Summary
Descemet's Stripping Only är ett experimentellt förfarande där patienter med centrala hornhinnan guttae som härrör från Fuchs Endotelial Corneal Dystrophy har Descemets membran strippat för perifera celler för att regenerera endotelskiktet. Vi presenterar ny metodik som simulerar DSO i dystrofa mänskliga hornhinnor ex vivo med accelererad läkning stimulerad av eFGF1 (NM141).
Abstract
Fuchs Endotelial Corneal Dystrophy (FECD) är resultatet av dysfunktionella hornhinnans endotelceller (CEC) och behandlas för närvarande genom transplantation av hela hornhinnan eller Descemets membran. Den senaste utvecklingen inom okulär kirurgi har etablerat Descemets Stripping Only (DSO), en kirurgisk teknik där en central cirkel av guttaetät Descemets membran avlägsnas för att möjliggöra migrering av CEC till den släta stroma, vilket återställer funktion och syn till hornhinnan. Även om detta potentiella behandlingsalternativ är av stort intresse inom oftalmisk forskning, har inga framgångsrika ex vivo-modeller av DSO etablerats och kliniska data är begränsade. Detta arbete presenterar en ny sårläkningsmodell som simulerar DSO i mänskliga donatorkorneor. Med hjälp av detta tillvägagångssätt för att utvärdera effekten av den mänskligt konstruerade FGF1 (NM141) fann vi att behandlingen påskyndade läkning via stimulering av migration och spridning av CEC. Detta fynd bekräftades hos 11 par humana hornhinnor med tecken på dystrofi som rapporterats av ögonbankerna för att verifiera att dessa resultat kan replikeras hos patienter med Fuchs dystrofi, som målpopulation för DSO-proceduren.
Introduction
Fuchs Endotelial Corneal Dystrophy (FECD) är en sjukdom som kännetecknas av förlorad pumpfunktion i hornhinnans endotelceller (CEC) och överdriven uppbyggnad av kollagen och andra extracellulära matrisproteiner på ytan av Descemets membran, som bildar hornhinnans guttae1. Den enda kända behandlingen för FECD är endotelial keratoplastik i varierande former, som alla medför risk för avstötning och endotelcellförlust2. Medan framsteg inom oftalmisk kirurgi har gjort det möjligt för dessa förfaranden att bli mindre invasiva med tiden, någon form av transplantation kommer med risken för avstötning och möjlighet till livstid steroidanvändning, en behandling med sina egna samtidiga biverkningar. Dessutom är den globala bristen på donatorvävnad sådan att endast en donator hornhinna är tillgänglig för varje 70 patienter i behov3. Med tanke på dessa utmaningar utforskar forskare och kliniker kirurgiska metoder som helt undviker behovet av donatorvävnad. En av dessa experimentella tekniker är Descemets Stripping Only (DSO) eller Descemetorhexis utan endotel keratoplastik (DWEK), där FECD-patienter med guttae lokaliserade till mitten av hornhinnan har en central 4 mm cirkel av Descemets membran strippad utan transplantatplacering. Avlägsnandet av guttae uppmuntrar friska perifera celler att migrera inåt och reformera endotelmonoskiktet, så småningom vända stromalt ödem och förbättra synen. Konceptet beskrevs ursprungligen i en serie fallstudier där patienter genomgick operation som komplicerades av avlägsnande av Descemets membran, men CEC-återpopulation inträffade fortfarande 4,5,6,7. Även om det finns många fördelar med denna metod är läkningsprocessen lång och inkonsekvent, eftersom vissa patienter kräver räddningstransplantation om ingen läkning ses under månaderna efter operation8. Av dessa skäl kan ett läkemedel som stimulerar snabbare migration och spridning av CEC vara fördelaktigt i återhämtningsprocessen för FECD-patienter som har genomgått DSO.
Flera nyligen genomförda studier har utvärderat ROCK-hämmare som en kompletterande behandling för patienter som genomgår DSO, och funnit att behandlade patienter återhämtade sig snabbare och hade högre centrala endotelcelltätheter (ECD) än de i DSO endast grupp 9,10,11. På grund av små provstorlekar och skillnader mellan doseringsregimer behövs dock mer data för att bättre förstå effekten av ROCK-hämmare i denna inställning.
