किए गए डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं जब तक कि अन्यथा नोट न किया गया हो।
डीएसओ के सर्जिकल परिणाम का अनुकरण करने के बाद, ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया था और 14 दिन की संस्कृति अवधि के दौरान दोहराया गया था, और घाव भरने का मूल्यांकन करने के लिए सकारात्मक धुंधला में कमी की मात्रा निर्धारित की गई थी (चित्रा 2)। सेल सीमाओं को चित्रित करने के लिए 14 वें दिन Alizarin लाल धुंधला भी किया गया था। कोई स्पष्ट पैटर्न के साथ गहरे लाल क्षेत्र दिखाई देते हैं (इसके बाद नकारात्मक धुंधला के रूप में संदर्भित) घाव के अनियंत्रित खंड के भीतर और कॉर्निया के अन्य क्षेत्रों में लगातार दिखाई देते हैं जहां कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त या लापता माना जाता था। जिन क्षेत्रों में 14 दिन में ट्रिपैन ब्लू के लिए सकारात्मक दाग थे, वे अलीज़ारिन रेड (चित्रा 2) द्वारा नकारात्मक धुंधला होने के साथ अच्छी तरह से मेल खाते थे। eFGF1 (NM141) के साथ इलाज किए गए सभी डिस्ट्रोफिक कॉर्निया ने अनुपचारित साथी की तुलना में दिन 14 पर अधिक उपचार दिखाया। औसतन, उपचारित कॉर्निया ने नियंत्रण कॉर्निया में 38% के विपरीत 91% उपचार का प्रदर्शन किया, और यह अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.001) (चित्रा 3 ए)। यह 20 सामान्य कॉर्निया से प्राप्त परिणामों के लिए तुलनीय है, जहां नियंत्रण ने औसतन 32% उपचार दिखाया और उपचारित कॉर्निया 81% तक पहुंच गया, जो फिर से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.001) (पूरक चित्रा 1)। ठीक किए गए प्रतिशत की तुलना सामान्य और डिस्ट्रोफिक कॉर्निया के बीच की गई थी, जिसमें दो नमूना टी-परीक्षणों का उपयोग करके समान विचरण माना जाता था, और नियंत्रण या उपचार समूहों (डेटा नहीं दिखाया गया) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था।
सामान्य और डिस्ट्रोफिक कॉर्निया दोनों के लिए नेत्र बैंकों (तालिका 1) द्वारा प्रदान की गई दाता जानकारी का विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या उम्र, ऑप्टिसोल में संग्रहीत दिन, संग्रह अंतराल के लिए मृत्यु, सेल घनत्व और लिंग सहित विशेषताएं उपचार के साथ सहसंबंधित हैं। पियर्सन के सहसंबंध गुणांक (आर) का उपयोग सेक्स को छोड़कर सभी कारकों की जांच करने के लिए किया गया था, जिसका मूल्यांकन पुरुषों और महिलाओं के बीच उपचार की तुलना करने के लिए एक अनपेयर्ड टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। आर का निरपेक्ष मूल्य सभी मामलों में 0.25 से नीचे था, यह दर्शाता है कि उपचार और उम्र, ऑप्टिसोल में संग्रहीत दिनों, संग्रह अंतराल के लिए मृत्यु, या सेल घनत्व के बीच किसी भी सहसंबंध को नगण्य माना जाता था। पुरुषों और महिलाओं के बीच उपचार में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था (पी = 0.53)।
सामान्य डेटा सेट के समान, 22 डिस्ट्रोफिक कॉर्निया में से 10 को कम से कम एक टाइमपॉइंट (आमतौर पर दिन 3) में घाव के भीतर दाग वाले क्षेत्र से जुड़े छीने गए क्षेत्र के बाहर उल्लेखनीय ट्रिपैन स्टेनिंग के साथ प्रस्तुत किया गया था - एक अवलोकन जिसे हमने परिधीय धुंधला (चित्रा 4 ए) कहा था। उन 10 में से, केवल दो नियंत्रण कॉर्निया थे जिनके इलाज किए गए समकक्षों ने एक ही प्रभाव प्रदर्शित नहीं किया था। शेष आठ सभी मिलान जोड़े थे और एक ही व्यक्ति से कॉर्निया के बीच समान गंभीरता के साथ प्रस्तुत किए गए थे। हालांकि धुंधला पैटर्न सामान्य और डिस्ट्रोफिक कॉर्निया के बीच तुलनीय थे, परिधीय धुंधला की आवृत्ति सामान्य समूह में 