Summary
デスメのストリッピングのみは、フックス内皮角膜ジストロフィーに起因する中枢角膜ガッタを有する患者が、末梢細胞が内皮層を再生するためにデスメの膜を剥離する実験手順である。我々は、eFGF1(NM141)によって刺激された治癒の促進を伴うジストロフィー性ヒト角膜 エクスビボ におけるDSOをシミュレートする新規方法論を提示する。
Abstract
フックス内皮角膜ジストロフィー(FECD)は、機能不全の角膜内皮細胞(CEC)の結果であり、現在、角膜全体またはデスメ膜の移植によって治療されている。眼科手術における最近の発展により、セメのストリッピングのみ(DSO)が確立されており、これは、腸内密集したデスメ膜の中心円を除去して、CECを滑らかな間質に移動し、角膜に機能および視力を回復させる外科的技術である。この潜在的な治療選択肢は眼科研究の分野で高い関心を集めているが、DSOの 成功したエクスビボ モデルは確立されておらず、臨床データは限られている。この研究は、ヒトドナー角膜におけるDSOをシミュレートする新規創傷治癒モデルを提示する。ヒトが操作したFGF1(NM141)の有効性を評価するためにこのアプローチを用いて、我々は、治療がCECの遊走および増殖の刺激 を介して 治癒を促進することを見出した。この知見は、DSO処置の標的集団として、これらの結果がフックスジストロフィー患者において複製され得ることを確認するために、アイバンクによって報告されたジストロフィーの徴候を有する11対のヒト角膜において確認された。
Introduction
フックス内皮角膜ジストロフィー(FECD)は、角膜内皮細胞(CEC)のポンプ機能が失われ、デスメ膜の表面にコラーゲンおよび他の細胞外マトリックスタンパク質が過剰に蓄積し、角膜腸1を形成することを特徴とする疾患である。FECDの唯一の既知の治療法は、様々な形態の内皮角膜形成術であり、そのすべてに拒絶反応および内皮細胞喪失のリスクが伴う2。眼科手術の進歩により、これらの手順は時間の経過とともに侵襲性が低くなりましたが、移植のいかなる形態にも拒絶のリスクと生涯ステロイド使用の可能性が伴います。さらに、世界的なドナー組織不足により、ドナー角膜は、必要な70人の患者ごとに1つのドナー角膜しか利用できません3。これらの課題を考えると、研究者や臨床医は、ドナー組織の必要性を完全に回避する外科的方法を模索しています。これらの実験技術の1つは、デスメのストリッピングのみ(DSO)または内皮ケラトプラスティ(DWEK)を伴わないデスメトレキシスであり、角膜の中心に局在するガッタを有するFECD患者は、移植片配置なしで剥ぎ取られたデスメ膜の中央4mm円を有する。ガッタエの除去は、健康な末梢細胞が内方に移動し、内皮単層を改革することを奨励し、最終的に間質浮腫を逆転させ、視力を改善する。この概念はもともと、患者がデスメ膜の剥離によって複雑化した手術を受けた一連のケーススタディで説明されていましたが、CECの再増殖は依然として4,5,6,7発生しました。この方法には多くの利点がありますが、手術後の数ヶ月間に治癒が見られない場合、一部の患者は救助移植を必要とするため、治癒プロセスは長く一貫性がありません8。これらの理由から、CECのより速い遊走および増殖を刺激する薬物は、DSOを受けたFECD患者の回復プロセスにおいて有益であり得る。
いくつかの最近の研究では、DSOを受けている患者のための補足的治療としてROCK阻害剤が評価されており、治療を受けた患者はDSOのみのグループ9、10、11の患者よりも早く回復し、中枢内皮細胞密度(ECD)が高いことが見出された。しかし、サンプルサイズが小さく、投薬レジメンの違いがあるため、この設定におけるROCK阻害剤の有効性をよりよく理解するには、より多くのデータが必要です。
線維芽細胞増殖因子はまた、ウシCECsを用いたインビトロ、およびネコ角膜におけるインビボの両方で角膜内皮の再生を刺激することが示されている12,13。eFGF1(NM141)は、半減期がはるかに短い天然FGF-1とは対照的に、分子を安定化させるためにいくつかのアミノ酸置換を含むFGF-1の操作されたバージョンです14,15。我々は以前、四分位ヒト角膜16におけるエクスビボでのCECsの増殖を刺激するeFGF1(NM141)の能力を実証した。この研究は、eFGF1(NM141)などの補助的治療がこのアプリケーションにおける治癒を促進するかどうかを決定するために、正常角膜とジストロフィー角膜の両方でDSOの最初の成功したex vivoモデルを確立することによって、その研究を改善しようとしました。
Protocol
この研究は、被験者の識別なしに既存の標本を使用し、45 CFR 46.101(b)(4)に基づくIRB承認から免除されています。
ヒトドナー角膜は、米国全土の様々なアイバンクから得られた( 材料表を参照)。角膜は、鏡面評価時にガッタエ、多型性、多面性、および/または低ECDなどの所見に基づいて、アイバンクによって個別にジストロフィーと判定された。 図1 は、創傷作成中、剥離直後、および培養2週間後の角膜におけるトリパンブルー染色を示す。
図1:創傷作成時、ストリパンブルーにより可視化した培養直後、および培養14日後の角膜を表す図。 これらの時点間の染色面積の減少を測定し、治癒のレベルを決定した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. 創傷の創作
