Summary
Descemet's Stripping Only er en eksperimentel procedure, hvor patienter med central hornhinde guttae som følge af Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy får Descemets membran strippet for perifere celler for at regenerere endotellaget. Vi præsenterer en ny metode, der simulerer DSO i dystrofiske humane hornhinden ex vivo med accelereret heling stimuleret af eFGF1 (NM141).
Abstract
Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) skyldes dysfunktionelle hornhindeendotelceller (CEC'er) og behandles i øjeblikket ved transplantation af hele hornhinden eller Descemets membran. Den seneste udvikling inden for okulær kirurgi har etableret Descemet's Stripping Only (DSO), en kirurgisk teknik, hvor en central cirkel af guttae-tæt Descemets membran fjernes for at muliggøre migration af CEC'er på den glatte stroma, genoprette funktion og vision til hornhinden. Mens denne potentielle behandlingsmulighed er af stor interesse inden for oftalmisk forskning, er der ikke etableret nogen vellykkede ex vivo-modeller af DSO, og kliniske data er begrænsede. Dette arbejde præsenterer en ny sårhelende model, der simulerer DSO i humane donorhornhindene. Ved hjælp af denne tilgang til at evaluere effekten af den menneskekonstruerede FGF1 (NM141) fandt vi, at behandlingen fremskyndede helingen via stimulering af migration og spredning af CEC'er. Dette fund blev bekræftet i 11 par humane hornhindene med tegn på dystrofi rapporteret af øjenbankerne for at verificere, at disse resultater kan replikeres hos patienter med Fuchs 'dystrofi, som målpopulationen for DSO-proceduren.
Introduction
Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) er en sygdom, der er karakteriseret ved tabt pumpefunktion i hornhindeendotelceller (CEC'er) og overdreven opbygning af kollagen og andre ekstracellulære matrixproteiner på overfladen af Descemets membran, der danner hornhinde guttae1. Den eneste kendte behandling for FECD er endotelkeratoplastik i forskellige former, som alle har risiko for afstødning og endotelcelletab2. Mens fremskridt inden for oftalmisk kirurgi har gjort det muligt for disse procedurer at blive mindre invasive over tid, kommer enhver form for transplantation med risiko for afvisning og mulighed for livstid steroidbrug, en behandling med sine egne samtidige bivirkninger. Desuden er den globale mangel på donorvæv sådan, at der kun er én donorhornhinde til rådighed for hver 70 patienter med behov3. I betragtning af disse udfordringer undersøger forskere og klinikere kirurgiske metoder, der helt undgår behovet for donorvæv. En af disse eksperimentelle teknikker er Descemet's Stripping Only (DSO) eller Descemetorhexis uden Endothelial Keratoplasty (DWEK), hvor FECD-patienter med guttae lokaliseret til midten af hornhinden har en central 4 mm cirkel af Descemets membran strippet uden transplantatplacering. Fjernelsen af guttae tilskynder sunde perifere celler til at migrere indad og reformere endotelmonolaget, til sidst vende stromalt ødem og forbedre synet. Konceptet blev oprindeligt beskrevet i en række casestudier, hvor patienter gennemgik kirurgi, der blev kompliceret af løsrivelse af Descemets membran, men CEC-repopulation forekom stadig 4,5,6,7. Selvom der er mange fordele ved denne metode, er helingsprocessen langvarig og inkonsekvent, da nogle patienter kræver redningstransplantation, hvis der ikke ses helbredelse i månederne efter operationen8. Af disse grunde kan et lægemiddel, der stimulerer hurtigere migration og spredning af CEC'er, være gavnligt i genopretningsprocessen for FECD-patienter, der har gennemgået DSO.
Flere nylige undersøgelser har evalueret ROCK-hæmmere som en supplerende behandling for patienter, der gennemgår DSO, og fundet ud af, at behandlede patienter kom sig hurtigere og havde højere centrale endotelcelletætheder (ECD) end dem i DSO-gruppenkun gruppe 9,10,11. På grund af små prøvestørrelser og forskelle mellem doseringsregimer er der imidlertid behov for flere data for bedre at forstå effekten af ROCK-hæmmere i denne indstilling.
Fibroblastvækstfaktorer har også vist sig at stimulere regenerering af hornhindeendotelet både in vitro med kvæg CIC'er og in vivo i kattehornherne12,13. eFGF1 (NM141) er en konstrueret version af FGF-1, der indeholder flere aminosyresubstitutioner for at stabilisere molekylet i modsætning til den oprindelige FGF-1, som har en meget kortere halveringstid 14,15. Vi har tidligere demonstreret eFGF1's (NM141) evne til at stimulere spredning af CEC'er ex vivo i kvartede humane hornherne16. Denne undersøgelse søgte at forbedre dette arbejde ved at etablere den første vellykkede ex vivo-model af DSO i både normale og dystrofiske hornhindene for at afgøre, om supplerende behandlinger som eFGF1 (NM141) fremskynder helingen i denne applikation.
Protocol
Dette arbejde anvendte eksisterende prøver uden identifikation af forsøgspersoner og er undtaget fra IRB-godkendelse i henhold til 45 CFR 46.101(b)(4).
Humane donorhornhiner blev opnået fra forskellige øjenbanker i hele USA (se Table of Materials). Hornhinden blev individuelt bedømt dystrofisk af øjenbankerne baseret på fund som guttae, pleomorfisme, polymegathisme og / eller lav ECD ved spekulær evaluering. Figur 1 viser Trypan Blue farvning i hornhinden under sårskabelse, umiddelbart efter stripping og efter 2 uger i kultur.
