Summary
Descemet's Stripping Only é um procedimento experimental em que pacientes com gutae córnea central resultante da Distrofia Corneal Endotelial De Fuchs têm a membrana de Descemet despojada para células periféricas para regenerar a camada endotelial. Apresentamos nova metodologia simulando DSO em córneas humanas distróficas ex vivo com cura acelerada estimulada pelo eFGF1 (NM141).
Abstract
A Distrofia Córnea Endotelial Fuchs (FECD) resulta de células endoteliais de córneas disfuncionais (CECs) e atualmente é tratada por transplante de toda a córnea ou membrana de Descemet. Desenvolvimentos recentes na cirurgia ocular estabeleceram o Descemet's Stripping Only (DSO), uma técnica cirúrgica na qual um círculo central da membrana de descemet gutae-denso é removido para permitir a migração de CECs para o estroma liso, restaurando função e visão para a córnea. Embora essa opção de tratamento potencial seja de alto interesse no campo da pesquisa oftálmica, nenhum modelo ex vivo bem sucedido de DSO foi estabelecido e os dados clínicos são limitados. Este trabalho apresenta um novo modelo de cicatrização de feridas simulando DSO em córneas doadoras humanas. Utilizando essa abordagem para avaliar a eficácia do FGF1 (NM141) projetado pelo homem, descobrimos que o tratamento acelerou a cicatrização através da estimulação da migração e proliferação de CECs. Esse achado foi confirmado em 11 pares de córneas humanas com sinais de distrofia relatados pelos bancos oculares, a fim de verificar se esses resultados podem ser replicados em pacientes com Distrofia de Fuchs, como população-alvo do procedimento DSO.
Introduction
A Distrofia Corneal Endotelial Fuchs (FECD) é uma doença caracterizada pela perda da função da bomba em células endoteliais da córnea (CECs) e pelo acúmulo excessivo de colágeno e outras proteínas da matriz extracelular na superfície da membrana de Descemet, formando a caldéiada córnea 1. O único tratamento conhecido para FECD é a ceratoplastia endotelial em formas variadas, todas elas vêm com risco de rejeição e perda celular endotelial2. Embora os avanços na cirurgia oftalmológica tenham permitido que esses procedimentos se tornassem menos invasivos ao longo do tempo, qualquer forma de transplante vem com o risco de rejeição e possibilidade de uso de esteroides ao longo da vida, um tratamento com seus próprios eventos adversos concomitantes. Além disso, a escassez global de tecidos doadores é tal que apenas uma córnea doadora está disponível para cada 70 pacientes necessitados3. Diante desses desafios, pesquisadores e médicos estão explorando métodos cirúrgicos que evitam completamente a necessidade de tecido doado. Uma dessas técnicas experimentais é o Descemet's Stripping Only (DSO) ou Descemetorhexis sem Ceraatoplastia Endotelial (DWEK), em que pacientes com GUTAE localizados ao centro da córnea têm um círculo central de 4 mm da membrana de Descemet descascada sem colocação de enxerto. A remoção da gutae incentiva as células periféricas saudáveis a migrarem para dentro e reformarem a monocamada endotelial, eventualmente revertendo o edema edema estrobo e melhorando a visão. O conceito foi originalmente descrito em uma série de estudos de caso em que os pacientes foram submetidos a cirurgias complicadas pelo descolamento da membrana de Descemet, mas a repopulação cec ainda ocorreu 4,5,6,7. Embora existam muitas vantagens para este método, o processo de cura é longo e inconsistente, pois alguns pacientes necessitam de transplante de resgate se nenhuma cura for vista nos meses seguintes à cirurgia8. Por essas razões, um medicamento que estimula a migração mais rápida e a proliferação de CECs pode ser benéfico no processo de recuperação de pacientes com FECD que foram submetidos ao DSO.
Vários estudos recentes avaliaram os inibidores do ROCK como um tratamento suplementar para pacientes submetidos ao DSO, e descobriram que os pacientes tratados se recuperaram mais rapidamente e apresentaram densidades celulares endoteliais centrais (ECD) mais altas do que os do DSO apenas no grupo 9,10,11. No entanto, devido a pequenos tamanhos amostrais e diferenças entre regimes de dosagem, mais dados são necessários para entender melhor a eficácia dos inibidores de ROCHA neste cenário.
Fatores de crescimento do fibroblasto também têm sido mostrados para estimular a regeneração do endotélio córnea tanto in vitro com CECs bovinos, quanto in vivo em córneas felinas12,13. eFGF1 (NM141) é uma versão projetada do FGF-1 contendo várias substituições de aminoácidos para estabilizar a molécula, em oposição ao FGF-1 nativo, que tem uma meia-vida muito mais curta14,15. Já demonstramos anteriormente a capacidade do eFGF1 (NM141) de estimular a proliferação de CECs ex vivo em córneas humanas esquartejadas16. Este estudo buscou melhorar esse trabalho estabelecendo o primeiro modelo ex vivo bem sucedido de DSO em córneas normais e distróficas para determinar se tratamentos aditivos como o eFGF1 (NM141) aceleram a cicatrização nesta aplicação.