- 滅菌鉗子を使用して、培地から角膜を除去し、1x PBSですすぎ、残留培地および細胞破片を除去する。すすぎ後、角膜内皮側をペトリ皿のふたの上に置きます。
- 30 μLのトリパンブルーをウェルドディッシュにピペットします。新しい4mm生検パンチをトリパンブルーに浸し、余分なものをタップします。
- 両手を使って、パンチを角膜の中心の上に置き、最小限の圧力をかけながら内皮表面にまっすぐ下に下ろします。
- 角膜の位置や圧力を変えずに、パンチを片手にずらし、新しく解放した手で鉗子に手を伸ばします。鉗子を使用して角膜を所定の位置に保持し、生検パンチを約90°前後に数回静かにねじります。
- パンチを角膜からまっすぐ持ち上げて脇に置きます。
- 1x PBSでもう一度すすぎ、余分なトリパンブルーを除去します。
2. デスメのストリッピング
- ペトリ皿のふたの角膜を解剖スコープに移す。
注:角膜を5分以上乾燥させないでください。プロセスを完了するためにさらに時間が必要な場合は、内皮を再水和させるために1x PBSで再度すすいでください。 - 湾曲した鉗子で角膜を所定の位置に保持し、生検パンチによって残されたトリパンブルーのリングに沿って鋭い30G針の先端を軽く引きずってデスメの膜を採点する。基礎となる間質を混乱させないように最小限の圧力を使用してください。
- Sinskeyフックで、穏やかなすくい上げ運動を使用して、傷口の周りのデスメの膜を持ち上げて剥がし、病変の中心に向かって作業します。
注:デスメの膜は、ほとんど抵抗を思い付かないはずです。困難を経験すると、間質を引き上げている可能性があります。このような場合は、傷口に沿って新しい点から持ち上げて、もう一度やり直してください。 - デスメの膜の大部分が間質から分離されたら、ゴロヴォイ鉗子を使用して膜を除去し、脇に置いておきます。
- 剥ぎ取られた部分に膜の残りの部分がないか調べ、ゴロボイ鉗子で取り除きます。
3. トリパンブルー染色
注:デスメのストリッピングに続いて、角膜をトリパンブルーで染色して創傷領域を視覚化します。
- ペトリ皿の蓋の角膜をバイオセーフティキャビネットに戻し、0.01%(w / v)CaCl2およびMgCl2を含む1x PBSですすぎ、細胞破片を除去し、残りのCECの無傷のデスメ膜への密着を促進する。
- 角膜をウェルドディッシュに入れ、30 μLのトリパンブルーを内皮層の上に30秒間ピペットで置きます。
- 鉗子を使用して角膜を静かに揺らし、内皮表面全体が覆われていることを確認します。
- 0.01%(w/v)CaCl2およびMgCl2 を含む1x PBS中の過剰なトリパンブルーを洗い流し、 染色された角膜を解剖顕微鏡下でDay 0の時点に画像化する。
- 角膜のバランスが取れていて、光が全体に均等に透過し、位置決めがタイムポイント間で複製可能であることを確認してください。
メモ:鉗子は、必要に応じてイメージング中に角膜を所定の位置に保持するために使用できます。
- 角膜のバランスが取れていて、光が全体に均等に透過し、位置決めがタイムポイント間で複製可能であることを確認してください。
4. 文化期間
- OptiMEMからなる低血清培地を含む6ウェルプレートでの角膜の培養;1xインスリン、トランスフェリン、およびセレン;1x抗生物質/抗真菌薬;0.02 ミリグラム/mL CaCl2;0.2 mg/mL アスコルビン酸;8%熱不活化ウシ胎児血清。左角膜を8 mLの低血清培地単独で、右角膜を100 ng/mL eFGF1(NM141)を添加した8 mLの低血清培地で培養します。
- 6%CO2 と共に37°Cで14日間インキュベートし、毎日の培地交換を行う。
- 3日目、6日目、9日目、12日目、14日目にトリパンブルー染色手順を繰り返し、染色直後の各角膜を画像化した。すべてのタイムポイントでカメラ設定の一貫性を保つようにしてください。
- 12日目に、コントロールおよびeFGF1(NM141)添加培地の両方に10μM EdUを添加し、増殖細胞を標識するために48時間インキュベートする。EdU でメディアを更新すると、13 日目に再び追加されました。
- EdUを添加してから48時間後の14日目に、CaCl2およびMgCl2 による1x PBSの代わりに、カルシウムがアリザリンレッド染色と相互作用するのを防ぐために、すすぎにプレーン1x PBSを使用する以外は、いつものようにトリパン染色および画像角膜。
5.アリザリンレッド染色
- 14日目に、0.9%生理食塩水に5%アリザリンレッドを調製する。
注:アリザリンレッドは生理食塩水に完全に溶解するわけではありません。組み合わせると、渦解と岩石を少なくとも1時間。使用前にもう一度ボルテックスとフィルターをかけ、未溶解の粒子を除去します。 - トリパン染色およびイメージングが完了したら、角膜をウェルドディッシュに移し、各角膜の内皮表面に200μLのアリザリンレッドを加える。
- 2分間染色し、その後、1x PBSのペトリ皿で各角膜をすすぎ、余分なアリザリンレッドを除去してから、8mLの1x PBSを予め充填した6ウェルプレートに5分間2回洗浄した。
- 2回目の洗浄後、各角膜の剥離領域を解剖顕微鏡下で画像化する。