Figur 1: Diagram, der repræsenterer hornhinden under sårskabelse, umiddelbart efter stripping og efter 14 dage i kultur som visualiseret af Trypan Blue. Reduktionen i farvet område mellem disse tidspunkter blev målt for at bestemme niveauet af helbredelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Oprettelse af sår
- Brug steril tang til at fjerne hornhinden fra medierne og skylle i 1x PBS for at fjerne resterende medier og celleaffald. Efter skylning skal du placere hornhindeendotelsiden op på låget på en petriskål.
- Pipette 30 μL Trypan Blue i et brøndfad. Dyp en ny 4 mm biopsistans i Trypan Blue og tryk på overskydende.
- Brug begge hænder til at placere stansen over midten af hornhinden og sænk den lige ned på endoteloverfladen og påfør minimalt tryk.
- Uden at ændre positionen eller trykket på hornhinden, skift stansen til den ene hånd og nå ud til tang med den nyligt frigjorte hånd. Brug tangen til at holde hornhinden på plads, mens du forsigtigt vrider biopsistansen ca. 90 ° frem og tilbage flere gange.
- Løft stansen lige op fra hornhinden og læg den til side.
- Skyl igen i 1x PBS for at fjerne overskydende Trypan Blue.
2. Descemets stripping
- Overfør hornhinden på et petriskålslåg til et dissekerende omfang.
BEMÆRK: Lad ikke hornhinden tørre længere end 5 min. Hvis der er behov for mere tid til at fuldføre processen, skylles igen i 1x PBS for at rehydrere endotelet. - Hold hornhinden på plads med buede tang, score Descemets membran ved let at trække spidsen af en skarp 30 G nål langs ringen af Trypan Blue efterladt af biopsistansen. Brug minimalt tryk for at undgå at forstyrre den underliggende stroma.
- Med en Sinskey-krog skal du bruge blide scooping-bevægelser til at løfte og skrælle Descemets membran tilbage omkring sårkanten og arbejde mod midten af læsionen.
BEMÆRK: Descemets membran skal komme med meget lidt modstand. Hvis der opleves vanskeligheder, trækker man sandsynligvis stroma op. Hvis dette sker, skal du starte igen og løfte fra et nyt punkt langs sårkanten. - Når størstedelen af Descemets membran er blevet adskilt fra stromaen, skal du bruge Gorovoy-tang til at fjerne membranen og sætte den til side.
- Undersøg det strippede område for eventuelle resterende stykker membran og fjern med Gorovoy tang.
3. Trypan Blå farvning
BEMÆRK: Efter Descemets stripning skal du plette hornhinden med Trypan Blue for at visualisere sårområdet.
- Returner hornhinden på et petriskålslåg til biosikkerhedsskabet, og skyl i 1x PBS indeholdende 0,01% (w/v) CaCl2 og MgCl2 for at fjerne celleaffald og lette tæt vedhæftning af resterende CEC'er til den intakte Descemets membran.
- Læg hornhinden i et godt fad og pipet 30 μL Trypan Blue på endotellaget i 30 s.
- Brug tang til forsigtigt at rocke hornhinden for at sikre, at hele endoteloverfladen er dækket.
- Skyl overskydende Trypan Blue af i 1x PBS med 0,01% (w/v) CaCl2 og MgCl2 og aftryk den farvede hornhinde under et dissekerende mikroskop til dag 0-tidspunktet.
- Sørg for, at hornhinden er afbalanceret, så lyset overføres jævnt overalt, og positionen kan replikeres på tværs af tidspunkter.
BEMÆRK: Tang kan bruges til at holde hornhinden på plads under billeddannelse, hvis det er nødvendigt.
- Sørg for, at hornhinden er afbalanceret, så lyset overføres jævnt overalt, og positionen kan replikeres på tværs af tidspunkter.
4. Kulturperiode
- Kulturhornhinden i en seks-brønds plade indeholdende lavserummedier bestående af OptiMEM; 1x insulin, transferrin og selen; 1x antibiotikum / antimykotisk; 0,02 mg/mlCaCl2; 0,2 mg/ml ascorbinsyre; og 0,8% varmeinaktiveret føtalt kvægserum. Kultur venstre hornhinde i 8 ml lavserumsmedier alene og højre hornhinde i 8 ml lavserummedier suppleret med 100 ng/ml eFGF1 (NM141).
- Inkuber ved 37 °C med 6 % CO2 i 14 dage med daglige medieændringer.
- Gentag Trypan Blue-farvningsproceduren på dag 3, 6, 9, 12 og 14, og forestil dig hver hornhinde umiddelbart efter farvning. Sørg for at holde kameraindstillingerne konsistente på tværs af alle tidspunkter.
- På dag 12 skal du tilføje 10 μM EdU til både kontrol og eFGF1 (NM141) -supplerede medier og inkubere i 48 timer for at mærke prolifererende celler. Forny medier med EdU tilføjet igen på dag 13.
- På dag 14, 48 timer efter tilsætning af EdU, Trypan-plet og billedhornhinden som normalt, undtagen i stedet for 1x PBS med CaCl2 og MgCl2, skal du bruge almindelig 1x PBS til skylninger for at forhindre calcium i at interagere med Alizarin Red-pletten.
5. Alizarin Rød farvning
- På dag 14 skal du forberede 5% Alizarin Red i 0,9% saltopløsning.
BEMÆRK: Alizarin Red opløses ikke fuldstændigt i saltopløsning. Ved kombination, hvirvelopløsning og sten i mindst 1 time. Vortex igen og filtrer før brug for at fjerne uopløste partikler. - Når Trypan-farvning og billeddannelse er afsluttet, overføres hornhinden til en brøndet skål og tilsættes 200 μL Alizarin Red til endoteloverfladen på hver hornhinde.