25% की तुलना में कॉर्निया सकारात्मक के 45% के साथ डिस्ट्रोफिक डेटा सेट में अधिक थी। चित्रा 4 ए एक जोड़ी को दिखाता है जिसे परिधीय धुंधला के लिए सकारात्मक माना जाता था, क्योंकि घाव के बाहर दाग वाला क्षेत्र दिन 6 छवियों में घाव के किनारे से मिला और धीरे-धीरे कम हो गया। इसी Alizarin लाल छवियों में, परिधीय Trypan धुंधला के साथ क्षेत्रों में कोशिकाओं को बढ़ाया और असामान्य रूप से आकार दिया, बहुत कोशिकाओं है कि छीन क्षेत्र में स्थानांतरित की तरह दिखाई दिया, और नकारात्मक धुंधला उन क्षेत्रों के साथ सहसंबद्ध जहां Trypan ब्लू दिन 14 पर मौजूद था के साथ सहसंबद्ध. संस्कृति अवधि के दौरान प्रभावित कॉर्निया के बड़े हिस्से के बावजूद, सभी 10 कॉर्निया में दागदार परिधि का आंशिक या पूर्ण समाशोधन हुआ। इसके अतिरिक्त, दिन 14 में चंगा अंतिम प्रतिशत सामान्य सीमा के भीतर था, उपचार समूह से संबंधित, सभी के लिए, लेकिन एक कॉर्निया। बाहरी (0811L, चित्रा 4A में चित्रित) ने परिधीय धुंधला के अवशेषों के कारण एक नकारात्मक प्रतिशत चंगा मूल्य वापस कर दिया जो अभी भी दिन 14 (चित्रा 3 ए और चित्रा 4 ए) में घाव क्षेत्र से जुड़ा हुआ है। एक दूसरा धुंधला पैटर्न, जिसे दूर तक परिधीय धुंधला के रूप में संदर्भित किया जाता है, चित्रा 4 बी से अलीज़ारिन रेड छवियों में कब्जा कर लिया गया था, लेकिन कई कॉर्निया (चित्रा 4 बी) में संस्कृति अवधि के दौरान ट्रिपैन ब्लू छवियों में भी स्पष्ट था। इस अवलोकन को लिम्बस के चारों ओर अंधेरे दाग की एक अंगूठी की विशेषता है, जो समझौता किए गए एंडोथेलियम को इंगित करता है। शब्द के बावजूद, यह पैटर्न सामान्य और डिस्ट्रोफिक कॉर्निया दोनों में इतना आम था कि उन्हें परिधीय धुंधला के लिए सकारात्मक के रूप में नहीं गिना गया था। इन छवियों में, नियंत्रण कॉर्निया ने दिन 14 पर अधिक जीवंत और व्यापक धुंधला दिखाया, दोनों कॉर्निया के बावजूद संस्कृति अवधि में जल्दी धुंधला होने की समान गंभीरता और पैटर्न रखने के बावजूद। उपचारित कॉर्निया में भी उल्लेख किया गया था, जो कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या प्रतीत होती है, जो नियंत्रण की तुलना में अधिक कॉम्पैक्ट और हेक्सागोनल दिखाई देती थी, हालांकि इन टिप्पणियों को मात्रात्मक रूप से मापा नहीं गया था। परिधि में वक्रता के कारण, केवल ट्रिपैन के भीतर और तुरंत छीन लिए गए क्षेत्र के आसपास के हिस्से को मात्रात्मक विश्लेषण में शामिल किया गया था। जब सभी डिस्ट्रोफिक कॉर्निया में प्रतिशत-दाग वाले मूल्यों का औसत किया गया था, तो परिधीय धुंधला होने के उद्भव के परिणामस्वरूप दिन 0 से प्रारंभिक वृद्धि हुई, जैसा कि सामान्य कॉर्निया में देखी गई स्थिर कमी के विपरीत था जहां परिधीय धुंधला कम प्रचलित था (चित्रा 3 बी)।
Confocal इमेजिंग द्वारा कल्पना की गई इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ZO-1 की अर्ध-संगठित अभिव्यक्ति का खुलासा करती है, जो घाव के किनारे (चित्रा 5) में और उसके आसपास सीईसी तंग जंक्शनों का एक कार्यात्मक मार्कर है, एक पैटर्न इसी तरह से Alizarin Red staining (चित्रा 2 और चित्रा 4) द्वारा प्रमाणित है। Pleomorphism और polymegathism अधिकांश dystrophic corneas में ZO-1 द्वारा दिखाई देते हैं; हालांकि, इस अवलोकन को उनकी रोगग्रस्त स्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है और कल्चरिंग से पहले कॉर्निया की स्पेकुलर परीक्षा पर आंख बैंक द्वारा नोट किया गया था। अव्यवस्थित ZO-1 अभिव्यक्ति उपचारित कॉर्निया के घाव क्षेत्र के भीतर देखी जाती है जहां कोशिकाएं अंदर की ओर चली गई थीं, जो अलीज़ारिन रेड पैटर्न के अनुरूप भी थीं। ईडीयू-शामिल कोशिकाओं को घाव की सीमा के आसपास और नियंत्रण और उपचारित कॉर्निया में घाव वाले क्षेत्र के अंदर देखा जा सकता है (चित्रा 5)। माइग्रेटेड सीईसी का पैटर्न ट्रिपैन ब्लू परिणामों को भी दर्शाता है, जहां नियंत्रण कॉर्निया में अधिकांश कोशिकाएं घाव के किनारे के दो क्षेत्रों के भीतर पाई जाती हैं, जबकि इलाज किए गए कॉर्निया में सीईसी को पूरे छीन क्षेत्र (चित्रा 2) में देखा जा सकता है।