Fibroblasttillväxtfaktorer har också visat sig stimulera regenerering av hornhinnans endotel både in vitro med bovina CEC och in vivo i katthinnan12,13. eFGF1 (NM141) är en konstruerad version av FGF-1 som innehåller flera aminosyrasubstitutioner för att stabilisera molekylen, i motsats till den inhemska FGF-1, som har en mycket kortare halveringstidpå 14,15. Vi har tidigare visat förmågan hos eFGF1 (NM141) att stimulera spridning av CEC ex vivo i kvartade humana hornhinnor16. Denna studie försökte förbättra det arbetet genom att etablera den första framgångsrika ex vivo-modellen av DSO i både normala och dystrofa hornhinnor för att avgöra om tilläggsbehandlingar som eFGF1 (NM141) påskyndar läkning i denna applikation.
Protocol
Detta arbete använde befintliga exemplar utan identifiering av försökspersoner och är undantaget från IRB-godkännande enligt 45 CFR 46.101 (b) (4).
Hornhinnor med mänsklig donator erhölls från olika ögonbanker över hela USA (se materialtabell). Hornhinnor bedömdes individuellt dystrofa av ögonbankerna baserat på fynd som guttae, pleomorfism, polymegathism och / eller låg ECD vid spekulär utvärdering. Figur 1 presenterar Trypan Blue färgning i hornhinnan under sårskapande, omedelbart efter strippning och efter 2 veckor i kultur.
Figur 1: Diagram som representerar hornhinnan under sårskapande, omedelbart efter strippning och efter 14 dagar i kultur som visualiseras av Trypan Blue. Minskningen av färgat område mellan dessa tidpunkter mättes för att bestämma läkningsnivån. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Sår skapande
- Använd sterila pincett, ta bort hornhinnan från media och skölj i 1x PBS för att ta bort kvarvarande media och cellrester. Efter sköljning, placera hornhinnans endotelsida uppåt på locket på en petriskål.
- Pipettera 30 μL Trypan Blue till en välformad skål. Doppa en ny 4 mm biopsistans i Trypan Blue och knacka bort eventuellt överskott.
- Använd båda händerna och placera stansen ovanför mitten av hornhinnan och sänk den rakt ner på endotelytan och applicera minimalt tryck.
- Utan att ändra position eller tryck på hornhinnan, flytta stansen till ena handen och sträck dig efter pincett med den nyligen frigjorda handen. Använd tången för att hålla hornhinnan på plats medan du försiktigt vrider biopsistansen cirka 90 ° fram och tillbaka flera gånger.
- Lyft stansen rakt upp från hornhinnan och lägg åt sidan.
- Skölj en gång till i 1x PBS för att ta bort överskott av Trypan Blue.
2. Descemets strippning
- Överför hornhinnan på ett petriskålslock till ett dissekerande omfång.
OBS: Låt inte hornhinnan torka längre än 5 min. Om mer tid behövs för att slutföra processen, skölj igen i 1x PBS för att rehydrera endotelet. - Håll hornhinnan på plats med böjda pincett, gör Descemets membran genom att lätt dra spetsen på en skarp 30 G nål längs ringen av Trypan Blue som lämnas av biopsistansen. Använd minimalt tryck för att undvika att störa den underliggande stroma.
- Med en Sinskey-krok kan du använda mjuka skopa rörelser för att lyfta och dra tillbaka Descemets membran runt sårkanten och arbeta mot mitten av lesionen.
OBS: Descemets membran bör ha mycket lite motstånd. Om svårigheter upplevs drar man sannolikt upp stroma. Om detta händer, börja om igen och lyft från en ny punkt längs sårkanten. - När majoriteten av Descemets membran har separerats från stroma, använd Gorovoy-pincett för att ta bort membranet och lägg åt sidan.
- Undersök det avskalade området för eventuella återstående membranstycken och ta bort med Gorovoy-pincett.
3. Trypan Blå färgning
OBS: Efter Descemets strippning, färga hornhinnan med Trypan Blue för att visualisera sårområdet.
- Sätt tillbaka hornhinnan på ett petriskålslock till biosäkerhetsskåpet och skölj i 1x PBS innehållande 0,01% (w / v) CaCl2 och MgCl2 för att avlägsna cellskräp och underlätta tät vidhäftning av återstående CEC till det intakta Descemets membran.
- Lägg hornhinnan i en välformad skål och pipettera 30 μL Trypan Blue på endotelskiktet i 30 s.