- Plet i 2 minutter, skyl derefter hver hornhinde i en petriskål på 1x PBS for at fjerne overskydende Alizarin Red, inden du lægger den i en seks-brønds plade, der er fyldt med 8 ml 1x PBS i to 5 minutters vaske.
- Efter den anden vask skal du afbilde det strippede område af hver hornhinde under et dissekerende mikroskop.
BEMÆRK: I modsætning til Trypan-billeddannelse kan hornhinden efterlades i 1x PBS for at afbilde Alizarin-farvning for at forhindre dem i at tørre ud under processen.
6. Fiksering og permeabilisering
- Når Alizarin-billeder er taget, overføres hornhinden til en plade med 12 brønde og vaskes i 4 ml 1x PBS indeholdende 0,05 % Tween-20 (PBS-T) i 30 minutter for at fjerne partikler fra vævet inden fiksering.
- Fastgør hornhinden i 4 ml 4% PFA i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Permeabiliser celler i 5 minutter i 4 ml 1x PBS indeholdende 1% Triton X-100, vask derefter tre gange i 4 ml almindelig 1x PBS i 30 minutter hver.
7. Immunohistokemi
- Hornhinden blokeres i 1 time ved 37 °C i 4 ml 1x PBS indeholdende 2 % bovin serumalbumin og 2 % gedeserum.
- Inkuber i 1 ml blokerende opløsning indeholdende 2,5 μg/ml primært antistofmus anti-ZO-1 i 1 time ved 37 °C, og vask derefter tre gange i 4 ml 1x PBS i 30 minutter hver.
BEMÆRK: Pladen kan vippes under antistoffarvning for at minimere mængden af nødvendige reagenser. Bare sørg for, at hele hornhinden er helt nedsænket i antistofopløsning. - Udfør EdU Click-iT-reaktionen ved hjælp af en cocktail indeholdende 0,88 mg / ml ascorbinsyre, 0,26 mg / ml CuSO4 og 2,5 μM Alexa Fluor 488azid.
- Forbered reaktionskomponenter
- Der tilsættes 500 μL 1x PBS til 88 mg ascorbinsyre og hvirvel, indtil det er opløst.
- Tilsæt 840 μL deioniseret vand til 44 mg CuSO4 og hvirvel, indtil det er opløst.
- Forbered cocktail ved at tilsætte følgende reagenser til 6 ml 1x PBS i denne rækkefølge, inverter rør til blanding efter hver tilsætning: 30 μL ascorbinsyreopløsning, 30 μL CuSO4-opløsning og derefter 15 μL Alexa Fluor 488
BEMÆRK: Når den er forberedt, er denne opløsning lysfølsom. I resten af protokollen bør hornhinden beskyttes mod lys, når det er muligt. - Tilsæt 1 ml EdU-reaktionscocktail til hver hornhinde og reager i 1 time ved stuetemperatur.
- Forbered reaktionskomponenter
- Tilsæt 4 ml 10 μg/ml Hoechst 33342 til hver hornhinde og reager i 2 minutter ved stuetemperatur, vask derefter tre gange i 1x PBS-T i 30 minutter hver.
- Inkuber i 1 ml blokerende opløsning indeholdende 2 μg / ml Alexa Fluor 555 mærket ged anti-mus IgG i 1 time ved 37 ° C, vask derefter tre gange i 1x PBS-T i 30 minutter hver.
- Opbevar hornhinden ved 4 °C i 4 ml 1x PBS med 1 % anti/anti, 0,1 % ciprofloxacin og 0,1 % amphotericin B for at forhindre mikrobiel vækst.
- Når du udfører konfokal billeddannelse, skal du montere hele hornhinden i 200 μL monteringsmedium på glasrutschebaner med dæksler tapet ned for at flade ud.
8. Trypan billedanalyse
- Udfør al billedanalyse ved hjælp af NIH's open source-software ImageJ. Åbn et billede ved hjælp af Filer > Åbn , og klik på Billede > Juster > farvetærskel.
- Brug skyderne "Hue" til kun at omfatte det blå område, og juster den øverste skyder "Lysstyrke" helt til venstre for at inkludere mere af det farvede område.
BEMÆRK: Hvis denne handling medfører, at dele af billedet, der ikke er Trypan-farvede, medtages, kan skyderen "Lysstyrke" returneres til sit oprindelige niveau. - Juster langsomt den øverste skyder "Mætning", indtil tærsklen nøjagtigt skitserer det farvede område.
BEMÆRK: Det er nyttigt at have en kopi af det originale billede åbent for at henvise til under denne proces. - Klik på knappen Vælg i farvetærskelmenuen, og brug derefter markeringspenselværktøjet til at fravælge områder uden for det sår, der blev samlet op.
- Klik på Analysér > Måling for at rapportere det farvede område i pixels.
- Fjern markeringen af alle ved hjælp af Rediger > Markering > Vælg ingen , og brug det ovale markeringsværktøj til at passe limbus så tæt som muligt, og klik derefter på Analysér > Måling for at rapportere hornhindens areal i pixels.
BEMÆRK: Lysstyrken kan skrues midlertidigt op for at hjælpe med visualisering af limbus, hvis denne del af billedet er for mørk. - Optag arealværdier og divider det farvede område med arealet af hele hornhinden, og multiplicer derefter med 100 for at beregne procentdelen farvet.
- Gentag denne proces to gange mere for hvert billede, og tag derefter gennemsnittet af de tre målinger.