注:トリパンイメージングとは異なり、角膜を1x PBSに残してアリザリン染色を画像化し、プロセス中に乾燥するのを防ぐことができます。
6. 固定と透過
- アリザリン画像がキャプチャされたら、角膜を12ウェルプレートに移し、0.05%Tween-20(PBS-T)を含む4mLの1x PBSで30分間洗浄し、固定前に組織から粒子を除去した。
- 角膜を4 mLの4%PFAで室温で30分間固定する。
- 1% Triton X-100を含む4 mLの1x PBSで細胞を5分間透過処理し、その後、4 mLのプレーン1x PBSでそれぞれ30分間3回洗浄します。
7. 免疫組織化学
- 2%ウシ血清アルブミンおよび2%ヤギ血清を含む4mLの1x PBS中で、37°Cで1時間角膜を遮断する。
- 2.5 μg/mL の一次抗体マウス抗 ZO-1 を含むブロッキング溶液 1 mL で 37°C で 1 時間インキュベートした後、4 mL の 1x PBS でそれぞれ 30 分間 3 回洗浄します。
注:抗体染色中にプレートを傾けて、必要な試薬の量を最小限に抑えることができます。角膜全体が抗体溶液に完全に浸されていることを確認してください。 - 0.88 mg/mL アスコルビン酸、0.26 mg/mL CuSO 4、および 2.5 μM Alexa Fluor488 アジドを含むカクテルを使用して EdU Click-iT 反応を行います。
- 反応成分の調製
- 500 μLの1x PBSを88mgのアスコルビン酸および渦に溶解するまで加える。
- 44mgのCuSO4 に840μLの脱イオン水を加え、溶解するまで渦巻き込む。
- 6 mLの1x PBSに以下の試薬を この順に添加し、各添加後に反転チューブで混合してカクテルを調製します:アスコルビン酸溶液30 μL、CuSO4 溶液30 μL、Alexa Fluor 488 15 μL
注:一度調製すると、この溶液は光に敏感です。プロトコルの残りの部分では、角膜は可能な限り光から保護する必要があります。 - 各角膜に1mLのEdU反応カクテルを加え、室温で1時間反応させる。
- 反応成分の調製
- 各角膜に4 mLの10 μg/mL Hoechst 33342を加え、室温で2分間反応させた後、1x PBS-Tで3回、それぞれ30分間洗浄する。
- 2 μg/mL の Alexa Fluor 555 標識ヤギ抗マウス IgG を含む 1 mL のブロッキング溶液中で 37°C で 1 時間インキュベートし、その後 1x PBS-T でそれぞれ 30 分間 3 回洗浄します。
- 微生物の増殖を防ぐために、1%抗/抗、0.1%シプロフロキサシン、および0.1%アムホテリシンBを含む4mLの1x PBSに4°Cで角膜を保管する。
- 共焦点イメージングを行う場合は、カバースリップをテープで留めて平らにして、スライドガラスに200μLのマウント媒体で角膜全体をマウントします。
8. トリパン画像解析
- NIHのオープンソースソフトウェアImageJを使用して、すべての画像解析を実行します。 「ファイルを開く 」を使用>て画像を開き、「 画像」>「>色の調整」のしきい値をクリックします。
- 「色相」スライダを使用して青色の範囲のみを囲み、上部の「明るさ」スライダを左端まで調整して、染色された領域をより多く含めます。
メモ: この操作により、画像の Trypan 染色されていない部分が含まれる場合は、「明るさ」スライダを元のレベルに戻すことができます。 - 上部の「彩度」スライダを、しきい値が染色領域の輪郭を正確に描くまでゆっくりと調整します。
メモ: このプロセス中に参照できるように、元のイメージのコピーを開いておくと便利です。 - カラーしきい値メニュー内の選択ボタンをクリックし、 選択 ブラシツールを使用して、拾った傷の外側の領域の選択を解除します。
- 「分析」>「測定」をクリックして、染色された領域をピクセル単位で報告します。
- 「>選択範囲を 編集」>「なし」 を使用してすべての選択を解除し、楕円形の選択ツールを使用してリムバスにできるだけ近づけてから、「 分析」>「測定」 をクリックして角膜の面積をピクセル単位で報告します。
注:画像のこの部分が暗すぎる場合、リムバスの視覚化を助けるために明るさを一時的に上げることができます。 - 面積値を記録し、染色面積を角膜全体の面積で除算し、100を掛けて染色率を計算します。
- 各画像についてこのプロセスをさらに2回繰り返し、3つの測定値の平均を取ります。
9. 統計分析
- すべての画像が分析されたら、14日目に染色された平均パーセントを0日目に染色されたパーセントで除算して、残りの未治癒領域を決定します。この量を100%から差し引いて、14日間に治癒した剥離領域の割合を計算します。
- 対応のあるt検定を使用して、対照群と治療群の間で治癒率の値を比較します。
Representative Results
この実験は、最も容易に入手できる10組の正常な研究用角膜で最初に実施された。この方法が成功することが示されると、この研究は、スペキュラー評価に基づいてアイバンクによってそのように標識された11対のジストロフィー性角膜において複製され、FECD患者集団を代表する角膜におけるeFGF1(NM141)の影響を研究した。より大きな臨床的関連性のために、本研究に含まれる数値は、特に断りのない限り、ジストロフィー性角膜から収集されたデータを表す。