- Använd pincett för att försiktigt gunga hornhinnan för att säkerställa att hela endotelytan är täckt.
- Skölj bort överskott av Trypan Blue i 1x PBS med 0,01% (w / v) CaCl2 och MgCl2 och avbilda den färgade hornhinnan under ett dissekerande mikroskop för dag 0-tidpunkten.
- Se till att hornhinnan är balanserad så att ljuset överförs jämnt hela tiden och positioneringen kan replikeras över tidpunkter.
OBS: Pincett kan användas för att hålla hornhinnan på plats under avbildning om det behövs.
- Se till att hornhinnan är balanserad så att ljuset överförs jämnt hela tiden och positioneringen kan replikeras över tidpunkter.
4. Kulturperioden
- Kultur hornhinnor i en sexbrunnsplatta innehållande lågserummedia bestående av OptiMEM; 1x insulin, transferrin och selen; 1x antibiotikum/antimykotisk; 0,02 mg/ml CaCl2; 0,2 mg / ml askorbinsyra; och 0,8% värmeinaktiverat fetalt bovint serum. Odla vänster hornhinna i 8 ml lågserummedia ensamt och höger hornhinna i 8 ml lågserummedier kompletterat med 100 ng/ml eFGF1 (NM141).
- Inkubera vid 37 °C med 6 % CO2 i 14 dagar med dagliga medieförändringar.
- Upprepa Trypan Blue-färgningsproceduren på dag 3, 6, 9, 12 och 14 och avbilda varje hornhinna omedelbart efter färgning. Se till att hålla kamerainställningarna konsekventa över alla tidpunkter.
- På dag 12, tillsätt 10 μM EdU till både kontroll- och eFGF1 (NM141) -kompletterade medier och inkubera i 48 timmar för att märka prolifererande celler. Förnya media med EdU tillagd igen på dag 13.
- På dag 14, 48 h efter tillsats av EdU, Trypan fläck och bild hornhinnor som vanligt, förutom istället för 1x PBS med CaCl2 och MgCl2, använd vanlig 1x PBS för sköljningar för att förhindra att kalcium interagerar med Alizarin Red fläck.
5. Alizarin Röd färgning
- På dag 14, förbered 5% Alizarin Red i 0,9% saltlösning.
OBS: Alizarin Red kommer inte att lösas upp helt i saltlösning. Vid kombination, virvellösning och sten i minst 1 h. Vortex en gång till och filtrera före användning för att ta bort oupplösta partiklar. - När Trypan-färgning och avbildning har slutförts, överför hornhinnorna till en välformad skål och tillsätt 200 μL Alizarin Red till endotelytan på varje hornhinna.
- Färga i 2 min, skölj sedan varje hornhinna i en petriskål med 1x PBS för att ta bort överskott av Alizarin Red innan du lägger i en sexbrunnsplatta förfylld med 8 ml 1x PBS i två 5 minuters tvättar.
- Efter den andra tvätten, avbilda det avskalade området på varje hornhinna under ett dissekerande mikroskop.
OBS: Till skillnad från Trypan-avbildning kan hornhinnor lämnas i 1x PBS för att avbilda Alizarin-färgning för att förhindra att de torkar ut under processen.
6. Fixering och permeabilisering
- När Alizarin-bilder har tagits, överför hornhinnor till en 12-brunnsplatta och tvätta i 4 ml 1x PBS innehållande 0,05% Tween-20 (PBS-T) i 30 minuter för att ta bort eventuella partiklar från vävnad före fixering.
- Fixera hornhinnorna i 4 ml 4% PFA i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Permeabilisera celler i 5 min i 4 ml 1x PBS innehållande 1% Triton X-100, tvätta sedan tre gånger i 4 ml vanlig 1x PBS i 30 min vardera.
7. Immunhistokemi
- Block hornhinnor i 1 timme vid 37 °C i 4 ml 1x PBS innehållande 2% bovint serumalbumin och 2% getserum.
- Inkubera i 1 ml blockerande lösning innehållande 2,5 μg/ml primär antikroppsmus anti-ZO-1 i 1 timme vid 37 °C och tvätta sedan tre gånger i 4 ml 1x PBS i 30 minuter vardera.