9. Statistisk analyse
- Når alle billeder er blevet analyseret, divideres den gennemsnitlige procentdel, der er farvet på dag 14, med den procentdel, der er farvet på dag 0 for at bestemme det resterende uhelede område. Træk dette beløb fra 100% for at beregne procentdelen af det strippede område, der er helet over 14 dage.
- Brug en parret t-test til at sammenligne procentvise helbredte værdier mellem kontrol- og behandlingsgrupper.
Representative Results
Dette eksperiment blev oprindeligt udført i 10 par normale forskningshornhindene, da de er lettest tilgængelige. Når metoden viste sig at være vellykket, blev undersøgelsen replikeret i 11 par dystrofiske hornhinden - mærket som sådan af øjenbanker baseret på spekulær evaluering - for at studere virkningerne af eFGF1 (NM141) i hornhindene, der er repræsentative for FECD-patientpopulationen. For større klinisk relevans repræsenterer tallene i dette arbejde data indsamlet fra dystrofiske hornhindene, medmindre andet er angivet.
Efter at have simuleret det kirurgiske resultat af DSO blev Trypan Blue-farvning udført og gentaget i hele 14-dages dyrkningsperioden, og reduktionen i positiv farvning kvantificeret for at evaluere sårheling (figur 2). Alizarin Rød farvning blev også udført på dag 14 for at afgrænse cellegrænser. Mørkerøde områder uden synligt klart mønster (i det følgende benævnt negativ farvning) optrådte konsekvent inden for den uhelede del af læsionen og i andre områder af hornhinden, hvor celler formodedes at være beskadiget eller manglede. Områder, der farvede positivt for Trypan Blue på dag 14, svarede godt til negativ farvning af Alizarin Red (figur 2). Alle dystrofiske hornhindene behandlet med eFGF1 (NM141) viste større heling på dag 14 sammenlignet med den ubehandlede mage. I gennemsnit viste behandlede hornhinden 91% heling i modsætning til 38% i kontrolhornherne, og denne forskel var statistisk signifikant (p < 0,001) (figur 3A). Dette kan sammenlignes med resultater opnået fra 20 normale hornhindene, hvor kontroller viste et gennemsnit på 32% heling og behandlede hornhinden nåede 81%, hvilket igen var statistisk signifikant (p < 0,001) (supplerende figur 1). Den procentdel, der blev helbredt, blev sammenlignet mellem normale og dystrofiske hornhinden ved hjælp af to prøve t-tests, der antog samme varians, og der blev ikke set nogen signifikant forskel i hverken kontrol- eller behandlingsgrupperne (data ikke vist).
Donoroplysninger fra øjenbanker (tabel 1) for både normale og dystrofiske hornhiner blev analyseret for at afgøre, om karakteristika, herunder alder, dage opbevaret i Optisol, død til indsamlingsinterval, celletæthed og køn korrelerer med helbredelse. Pearsons korrelationskoefficient (r) blev brugt til at undersøge alle faktorer undtagen køn, som blev evalueret ved hjælp af en uparret t-test for at sammenligne helbredelse mellem mænd og kvinder. Den absolutte værdi af r var under 0,25 i alle tilfælde, hvilket indikerer, at eventuelle sammenhænge mellem helbredelse og alder, dage lagret i Optisol, død til indsamlingsinterval eller celletæthed blev betragtet som ubetydelige. Forskellen i helbredelse mellem mænd og kvinder var ikke statistisk signifikant (p = 0,53).
I lighed med det normale datasæt præsenterede 10 af de 22 dystrofiske hornhhornherne bemærkelsesværdig Trypan-farvning uden for det strippede område, der er forbundet med det farvede område inden for læsionen i mindst et tidspunkt (normalt dag 3) - en observation, vi kaldte perifer farvning (figur 4A). Af disse 10 var kun to kontrolhornhindene, hvis behandlede modparter ikke udviste den samme virkning. De resterende otte var alle matchede par og præsenteret med samme sværhedsgrad mellem hornhindene fra samme individ. Selvom farvningsmønstre var sammenlignelige mellem normale og dystrofiske hornhindene, var hyppigheden af perifer farvning højere i det dystrofiske datasæt med 45% af hornhinderne positive sammenlignet med 25% i den normale gruppe. Figur 4A viser et par, der blev betragtet som positivt for perifer farvning, da det farvede område uden for læsionen mødte sårkanten i dag 6-billederne og gradvist trak sig tilbage. I de tilsvarende Alizarin Red-billeder syntes celler i områder med perifer Trypan-farvning forstørret og unormalt formet, ligesom de celler, der migrerede ind i det strippede område, og negativ farvning korrelerede med de områder, hvor Trypan Blue var til stede på dag 14. På trods af den store del af hornhinden, der blev påvirket i hele kulturperioden, forekom delvis eller fuldstændig rydning af den farvede periferi i alle 10 hornhindene. Derudover var den sidste procent, der blev helbredt på dag 14, inden for det normale interval, respektive behandlingsgruppe, for alle undtagen en hornhinde. Outlier (0811L, afbildet i figur 4A) returnerede en negativ procent helet værdi på grund af resterne af perifer farvning, der stadig er forbundet med læsionsområdet på dag 14 (figur 3A og figur 4A). Et andet farvningsmønster, kaldet langt perifer farvning, blev fanget i Alizarin Red-billederne fra figur 4B, men var også tydeligt i Trypan Blue-billeder i hele kulturperioden i mange hornhiner (figur 4B). Denne observation er kendetegnet ved en ring af mørk farvning omkring limbus, hvilket indikerer kompromitteret endotel. På trods af udtrykket var dette mønster så almindeligt i både normale og dystrofiske hornhinden, at de ikke blev regnet som positive for perifer farvning. På disse billeder viste kontrolhornhinden mere levende og omfattende farvning på dag 14, på trods af at begge hornhinden havde samme sværhedsgrad og mønster af farvning tidligt i kulturperioden. Også bemærket i den behandlede hornhinde var et tilsyneladende større antal celler, som syntes mere kompakte og sekskantede sammenlignet med kontrol, selvom disse observationer ikke blev kvantitativt målt. På grund af krumningen i periferien blev kun Trypan-farvning inden for og umiddelbart omkring det strippede område inkluderet i kvantitativ analyse. Når procentfarvede værdier blev gennemsnitligt på tværs af alle dystrofiske hornhindene, resulterede fremkomsten af perifer farvning i en indledende stigning fra dag 0 i modsætning til det stadige fald, der blev set i normale hornhindene, hvor perifer farvning var mindre udbredt (figur 3B).
