Summary
Descemet的剥离只是一种实验程序，其中由Fuchs内皮角膜营养不良引起的中央角膜内膜的患者剥离Descemet的膜，以便外周细胞再生内皮层。我们提出了在营养不良性人角膜 离体 模拟DSO的新方法，其eFGF1（NM141）刺激加速愈合。
Abstract
Fuchs内皮角膜营养不良症（FECD）由功能失调的角膜内皮细胞（CEC）引起，目前通过移植整个角膜或Descemet膜进行治疗。眼科手术的最新发展已经建立了Descemet的仅剥离（DSO），这是一种手术技术，其中切除中心圈的肠密集Descemet膜，以允许CEC迁移到光滑的基质上，恢复角膜的功能和视力。虽然这种潜在的治疗选择在眼科研究领域引起了人们的高度兴趣，但尚未建立成功的DSO 离体 模型，临床数据有限。这项工作提出了一种模拟人类供体角膜中DSO的新型伤口愈合模型。使用这种方法来评估人类工程FGF1（NM141）的功效，我们发现治疗 通过 刺激CEC的迁移和增殖来加速愈合。这一发现在眼库报告的11对具有营养不良迹象的人角膜中得到证实，以验证这些结果可以在Fuchs营养不良症患者中复制，作为DSO手术的目标人群。
Introduction
Fuchs内皮角膜营养不良症（FECD）是一种以角膜内皮细胞（CEC）泵功能丧失以及Descemet膜表面胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白过度积聚，形成角膜内皮1的疾病。FECD唯一已知的治疗方法是不同形式的内皮角膜移植术，所有这些都有排斥和内皮细胞丢失的风险2。虽然眼科手术的进步使这些手术随着时间的推移变得不那么具有侵入性，但任何形式的移植都伴随着排斥的风险和终身使用类固醇的可能性，这种治疗本身就伴有不良事件。此外，全球供体组织短缺，每70名有需要的患者中只有一名供体角膜可供3名患者使用。鉴于这些挑战，研究人员和临床医生正在探索完全避免对供体组织的需求的手术方法。这些实验技术之一是Descemet的仅剥离（DSO）或无内皮角膜移植术（DWEK）的Descemetorhexis，其中FECD患者具有局限于角膜中心的牙本质具有中心4 mm的Descemet膜环，无需移植物放置。去除牙龈瘤可促进健康的外周细胞向内迁移并修复内皮单层，最终逆转基质水肿并改善视力。这个概念最初是在一系列案例研究中描述的，其中患者接受了因Descemet膜脱离而复杂的手术，但CEC再造仍然发生了4，5，6，7。虽然这种方法有很多优点，但愈合过程漫长且不一致，因为如果在手术后的几个月内没有看到愈合，一些患者需要抢救移植8。由于这些原因，刺激CECs的快速迁移和增殖的药物可能对接受DSO的FECD患者的恢复过程有益。
最近的几项研究评估了ROCK抑制剂作为DSO患者的补充治疗，并发现治疗患者恢复得更快，中心内皮细胞密度（ECD）高于仅DSO组9，10，11的患者。然而，由于样本量小且给药方案之间存在差异，因此需要更多的数据来更好地了解 ROCK 抑制剂在这种情况下的疗效。
成纤维细胞生长因子也被证明可以刺激角膜内皮的再生，无论是在体外用牛CECs，还是在猫角膜12，13的体内。eFGF1（NM141）是FGF-1的工程版本，含有几种氨基酸取代物来稳定分子，而天然FGF-1的半衰期要短得多，为14，15。我们之前已经证明了eFGF1（NM141）在四分生的人角膜16中刺激CEC离体增殖的能力。这项研究试图通过在正常和营养不良的角膜中建立第一个成功的DSO离体模型来改进这项工作，以确定辅助治疗（如eFGF1（NM141））是否加速了该应用中的愈合。
Protocol
这项工作使用现有标本，没有确定受试者，并且根据45 CFR 46.101（b）（4）（4）免于IRB批准。
人类供体角膜是从美国各地的不同眼库获得的（见 材料表）。眼库根据镜面评估后的牙龈、多形性、多角膜增多症和/或低 ECD 等发现，分别对角膜进行营养不良性评价。 图1 显示了在伤口形成期间，剥离后立即和培养2周后角膜中的台盼蓝染色。
图1：代表伤口形成期间，剥离后立即以及培养14天后的角膜的图表，如台盼蓝可视化的那样。 测量这些时间点之间染色面积的减少以确定愈合水平。 请点击此处查看此图的大图。