DSOの外科的転帰をシミュレートした後、トリパンブルー染色を行い、14日間の培養期間を通して繰り返し、陽性染色の減少を定量化し、創傷治癒を評価した(図2)。アリザリンレッド染色も14日目に行い、細胞の境界を描写した。明確なパターンが見えない濃い赤色の領域(以下、陰性染色と呼ぶ)は、病変の治癒していない部分および細胞が損傷または欠損していると推定される角膜の他の領域に一貫して現れた。14日目にトリパンブルーに対して陽性に染色された領域は、アリザリンレッドによる陰性染色と良好に一致した(図2)。eFGF1(NM141)で処置した全てのジストロフィー性角膜は、未処置の交配者と比較して14日目に大きな治癒を示した。平均して、処置された角膜は、対照角膜では38%に対して91%の治癒を示し、この差は統計的に有意であった(p<0.001)(図3A)。これは、対照が平均32%の治癒を示し、治療された角膜が81%に達した20の正常な角膜から得られた結果に匹敵し、これもまた統計的に有意であった(p<0.001)(補足図1)。治癒率は、等分散を仮定した2つのサンプルt検定を用いて正常角膜とジストロフィー角膜の間で比較されたが、対照群または治療群のいずれにおいても有意差は見られなかった(データは示さず)。
正常角膜とジストロフィー角膜の両方についてアイバンクによって提供されたドナー情報(表1)を分析し、年齢、オプチゾールに保存された日数、死から採取間隔、細胞密度、および性別を含む特性が治癒と相関するかどうかを決定した。ピアソンの相関係数(r)は、性別を除くすべての因子を調査するために使用され、男性と女性の間で治癒を比較するために不対のt検定を使用して評価された。rの絶対値はすべての症例で0.25未満であり、治癒と年齢、オプチゾールに保存された日数、死から収集間隔、または細胞密度の間の相関は無視できると考えられたことを示している。男性と女性の治癒の差は統計的に有意ではなかった(p = 0.53)。
正常データセットと同様に、22個のジストロフィー性角膜のうち10個が、少なくとも1つの時点(通常は3日目)において病変内の染色領域に接続された剥離領域の外側に顕著なトリパン染色を提示した観察を末梢染色と呼んだ(図4A)。それらの10のうち、2つだけが対照角膜であり、その治療された対応物は同じ効果を示さなかった。残りの8つはすべて一致したペアであり、同じ個体からの角膜間で同様の重症度を示した。染色パターンは正常角膜とジストロフィー角膜で同等であったが、末梢染色の頻度は、正常群の25%と比較して、角膜陽性の45%を有するジストロフィーデータセットにおいて高かった。図4Aは、末梢染色に対して陽性と考えられた一対を示し、病変の外側の染色領域がDay6画像において創傷縁部を満たし、徐々に後退した。対応するアリザリンレッド画像では、末梢トリパン染色を受けた領域の細胞は、剥離された領域に遊走した細胞とよく似て拡大し、異常な形状に見え、陰性染色は14日目にトリパンブルーが存在した領域と相関していた。培養期間を通して影響を受けた角膜の大部分にもかかわらず、染色された周囲の部分的または完全な除去は、10の角膜すべてで起こった。さらに、14日目に治癒した最終パーセントは、1つの角膜を除くすべての角膜について、治療群ごとに正常範囲内であった。外れ値(0811L、図4Aに写真)は、14日目に病変領域にまだ接続していた末梢染色の残骸のために、負の治癒パーセント値を返した(図3Aおよび図4A)。遠周染色と呼ばれる第2の染色パターンは、図4Bのアリザリンレッド画像でキャプチャされたが、多くの角膜における培養期間を通してトリパンブルー画像でも明らかであった(図4B)。この観察は、辺縁部の周りの暗い染色のリングによって特徴付けられ、妥協した内皮を示す。この用語にもかかわらず、このパターンは正常角膜およびジストロフィー角膜の両方で非常に一般的であったため、末梢染色に対して陽性としてカウントされなかった。これらの画像では、対照角膜は、培養期間の初期に同様の重症度および染色パターンを有していたにもかかわらず、14日目により鮮やかで広範な染色を示した。また、処理された角膜には、一見多くの細胞があり、対照と比較してよりコンパクトで六角形に見えたが、これらの観察は定量的に測定されなかった。末梢の曲率のために、剥離された領域内およびそのすぐ周囲のトリパン染色のみが定量分析に含まれていた。パーセント染色値をすべてのジストロフィー角膜で平均化した場合、末梢染色の出現は、末梢染色があまり一般的ではなかった正常な角膜で見られる着実な減少とは対照的に、0日目のそれよりも初期の増加をもたらした(図3B)。
共焦点イメージングによって可視化された免疫組織化学は、病変縁部およびその周辺におけるCECタイトジャンクションの機能マーカーであるZO-1の半組織化発現を明らかにし(図5)、アリザリンレッド染色によって同様に証明されたパターンである(図2 および 図4)。プレオモルフィズムおよび多重症は、ほとんどのジストロフィー性角膜においてZO-1によって見える。しかし、この観察は、それらの罹患状態に起因する可能性があり、培養前の角膜の鏡面検査時に眼盤によって認められた。無秩序なZO−1発現は、細胞が内側に移動していた処置角膜の病変領域内で観察され、また、アリザリンレッドパターンと一致する。EdU取り込み細胞は、対照および処置角膜における病変部の境界および病変領域の内側に見ることができる(図5)。遊走したCECのパターンはまた、対照角膜においてほとんどの細胞が病変縁部の2つの野内に見出されたトリパンブルーの結果を反映しているが、治療された角膜中のCECは剥離領域全体に見られる(図2)。