Immunohistokemi visualiseret ved konfokal billeddannelse afslører semi-organiseret ekspression af ZO-1, en funktionel markør for CEC-tætte kryds, i og omkring læsionskanten (figur 5), et mønster, der ligeledes fremgår af Alizarin Red farvning (figur 2 og figur 4). Pleomorfisme og polymegathisme er synlige ved ZO-1 i de fleste dystrofiske hornhindene; denne observation kan dog tilskrives deres syge tilstand og blev bemærket af øjenbanken ved spekulær undersøgelse af hornhinderne inden dyrkning. Uorganiseret ZO-1-ekspression observeres inden for læsionsområdet for behandlede hornhinden, hvor celler var migreret indad, også i overensstemmelse med Alizarin Red-mønstrene. EdU-inkorporerende celler kan ses omkring læsionens grænse og inde i det læsionerede område i kontrol og behandlede hornhinden (figur 5). Mønsteret af migrerede CEC'er afspejler også Trypan Blue-resultaterne, hvor der i kontrolhornhinden blev fundet inden for to felter i læsionskanten, mens CEC'er i behandlede hornhinden kan ses i hele det strippede område (figur 2).
EdU-mærkning blev udført som en kvalitativ foranstaltning i denne undersøgelse for at bekræfte, at spredning bidrog til helbredelse. Kvantificering af celler, der inkorporerer EdU, kunne imidlertid ikke udføres systematisk på grund af hornhindehævelse, der forhindrede konsistente, replikerbare billeder i at blive taget i og omkring læsionen. Som surrogat er kvantitativ analyse udført i en undersøgelse udført forud for etableringen af DSO-modellen medtaget for at påvise virkningerne af eFGF-1 (NM141) på spredning (figur 6). Normale humane donorhornhiner blev skåret i kvarte ved hjælp af en skalpel og dyrket i nærværelse af EdU, med eller uden eFGF1 (NM141) i 48 timer som beskrevet tidligere (Eveleth, 2020)16. Billeddannelse og efterfølgende analyse af Hoechst 33342 og EdU-mærkede celler blev udført separat i den uforstyrrede midterzone i kvartalerne og i kantzonen inden for tre felter, hvorfra hornhinden blev skåret. I den midterste zone var procentdelen af celler, der inkorporerede EdU, lav og meget variabel på tværs af de 10 hornhindene, der blev analyseret. I gennemsnit havde kvartaler behandlet med eFGF1 (NM141) højere niveauer af EdU-inkorporering i mellemzonen (4,1% ± 7,9%) sammenlignet med kontroller (1,8% ± 2,9%), selvom denne forskel ikke var statistisk signifikant (p = 0,239). Ved sårkanten viste behandlede kvartaler stimuleret med eFGF1 (NM141) signifikant højere EdU-inkorporeringshastigheder i gennemsnit (18,1% ± 11,5%) sammenlignet med kontrolkvartaler (10% ± 9,6%, p = 0,012).
Tabel 1: Donoroplysninger for 22 dystrofiske og 20 normale hornhindene, der blev anvendt i denne undersøgelse, samt 10 normale hornhindene, der tidligere blev brugt til EdU-kvantation. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 2: Vital farvestoffarvning af hornhinden efter Descemets stripning. Dystrofiske humane hornhinder blev frataget de centrale 4 mm af Descemets membran og inkuberet med eller uden eFGF1 (NM141) (100 ng/ml) i 14 dage. Læsioner blev visualiseret af Trypan Blue farvning på dag 0, 3, 6, 9, 12 og 14. CEC grænser blev visualiseret af Alizarin Red farvning på dag 14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dystrofiske humane hornhindene viser signifikant større heling fra DSO, når de dyrkes med eFGF1 (NM141). (A) Procent heling blev bestemt ved at måle det farvede område på dag 14 ved hjælp af ImageJ og sammenligne det med procentdelen farvet på dag 0. (B) Den gennemsnitlige procentdel, der er farvet graferet over tid, viser et konsekvent fald i normale hornhindene, mens den topper på dag 3 i dystrofiske hornhinden på grund af den højere forekomst af perifer farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vital farvestoffarvning af dystrofiske hornhinden med perifer farvning. (A) Trypan-farvning af den intakte Descemets membran kan ses fremad mod midten og derefter rydde over tid i både kontrol og behandlede hornhinder. (B) Alizarinmønstre omkring limbus repræsenterer en typisk observation af perifer skade og uorganiseret genetablering af endotelet set i mange donorhornhindene - i dette tilfælde dystrofisk. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Stimulering af migration og spredning af CEC'er ved hjælp af eFGF1 (NM141) i strippede dystrofiske hornhindene. Konfokale mikrografer af Descemets strippede hornhoder farvet til ZO-1 (rød), EdU (grøn) og Hoechst 33342 (blå). Den prikkede linje repræsenterer læsionskanten med det strippede område på venstre side af billedet og den intakte Descemets membran til højre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kvantitering af prolifererende celler fra normale hornhindene, der er kvartet ved hjælp af en skalpel og inkuberet i medier, der indeholder EdU med eller uden eFGF-1 (NM141) i 48 timer. Kvartaler blev afbildet i tre eksemplarer i den uforstyrrede midterzone og langs den afskårne kant, og tællinger i gennemsnit blev for at bestemme procentdelen af celler, der inkorporerede EdU i midter- og kantzonerne. Figur ændret fra Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, anvendt med tilladelse16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Normale humane hornhindene viser signifikant større heling fra DSO, når de dyrkes med eFGF1 (NM141). ImageJ blev brugt til at måle de farvede områder og bestemme % heling. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Mange øjenlæger er bekymrede for at anbefale DSO til deres patienter af to hovedårsager: 1) den langvarige helingsproces og 2) mangel på data (DSO er et nyt koncept inden for oftalmisk kirurgi). Den forskning, vi har præsenteret, ville være til stor nytte for at lette begge disse bekymringer. Baseret på data fra dette studie og andre har FDA godkendt et klinisk fase 2-forsøg, hvor eFGF1 (NM141) vil blive administreret ved forskellige doseringsplaner til patienter, der gennemgår DSO17.