Protocol
Este trabalho utilizou espécimes existentes sem identificação de sujeitos e está isento da aprovação do IRB sob 45 CFR 46.101(b)(4).
Córneas de doadores humanos foram obtidas de vários bancos oculares em todo os EUA (ver Tabela de Materiais). As córneas foram julgadas individualmente distróficas pelos bancos oculares com base em achados como gutae, pleomorfismo, polimegatismo e/ou baixa ECD após avaliação especulativa. A Figura 1 apresenta a coloração do Trypan Blue na córnea durante a criação da ferida, imediatamente após a desmontagem, e após 2 semanas na cultura.
Figura 1: Diagrama representando córnea durante a criação da ferida, imediatamente pós-descascamento, e após 14 dias na cultura como visualizado por Trypan Blue. A redução da área manchada entre esses pontos de tempo foi medida para determinar o nível de cura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Criação de feridas
- Usando fórceps estéreis, remova a córnea da mídia e enxágue em 1x PBS para remover resíduos de mídia e detritos celulares. Depois de enxaguar, coloque o lado endotelial da córnea na tampa de uma placa de Petri.
- Pipeta 30 μL de Trypan Blue em um prato de poço. Mergulhe um novo soco de biópsia de 4 mm no Trypan Blue e toque em qualquer excesso.
- Usando ambas as mãos, posicione o soco acima do centro da córnea e abaixe-o direto para a superfície endotelial, aplicando pressão mínima.
- Sem mudar a posição ou pressão sobre a córnea, mude o soco para uma mão e busque fórceps com a mão recém-liberada. Use os fórceps para segurar a córnea no lugar enquanto torça suavemente o soco da biópsia cerca de 90° para frente e para trás várias vezes.
- Levante o soco direto da córnea e reserve.
- Enxágüe mais uma vez em 1x PBS para remover o excesso de Tripano Azul.
2. Descemet está descascando
- Transfira córnea em uma tampa de placa de Petri para um escopo de dissecação.
NOTA: Não deixe a córnea seca por mais de 5 minutos. Se for necessário mais tempo para concluir o processo, enxágue novamente em 1x PBS para reidratar o endotélio. - Segurando a córnea no lugar com fórceps curvos, marque a membrana de Descemet arrastando levemente a ponta de uma agulha afiada de 30 G ao longo do anel de Trypan Blue deixado pelo soco da biópsia. Use pressão mínima para evitar interromper o estroma subjacente.
- Com um gancho Sinskey, use movimentos suaves de colher para levantar e descascar a membrana de Descemet ao redor da borda da ferida, trabalhando em direção ao centro da lesão.
NOTA: A membrana de Descemet deve vir com muito pouca resistência. Se a dificuldade for experimentada, é provável que se puxe para cima stroma. Se isso acontecer, comece de novo, levantando-se de um novo ponto ao longo da borda da ferida. - Uma vez que a maior parte da membrana de Descemet tenha sido separada do estroma, use fórceps gorovoy para remover a membrana e reserve.
- Examine a área despojada para quaisquer pedaços restantes de membrana e remova com fórceps gorovoy.
3. Mancha azul trypan
NOTA: Após a desmontagem de Descemet, colori a córnea com Trypan Blue para visualizar a área da ferida.
- Devolva a córnea em uma tampa de placa de Petri ao armário de biossegurança e enxágue em 1x PBS contendo 0,01% (w/v) CaCl2 e MgCl2 para remover detritos celulares e facilitar a adesão apertada dos CECs restantes à membrana intacta do Descemet.
- Coloque córnea em um prato de poço e pipeta 30 μL de Trypan Blue na camada endotelial por 30 s.
- Use fórceps para balançar suavemente a córnea para garantir que toda a superfície endotelial esteja coberta.
- Enxágüe o excesso de Trypan Blue em 1x PBS com 0,01% (w/v) CaCl2 e MgCl2 e imagem a córnea manchada sob um microscópio dissecando para o ponto de tempo do dia 0.
- Certifique-se de que a córnea é equilibrada de tal forma que a luz é transmitida uniformemente por toda parte e o posicionamento é replicável entre os pontos de tempo.
NOTA: As fórceps podem ser usadas para segurar a córnea no lugar durante a imagem, se necessário.
- Certifique-se de que a córnea é equilibrada de tal forma que a luz é transmitida uniformemente por toda parte e o posicionamento é replicável entre os pontos de tempo.
4. Período cultural
- Córneas de cultura em uma placa de seis poços contendo mídia de baixo soro consistindo de OptiMEM; 1x insulina, transferrina e selênio; 1x antibiótico/antimíctico; 0,02 mg/mL CaCl2; 0,2 mg/mL ácido ascórbico; e 0,8% de soro bovino fetal inativado. Cultura a córnea esquerda em 8 mL apenas de mídia de baixo soro, e a córnea direita em 8 mL de mídia de baixo soro complementada com 100 ng/mL eFGF1 (NM141).