इस अध्ययन में ईडीयू लेबलिंग को एक गुणात्मक उपाय के रूप में किया गया था ताकि यह पुष्टि की जा सके कि प्रसार ने उपचार में योगदान दिया। हालांकि, ईडीयू को शामिल करने वाली कोशिकाओं का परिमाणीकरण कॉर्नियल सूजन के कारण व्यवस्थित रूप से नहीं किया जा सका, जो लगातार, प्रतिकृति छवियों को घाव में और उसके आसपास कैप्चर होने से रोकता है। एक सरोगेट के रूप में, डीएसओ मॉडल की स्थापना से पहले किए गए एक अध्ययन में किए गए मात्रात्मक विश्लेषण को प्रसार पर ईएफजीएफ -1 (एनएम 141) के प्रभावों को प्रदर्शित करने के लिए शामिल किया गया है (चित्रा 6)। सामान्य मानव दाता कॉर्निया को ईडीयू की उपस्थिति में एक स्केलपेल और सुसंस्कृत का उपयोग करके क्वार्टर में काट दिया गया था, 48 घंटे के लिए ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) के साथ या बिना जैसा कि पहले वर्णित है (एवलेथ, 2020)16। Hoechst 33342 और EdU-लेबल कोशिकाओं के इमेजिंग और बाद के विश्लेषण को क्वार्टर के अबाधित मध्य क्षेत्र में और किनारे के क्षेत्र में अलग-अलग प्रदर्शन किया गया था, तीन क्षेत्रों के भीतर जहां से कॉर्निया काटा गया था। मध्य क्षेत्र में, ईडीयू को शामिल करने वाली कोशिकाओं का प्रतिशत विश्लेषण किए गए 10 कॉर्निया में कम और अत्यधिक परिवर्तनशील था। औसतन, eFGF1 (NM141) के साथ इलाज किए गए तिमाहियों में नियंत्रण (1.8% ± 2.9%) की तुलना में मध्य क्षेत्र (4.1% ± 7.9%) में EdU निगमन का उच्च स्तर था, हालांकि यह अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था (पी = 0.239)। घाव के किनारे पर, eFGF1 (NM141) के साथ प्रेरित उपचारित तिमाहियों ने नियंत्रण तिमाहियों (10% ± 9.6%, पी = 0.012) की तुलना में औसत (18.1% ± 11.5%) औसत होने पर ईडीयू निगमन की काफी उच्च दर दिखाई।
तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 22 डिस्ट्रोफिक और 20 सामान्य कॉर्निया के लिए दाता जानकारी, साथ ही साथ ईडीयू मात्रा के लिए पहले उपयोग किए गए 10 सामान्य कॉर्निया। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: कॉर्निया के महत्वपूर्ण डाई धुंधला पोस्ट-Descemet है अलग करना. Dystrophic मानव कॉर्निया को Descemet की झिल्ली के केंद्रीय 4 मिमी से छीन लिया गया था और 14 दिनों के लिए eFGF1 (NM141) (100 ng / mL) के साथ या बिना इनक्यूबेट किया गया था। घावों को 0, 3, 6, 9, 12 और 14 दिनों पर ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग द्वारा कल्पना की गई थी। सीईसी सीमाओं को 14 वें दिन Alizarin लाल धुंधला द्वारा कल्पना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: Dystrophic मानव कॉर्निया eFGF1 (NM141) के साथ सुसंस्कृत होने पर DSO से काफी अधिक उपचार दिखाते हैं। (A) छविJ का उपयोग करके दिन 14 में दाग वाले क्षेत्र को मापकर और दिन 0 पर दाग वाले प्रतिशत की तुलना करके प्रतिशत उपचार का निर्धारण किया गया था। (बी) समय के साथ ग्राफ किए गए औसत प्रतिशत दाग सामान्य कॉर्निया में लगातार कमी दिखाते हैं, जबकि परिधीय धुंधला होने के उच्च प्रसार के कारण डिस्ट्रोफिक कॉर्निया में दिन 3 पर चरम पर