OBS: Plattan kan lutas under antikroppsfärgning för att minimera volymen reagens som behövs. Se bara till att hela hornhinnan är helt nedsänkt i antikroppslösning. - Utför EdU Click-iT-reaktionen med en cocktail innehållande 0,88 mg / ml askorbinsyra, 0,26 mg / ml CuSO4 och 2,5 μM Alexa Fluor 488 azid.
- Förbered reaktionskomponenter
- Tillsätt 500 μL 1x PBS till 88 mg askorbinsyra och virvel tills det är upplöst.
- Tillsätt 840 μL avjoniserat vatten till 44 mgCuSO4 och virvel tills det är upplöst.
- Förbered cocktail genom att tillsätta följande reagenser till 6 ml 1x PBS i denna ordning, invertera röret för att blanda efter varje tillsats: 30 μl askorbinsyralösning, 30 μl CuSO4-lösning och sedan 15 μL Alexa Fluor 488
OBS: När den är beredd är denna lösning ljuskänslig. Under resten av protokollet bör hornhinnor skyddas mot ljus när det är möjligt. - Tillsätt 1 ml EdU-reaktionscocktail till varje hornhinna och reagera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Förbered reaktionskomponenter
- Tillsätt 4 ml 10 μg/ml Hoechst 33342 till varje hornhinna och reagera i 2 minuter vid rumstemperatur, tvätta sedan tre gånger i 1x PBS-T i 30 minuter vardera.
- Inkubera i 1 ml blockerande lösning innehållande 2 μg / ml Alexa Fluor 555 märkt get-antimus IgG i 1 timme vid 37 ° C, tvätta sedan tre gånger i 1x PBS-T i 30 minuter vardera.
- Förvara hornhinnor vid 4 °C i 4 ml 1x PBS med 1% anti/anti, 0,1% ciprofloxacin och 0,1% Amfotericin B för att förhindra mikrobiell tillväxt.
- När du utför konfokal avbildning, montera hela hornhinnor i 200 μL monteringsmedium på glasskivor med täckglas tejpade ner för att platta.
8. Trypan Bildanalys
- Utför all bildanalys med NIH:s programvara ImageJ med öppen källkod. Öppna en bild med Arkiv > Öppna och klicka på Bild > Justera > färgtröskel.
- Använd skjutreglagen "Nyans" för att endast omfatta det blå området och justera det övre skjutreglaget "Ljusstyrka" hela vägen till vänster för att inkludera mer av det färgade området.
OBS: Om den här åtgärden gör att delar av bilden som inte är Trypan-färgade inkluderas, kan skjutreglaget "Ljusstyrka" återställas till sin ursprungliga nivå. - Justera långsamt det övre skjutreglaget "Mättnad" tills tröskeln exakt skisserar det färgade området.
DET är bra att ha en kopia av originalbilden öppen att hänvisa till under denna process. - Klicka på knappen Markera på menyn för färgtröskel och använd sedan markeringspenseln för att avmarkera områden utanför såret som plockades upp.
- Klicka på Analysera > Mått för att rapportera det färgade området i pixlar.
- Avmarkera alla med Redigera > Markering > Markera ingen och använd det ovala markeringsverktyget för att passa limbus så nära som möjligt och klicka sedan på Analysera > mått för att rapportera hornhinnans yta i pixlar.
OBS: Ljusstyrkan kan höjas tillfälligt för att underlätta visualiseringen av limbus om den här delen av bilden är för mörk. - Registrera areavärden och dela det färgade området med hela hornhinnans yta och multiplicera sedan med 100 för att beräkna procenten färgad.
- Upprepa denna process ytterligare två gånger för varje bild och ta sedan genomsnittet av de tre mätningarna.
9. Statistisk analys
- När alla bilder har analyserats delar du den genomsnittliga procenten som färgas på dag 14 med procenten som färgas på dag 0 för att bestämma det återstående oläkta området. Subtrahera detta belopp från 100% för att beräkna procentandelen av det avskalade området läkt under 14 dagar.
- Använd ett parat t-test för att jämföra procent läkta värden mellan kontroll- och behandlingsgrupper.
Representative Results
Detta experiment utfördes ursprungligen i 10 par normala forskningskornor, eftersom de är mest lättillgängliga. När metoden visade sig vara framgångsrik replikerades studien i 11 par dystrofa hornhinnor-märkta som sådana av ögonbanker baserat på spekulär utvärdering - för att studera effekterna av eFGF1 (NM141) i hornhinnor som är representativa för FECD-patientpopulationen. För större klinisk relevans representerar siffrorna som ingår i detta arbete data som samlats in från dystrofa hornhinnor om inget annat anges.