1. 伤口形成
- 使用无菌镊子，从培养基中取出角膜，并用1x PBS冲洗以除去残留的培养基和细胞碎片。冲洗后，将角膜内皮面朝上放在培养皿的盖子上。
- 将30μL台盼蓝移液到孔中。在台盼蓝中浸入新的4毫米活检拳，然后轻拍任何多余的。
- 用双手将冲头放在角膜中心上方，并将其直接降低到内皮表面上，施加最小的压力。
- 在不改变角膜上的位置或压力的情况下，将拳头转移到一只手上，并用新释放的手伸手镊子。使用镊子将角膜固定到位，同时轻轻地来回扭动活检拳约90°几次。
- 将拳头从角膜上直接抬起，放在一边。
- 在1x PBS中再次冲洗，以去除多余的台盼蓝。
2. 脱模
- 将培养皿盖上的角膜转移到解剖范围。
注意：不要让角膜干燥超过5分钟。如果需要更多的时间来完成该过程，请在1x PBS中再次冲洗以重新水化内皮。 - 用弯曲的镊子将角膜固定到位，沿着活检拳留下的台盼蓝环轻轻拖动尖锐的30 G针尖，对Descemet的膜进行评分。使用最小的压力，以避免破坏潜在的基质。
- 使用Sinskey钩，使用轻柔的舀取动作来抬起并剥离Descemet在伤口边缘周围的膜，朝着病变的中心工作。
注意：Descemet的膜应该具有非常小的阻力。如果遇到困难，可能会拉起基质。如果发生这种情况，请重新开始，从伤口边缘的新点抬起。 - 一旦Descemet的大部分膜与基质分离，使用Gorovoy镊子去除膜并放在一边。
- 检查剥离区域是否有任何剩余的膜片，并用Gorovoy镊子去除。
3. 台盼蓝染色
注意：在Descemet剥离后，用台盼蓝染色角膜以可视化伤口区域。
- 将培养皿盖上的角膜放回生物安全柜中，并在含有0.01%（w / v）CaCl 2和MgCl 2的1x PBS中冲洗，以去除细胞碎片并促进剩余CEC与完整的Descemet膜紧密粘附。
- 将角膜放入孔室中，并将30μL台盼蓝移液到内皮层上30秒。
- 使用镊子轻轻摇晃角膜，以确保整个内皮表面被覆盖。
- 用0.01%（w / v）CaCl 2和MgCl2 在1x PBS中冲洗掉多余的台盼蓝，并在 解剖显微镜下对染色的角膜进行成像，用于第0天的时间点。
- 确保角膜是平衡的，以便光线在整个时间点均匀传输，并且定位可以跨时间点复制。
注意：如果需要，镊子可用于在成像时将角膜固定到位。
- 确保角膜是平衡的，以便光线在整个时间点均匀传输，并且定位可以跨时间点复制。
4. 文化时期
- 在含有由OptiMEM组成的低血清培养基的六孔板中培养角膜;1x胰岛素，转铁蛋白和硒;1x抗生素/抗真菌药;0.02毫克/毫升氯化钙2;0.2毫克/毫升抗坏血酸;和0.8%热灭活胎牛血清。在仅 8 mL 低血清培养基中培养左角膜，在 8 mL 低血清培养基中培养右角膜，补充 100 ng/mL eFGF1 （NM141）。
- 在37°C下用6%CO2 孵育14天，每日更换培养基。
- 在第3天，第6天，第9天，第12天和第14天重复台盼蓝染色程序，并在染色后立即对每个角膜进行成像。请务必在所有时间点保持相机设置的一致性。
- 在第12天，向对照和eFGF1（NM141）补充的培养基中加入10μM EdU，并孵育48小时以标记增殖细胞。在第 13 天再次使用 EdU 续订媒体。
- 在第14天，像往常一样加入EdU，台盼染色和成像角膜后48小时，除了使用1x PBS与CaCl2 和MgCl2代替1x PBS外，使用普通的1x PBS进行冲洗，以防止钙与茜素红染色相互作用。
5. 茜素红染色
- 在第14天，在0.9%盐水溶液中制备5%茜素红。
注意：茜素红不会完全溶解在盐水溶液中。结合后，涡旋溶液和岩石至少1小时。再次涡旋，并在使用前过滤以去除未溶解的颗粒。 - 一旦台盼染色和成像完成，将角膜转移到出孔的培养皿中，并将200μL茜素红添加到每个角膜的内皮表面。
- 染色2分钟，然后在1x PBS的培养皿中冲洗每个角膜以除去多余的茜素红，然后放入预先填充有8mL 1x PBS的六孔板中洗涤两次5分钟。
- 第二次洗涤后，在解剖显微镜下对每个角膜的剥离区域进行成像。
注意：与台盼成像不同，角膜可以留在1x PBS中对茜素染色进行成像，以防止它们在此过程中变干。
6. 固定和渗透