- Incubar a 37 °C com 6% de CO2 durante 14 dias com alterações diárias na mídia.
- Repita o procedimento de coloração trypan azul nos dias 3, 6, 9, 12 e 14, e imagem cada córnea imediatamente após a coloração. Certifique-se de manter as configurações da câmera consistentes em todos os pontos de tempo.
- No dia 12, adicione 10 μM EdU ao controle e à mídia complementada e eFGF1 (NM141) e incubar por 48 h para rotular células proliferadoras. Renovar a mídia com a EdU adicionada novamente no dia 13.
- No dia 14, 48 h após a adição de EdU, mancha trypan e córneas de imagem como de costume, exceto em vez de 1x PBS com CaCl2 e MgCl2, use pbs simples 1x para enxaguar para evitar que o cálcio interaja com a mancha vermelha de Alizarin.
5. Mancha vermelha alizarin
- No dia 14, prepare 5% Alizarin Red em solução salina de 0,9%.
NOTA: O Vermelho Alizarin não se dissolverá completamente em solução salina. Ao combinar, solução de vórtice e rocha por pelo menos 1h. Vórtice mais uma vez e filtro antes de usar para remover partículas não resolvidas. - Uma vez que a coloração e a imagem do Trypan tenham sido concluídas, transfira córneas para um prato de poço e adicione 200 μL Alizarin Red à superfície endotelial de cada córnea.
- Manche por 2 minutos, depois enxágue cada córnea em uma placa de Petri de 1x PBS para remover o excesso de Alizarin Red antes de colocar em uma placa de seis poços pré-preenchida com 8 mL de 1x PBS para duas lavagens de 5 minutos.
- Após a segunda lavagem, imagem a área despojada de cada córnea sob um microscópio dissecando.
NOTA: Ao contrário da imagem do Trypan, as córneas podem ser deixadas em 1x PBS para a imagem da mancha de Alizarin para evitar que elas sequem durante o processo.
6. Fixação e permeabilização
- Uma vez que as imagens de Alizarin tenham sido capturadas, transfira córneas para uma placa de 12 poços e lave em 4 mL de 1x PBS contendo 0,05% Tween-20 (PBS-T) por 30 minutos para remover quaisquer partículas do tecido antes da fixação.
- Fixar córneas em 4 mL de 4% PFA por 30 min a temperatura ambiente.
- Células permeabilizes por 5 min em 4 mL de 1x PBS contendo 1% Triton X-100, em seguida, lavar três vezes em 4 mL de 1x PBS simples por 30 minutos cada.
7. Imunohistoquímica
- Bloqueie córneas por 1 h a 37°C em 4 mL de 1x PBS contendo 2% de albumina de soro bovino e 2% de soro de cabra.
- Incubar em 1 mL de solução de bloqueio contendo 2,5 μg/mL anticorpos do camundongo primário anti-ZO-1 por 1 h a 37°C, depois lave três vezes em 4 mL de 1x PBS por 30 min cada.
NOTA: A placa pode ser inclinada durante a coloração de anticorpos para minimizar o volume de reagentes necessários. Apenas certifique-se de que toda a córnea está completamente submersa na solução de anticorpos. - Realize a reação EdU Click-iT usando um coquetel contendo ácido ascórbico de 0,88 mg/mL, 0,26 mg/mL CuSO4 e 2,5 μM Alexa Fluor 488 azide.
- Prepare componentes de reação
- Adicione 500 μL de 1x PBS a 88 mg de ácido ascórbico e vórtice até dissolver.
- Adicione 840 μL de água deionizada a 44 mg de CuSO4 e vórtice até dissolver.
- Prepare o coquetel adicionando os seguintes reagentes a 6 mL de 1x PBS nesta ordem, invertendo tubo para misturar após cada adição: 30 μL de solução de ácido ascórbico, 30 μL de solução CuSO4 e, em seguida, 15 μL de Alexa Fluor 488
NOTA: Uma vez preparada, esta solução é sensível à luz. Para o restante do protocolo, as córneas devem ser protegidas da luz sempre que possível. - Adicione 1 mL de coquetel de reação EdU a cada córnea e reaja por 1h à temperatura ambiente.
- Prepare componentes de reação
- Adicione 4 mL de 10 μg/mL Hoechst 33342 a cada córnea e reaja por 2 minutos à temperatura ambiente, depois lave três vezes em 1x PBS-T por 30 minutos cada.
- Incubar em 1 mL de solução de bloqueio contendo 2 μg/mL Alexa Fluor 555 rotulada anti-rato de cabra IgG por 1 h a 37°C, em seguida, lavar três vezes em 1x PBS-T por 30 min cada.