Efter simulering av det kirurgiska resultatet av DSO utfördes och upprepades Trypan Blue-färgning under hela 14-dagars odlingsperioden, och minskningen av positiv färgning kvantifierades för att utvärdera sårläkning (figur 2). Alizarin Röd färgning utfördes också på dag 14 för att avgränsa cellgränser. Mörkröda områden utan något tydligt mönster synligt (nedan kallat negativ färgning) uppträdde konsekvent inom den oläkta delen av lesionen och i andra delar av hornhinnan där celler antogs vara skadade eller saknade. Områden som färgade positivt för Trypan Blue på dag 14 motsvarade väl med negativ färgning av Alizarin Red (figur 2). Alla dystrofa hornhinnor behandlade med eFGF1 (NM141) visade större läkning på dag 14 jämfört med den obehandlade partnern. I genomsnitt visade behandlade hornhinnor 91% läkning i motsats till 38% i kontroll hornhinnor, och denna skillnad var statistiskt signifikant (p < 0,001) (figur 3A). Detta är jämförbart med resultat från 20 normala hornhinnor, där kontroller visade i genomsnitt 32% läkning och behandlade hornhinnor nådde 81%, vilket återigen var statistiskt signifikant (p < 0,001) (Kompletterande figur 1). Andelen läkta jämfördes mellan normala och dystrofa hornhinnor med hjälp av två t-provtester som antog lika varians, och ingen signifikant skillnad sågs i vare sig kontroll- eller behandlingsgrupperna (data visades inte).
Donatorinformation från ögonbanker (tabell 1) för både normala och dystrofa hornhinnor analyserades för att avgöra om egenskaper inklusive ålder, dagar lagrade i Optisol, död till insamlingsintervall, celltäthet och kön korrelerar med läkning. Pearsons korrelationskoefficient (r) användes för att undersöka alla faktorer utom kön, som utvärderades med hjälp av ett oparat t-test för att jämföra läkning mellan män och kvinnor. Det absoluta värdet av r var under 0,25 i alla fall, vilket indikerar att eventuella korrelationer mellan läkning och ålder, dagar lagrade i Optisol, död till insamlingsintervall eller celltäthet ansågs försumbara. Skillnaden i läkning mellan män och kvinnor var inte statistiskt signifikant (p = 0,53).
I likhet med den normala datauppsättningen presenterade 10 av de 22 dystrofa hornhinnorna med anmärkningsvärd Trypan-färgning utanför det avskalade området som är anslutet till det färgade området inom lesionen i minst en tidpunkt (vanligtvis dag 3) - en observation som vi kallade perifer färgning (Figur 4A). Av dessa 10 var endast två kontrollhornhinnor vars behandlade motsvarigheter inte uppvisade samma effekt. De återstående åtta var alla matchade par och presenterades med liknande svårighetsgrad mellan hornhinnor från samma individ. Även om färgningsmönstren var jämförbara mellan normala och dystrofa hornhinnor, var frekvensen av perifer färgning högre i den dystrofa datauppsättningen med 45% av hornhinnorna positiva, jämfört med 25% i den normala gruppen. Figur 4A visar ett par som ansågs vara positiva för perifer färgning, eftersom det färgade området utanför lesionen mötte sårkanten i dag 6-bilderna och gradvis avtog. I motsvarande Alizarin Red-bilder verkade celler i områden med perifer Trypan-färgning förstorade och onormalt formade, ungefär som cellerna som migrerade in i det avskalade området, och negativ färgning korrelerade med de områden där Trypan Blue var närvarande på dag 14. Trots den stora delen av hornhinnan som påverkades under hela kulturperioden inträffade delvis eller fullständig röjning av den färgade periferin i alla 10 hornhinnor. Dessutom var den sista procenten som läktes vid dag 14 inom det normala intervallet, respektive behandlingsgrupp, för alla utom en hornhinna. Extremvärden (0811L, bilden i figur 4A) returnerade ett negativt procent läkt värde på grund av resterna av perifer färgning som fortfarande anslöt till lesionsområdet vid dag 14 (figur 3A och figur 4A). Ett andra färgningsmönster, kallat långt perifer färgning, fångades i Alizarin Red-bilderna från figur 4B, men var också uppenbart i Trypan Blue-bilder under hela kulturperioden i många hornhinnor (figur 4B). Denna observation kännetecknas av en ring av mörk färgning runt limbus, vilket indikerar komprometterat endotel. Trots termen var detta mönster så vanligt i både normala och dystrofa hornhinnor att de inte räknades som positiva för perifer färgning. På dessa bilder visade kontrollhinnan mer levande och omfattande färgning på dag 14, trots att båda hornhinnorna hade liknande svårighetsgrad och färgmönster tidigt under kulturperioden. I den behandlade hornhinnan noterades också ett till synes större antal celler, som verkade mer kompakta och sexkantiga jämfört med kontroll, även om dessa observationer inte mättes kvantitativt. På grund av krökningen i periferin inkluderades endast Trypan-färgning inom och omedelbart kring det avskalade området i kvantitativ analys. När procentfärgade värden var i genomsnitt över alla dystrofa hornhinnor resulterade uppkomsten av perifer färgning i en initial ökning från dag 0, i motsats till den stadiga minskningen som sågs i normala hornhinnor där perifer färgning var mindre utbredd (figur 3B).