Metoden beskrevet ovenfor blev modelleret efter en undersøgelse udført af Soh et al., hvor hornhindeendotelheling blev evalueret med og uden ROCK-hæmmeren Y-27632 i både ridsede og skrællede sår18. Mens Y-27632 accelererede endotelregenerering med Descemets membran stadig intakt, blev der ikke fundet nogen væsentlig heling i strippede sår, selv med behandling. Ved hjælp af en lignende strippeteknik efterfulgt af behandling med eller uden eFGF1 (NM141) var de observationer, vi fandt, ikke i overensstemmelse med Soh og kollegers. Fraværet af Trypan Blue-farvning i mange behandlede hornhinden på dag 14 og tilstedeværelsen af ZO-1-positive tætte kryds inden for det reformerede endotellag hævder, at en intakt barriere, en del af CEC's naturlige funktion, blev genoprettet i både normale og dystrofiske hornhindene. Selvom det ikke er kvantificeret i denne undersøgelse, antyder tilstedeværelsen af EdU-positive celler i og omkring det strippede område også spredning som en helingsmekanisme, som vi tidligere har fastslået kan stimuleres af eFGF1 (NM141) i skadede hornhindene16. Statistisk analyse viste, at behandling med eFGF1 (NM141) resulterede i signifikant større heling fra DSO, i gennemsnit over dobbelt så høj som kontrolhornherne på 14-dages tidspunktet. Selvom helingshastighederne varierer moderat mellem individer - et typisk kendetegn ved donorhornhindene - viser resultaternes replikabilitet over store prøvestørrelser også en meget målbar metode. Så vidt vi ved, er der ingen andre eksempler på en ex vivo Descemets strippemodel i litteraturen.
Nøglekomponenter i selve protokollen, der ville tjene værdifuldt for andre forskere, der studerer DSO, er brugen af Trypan Blue til at detektere bar stroma og billedbehandlingsteknikken, der bruges til at måle det farvede område. Trypan Blue er almindeligt anvendt i oftalmisk kirurgi, især når man arbejder med Descemets membran for at detektere ikke-levedygtige celler og hjælpe med synlighed af vævet. De farvningstidspunkter, der er inkluderet i denne protokol, tillod effektiv gentagen farvning uden at udsætte hornhinderne for Trypan Blue, da det har vist sig at være giftigt for CEC'er i høje koncentrationer19. Reduktionen af farvet areal over 14 dage i alle hornhindene, bekræftet af Alizarin Red og immunohistokemi at være resultatet af migrerede CEC'er, viser en enkel og reproducerbar metode til måling af heling. Ved hjælp af ImageJ's farvetærskelmenu indsamlede flere analytikere data med standardafvigelser konsekvent under 1% (data vises ikke). Selvom alternative programmer kan fungere på samme måde, er ImageJ en open source-software, der er i stand til at producere nøjagtige områdemålinger for at spore helbredelse.
Der er dog et aspekt af stripningsprotokollen, som vi fandt både nødvendigt for sårskabelse, men alligevel hindrende for den samlede helingsproces. Brug af en skarp 30 G-nål til at score Descemets membran langs det mærke, der efterlades af biopsistansen, muliggør skabelsen af et glat, cirkulært sår, som klinikere bemærker for at understøtte hurtigere heling10. Samtidig er dette trin skadeligt for hornhinden, da det kan skabe tårer i stromalfibrene, der forårsager stromal celledød, hindrer migration af endotelceller over sårkanten og inducerer dannelsen af knuder, der resulterer i mere vedvarende postoperativt ødem20. Klinikere, der udfører DSO, bruger typisk en omvendt Sinskey-krog til at starte såret, men uden noget intraokulært tryk, der holder hornhinden stram, er dette værktøj mindre effektivt i ex vivo-modellen . Et alternativt værktøj, der er i stand til at rive Descemets membran uden at beskadige den underliggende stroma, ville forbedre protokollen, for eksempel vandings- og aspirationshåndstykket, der anbefales af Macsai og Shiloach10. Yderligere eksperimenter vil være nødvendige for at afgøre, om denne teknik er kompatibel med ex vivo-modellen .