- Armazene córneas a 4 °C em 4 mL de 1x PBS com 1% anti/anti, 0,1% ciprofloxacina e 0,1% anfotericina B para evitar o crescimento microbiano.
- Ao realizar imagens confocal, monte córneas inteiras em 200 μL de meio de montagem em lâminas de vidro com deslizamento de tampa colado para achatar.
8. Análise de imagem trypan
- Realize todas as análises de imagem usando o software de código aberto ImageJ do NIH. Abra uma imagem usando o Arquivo > Abra e clique em Imagem > Ajuste > limite de cores.
- Use os controles deslizantes "Hue" para abranger apenas a faixa azul e ajustar o controle deslizante superior "Brilho" até a esquerda para incluir mais da área manchada.
NOTA: Se esta ação fizer com que partes da imagem que não estão manchadas de Trypan sejam incluídas, o controle deslizante "Brilho" pode ser devolvido ao seu nível original. - Ajuste lentamente o controle deslizante superior "Saturação" até que o limiar delineie com precisão a área manchada.
NOTA: É útil ter uma cópia da imagem original aberta para se referir durante este processo. - Clique no botão Selecionar dentro do menu de limiar de cor e use a ferramenta de pincel de seleção para desesse selecionar áreas fora da ferida que foram captadas.
- Clique em Analisar > Medida para relatar a área manchada em pixels.
- Dese selecione todos usando Editar > Seleção > Selecionar Nenhum e usar a ferramenta de seleção oval para encaixar o limbus o mais próximo possível, em seguida, clique em Analisar > Medida para relatar a área da córnea em pixels.
NOTA: O brilho pode ser captado temporariamente para ajudar na visualização do limbus se esta parte da imagem estiver muito escura. - Registos da área e divida a área manchada pela área de toda a córnea, em seguida, multiplique por 100 para calcular a porcentagem manchada.
- Repita este processo mais duas vezes para cada imagem e, em seguida, tome a média das três medidas.
9. Análise Estatística
- Uma vez analisadas todas as imagens, divida a média percentual manchada no dia 14 pelo percentual manchado no dia 0 para determinar a área residual não zerada. Subtraia esse valor de 100% para calcular o percentual da área despojada curada ao longo de 14 dias.
- Use um teste t emparelhado para comparar valores percente curados entre grupos de controle e tratamento.
Representative Results
Este experimento foi inicialmente realizado em 10 pares de córneas normais de pesquisa, pois elas estão mais prontamente disponíveis. Uma vez que o método foi demonstrado ser bem sucedido, o estudo foi replicado em 11 pares de córneas distróficas rotuladas como tal por bancos oculares com base na avaliação especulativa - para estudar os efeitos do eFGF1 (NM141) em córneas representativas da população de pacientes FECD. Para maior relevância clínica, os números incluídos no presente trabalho representam dados coletados de córneas distróficas, salvo observação em contrário.
Após simular o desfecho cirúrgico do DSO, a coloração trypan azul foi realizada e repetida ao longo do período de cultura de 14 dias, e a redução da coloração positiva quantificada para avaliar a cicatrização da ferida (Figura 2). A coloração alizarina vermelha também foi realizada no dia 14 para delinear as bordas das células. Áreas vermelhas escuras sem padrão claro visível (referida a manchas negativas a seguir) apareceram consistentemente dentro da seção não cicatrizada da lesão e em outras áreas da córnea onde as células foram presumidamente danificadas ou ausentes. As áreas que mancharam positivo para o Trypan Blue no dia 14 corresponderam bem com a coloração negativa de Alizarin Red (Figura 2). Todas as córneas distróficas tratadas com eFGF1 (NM141) apresentaram maior cicatrização no dia 14 em comparação com a companheira não tratada. Em média, as córneas tratadas demonstraram 91% de cura, contra 38% nas córneas de controle, e essa diferença foi estatisticamente significante (p < 0,001) (Figura 3A). Isso é comparável aos resultados obtidos a partir de 20 córneas normais, onde os controles mostraram uma média de 32% de cura e córneas tratadas atingiram 81%, o que novamente foi estatisticamente significativo (p < 0,001) (Figura Suplementar 1). O percentual curado foi comparado entre córneas normais e distróficas usando dois testes t amostrais assumindo variância igual, e nenhuma diferença significativa foi observada nos grupos de controle ou tratamento (dados não mostrados).
Foram analisadas informações de doadores fornecidas pelos bancos oculares (Tabela 1) para córneas normais e distróficas para determinar se características como idade, dias armazenados em Optisol, morte ao intervalo de coleta, densidade celular e sexo se correlacionam com a cura. O coeficiente de correlação de Pearson (r) foi utilizado para investigar todos os fatores, exceto o sexo, que foi avaliado usando um teste t não pago para comparar a cicatrização entre homens e mulheres. O valor absoluto de r foi inferior a 0,25 em todos os casos, indicando que quaisquer correlações entre cura e idade, dias armazenados em Optisol, óbito ao intervalo de coleta ou densidade celular foram consideradas insignificantes. A diferença na cicatrização entre machos e fêmeas não foi estatisticamente significante (p = 0,53).