पहुंचते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: परिधीय धुंधला के साथ dystrophic कॉर्निया के महत्वपूर्ण डाई धुंधला. (ए) बरकरार डेसेमेट की झिल्ली के ट्रिपैन स्टेनिंग को केंद्र की ओर आगे बढ़ते हुए देखा जा सकता है, फिर नियंत्रण और उपचारित कॉर्निया दोनों में समय के साथ समाशोधन किया जा सकता है। (बी) लिम्बस के चारों ओर एलिजारिन पैटर्न परिधीय क्षति के एक विशिष्ट अवलोकन का प्रतिनिधित्व करते हैं और कई दाता कॉर्निया में देखे जाने वाले एंडोथेलियम की अव्यवस्थित पुन: स्थापना करते हैं- इस मामले में डिस्ट्रोफिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: पलायन की उत्तेजना और eFGF1 (NM141) द्वारा CECs के प्रसार छीन लिया dystrophic corneas में. Descemet के छीन कॉर्निया के Confocal माइक्रोग्राफ ZO-1 (लाल), EdU (हरा), और Hoechst 33342 (नीले) के लिए दाग दिया. बिंदीदार रेखा छवि के बाईं ओर छीन क्षेत्र और दाईं ओर बरकरार Descemet झिल्ली के साथ घाव के किनारे का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: सामान्य कॉर्निया से कोशिकाओं को फैलाने की मात्रा एक स्केलपेल का उपयोग करके तिमाही की जाती है और 48 घंटे के लिए ईएफजीएफ -1 (एनएम 141) के साथ या बिना ईडीयू युक्त मीडिया में इनक्यूबेट की जाती है। क्वार्टर को अबाधित मध्य क्षेत्र में और कट एज के साथ तीन प्रतियों में चित्रित किया गया था, और मध्य और किनारे के क्षेत्रों में ईडीयू को शामिल करने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए औसत गणना की गई थी। ओकुलर फार्माकोलॉजी और थेराप्यूटिक्स के जर्नल से संशोधित चित्रा, अनुमति के साथ उपयोग किया जाताहै 16। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 1: सामान्य मानव कॉर्निया ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) के साथ सुसंस्कृत होने पर डीएसओ से काफी अधिक उपचार दिखाते हैं। ImageJ का उपयोग दाग वाले क्षेत्रों को मापने और % उपचार निर्धारित करने के लिए किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
Discussion
कई नेत्र रोग विशेषज्ञों को दो मुख्य कारणों से अपने रोगियों को डीएसओ की सिफारिश करने के बारे में चिंताएं हैं: 1) लंबी उपचार प्रक्रिया, और 2) डेटा की कमी (डीएसओ नेत्र शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में एक नई अवधारणा है)। हमने जो शोध प्रस्तुत किया है, वह इन दोनों चिंताओं को कम करने के लिए बहुत उपयोगी होगा। इस अध्ययन और अन्य लोगों के आंकड़ों के आधार पर, एफडीए ने एक चरण 2 नैदानिक परीक्षण को मंजूरी दे दी है जहां ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) को डीएसओ17 से गुजरने वाले रोगियों के लिए अलग-अलग खुराक कार्यक्रम में प्रशासित किया जाएगा।
ऊपर वर्णित विधि को सोह एट अल द्वारा किए गए एक अध्ययन के बाद मॉडलिंग की गई थी, जहां कॉर्नियल एंडोथेलियल हीलिंग का मूल्यांकन खरोंच और छिले हुए घावोंदोनों में रॉक अवरोधक वाई -27632 के साथ और बिना किया गया था। जबकि वाई -27632 ने डेसेमेट की झिल्ली के साथ एंडोथेलियल पुनर्जनन को तेज कर दिया, फिर भी उपचार के साथ छीन लिए गए घावों में कोई पर्याप्त उपचार नहीं पाया गया। eFGF1 (NM141) के साथ या उसके बिना उपचार के बाद एक समान स्ट्रिपिंग तकनीक का उपयोग करके, हमने जो अवलोकन पाए, वे सोह और सहयोगियों के अनुरूप नहीं थे। दिन 14 में कई इलाज किए गए कॉर्निया में ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग की अनुपस्थिति, और सुधारित एंडोथेलियल परत के भीतर ZO-1 सकारात्मक तंग जंक्शनों की उपस्थिति का तर्क है कि एक बरकरार बाधा, सीईसी के