- 捕获茜素图像后，将角膜转移到12孔板上，并在4mL含有0.05%吐温-20（PBS-T）的1x PBS中洗涤30分钟，以在固定前从组织中除去任何颗粒。
- 在室温下将角膜固定在4 mL 4%PFA中30分钟。
- 在含有1%Triton X-100的4mL 1x PBS中透化细胞5分钟，然后在4mL普通1x PBS中洗涤三次，每次30分钟。
7. 免疫组织化学
- 在37°C下在含有2%牛血清白蛋白和2%山羊血清的1x PBS中阻断角膜1小时。
- 在含有2.5μg/ mL一抗小鼠抗ZO-1的1mL封闭溶液中孵育1小时，在37°C下1小时，然后在4mL 1x PBS中洗涤三次，每次30分钟。
注意：在抗体染色过程中，板可以倾斜，以最大限度地减少所需试剂的体积。只需确保整个角膜完全浸没在抗体溶液中即可。 - 使用含有0.88 mg / mL抗坏血酸，0.26 mg / mL CuSO 4和2.5 μM Alexa Fluor488叠氮化物的鸡尾酒进行EdU Click-iT反应。
- 制备反应组分
- 加入500μL1x PBS至88mg抗坏血酸并涡旋直至溶解。
- 向44mgCuSO 4 中加入840μL去离子水并涡旋至溶解。
- 通过 按此顺序将以下试剂加入6 mL 1x PBS中来制备鸡尾酒，每次加入后倒置管进行混合：30μL抗坏血酸溶液，30μL CuSO4 溶液，然后是15μLAlexa Fluor 488
注意：一旦制备，该溶液对光敏感。对于方案的其余部分，应尽可能保护角膜免受光照。 - 向每个角膜中加入1mLEdU反应混合物，并在室温下反应1小时。
- 制备反应组分
- 向每个角膜中加入4 mL 10μg/ mL Hoechst 33342，并在室温下反应2分钟，然后在1x PBS-T中洗涤三次，每次30分钟。
- 在含有2μg/ mLAlexa Fluor 555标记的山羊抗小鼠IgG的1mL封闭溶液中孵育1小时，然后在1x PBS-T中洗涤三次，每次30分钟。
- 将角膜在4°C下储存在4毫升1x PBS中，其中含有1%抗/抗，0.1%环丙沙星和0.1%两性霉素B，以防止微生物生长。
- 进行共聚焦成像时，将整个角膜安装在200μL安装介质中，放在载玻片上，盖玻片向下贴平。
8. 台盼图像分析
- 使用NIH的开源软件ImageJ执行所有图像分析。使用 “文件”>“打开”打开 图像，然后单击“ 图像”>“调整>颜色阈值”。
- 使用“Hue”滑块仅包含蓝色范围，并将上方的“亮度”滑块一直向左调整以包括更多染色区域。
注意：如果此操作导致图像中未沾染的台盼表部分被包括在内，则“亮度”滑块可以返回到其原始级别。 - 慢慢调整上面的“饱和度”滑块，直到阈值准确勾勒出染色区域的轮廓。
注意：在此过程中打开原始图像的副本以供参考会很有帮助。 - 单击颜色阈值菜单中的 “选择 ”按钮，然后使用选择画笔工具取消选择伤口外拾取的区域。
- 单击“ 分析>测量” 以像素为单位报告染色区域。
- 使用 “编辑>选择”>“选择”取消选择 所有内容，并使用椭圆形选择工具尽可能紧密地适合边缘，然后单击“ 分析>测量 ”以像素为单位报告角膜面积。
注意：如果图像的这一部分太暗，可以暂时调高亮度，以帮助可视化边缘。 - 记录面积值并将染色面积除以整个角膜的面积，然后乘以100以计算染色的百分比。
- 对每个图像重复此过程两次，然后取三个测量值的平均值。
9. 统计分析
- 分析完所有图像后，将第14天染色的平均百分比除以第0天染色的百分比，以确定残留的未愈合区域。从100%中减去此量，以计算14天内剥离区域愈合的百分比。
- 使用配对 t 检验比较对照组和治疗组之间的愈合百分比值。
Representative Results
该实验最初是在10对正常研究角膜中进行的，因为它们最容易获得。一旦该方法被证明是成功的，该研究在11对营养不良性角膜中复制 - 由基于镜面评估的眼库标记 - 以研究eFGF1（NM141）在代表FECD患者群体的角膜中的作用。为了提高临床相关性，除非另有说明，否则本著作中包含的数字代表从营养不良性角膜收集的数据。