Semelhante ao conjunto de dados normal, 10 das 22 córneas distróficas apresentaram manchas notáveis de Trypan fora da área despojada conectada à área manchada dentro da lesão em pelo menos um ponto de tempo (geralmente dia 3)- uma observação que chamamos de coloração periférica (Figura 4A). Dessas 10, apenas duas eram córneas de controle cujas contrapartes tratadas não apresentaram o mesmo efeito. Os oito restantes eram todos pares combinados e apresentados com gravidade semelhante entre córneas do mesmo indivíduo. Embora os padrões de coloração tenham sido comparáveis entre córneas normais e distróficas, a frequência de coloração periférica foi maior no conjunto de dados distróficos com 45% das córneas positivas, em comparação com 25% no grupo normal. A Figura 4A mostra um par considerado positivo para coloração periférica, pois a área manchada fora da lesão atingiu a borda da ferida nas imagens do dia 6 e recuou gradualmente. Nas imagens seguintes de Alizarin Red, as células em áreas com coloração periférica do Trypan apareceram ampliadas e de forma anormal, assim como as células que migraram para a área despojada, e a coloração negativa correlacionada com as áreas onde o Trypan Blue estava presente no dia 14. Apesar da grande parte da córnea afetada durante todo o período cultural, a limpeza parcial ou completa da periferia manchada ocorreu em todas as 10 córneas. Além disso, o percentual final curado no dia 14 estava dentro da faixa normal, respectivamente para o grupo de tratamento, para todos, exceto uma córnea. O outlier (0811L, retratado na Figura 4A) devolveu um valor negativo por cento curado devido aos remanescentes de manchas periféricas que ainda se conectavam à área da lesão no dia 14 (Figura 3A e Figura 4A). Um segundo padrão de coloração, referido como mancha periférica, foi capturado nas imagens vermelhas de Alizarin da Figura 4B, mas também foi aparente em imagens do Trypan Blue durante todo o período de cultura em muitas córneas (Figura 4B). Esta observação é caracterizada por um anel de manchas escuras ao redor do limbus, indicando endotélio comprometido. Apesar do termo, esse padrão era tão comum tanto em córneas normais quanto distróficas que não foram contadas como positivas para a coloração periférica. Nessas imagens, a córnea de controle mostrou manchas mais vibrantes e extensas no dia 14, apesar de ambas as córneas possuírem gravidade e padrão de coloração semelhantes no início do período cultural. Também foi observado na córnea tratada um número aparentemente maior de células, que pareciam mais compactas e hexagonais em comparação com o controle, embora essas observações não fossem medidas quantitativamente. Devido à curvatura na periferia, apenas a mancha de Trypan dentro e imediatamente ao redor da área despojada foi incluída na análise quantitativa. Quando os valores manchados por cento foram mediados em todas as córneas distróficas, o surgimento de manchas periféricas resultou em um aumento inicial a partir do dia 0, em oposição à diminuição constante observada nas córneas normais, onde a coloração periférica foi menos prevalente (Figura 3B).
A imunohistoquímica visualizada por imagens confocal revela a expressão semi-organizada do ZO-1, um marcador funcional de junções apertadas de CEC, dentro e ao redor da borda da lesão (Figura 5), um padrão igualmente evidenciado pela coloração vermelha de Alizarin (Figura 2 e Figura 4). Pleomorfismo e polimegatismo são visíveis pelo ZO-1 na maioria das córneas distróficas; no entanto, essa observação pode ser atribuída ao seu estado doente e foi notada pelo banco ocular após o exame especular das córneas antes da cultivo. A expressão ZO-1 desorganizada é observada dentro da área de lesão das córneas tratadas onde as células haviam migrado para dentro, também consistente com os padrões vermelhos de Alizarin. As células incorporadas à EdU podem ser vistas ao redor da borda da lesão e dentro da área lesionada em córneas de controle e tratamento (Figura 5). O padrão de CECs migrados também reflete os resultados do Trypan Blue, onde no controle córneas a maioria das células foram encontradas dentro de dois campos da borda da lesão, enquanto ceas em córneas tratadas podem ser vistas em toda a área despojada (Figura 2).