प्राकृतिक कार्य का हिस्सा, सामान्य और डिस्ट्रोफिक कॉर्निया दोनों में बहाल किया गया था। हालांकि इस अध्ययन में परिमाणित नहीं किया गया है, छीन क्षेत्र में और उसके आसपास ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं की उपस्थिति भी एक उपचार तंत्र के रूप में प्रसार का सुझाव देती है, जिसे हमने पहले स्थापित किया है, घायल कॉर्निया16 में ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) द्वारा उत्तेजित किया जा सकता है। सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि eFGF1 (NM141) के साथ उपचार के परिणामस्वरूप DSO से काफी अधिक उपचार हुआ, औसतन 14 दिन के टाइमपॉइंट पर नियंत्रण कॉर्निया के रूप में दो गुना अधिक उच्च। यद्यपि उपचार दर व्यक्तियों के बीच मामूली रूप से भिन्न होती है- दाता कॉर्निया की एक विशिष्ट विशेषता- बड़े नमूना आकारों पर परिणामों की प्रतिकृति भी एक अत्यधिक औसत दर्जे की विधि का सबूत देती है। हमारे ज्ञान के लिए, साहित्य में एक पूर्व विवो डेसेमेट के स्ट्रिपिंग मॉडल का कोई अन्य उदाहरण नहीं है।
प्रोटोकॉल के प्रमुख घटक जो डीएसओ का अध्ययन करने वाले अन्य शोधकर्ताओं के लिए मूल्यवान होंगे, नंगे स्ट्रोमा का पता लगाने के लिए ट्रिपैन ब्लू का उपयोग कर रहे हैं, और दाग क्षेत्र को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली छवि प्रसंस्करण तकनीक। ट्राइपैन ब्लू का उपयोग आमतौर पर नेत्र शल्य चिकित्सा में किया जाता है, खासकर जब गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं का पता लगाने और ऊतक की दृश्यता में सहायता करने के लिए डेसेमेट की झिल्ली के साथ काम करना। इस प्रोटोकॉल में शामिल धुंधला टाइमपॉइंट्स ने ट्रिपैन ब्लू को कॉर्निया को ओवर-एक्सपोज़ किए बिना प्रभावी दोहराने वाले धुंधला करने की अनुमति दी, क्योंकि यह उच्च सांद्रता19 पर सीईसी के लिए विषाक्त दिखाया गया है। सभी कॉर्निया में 14 दिनों में दाग क्षेत्र की कमी, Alizarin लाल और immunohistochemistry द्वारा माइग्रेटेड CECs का परिणाम होने की पुष्टि की, उपचार को मापने के लिए एक सरल और पुन: प्रस्तुत करने योग्य विधि को दर्शाता है। इमेजजे के रंग थ्रेशोल्ड मेनू का उपयोग करते हुए, कई विश्लेषकों ने 1% से नीचे लगातार मानक विचलन के साथ डेटा एकत्र किया (डेटा नहीं दिखाया गया है)। यद्यपि वैकल्पिक कार्यक्रम इसी तरह प्रदर्शन कर सकते हैं, ImageJ एक ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर है जो उपचार को ट्रैक करने के लिए सटीक क्षेत्र माप का उत्पादन करने में सक्षम है।
हालांकि, स्ट्रिपिंग प्रोटोकॉल का एक पहलू है जिसे हमने घाव निर्माण के लिए दोनों आवश्यक पाया, फिर भी समग्र उपचार प्रक्रिया के लिए अवरोधक। बायोप्सी पंच द्वारा छोड़े गए निशान के साथ डेसेमेट की झिल्ली को स्कोर करने के लिए एक तेज, 30 जी सुई का उपयोग करना एक चिकनी, परिपत्र घाव के निर्माण को सक्षम बनाता है जिसे चिकित्सकों द्वारा तेजी से उपचार10 का समर्थन करने के लिए नोट किया जाता है। उसी समय, यह चरण कॉर्निया के लिए हानिकारक है, क्योंकि यह स्ट्रोमल फाइबर में आँसू पैदा कर सकता है जिससे स्ट्रोमल सेल की मृत्यु हो सकती है, घाव के किनारे पर एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रवास को बाधित कर सकती है, और नोड्यूल्स के गठन को प्रेरित कर सकती है जिसके परिणामस्वरूप अधिक लगातार पोस्ट-ऑपरेटिव एडिमा20 होती है। डीएसओ करने वाले चिकित्सक आमतौर पर घाव को शुरू करने के लिए एक रिवर्स सिंस्की हुक का उपयोग करते हैं, लेकिन कॉर्निया को तना हुआ रखने वाले किसी भी इंट्राओकुलर दबाव के बिना, यह उपकरण पूर्व विवो मॉडल में कम प्रभावी है। अंतर्निहित स्ट्रोमा को नुकसान पहुंचाए बिना डेसेमेट की झिल्ली को फाड़ने में सक्षम एक वैकल्पिक उपकरण प्रोटोकॉल पर सुधार करेगा, उदाहरण के लिए मैकसाई और शिलोच10 द्वारा अनुशंसित सिंचाई और आकांक्षा हैंडपीस। यह निर्धारित करने के लिए आगे के प्रयोग की आवश्यकता होगी कि क्या यह तकनीक पूर्व विवो मॉडल के साथ संगत है।