在模拟DSO的手术结果后，在整个14天培养期间进行台盼蓝染色并重复染色，并量化阳性染色的减少以评估伤口愈合（图2）。第14天还进行了茜素红染色，以描绘细胞边界。没有可见明显图案的深红色区域（以下称为阴性染色）始终出现在病变的未愈合部分以及角膜的其他区域，其中细胞被推定为受损或缺失。第14天台盼蓝染色阳性的区域与茜素红的阴性染色非常吻合（图2）。与未治疗的配偶相比，所有用eFGF1（NM141）治疗的营养不良性角膜在第14天显示出更大的愈合。平均而言，治疗后的角膜愈合率为91%，而对照角膜为38%，并且该差异具有统计学意义（p <0.001）（图3A）。这与从20个正常角膜获得的结果相当，其中对照组显示平均愈合率为32%，治疗后的角膜达到81%，这再次具有统计学意义（p <0.001）（补充图1）。使用假设方差相等的两个样本t检验比较正常角膜和营养不良性角膜的愈合百分比，并且在对照组或治疗组中均未观察到显着差异（未显示数据）。
分析眼库提供的正常和营养不良性角膜的供体信息（表1），以确定年龄，在Optisol中储存的天数，收集间隔的死亡，细胞密度和性别等特征是否与愈合相关。皮尔逊的相关系数（r）用于研究除性别以外的所有因素，该系数使用未成对的t检验来评估，以比较男性和女性之间的愈合情况。在所有情况下，r的绝对值均低于0.25，表明愈合与年龄，储存在Optisol中的天数，死亡与收集间隔或细胞密度之间的任何相关性都被认为可以忽略不计。男性和女性之间的愈合差异没有统计学意义（p = 0.53）。
与正常数据集类似，22个营养不良性角膜中的10个在至少一个时间点（通常是第3天）在连接到病变内染色区域的剥离区域外呈现明显的台盼染色 - 我们称之为外周染色的观察结果（图4A）。在这10个中，只有两个是对照角膜，其治疗的对应物没有表现出相同的效果。其余八个都是匹配的对，并且在同一个体的角膜之间表现出相似的严重程度。虽然正常角膜和营养不良性角膜的染色模式相当，但营养不良数据集中外周染色的频率更高，角膜阳性率为45%，而正常组为25%。 图4A 显示了一对被认为外周染色阳性的染色，因为病变外的染色区域在第6天的图像中与伤口边缘相遇并逐渐消退。在相应的茜素红图像中，外周台盼染色区域的细胞出现增大和异常形状，就像迁移到剥离区域的细胞一样，负染色与第14天台盼蓝存在的区域相关。尽管在整个培养期间大部分角膜受到影响，但所有10个角膜都部分或完全清除了染色的外围。此外，第14天治愈的最终百分比在正常范围内，分别对应于治疗组，除了一个角膜。异常值（0811L，如图 4A所示）返回负百分比愈合值，因为外周染色的残留物在第14天仍然连接到病变区域（图3A 和 图4A）。在 图4B的茜素红图像中捕获了第二种染色图案，称为远外周染色，但在整个培养期间在许多角膜的台盼蓝图像中也很明显（图4B）。这一观察结果的特征是边缘周围有一圈深色染色，表明内皮受损。尽管有这个术语，但这种模式在正常和营养不良的角膜中都很常见，以至于它们不被算作外周染色阳性。在这些图像中，对照角膜在第14天显示出更鲜艳和广泛的染色，尽管两种角膜在培养期早期具有相似的严重程度和染色模式。在治疗的角膜中还注意到似乎有更多数量的细胞，与对照相比，这些细胞看起来更紧凑和六边形，尽管这些观察结果没有定量测量。由于外围的曲率，定量分析中仅包括剥离区域内和紧邻周围的台盼染色。当对所有营养不良性角膜的染色百分比值进行平均时，外周染色的出现导致从第0天开始的初始增加，而不是在外周染色不太普遍的正常角膜中看到的稳定下降（图3B）。
通过共聚焦成像可视化的免疫组化显示ZO-1的半组织表达，ZO-1是CEC紧密连接的功能标志物，在病变边缘及其周围（图5），这种模式与茜素红染色相似（图2 和 图4）。在大多数营养不良性角膜中，ZO-1可见多态性和多形性;然而，这种观察结果可归因于它们的患病状态，并且在培养前对角膜进行镜面检查时，眼库注意到了这一点。在细胞向内迁移的治疗角膜病变区域内观察到无序的ZO-1表达，这也与茜素红模式一致。EdU合并细胞可以在病变边界周围和病变区域内看到控制和治疗的角膜（图5）。迁移CEC的模式也反映了台盼蓝的结果，在对照角膜中，大多数细胞在病变边缘的两个区域内被发现，而治疗角膜中的CEC可以在整个剥离区域看到（图2）。