A rotulagem edu foi realizada como medida qualitativa neste estudo para confirmar que a proliferação contribuiu para a cura. No entanto, a quantificação das células que incorporam a EdU não pôde ser realizada sistematicamente devido ao inchaço da córnea impedindo que imagens consistentes e replicáveis fossem capturadas dentro e ao redor da lesão. Como substituto, a análise quantitativa realizada em estudo realizado antes da criação do modelo DSO foi incluída para demonstrar os efeitos do eFGF-1 (NM141) na proliferação (Figura 6). Córneas normais de doadores humanos foram cortadas em trimestres usando um bisturi e cultivadas na presença de EdU, com ou sem eFGF1 (NM141) por 48 h, conforme descrito anteriormente (Eveleth, 2020)16. A imagem e a análise subsequente das células hoechst 33342 e edu foram realizadas separadamente na zona média não perturbada dos quartos e na zona de borda, dentro de três campos de onde a córnea foi cortada. Na zona média, o percentual de células que incorporam a EdU foi baixo e altamente variável entre as 10 córneas analisadas. Em média, os trimestres tratados com eFGF1 (NM141) apresentaram níveis mais elevados de incorporação da EdU na zona média (4,1% ± 7,9%) em comparação com os controles (1,8% ± 2,9%), embora essa diferença não tenha sido estatisticamente significante (p = 0,239). Na borda da ferida, os trimestres tratados estimulados com eFGF1 (NM141) apresentaram taxas significativamente maiores de incorporação da EdU quando média (18,1% ± 11,5%) em comparação com os trimestres de controle (10% ± 9,6%, p = 0,012).
Tabela 1: Informações do doador para 22 córneas distróficas e 20 normais utilizadas neste estudo, bem como 10 córneas normais utilizadas anteriormente para a quantitação da EdU. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Figura 2: Mancha de corante vital das córneas pós-descemet. Córneas humanas distróficas foram despojadas da membrana central de 4 mm de Descemet e incubadas com ou sem eFGF1 (NM141) (100 ng/mL) por 14 dias. As lesões foram visualizadas pela mancha Trypan Blue nos dias 0, 3, 6, 9, 12 e 14. As fronteiras do CEC foram visualizadas pela mancha de Alizarin Red no dia 14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Córneas humanas distróficas mostram significativamente maior cura do DSO quando cultivadas com eFGF1 (NM141). (A) Por cento de cura foi determinada medindo a área manchada no dia 14 usando ImageJ e comparando-a com a porcentagem manchada no dia 0. (B) A média de porcentagem manchada grafizada ao longo do tempo mostra uma diminuição consistente das córneas normais enquanto atinge o pico no dia 3 em córneas distróficas devido à maior prevalência de manchas periféricas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração de corante vital de córneas distróficas com coloração periférica. (A) A coloração do Trypan da membrana intacta do Descemet pode ser vista avançando em direção ao centro, e depois clareando ao longo do tempo tanto no controle quanto nas córneas tratadas. (B) Os padrões de alizarina ao redor do límbico representam uma observação típica de danos periféricos e restatalização desorganizada do endotélio visto em muitas córneas doadoras - neste caso distrófica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Estimulação da migração e proliferação de CECs por eFGF1 (NM141) em córneas distróficas despojadas. Micrografos confocal das córneas despojadas de Descemet manchadas para ZO-1 (vermelho), EdU (verde) e Hoechst 33342 (azul). A linha pontilhada representa a borda da lesão com a área despojada no lado esquerdo da imagem e a membrana intacta do Descemet à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Quantitação de células proliferadoras de córneas normais esquartejadas usando um bisturi e incubadas em meios contendo EdU com ou sem eFGF-1 (NM141) por 48 h. Os quartos foram retratados em triplicado na zona média não perturbada e ao longo da borda de corte, e a contagem média foi mediada para determinar a porcentagem de células que incorporam EdU nas zonas média e superior. Figura modificada do Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, usado com permissão16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Córneas humanas normais apresentam uma cicatrização significativamente maior do DSO quando cultivada com eFGF1 (NM141). ImageJ foi usado para medir as áreas manchadas e determinar % de cura. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Discussion
Muitos oftalmologistas têm preocupações em recomendar DSO aos seus pacientes por duas razões principais: 1) o longo processo de cura e 2) falta de dados (ODSO é um novo conceito no campo da cirurgia oftalmológica). A pesquisa que apresentamos seria de grande utilidade para aliviar ambas as preocupações. Com base em dados deste estudo e outros, a FDA aprovou um ensaio clínico fase 2 onde o eFGF1 (NM141) será administrado em horários variados de dosagem para pacientes submetidos ao DSO17.