この研究において定性的尺度としてEdU標識を実施したところ、増殖が治癒に寄与したことを確認した。しかし、EdUを取り込んだ細胞の定量は、角膜腫脹のために、病変部内および病変部周辺で一貫した複製可能な画像が撮影されるのを妨げるため、体系的に行うことができなかった。代理として、DSOモデルの確立前に実施された研究で実施された定量分析が、増殖に対するeFGF-1(NM141)の効果を実証するために含まれていた(図6)。正常なヒトドナー角膜をメスを用いて四分の一に切断し、前述のようにeFGF1(NM141)の有無にかかわらず48時間、EdUの存在下で培養した(Eveleth, 2020)16。ヘキスト33342およびEdU標識細胞のイメージングおよびその後の分析は、角膜を切断した場所から3つの視野内の四分の一の邪魔されない中間ゾーンおよびエッジゾーンで別々に実施した。中間ゾーンでは、EdUを組み込んだ細胞の割合が低く、分析された10個の角膜にわたって非常に変動した。平均して、eFGF1(NM141)で治療された四半期は、対照(1.8%±2.9%)と比較して、中間ゾーン(4.1%±7.9%)でEdUの取り込みレベルが高かったが、この差は統計的に有意ではなかった(p = 0.239)。創傷縁部において、eFGF1で刺激された処置区(NM141)は、対照区(10%±9.6%、p = 0.012)と比較して、平均化(18.1%±11.5%)した場合、有意に高いEdU取り込み率を示した。
表1:この研究で使用した22個のジストロフィーおよび20個の正常角膜、ならびに以前にEdU定量に使用した10個の正常角膜のドナー情報。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図2:デスメのストリッピング後の角膜の生命色素染色。 ジストロフィー性ヒト角膜をデスメ膜の中央4mmから剥離し、eFGF1(NM141)(100ng/mL)の有無にかかわらず14日間インキュベートした。病変は、0日目、3日目、6日目、9日目、12日目、および14日目にトリパンブルー染色によって可視化した。CECの境界線は、14日目にアリザリンレッド染色によって視覚化された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ジストロフィー性ヒト角膜は、eFGF1(NM141)と共に培養した場合、DSOからの有意に大きな治癒を示す 。 (A)治癒率は、ImageJを用いて14日目の染色領域を測定し、それを0日目に染色されたパーセントと比較することによって決定された。(B)経時的にグラフ化された染色された平均パーセントは、末梢染色のより高い有病率のためにジストロフィー性角膜において3日目にピークを迎える一方で、正常な角膜の一貫した減少を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:末梢染色によるジストロフィー性角膜のバイタル色素染色。 (A)無傷のデスメ膜のトリパン染色は、中心に向かって進行し、その後、対照および処理された角膜の両方で経時的に消去されるのを見ることができる。(B)辺縁部の周りのアリザリンパターンは、多くのドナー角膜(この場合はジストロフィー)に見られる内皮の末梢損傷および無秩序な再確立の典型的な観察を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:剥離ジストロフィー角膜におけるeFGF1(NM141)によるCECsの遊走および増殖の刺激。 ZO-1(赤)、EdU(緑)、およびヘキスト33342(青)について染色されたデスメの剥ぎ取られた角膜の共焦点顕微鏡写真。点線は病変のエッジを表し、画像の左側に剥ぎ取られた領域があり、右側に無傷のデスメの膜があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:メスを用いて分光した正常角膜からの増殖細胞の定量を、eFGF-1(NM141)の有無にかかわらずEdUを含む培地中で48時間インキュベートした。 四分の一を、乱れのない中間ゾーンおよび切断エッジに沿って3連で画像化し、カウントを平均して、ミッドゾーンおよびエッジゾーンにEdUを組み込んだ細胞の割合を決定した。 Journal of Ocular Pharmacology and Therapeuticsから改変された図は、許可を得て使用 16. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:正常なヒト角膜は、eFGF1(NM141)で培養した場合にDSOから有意に大きな治癒を示す。 ImageJは、染色された領域を測定し、治癒率を決定するために使用された。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