En udfordring, der synes at være forbundet med ex vivo-modellen, er den hyppige forekomst af CEC-død i det område, der er perifert for såret, især i dystrofiske hornhindene. Denne lejlighedsvis skjulte kvantation af sårområdet, da nøjagtigheden af farvetærskelværktøjet bliver mere begrænset, da det farvede område strækker sig ud over hornhindens centrum, hvor dets krumning resulterer i ujævn lysfordeling. Disse variable målinger fandt dog primært sted på tidligere tidspunkter, før perifer farvning gradvist trak sig tilbage, da beskadigede CEC'er ryddede og naboceller strakte sig, migrerede eller spredte sig for at erstatte dem. Ved det sidste 14 dages tidspunkt var det farvede område lokaliseret tilbage til midten af hornhinden, og alle billeder var målbare. En lignende observation blev gjort med sammenlignelig frekvens af Soh et al., hvor fem af 14 normale hornhindene præsenterede, hvad de kaldte 'Premature Culture Failure' (PCF) tidligt i kulturperioden18. Mens skaden vendte sig over tid i vores hornhinden og alligevel var permanent i deres tilfælde, kan dette tilskrives det faktum, at deres metode krævede at såre et større område af hornhinden. Observationen af mere udbredt perifer Trypan-farvning i dystrofiske hornhindene kan indikere, at dystrofiske hornhindene er mere modtagelige for endotelcelledød end sunde hornhindene. Mens den nøjagtige årsag til denne celledød endnu ikke er belyst, mener vi, at det er usandsynligt, at dette spørgsmål vil være relevant for menneskelige hornhinden in vivo. Skader på det perifere endotel er ikke rapporteret i nogen kliniske casestudier af DSO til vores viden, hvilket tyder på, at dette fænomen er unikt for donorhornhinden dyrket ex vivo 6,8,10,11,21. Bortset fra to tilfælde, hvor kun kontrolhornhinden var farvet, blev alle observationer af perifer farvning parret, så det er usandsynligt, at årsagen var eksponering for eFGF1 (NM141). Det er imidlertid muligt, at behandlingen i disse tilfælde kan have givet en beskyttende virkning mod den skade, der ellers ville have fremkaldt perifer farvning i begge hornhindene. Yderligere undersøgelse af denne hypotese er nødvendig.
En anden begrænsning af denne metode er sourcing af donorhornhiner, der er repræsentative for FECD-fænotypen, som DSO er beregnet til. Donorhornhindene af enhver art er knappe, og derfor er der behov for en operation, der undgår brugen af donorvæv. Til vores formål er de eneste hornhhorn, der er tilgængelige, dem, der afvises fra transplantation af forskellige årsager. Øjenbanker klassificerer yderligere disse hornhinden som normale eller dystrofiske baseret på kriterier, herunder tilstedeværelse af guttae, lavt eller ikke-målbart ECD og uregelmæssig CEC-morfologi. Bekræftelse af en dystrofisk diagnose inden accept af væv fra en øjenbank er også næsten umulig, da de fleste donorers sygehistorie ikke omfatter tidligere okulær historie, og de eneste oplysninger, der gives, er ECD-værdien, teknikerens noter og i nogle tilfælde et repræsentativt spekulært billede. De dystrofiske hornhindene opnået til denne undersøgelse viste ikke sammenflydende central guttae ved konfokal mikroskopi udført efter dyrkningsperioden var afsluttet, hvilket tyder på, at de kan repræsentere "tidlige" stadier af FECD. Vi forventer ikke, at dette vil have en væsentlig indvirkning på konsekvenserne af undersøgelsen, da formålet med DSO er at fjerne sammenflydende områder af guttae, så sunde perifere celler kan migrere indad.
Denne metode giver en meget anvendelig og reproducerbar teknik til evaluering af agenser, der kan påvirke CEC-spredning og migration. Modellen har flere funktioner, der gør den mere fysiologisk relevant end in vitro-modeller, der involverer dyrkede CEC'er, selv når den sås på humant hornhindevævstransplantat 22,23,24. For det første er de CEC'er, der skal stimuleres, i et monolag, nøjagtigt som de findes i patientens øje, og migrerer over hornhindestromaen, som de ville efter klinisk DSO. Den pågældende stroma er fra samme patient som CEC'erne og kontrollerer således for potentielle FECD-relaterede stromalforskelle. Der er ingen grund til at udplante, dissociere og udvide kulturer af CEC'er med de tilhørende udfordringer og potentiale for Endothelial to Mesenchymal Transition (EnMT) under dyrkningsprocessen. Den beskrevne protokol ligner i sig selv meget den kliniske DSO-procedure. Selvom det omgår kultur- og ekspansionstrinnene, har denne metode den begrænsning, at undersøgelsens varighed er begrænset af hornhindehævelse, da epitellaget ikke opretholdes. Dette forhindrer os i at undersøge morfologien af CEC'er, der er migreret for at dække det strippede område, hvilket efterlader det uklart, om de til sidst vil omarrangere sig til et sekskantet array i denne model. Garcin et al. har udviklet en potentiel løsning med deres aktive opbevaringsmaskine (ASM), en enhed, der har vist sig at holde hornhinden i kultur i op til 3 måneder med betydeligt mindre ødem end hornhindene, der opretholdes i traditionel organkultur25. En sådan anordning kan være nyttig til at replikere og udvide dette arbejde.
Denne model har potentiel nytteværdi til at teste andre sårhelingsterapier (f.eks. ROCK-hæmmere), evaluere ændringer af kirurgisk teknik og sammenligne heling på tværs af forskellige donorpopulationer eller sygdomsstadier. Vi håber, at denne forskning sammen med kliniske forsøgsdata, når den kommer ud, tilskynder klinikere til at overveje DSO som en værdifuld behandlingsmulighed for deres kvalificerede FECD-patienter.