在这项研究中，EdU标记作为定性措施进行，以证实增殖有助于愈合。然而，由于角膜肿胀阻止了在病变内和周围捕获一致，可复制的图像，因此无法系统地对包含EdU的细胞进行定量。作为替代物，在建立DSO模型之前进行的一项研究中进行的定量分析已被纳入，以证明eFGF-1（NM141）对增殖的影响（图6）。使用手术刀将正常供体角膜切成四分之一，并在EdU存在下培养，有或没有eFGF1（NM141）48小时，如前所述（Eveleth，2020）16。Hoechst 33342和EdU标记细胞的成像和随后分析分别在四分之一的未受干扰的中间区域和边缘区域进行，在角膜被切割的三个区域内。在中区，在所分析的10个角膜中，掺入EdU的细胞百分比很低且高度可变。平均而言，与对照组（1.8%±2.9%）相比，接受eFGF1（NM141）治疗的季度在中间区的EdU掺入水平较高（4.1%±7.9%），尽管这种差异在统计学上并不显着（p = 0.239）。在伤口边缘，与对照区相比（10%±9.6%，p = 0.012），平均时，用eFGF1（NM141）刺激的治疗季度显示出显着更高的EdU掺入率（18.1%±11.5%）。
表1：本研究中使用的22个营养不良性角膜和20个正常角膜的供体信息，以及以前用于EdU定量的10个正常角膜的供体信息。请按此下载此表格。
图2：Descemet剥离后角膜的重要染料染色。 将营养不良的人角膜从Descemet膜的中心4 mm剥离，并用或不与eFGF1（NM141）（100ng / mL）孵育14天。在第0天，第3天，第6天，第9天，第12天和第14天通过台盼蓝染色观察病变。CEC边界在第14天通过茜素红染色可视化。 请点击此处查看此图的大图。
图3：当用eFGF1（NM141）培养时，营养不良的人角膜显示出显着更大的DSO愈合。 （A）通过使用ImageJ测量第14天的染色区域并将其与第0天染色的百分比进行比较来确定愈合百分比。（B）随着时间的推移，染色的平均百分比显示正常角膜的一致下降，而由于外周染色的患病率较高，在第3天达到营养不良角膜的峰值。 请点击此处查看此图的大图。
图4：萎缩性角膜的重要染料染色与外周染色。 （A）可以看到完整的Descemet膜的台盼染色向中心推进，然后在对照角膜和治疗角膜中随着时间的推移而清除。（B）边缘周围的茜素模式代表了在许多供体角膜中看到的外周损伤和内皮无序重建的典型观察 - 在这种情况下是营养不良的。 请点击此处查看此图的大图。
图5：eFGF1（NM141）在剥离的营养不良性角膜中刺激CECs的迁移和增殖。 Descemet剥离的角膜的共聚焦显微照片染色为ZO-1（红色），EdU（绿色）和Hoechst 33342（蓝色）。虚线表示病变边缘，图像左侧是剥离区域，右侧是完整的Descemet膜。 请点击此处查看此图的大图。
图6：使用手术刀从正常角膜中定量增殖细胞，并在含有或不含eFGF-1（NM141）的EdU培养基中孵育48小时。 在未受干扰的中区和沿着切割边缘对四分之一进行一式两份的成像，并平均计数以确定在中边缘区域掺入EdU的细胞的百分比。图摘自 《眼部药理学与治疗学杂志》，经许可使用16. 请点击此处查看此图的大图。
补充图1：当用eFGF1（NM141）培养时，正常人角膜显示出显着更大的DSO愈合。 ImageJ用于测量染色区域并确定%愈合。 请点击此处下载此文件。
Discussion
许多眼科医生担心向患者推荐DSO有两个主要原因：1）漫长的愈合过程，以及2）缺乏数据（DSO是眼科手术领域的新概念）。我们提出的研究对于缓解这两个问题都非常有用。根据这项研究和其他研究的数据，FDA已经批准了一项2期临床试验，其中eFGF1（NM141）将以不同的给药时间表施用于接受DSO17的患者。