O método descrito acima foi modelado após estudo realizado por Soh et al., onde a cura endotelial da córnea foi avaliada com e sem o inibidor de ROCHA Y-27632 em feridas arranhadas e descascadas18. Enquanto o Y-27632 acelerou a regeneração endotelial com a membrana de Descemet ainda intacta, nenhuma cura substancial foi encontrada em feridas despojadas mesmo com tratamento. Utilizando uma técnica de descascamento semelhante seguida de tratamento com ou sem eFGF1 (NM141), as observações encontradas não foram consistentes com as de Soh e colegas. A ausência de manchas de Trypan Blue em muitas córneas tratadas no dia 14, e a presença de junções apertadas positivas zo-1 dentro da camada endotelial reformada argumenta que uma barreira intacta, parte da função natural do CEC, foi restaurada em córneas normais e distróficas. Embora não tenha sido quantificada neste estudo, a presença de células EdU positivas dentro e ao redor da área despojada também sugere a proliferação como um mecanismo de cura, que já estabelecemos pode ser estimulado pelo eFGF1 (NM141) nas córneas feridas16. A análise estatística mostrou que o tratamento com eFGF1 (NM141) resultou em uma cicatrização significativamente maior do DSO, em média mais de duas vezes mais do que as córneas de controle no ponto de tempo de 14 dias. Embora as taxas de cura variem moderadamente entre indivíduos - uma característica típica das córneas de doadores - a replicabilidade dos resultados sobre grandes tamanhos amostrais também evidencia um método altamente mensurável. Pelo que sabemos, não há outros exemplos do modelo de descascamento de um ex vivo Descemet na literatura.
Os principais componentes do próprio protocolo que serviriam valiosos para outros pesquisadores que estudam o DSO são o uso do Trypan Blue para detectar estroma nu, e a técnica de processamento de imagem usada para medir a área manchada. Trypan Blue é comumente usado em cirurgia oftálmica, particularmente quando se trabalha com a membrana de Descemet para detectar células não viáveis e auxiliar na visibilidade do tecido. Os pontos de tempo de coloração incluídos neste protocolo permitiram uma repetição efetiva das manchas sem expor excessivamente as córneas ao Trypan Blue, pois mostrou-se tóxica para os CECs em altas concentrações19. A redução da área manchada ao longo de 14 dias em todas as córneas, confirmada por Alizarin Red e imunohistoquímica como resultado de CECs migradas, demonstra um método simples e reprodutível para medir a cura. Usando o menu de limiar de cores do ImageJ, vários analistas coletaram dados com desvios padrão consistentemente abaixo de 1% (dados não mostrados). Embora programas alternativos possam funcionar de forma semelhante, o ImageJ é um software de código aberto capaz de produzir medições precisas de área para rastrear a cura.
Há, no entanto, um aspecto do protocolo de desmontagem que achamos ser necessário tanto para a criação de feridas, mas obstrutivo ao processo de cicatrização global. O uso de uma agulha afiada de 30 G para escorrizar a membrana de Descemet ao longo da marca deixada pelo soco da biópsia permite a criação de uma ferida suave e circular que é notada pelos médicos para suportar a cicatrização mais rápida10. Ao mesmo tempo, este passo é prejudicial à córnea, pois pode criar lágrimas nas fibras estrommal que causam a morte das células estromais, impedindo a migração de células endoteliais através da borda da ferida, e induzindo a formação de nódulos que resultam em edema pós-operatório mais persistente20. Os médicos que realizam DSO normalmente usam um gancho Sinskey reverso para iniciar a ferida, mas sem qualquer pressão intraocular mantendo a córnea esticada, esta ferramenta é menos eficaz no modelo ex vivo . Uma ferramenta alternativa capaz de rasgar a membrana de Descemet sem danificar o estroma subjacente melhoraria o protocolo, por exemplo, a peça de mão de irrigação e aspiração recomendada por Macsai e Shiloach10. Mais experimentações serão necessárias para determinar se essa técnica é compatível com o modelo ex vivo .
Um desafio que parece inerente ao modelo ex vivo é a frequente ocorrência de morte de CEC na área periférica à ferida, particularmente em córneas distróficas. Esta quantificação ocasionalmente obscurecida da área da ferida, uma vez que a precisão da ferramenta de limiar de cor torna-se mais limitada à medida que a área manchada se estende além do centro da córnea onde sua curvatura resulta em distribuição desigual da luz. No entanto, essas medidas variáveis ocorreram principalmente em momentos anteriores antes que a coloração periférica gradualmente recuasse à medida que cecs danificados limpas e células vizinhas se esticassem, migrassem ou proliferassem para substituí-las. No ponto de tempo final de 14 dias, a área manchada tinha localizado de volta ao centro da córnea, e todas as imagens eram mensuráveis. Observação semelhante foi feita com frequência comparável por Soh et al., onde cinco das 14 córneas normais apresentaram o que eles chamavam de "Falha da Cultura Prematura" (PCF) no início do período cultural18. Embora o dano tenha se revertido ao longo do tempo em nossas córneas e ainda assim fosse permanente em seu caso, isso pode ser atribuído ao fato de que seu método exigia ferir uma área maior da córnea. A observação de manchas de Tripano mais prevalentes em córneas distróficas podem indicar que córneas distróficas são mais suscetíveis à morte celular endotelial do que córneas saudáveis. Embora a causa exata desta morte celular ainda não tenha sido elucidada, acreditamos que é improvável que essa questão seja relevante para as córneas humanas in vivo. Os danos ao endotélio periférico não foram relatados em nenhum estudo de caso clínico do DSO até onde sabemos, sugerindo que esse fenômeno é único para as córneas doadoras cultivadas ex vivo 6,8,10,11,21. Além de dois casos em que apenas controlam córneas manchadas, todas as observações de manchas periféricas foram emparelhadas, por isso é improvável que a causa tenha sido a exposição ao eFGF1 (NM141). No entanto, é possível que nesses casos o tratamento possa ter proporcionado um efeito protetor contra o dano que, de outra forma, teria induzido a coloração periférica em ambas as córneas. É necessária uma investigação mais aprofundada sobre essa hipótese.