एक चुनौती जो पूर्व विवो मॉडल के लिए अंतर्निहित प्रतीत होती है, घाव के परिधीय क्षेत्र में सीईसी की मौत की लगातार घटना है, विशेष रूप से डिस्ट्रोफिक कॉर्निया में। यह कभी-कभी घाव क्षेत्र की मात्रा को अस्पष्ट करता है, क्योंकि रंग थ्रेशोल्डिंग टूल की सटीकता अधिक सीमित हो जाती है क्योंकि सना हुआ क्षेत्र कॉर्निया के केंद्र से परे फैलता है जहां इसकी वक्रता के परिणामस्वरूप असमान प्रकाश वितरण होता है। हालांकि, ये चर माप मुख्य रूप से परिधीय धुंधला होने से पहले पहले के टाइमपॉइंट्स पर हुए थे, धीरे-धीरे क्षतिग्रस्त सीईसी के रूप में कम हो गए और पड़ोसी कोशिकाओं को फैलाया गया, माइग्रेट किया गया, या उन्हें बदलने के लिए फैलाया गया। अंतिम 14 दिन के टाइमपॉइंट तक, सना हुआ क्षेत्र कॉर्निया के केंद्र में वापस स्थानीयकृत हो गया था, और सभी छवियां औसत दर्जे की थीं। सोह एट अल द्वारा तुलनीय आवृत्ति के साथ एक समान अवलोकन किया गया था, जहां 14 सामान्य कॉर्निया में से पांच ने संस्कृति अवधि18 की शुरुआत में 'समय से पहले संस्कृति विफलता' (पीसीएफ) को प्रस्तुत किया था। जबकि क्षति ने हमारे कॉर्निया में समय के साथ खुद को उलट दिया और फिर भी उनके मामले में स्थायी था, इसे इस तथ्य के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि उनकी विधि को कॉर्निया के एक बड़े क्षेत्र को घायल करने की आवश्यकता थी। डिस्ट्रोफिक कॉर्निया में अधिक प्रचलित परिधीय ट्रिपैन स्टेनिंग का अवलोकन इंगित कर सकता है कि डिस्ट्रोफिक कॉर्निया स्वस्थ कॉर्निया की तुलना में एंडोथेलियल सेल मृत्यु के लिए अधिक संवेदनशील हैं। हालांकि इस सेल की मौत का सटीक कारण अभी तक स्पष्ट नहीं किया गया है, हमारा मानना है कि यह संभावना नहीं है कि यह मुद्दा विवो में मानव कॉर्निया के लिए प्रासंगिक होगा। परिधीय एंडोथेलियम को नुकसान हमारे ज्ञान के लिए डीएसओ के किसी भी नैदानिक मामले के अध्ययन में सूचित नहीं किया गया है, यह सुझाव देते हुए कि यह घटना दाता कॉर्निया के लिए अद्वितीय है जो पूर्व विवो 6,8,10,11,21 सुसंस्कृत है। दो उदाहरणों के अलावा जहां केवल कॉर्निया को नियंत्रित करते हैं, परिधीय धुंधला की सभी टिप्पणियों को जोड़ा गया था, इसलिए यह संभावना नहीं है कि कारण ईएफजीएफ 1 (एनएम 141) के संपर्क में था। हालांकि, यह संभव है कि उन उदाहरणों में उपचार ने क्षति के खिलाफ एक सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदान किया हो सकता है जो अन्यथा दोनों कॉर्निया में परिधीय धुंधला होने को प्रेरित करता है। इस परिकल्पना पर आगे की जांच की आवश्यकता है।
इस विधि के लिए एक और सीमा एफईसीडी फेनोटाइप के दाता कॉर्निया प्रतिनिधि को सोर्स करना है जिसके लिए डीएसओ का इरादा है। किसी भी प्रकार के दाता कॉर्निया दुर्लभ हैं, इसलिए एक सर्जरी की आवश्यकता होती है जो दाता ऊतक के उपयोग से बचती है। हमारे उद्देश्यों के लिए, उपलब्ध एकमात्र कॉर्निया वे हैं जो विभिन्न कारणों से प्रत्यारोपण से अस्वीकार कर दिए गए हैं। नेत्र बैंक आगे इन कॉर्निया को सामान्य या डिस्ट्रोफिक के रूप में वर्गीकृत करते हैं, जिसमें गुट्टा, कम या गैर-औसत दर्जे का ईसीडी और अनियमित सीईसी आकृति विज्ञान की उपस्थिति शामिल है। एक आंख बैंक से ऊतक स्वीकार