上述方法在Soh等人进行的研究之后建模，其中在划伤和剥离的伤口18中评估了使用和不使用ROCK抑制剂Y-27632的角膜内皮愈合。虽然Y-27632加速了内皮再生，Descemet的膜仍然完好无损，但即使经过治疗，在剥离的伤口中也没有发现实质性的愈合。使用类似的剥离技术，然后进行有或没有eFGF1（NM141）的治疗，我们发现的观察结果与Soh及其同事的观察结果不一致。在第14天，许多治疗角膜中没有台盼蓝染色，并且在改造后的内皮层中存在ZO-1阳性紧密连接，这表明完整的屏障，CEC自然功能的一部分，在正常和营养不良的角膜中都得到了恢复。虽然在这项研究中没有量化，但剥离区域及其周围EdU阳性细胞的存在也表明增殖是一种愈合机制，我们之前已经建立的可以在受伤的角膜16中受到eFGF1（NM141）的刺激。统计分析显示，eFGF1 （NM141） 治疗后 DSO 的愈合效果显著提高，平均在 14 天时间点是对照角膜的两倍以上。虽然个体之间的愈合率略有不同 - 供体角膜的典型特征 - 结果在大样本量上的可复制性也证明了一种高度可测量的方法。据我们所知，文献中没有其他 离体 Descemet剥离模型的例子。
该协议本身的关键组成部分对研究DSO的其他研究人员很有价值，是使用台盼蓝检测裸基质，以及用于测量染色区域的图像处理技术。台盼蓝通常用于眼科手术，特别是当使用Descemet的膜来检测无活性细胞并有助于组织的可见性时。该方案中包含的染色时间点允许有效的重复染色，而不会使角膜过度暴露于台盼蓝，因为它已被证明在高浓度19下对CEC有毒。茜素红和免疫组化证实，所有角膜染色面积在14天内减少，是迁移CEC的结果，展示了一种简单且可重复的测量愈合的方法。使用ImageJ的颜色阈值菜单，多个分析师收集的数据标准偏差始终低于1%（数据未显示）。虽然替代程序可以执行类似的操作，但ImageJ是一个开源软件，能够产生准确的面积测量值来跟踪愈合。
然而，我们发现剥离方案的一个方面既是伤口形成的必要条件，又阻碍了整个愈合过程。使用锋利的30 G针头沿着活检冲孔留下的标记对Descemet的膜进行评分，可以创建光滑的圆形伤口，临床医生注意到这一点可以支持更快的愈合10。同时，这一步会损害角膜，因为它会在基质纤维中产生撕裂，导致基质细胞死亡，阻碍内皮细胞向伤口边缘的迁移，并诱导结节的形成，导致术后水肿更持久20。执行DSO的临床医生通常使用反向Sinskey钩来启动伤口，但是没有任何眼内压保持角膜绷紧，该工具在 离体 模型中效果较差。能够在不损坏底层基质的情况下撕裂Descemet膜的替代工具将改善该方案，例如Macsai和Shiloach10推荐的灌溉和抽吸手机。需要进一步的实验来确定该技术是否与 离体 模型兼容。
离体模型固有的一个挑战是伤口周围区域频繁发生CEC死亡，特别是在营养不良性角膜中。这种偶尔遮挡伤口区域的定量，因为颜色阈值工具的准确性变得更加有限，因为染色区域延伸到角膜中心之外，其曲率导致光分布不均匀。然而，这些可变测量主要发生在外周染色逐渐消退之前的早期时间点，因为受损的CEC被清除，邻近的细胞被拉伸，迁移或增殖以取代它们。到最后的14天时间点，染色区域已经定位回角膜中心，所有图像都是可测量的。Soh等人以相当的频率进行了类似的观察，其中14个正常角膜中有5个在18个培养期早期呈现出他们所谓的“过早培养失败”（PCF）。虽然随着时间的推移，我们的角膜损伤发生了逆转，但在他们的情况下却是永久性的，这可能归因于他们的方法需要伤害更大面积的角膜。在营养不良性角膜中更普遍的外周台盼染色的观察结果可能表明，营养不良性角膜比健康角膜更容易发生内皮细胞死亡。虽然这种细胞死亡的确切原因尚未阐明，但我们认为这个问题不太可能与体内的人类角膜有关。据我们所知，DSO的任何临床案例研究中均未报道外周内皮损伤，这表明这种现象是供体角膜6，8，10，11，21培养的特有。除了两种仅对照角膜染色的实例外，所有外周染色的观察结果都是配对的，因此原因不太可能是暴露于eFGF1（NM141）。然而，在这些情况下，治疗可能提供了对损伤的保护作用，否则这些损伤会引起两个角膜的外周染色。需要对这一假设进行进一步调查。
这种方法的另一个限制是采购代表DSO所针对的FECD表型的供体角膜。任何类型的供体角膜都是稀缺的，因此需要手术来避免使用供体组织。就我们的目的而言，唯一可用的角膜是那些由于各种原因而无法移植的角膜。眼库根据包括是否存在内脏、低或不可测量的 ECD 和不规则的 CEC 形态等标准，将这些角膜进一步分类为正常或营养不良。在接受来自眼库的组织之前确认营养不良诊断也几乎是不可能的，因为大多数捐赠者的病史不包括过去的眼史，提供的唯一信息是ECD值，技术人员的笔记，以及在某些情况下具有代表性的镜面图像。本研究获得的营养不良性角膜在培养期完成后进行的共聚焦显微镜检查中未显示融合的中央内脏，这表明它们可能代表FECD的“早期”阶段。我们预计这不会对研究的影响产生重大影响，因为DSO的目的是去除肠道的融合区域，允许健康的外周细胞向内迁移。