多くの眼科医は、1)治癒プロセスが長いこと、および2)データの欠如(DSOは眼科手術の分野における新しい概念である)の2つの主な理由により、DSOを患者に推奨することについて懸念を抱いている。私たちが提示した研究は、これらの懸念の両方を和らげるための大きな有用性があります。この研究などのデータに基づいて、FDAは、eFGF1(NM141)をDSO17を受けている患者にさまざまな投与スケジュールで投与する第2相臨床試験を承認しました。
上述の方法は、Sohらによって行われた研究の後にモデル化され、角膜内皮治癒は、傷のある創傷および剥離された創傷の両方においてROCK阻害剤Y−27632の有無にかかわらず評価された18。Y-27632はデスメの膜が無傷のままで内皮再生を加速したが、治療を行っても剥ぎ取られた創傷には実質的な治癒は見られなかった。eFGF1(NM141)の有無にかかわらず処理した後に同様のストリッピング技術を使用して、我々が発見した観察結果は、Sohおよび同僚の観察と一致しなかった。14日目に多くの処理された角膜にトリパンブルー染色がなかったこと、および改質内皮層内にZO-1陽性タイトジャンクションが存在することは、CECの自然な機能の一部である無傷の障壁が正常角膜およびジストロフィー角膜の両方で回復したと主張する。この研究では定量化されていないが、剥離領域内およびその周辺におけるEdU陽性細胞の存在も治癒機構としての増殖を示唆しており、我々が以前に確立したものは、損傷した角膜におけるeFGF1(NM141)によって刺激され得る16。統計解析により、eFGF1(NM141)による治療は、14日間の時点で平均して対照角膜の2倍以上の有意に高いDSOからの治癒をもたらしたことが示されました。治癒率は個人間で適度に異なるが(ドナー角膜の典型的な特徴である)、大きなサンプルサイズに対する結果の再現性も、非常に測定可能な方法の証拠である。我々の知る限り、 エクスビボ ・デスメのストリッピングモデルの例は他に文献にない。
DSOを研究している他の研究者にとって価値のあるプロトコル自体の重要な要素は、裸の間質を検出するためのTrypan Blueの使用と、染色された領域を測定するために使用される画像処理技術です。トリパンブルーは、眼科手術、特にデスメの膜を使用して非生存細胞を検出し、組織の可視性を支援する場合に一般的に使用されます。このプロトコールに含まれる染色タイムポイントは、高濃度のCECsに有毒であることが示されているため、角膜をトリパンブルーに過剰に曝露することなく効果的な反復染色を可能にしました19。アリザリンレッドおよび免疫組織化学によって、移行したCECの結果であることが確認されたすべての角膜における14日間にわたる染色面積の減少は、治癒を測定するための簡単で再現可能な方法を実証する。ImageJのカラーしきい値メニューを使用して、複数のアナリストが標準偏差が一貫して1%未満のデータを収集しました(データは示されていません)。他のプログラムも同様に動作するかもしれませんが、ImageJは治癒を追跡するための正確な面積測定を生成できるオープンソースソフトウェアです。
しかし、ストリッピングプロトコルには、創傷の作成に必要でありながら、治癒プロセス全体を妨げるという側面があります。鋭い30G針を使用して、生検パンチによって残されたマークに沿ってデスメの膜をスコアリングすると、滑らかで円形の創傷が形成され、臨床医はより速い治癒をサポートすると指摘されている10。同時に、このステップは、間質線維に涙を生じさせ、間質細胞死を引き起こし、創傷縁部を横切る内皮細胞の遊走を妨げ、そしてより持続的な術後浮腫をもたらす結節の形成を誘導する可能性があるため、角膜に損傷を与える20。DSOを行う臨床医は、典型的には、創傷を開始するために逆シンスキーフックを使用するが、角膜を緊張させ続ける眼内圧なしでは、このツールは エクスビボ モデルにおいてあまり効果的ではない。下層の間質を損傷することなくデスメの膜を引き裂くことができる代替ツールは、例えば、MacsaiとShiloach10によって推奨された灌漑および吸引ハンドピースのようなプロトコルを改善するであろう。この技術が エクスビボ モデルと互換性があるかどうかを判断するには、さらなる実験が必要になります。
エクスビボモデルに内在しているように見える課題は、創傷の末梢領域、特にジストロフィー性角膜におけるCEC死の頻繁な発生である。これは、染色された領域が角膜の中心を超えて延びるにつれて、その曲率が不均一な配光をもたらすので、色の閾値化ツールの精度がより制限されるため、創傷領域の定量を時折不明瞭にする。しかし、これらの可変測定は、損傷したCECが除去され、隣接する細胞がそれらを置き換えるために伸張、遊走、または増殖するにつれて、末梢染色が徐々に後退する前の以前の時点で主に起こった。最後の14日間の時点までに、染色された領域は角膜の中心に局在し、すべての画像が測定可能であった。Sohらによって同様の観察が同等の頻度で行われ、14の正常な角膜のうち5つが、培養期間18の早い段階で「早期培養不全」(PCF)と呼ばれるものを提示した。損傷は私たちの角膜で時間の経過とともに逆転しましたが、それでも彼らのケースでは永久的でしたが、これは彼らの方法が角膜のより広い領域を傷つけることを必要としたという事実に起因するかもしれません。