Disclosures
DDE, SP, GD og JW er ansatte i og har egenkapital i Trefoil Therapeutics, Inc. DDE er opfinder på patenter, der dækker eFGF1 (NM141).
Acknowledgments
Finansiering til dette arbejde blev støttet af Trefoil Therapeutics og NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. Forfatterne vil gerne takke Tony Wong for histopatologiske råd og tjenester, Nikon Imaging Center ved UC San Diego for brug af deres konfokale mikroskop og Dr. Natalie Afshari og Marian Macsai for deres råd om kirurgisk teknik. Derudover udtrykker forfatterne deres taknemmelighed over for øjendonorerne og øjenbankerne for at have leveret hornhinden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
| 0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
| 0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
| 10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
| 12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
| 15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| 2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
| 310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
| 5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
| 6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
| Analytical balance | Sartorious | R200D | |
| Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
| Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
| Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
| Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
| Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
| Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
| Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
| Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
| Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
| Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
| ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
| Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
| Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
| Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
| L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
| Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
| Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
| N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
| Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
| Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
| Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
| Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
| Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
| Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
| Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
| Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
| Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
| Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
| Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
| Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
| Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
| Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
| Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
| VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |
References
- Eghrari, A. O., Gottsch, J. D.
- Ku, B., et al. Endothelial cell loss in penetrating keratoplasty, endothelial keratoplasty, and deep anterior lamellar keratoplasty. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (4), 199 (2017).
- Gain, P., et al. Global survey of corneal transplantation and eye banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Braunstein, R. E., Airiani, S., Chang, M. A., Odrich, M. G. Corneal edema resolution after "descemetorhexis". Journal of Cataract and Refractive Surgery. 29 (7), 1436-1439 (2003).
- Pan, J. C., Eong, K. G. A. Spontaneous resolution of corneal oedema after inadvertent 'descemetorhexis' during cataract surgery. Clinical and Experimental Ophthalmology. 34 (9), 896-897 (2006).
- Shah, R. D., et al. Spontaneous corneal clearing after Descemet's stripping without endothelial replacement. Ophthalmology. 119 (2), 256-260 (2012).
- Ziaei, M., Barsam, A., Mearza, A. Spontaneous corneal clearance despite graft removal in Descemet stripping endothelial keratoplasty in Fuchs endothelial dystrophy. Cornea. 32 (7), 164-166 (2013).
- Huang, M. J., Kane, S., Dhaliwal, D. K. Descemetorhexis without endothelial keratoplasty versus DMEK for treatment of fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 37 (12), 1497 (2018).
- Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Pilot study of corneal clearance with the use of a rho-kinase inhibitor after descemetorhexis without endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 40 (7), 899-902 (2021).
- Macsai, M. S., Shiloach, M. Use of topical rho kinase inhibitors in the treatment of Fuchs dystrophy after Descemet stripping only. Cornea. 38 (5), 529-534 (2019).
- Moloney, G., et al. Descemetorhexis without grafting for Fuchs endothelial dystrophy-supplementation with topical ripasudil. Cornea. 36 (6), 642-648 (2017).
- Thalmann-Goetsch, A., Engelmann, K., Bednarz, J. Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 75 (5), 490-495 (1997).
- Landshman, N., et al. Regeneration of cat corneal endothelium induced in vivo by fibroblast growth factor. Experimental Eye Research. 45 (6), 805-811 (1987).
- Lee, J., Blaber, M. Increased functional half-life of fibroblast growth factor-1 by recovering a vestigial disulfide bond. Journal of Proteins & Proteomics. 1, 37-42 (2010).
- Xia, X., et al. Engineering a cysteine-free form of human fibroblast growth factor-1 for "second generation" therapeutic application. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (4), 1444-1453 (2016).
- Eveleth, D., Pizzuto, S., Weant, J., Jenkins-Eveleth, J., Bradshaw, R. Proliferation of human corneal endothelia in organ culture stimulated by wounding and the engineered human fibroblast growth factor 1 derivative TTHX1114. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: the Official Journal of the. 36 (9), 686-696 (2020).
- Tremblay, T. M. TTHX1114(NM141) in Combination With DWEK/DSO. ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&draw=2&rank=2 (2020).
- Soh, Y. Q., et al. Predicative factors for corneal endothelial cell migration). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 338-348 (2016).
- van Dooren, B. T. H., Beekhuis, W. H., Pels, E. Biocompatibility of trypan blue with human corneal cells. Archives of Ophthalmology. 122, Chicago, Ill: 1960 (2004).
- Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Predictive Factors for Corneal Clearance After Descemetorhexis Without Endothelial Keratoplasty. Cornea. 37 (2), 736-742 (2018).
- Borkar, D. S., Veldman, P., Colby, K. A. Treatment of Fuchs endothelial dystrophy by Descemet stripping without endothelial keratoplasty. Cornea. 35 (10), 1267-1273 (2016).
- Amano, S., Mimura, T., Yamagami, S., Osakabe, Y., Miyata, K. Properties of corneas reconstructed with cultured human corneal endothelial cells and human corneal stroma. Japanese Journal of Ophthalmology. 49 (6), 448-452 (2005).
- Rolev, K., OʼDonovan, D. G., Coussons, P., King, L., Rajan, M. S. Feasibility study of human corneal endothelial cell transplantation using an in vitro human corneal model. Cornea. 37 (6), 778-784 (2018).
- Spinozzi, D., et al. In vitro evaluation and transplantation of human corneal endothelial cells cultured on biocompatible carriers. Cell Transplantation. 29, 1-11 (2020).
- Garcin, T., et al. Three-month storage of human corneas in an active storage machine. Transplantation. 104 (6), 1159-1165 (2020).