Outra limitação a este método é a sourcing de córneas doadoras representativas do fenótipo FECD para o qual se destina o DSO. Córneas doadoras de qualquer tipo são escassas, daí a necessidade de uma cirurgia que evite o uso de tecido doador. Para nossos propósitos, as únicas córneas disponíveis são aquelas rejeitadas do transplante por várias razões. Os bancos oculares classificam ainda essas córneas como normais ou distróficas com base em critérios que incluem presença de gutae, ECD baixa ou não mensurável e morfologia irregular da CEC. Confirmar um diagnóstico distrófico antes de aceitar tecido de um banco ocular também é quase impossível, uma vez que o histórico médico da maioria dos doadores não inclui o histórico ocular passado e a única informação fornecida é o valor da ECD, as notas do técnico e, em alguns casos, uma imagem especulativa representativa. As córneas distróficas obtidas para este estudo não apresentaram gutae central confluente sobre microscopia confocal realizada após o período de cultura estar completa, sugerindo que podem representar estágios "iniciais" da FECD. Não esperamos que isso tenha um impacto significativo nas implicações do estudo, pois o objetivo do DSO é remover áreas confluentes de gutae, permitindo que células periféricas saudáveis migrem para dentro.
Este método fornece uma técnica altamente aplicável e reprodutível para avaliar agentes que possam impactar a proliferação e migração do CEC. O modelo possui várias características que o tornam mais fisiologicamente relevante do que modelos in vitro que envolvem CECs cultivados, mesmo quando semeados no enxerto de tecido córnea humano 22,23,24. Primeiro, os CECs a serem estimulados estão em uma monocamada exatamente como existem no olho do paciente, e estão migrando através do estroma córnea como fariam após o DSO clínico. O estroma em questão é do mesmo paciente que os CECs, controlando assim possíveis diferenças estromais relacionadas à FECD. Não há necessidade de explantar, dissociar e expandir culturas de CECs com os desafios associados e potencial para a Transição Endotelial para Transição Mesenquimal (TNM) durante o processo de cultivo. O protocolo descrito é em si muito semelhante ao procedimento clínico DSO. Embora contorne as etapas de cultura e expansão, esse método tem a limitação de que a duração do estudo seja restrita pelo inchaço da córnea, uma vez que a camada epitelial não é mantida. Isso nos inibe de investigar a morfologia dos CECs que migraram para cobrir a área despojada, deixando claro se eles eventualmente se reorganizarão em uma matriz hexagonal neste modelo. Garcin et al. desenvolveram uma solução potencial com sua máquina de armazenamento ativa (ASM), um dispositivo mostrado para manter córneas em cultura por até 3 meses com significativamente menos edema do que córneas mantidas na cultura tradicional de órgãos25. Tal dispositivo pode ser útil para replicar e expandir este trabalho.
Este modelo tem potencial utilidade no teste de outras terapias de cicatrização de feridas (por exemplo, inibidores de ROCHA), avaliando modificações na técnica cirúrgica e comparando a cicatrização entre diferentes populações de doadores ou estágios da doença. Esperamos que esta pesquisa, em conjunto com os dados de ensaios clínicos como ele sai, incentive os médicos a considerar o DSO como uma opção de tratamento valiosa para seus pacientes fecd elegíveis.
Disclosures
DDE, SP, GD e JW são funcionários e possuem equidade na Trefoil Therapeutics, Inc. DDE é inventor de patentes que cobrem eFGF1 (NM141).
Acknowledgments
O financiamento para este trabalho foi apoiado pela Trefoil Therapeutics e nih NCATS TRND CRADA #2016-04. Os autores gostariam de agradecer tony Wong por conselhos e serviços de histopatologia, o Nikon Imaging Center na UC San Diego pelo uso de seu microscópio confocal, e Drs. Natalie Afshari e Marian Macsai por seus conselhos sobre técnica cirúrgica. Além disso, os autores estendem sua gratidão aos doadores de olhos e aos bancos oculares pelo fornecimento de córneas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
| 0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
| 0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
| 10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
| 12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
| 15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| 2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
| 310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
| 5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
| 6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
| Analytical balance | Sartorious | R200D | |
| Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
| Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
| Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
| Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
| Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
| Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
| Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
| Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
| Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
| Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
| ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
| Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
| Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
| Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
| L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
| Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
| Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
| N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
| Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
| Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
| Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
| Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
| Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
| Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
| Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
| Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
| Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
| Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
| Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
| Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
| Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
| Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
| Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
| VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |
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