करने से पहले एक डिस्ट्रोफिक निदान की पुष्टि करना भी लगभग असंभव है, क्योंकि अधिकांश दाताओं के चिकित्सा इतिहास में पिछले ओकुलर इतिहास को शामिल नहीं किया गया है और प्रदान की गई एकमात्र जानकारी ईसीडी मूल्य, तकनीशियन के नोट्स और कुछ मामलों में एक प्रतिनिधि स्पेकुलर छवि है। इस अध्ययन के लिए प्राप्त डिस्ट्रोफिक कॉर्निया ने संस्कृति अवधि पूरी होने के बाद किए गए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर कॉन्फ्लुएंट केंद्रीय गुट्टा नहीं दिखाया, यह सुझाव देते हुए कि वे एफईसीडी के "शुरुआती" चरणों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। हम उम्मीद नहीं करते हैं कि इसका अध्ययन के निहितार्थों पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा, क्योंकि डीएसओ का उद्देश्य गुट्टा के confluent क्षेत्रों को हटाना है, जिससे स्वस्थ परिधीय कोशिकाओं को अंदर की ओर स्थानांतरित करने की अनुमति मिलती है।
यह विधि एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए एक अत्यधिक लागू और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तकनीक प्रदान करती है जो सीईसी प्रसार और प्रवास को प्रभावित कर सकती है। मॉडल में कई विशेषताएं हैं जो इसे इन विट्रो मॉडल की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक बनाती हैं जिसमें सुसंस्कृत सीईसी शामिल होते हैं, यहां तक कि जब मानव कॉर्नियल ऊतक ग्राफ्ट 22,23,24 पर बीज दिया जाता है। सबसे पहले, उत्तेजित होने वाले सीईसी एक मोनोलेयर में हैं, जैसा कि वे रोगी की आंखों में मौजूद हैं, और कॉर्नियल स्ट्रोमा में प्रवास कर रहे हैं क्योंकि वे नैदानिक डीएसओ के बाद होंगे। प्रश्न में स्ट्रोमा सीईसी के रूप में एक ही रोगी से है, इस प्रकार संभावित एफईसीडी से संबंधित स्ट्रोमल मतभेदों के लिए नियंत्रित होता है। सांस्कृतिक प्रक्रिया के दौरान एंडोथेलियल से मेसेनकाइमल संक्रमण (एनएमटी) के लिए संबंधित चुनौतियों और क्षमता के साथ सीईसी की संस्कृतियों को स्पष्ट करने, अलग करने और विस्तारित करने की कोई आवश्यकता नहीं है। वर्णित प्रोटोकॉल अपने आप में नैदानिक डीएसओ प्रक्रिया के समान है। हालांकि यह संस्कृति और विस्तार चरणों को दरकिनार करता है, इस विधि की सीमा है कि अध्ययन की अवधि कॉर्नियल सूजन द्वारा प्रतिबंधित है, क्योंकि उपकला परत को बनाए नहीं रखा जाता है। यह हमें सीईसी की आकृति विज्ञान की जांच करने से रोकता है जो छीने गए क्षेत्र को कवर करने के लिए चले गए हैं, जिससे यह स्पष्ट नहीं होता है कि वे अंततः इस मॉडल में एक हेक्सागोनल सरणी में पुनर्व्यवस्थित करेंगे या नहीं। गार्सिन एट अल ने अपनी सक्रिय भंडारण मशीन (एएसएम) के साथ एक संभावित समाधान विकसित किया है, एक उपकरण जो पारंपरिक अंग संस्कृति25 में बनाए रखे गए कॉर्निया की तुलना में काफी कम एडिमा के साथ 3 महीने तक संस्कृति में कॉर्निया रखने के लिए दिखाया गया है। इस तरह का एक उपकरण इस काम पर प्रतिकृति और विस्तार करने में सहायक हो सकता है।
इस मॉडल में अन्य घाव भरने वाले उपचारों (जैसे, रॉक अवरोधक) का परीक्षण करने, सर्जिकल तकनीक में संशोधनों का मूल्यांकन करने और विभिन्न दाता आबादी या बीमारी के चरणों में उपचार की तुलना करने में संभावित उपयोगिता है। हमें उम्मीद है कि यह शोध, नैदानिक परीक्षण डेटा के साथ संयोजन के रूप में यह बाहर आता है, चिकित्सकों को अपने योग्य एफईसीडी रोगियों के लिए एक मूल्यवान उपचार विकल्प के रूप में डीएसओ पर विचार करने के लिए प्रोत्साहित करता है।
Disclosures
DDE, SP, GD, और JW के कर्मचारी हैं और Trefoil Therapeutics में इक्विटी रखते हैं, Inc. DDE eFGF1 (NM141) को कवर करने वाले पेटेंट पर आविष्कारक है।
Acknowledgments
इस काम के लिए धन Trefoil Therapeutics और NIH NCATS TRND CRADA # 2016-04 द्वारा समर्थित था। लेखकों को हिस्टोपैथोलॉजी सलाह और सेवाओं के लिए टोनी वोंग, यूसी सैन डिएगो में निकॉन इमेजिंग सेंटर को उनके कन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, और शल्य चिकित्सा तकनीक पर उनकी सलाह के लिए डॉ नताली अफशरी और मैरियन मैकसाई। इसके अलावा, लेखक कॉर्निया प्रदान करने के लिए आंखों के दाताओं और आंखों के बैंकों के प्रति अपनी कृतज्ञता का विस्तार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
| 0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
| 0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
| 10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
| 12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
| 15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| 2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
| 310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
| 5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
| 6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
| Analytical balance | Sartorious | R200D | |
| Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
| Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
| Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
| Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
| Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
| Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
| Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
| Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
| Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
| Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
| ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
| Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
| Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
| Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
| L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
| Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
| Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
| N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
| Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
| Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
| Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
| Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
| Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
| Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
| Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
| Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
| Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
| Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
| Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
| Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
| Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
| Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
| Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
| VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |
References
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