该方法提供了一种高度适用且可重复的技术来评估可能影响CEC增殖和迁移的试剂。该模型具有几个特征，使其比涉及培养CEC 的体外 模型更具生理相关性，即使接种到人角膜组织移植物22，23，24上也是如此。首先，要受刺激的CEC与患者眼睛中存在的CEC完全一样处于单层中，并且像临床DSO之后一样在角膜基质上迁移。所讨论的基质来自与CEC相同的患者，从而控制潜在的FECD相关基质差异。在培养过程中，无需排卵，解离和扩增CEC的培养物，从而带来内皮至间充质过渡（EnMT）的相关挑战和潜力。所描述的方案本身与临床DSO程序非常相似。虽然它绕过了培养和扩张步骤，但这种方法确实具有研究持续时间受到角膜肿胀的限制，因为上皮层没有维持。这阻碍了我们研究已经迁移到剥离区域的CEC的形态，从而不清楚它们最终是否会在此模型中重新排列成六边形阵列。Garcin等人用他们的活性储存机（ASM）开发了一种潜在的解决方案，该装置显示角膜在培养物中保持长达3个月，水肿明显低于传统器官培养物中维持的水肿25。这样的设备可能有助于复制和扩展这项工作。
该模型在测试其他伤口愈合疗法（例如，ROCK抑制剂），评估手术技术的修改以及比较不同供体群体或疾病阶段的愈合方面具有潜在的实用性。我们希望这项研究与临床试验数据相结合，鼓励临床医生将DSO视为符合条件的FECD患者的宝贵治疗选择。
Disclosures
DDE，SP，GD和JW是Trefoil Therapeutics，Inc.的员工并持有股权，DDE是涵盖eFGF1（NM141）的专利的发明人。
Acknowledgments
这项工作的资金得到了Trefoil Therapeutics和NIH NCATS TRND CRADA #2016-04的支持。作者要感谢Tony Wong的组织病理学建议和服务，加州大学圣地亚哥分校尼康成像中心使用共聚焦显微镜，以及Natalie Afshari博士和Marian Macsai博士对手术技术的建议。此外，作者还感谢眼睛捐赠者和眼库提供角膜。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
| 0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
| 0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
| 10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
| 12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
| 15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| 2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
| 310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
| 5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
| 6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
| Analytical balance | Sartorious | R200D | |
| Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
| Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
| Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
| Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
| Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
| Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
| Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
| Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
| Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
| Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
| ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
| Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
| Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
| Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
| L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
| Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
| Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
| N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
| Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
| Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
| Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
| Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
| Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
| Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
| Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
| Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
| Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
| Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
| Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
| Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
| Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
| Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
| Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
| VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |
References
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