ジストロフィー性角膜におけるより一般的な末梢トリパン染色の観察は、ジストロフィー性角膜が健康な角膜よりも内皮細胞死に対してより感受性が高いことを示している可能性がある。この細胞死の正確な原因はまだ解明されていませんが、この問題が生体内のヒト角膜に関連する可能性は低いと考えています。末梢内皮への損傷は、我々の知る限りDSOのいずれの臨床症例研究においても報告されておらず、この現象がエクスビボで培養されたドナー角膜に特有のものであることを示唆している6、8、10、11、21。対照角膜のみが染色された2つの例を除いて、末梢染色のすべての観察はペアであったため、原因がeFGF1(NM141)への曝露であった可能性は低い。しかしながら、それらの場合において、治療は、そうでなければ両方の角膜において末梢染色を誘発したであろう損傷に対する保護効果を提供し得る。この仮説については、さらなる調査が必要である。
この方法に対する別の制限は、DSOが意図されるFECD表現型を代表するドナー角膜を調達することである。あらゆる種類のドナー角膜は希少であるため、ドナー組織の使用を避ける手術が必要です。私たちの目的のために、利用可能な唯一の角膜は、様々な理由で移植から拒絶されたものです。アイバンクはさらに、これらの角膜を、ガッタエの存在、低または測定不能なECD、および不規則なCEC形態を含む基準に基づいて、正常またはジストロフィーとして分類する。ほとんどのドナーの病歴には過去の眼歴が含まれておらず、提供される唯一の情報はECD値、技術者のメモ、および場合によっては代表的な鏡面画像であるため、アイバンクから組織を受け入れる前にジストロフィー診断を確認することもほとんど不可能です。本研究で得られたジストロフィー性角膜は、培養期間終了後に実施した共焦点顕微鏡検査ではコンフルエントな中央腸を示さず、FECDの「初期段階」を表している可能性を示唆した。DSOの目的は、腸のコンフルエント領域を除去し、健康な末梢細胞が内側に移動することを可能にすることであるため、これが研究の意味に大きな影響を与えるとは予想していない。
この方法は、CECの増殖および移行に影響を与える可能性のある薬剤を評価するために、非常に適用可能で再現可能な技術を提供する。このモデルは、ヒト角膜組織移植片22、23、24に播種した場合でも、培養CECを含むin vitroモデルよりも生理学的に関連性の高いいくつかの特徴を有する。第一に、刺激されるCECは、患者の眼内に存在するのとまったく同じ単層にあり、臨床DSOの後と同様に角膜間質を横切って移動している。問題の間質はCECと同じ患者からのものであり、したがって潜在的なFECD関連の間質の違いを制御する。培養プロセス中に内皮から間葉への移行(EnMT)に関連する課題と可能性を伴うCECの培養物を外植、解離、および拡大する必要はありません。記載されているプロトコル自体は、臨床DSO手順と非常によく似ています。培養および拡張ステップをバイパスするが、この方法は、上皮層が維持されないため、研究期間が角膜腫脹によって制限されるという制限を有する。これは、剥ぎ取られた領域をカバーするために移動したCECの形態を調査することを妨げ、このモデルで最終的に六角形の配列に再配置するかどうかは不明である。Garcinらは、従来の臓器培養で維持される角膜よりも有意に少ない浮腫で、角膜を最大3ヶ月間培養中に保持することが示された装置であるアクティブストレージマシン(ASM)を用いて、1つの潜在的な解決策を開発した25。このようなデバイスは、この作業を複製して拡張するのに役立ちます。
このモデルは、他の創傷治癒療法(例えば、ROCK阻害剤)の試験、外科的技術への改変の評価、および異なるドナー集団または疾患の段階にわたる治癒の比較において潜在的に有用性を有する。この研究が、臨床試験データが発表されたときに、臨床医がDSOを適格なFECD患者にとって貴重な治療選択肢として考えるよう促すことを願っています。
Disclosures
DDE、SP、GD、およびJWは、トレフォイル・セラピューティクス・インクの従業員であり、株式を保有しています。
Acknowledgments
この研究のための資金は、トレフォイル・セラピューティクスとNIH NCATS TRND CRADA #2016-04によって支援されました。著者らは、組織病理学のアドバイスとサービスについてTony Wong氏、共焦点顕微鏡の使用についてUCサンディエゴのNikon Imaging Center氏、外科的技術に関するアドバイスをしてくれたNatalie Afsari博士とMarian Macsai博士に感謝したい。さらに、著者らは、角膜を提供してくれた目のドナーとアイバンクに感謝の意を表している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
| 0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
| 0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
| 10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
| 12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
| 15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| 2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
| 310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
| 5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
| 6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
| Analytical balance | Sartorious | R200D | |
| Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
| Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
| Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
| Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
| Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
| Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
| Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
| Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
| Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
| Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
| ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
| Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
| Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
| Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
| L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
| Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
| Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
| N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
| Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
| Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
| Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
| Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
| Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
| Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
| Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
| Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
| Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
| Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
| Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
| Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
| Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
| Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
| Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
| VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |
References
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