Immunohistokemi visualiserad genom konfokal avbildning avslöjar halvorganiserat uttryck av ZO-1, en funktionell markör för CEC-täta korsningar, i och runt lesionskanten (figur 5), ett mönster som på liknande sätt framgår av Alizarin Red-färgningen (figur 2 och figur 4). Pleomorfism och polymegathism är synliga av ZO-1 i de flesta dystrofa hornhinnor; denna observation kan dock hänföras till deras sjuka tillstånd och noterades av ögonbanken vid spekulär undersökning av hornhinnorna före odling. Oorganiserat ZO-1-uttryck observeras inom lesionsområdet för behandlade hornhinnor där celler hade migrerat inåt, vilket också överensstämmer med Alizarin Red-mönstren. EdU-införlivande celler kan ses runt lesionens kant och inuti det lesionerade området i kontroll och behandlade hornhinnor (figur 5). Mönstret för migrerade CEC återspeglar också Trypan Blue-resultaten, där de flesta celler i kontrollkornen hittades inom två fält i lesionskanten, medan CEC i behandlade hornhinnor kan ses i hela det avskalade området (figur 2).
EdU-märkning utfördes som ett kvalitativt mått i denna studie för att bekräfta att spridning bidrog till läkning. Kvantifiering av celler som innehåller EdU kunde emellertid inte utföras systematiskt på grund av hornhinnesvullnad som förhindrade att konsekventa, replikerbara bilder togs i och runt lesionen. Som ett surrogat har kvantitativ analys utförd i en studie som genomfördes före upprättandet av DSO-modellen inkluderats för att visa effekterna av eFGF-1 (NM141) på proliferation (figur 6). Normala humana donatorkorneor skars i fjärdedelar med en skalpell och odlades i närvaro av EdU, med eller utan eFGF1 (NM141) i 48 timmar enligt beskrivningen tidigare (Eveleth, 2020)16. Avbildning och efterföljande analys av Hoechst 33342 och EdU-märkta celler utfördes separat i den ostörda mittzonen i kvarteren och i kantzonen, inom tre fält från vilka hornhinnan skars. I mittzonen var andelen celler som införlivade EdU låg och mycket varierande över de 10 analyserade hornhinnorna. I genomsnitt hade kvartaler som behandlades med eFGF1 (NM141) högre nivåer av EdU-införlivande i mittzonen (4,1% ± 7,9%) jämfört med kontroller (1,8% ± 2,9%), även om denna skillnad inte var statistiskt signifikant (p = 0,239). Vid sårkanten visade behandlade kvartaler stimulerade med eFGF1 (NM141) signifikant högre frekvenser av EdU-inkorporering i genomsnitt (18,1% ± 11,5%) jämfört med kontrollkvartal (10% ± 9,6%, p = 0,012).
Tabell 1: Donatorinformation för 22 dystrofa och 20 normala hornhinnor som användes i denna studie, samt 10 normala hornhinnor som tidigare använts för EdU-kvantifiering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Figur 2: Vital färgfärgning av hornhinnor efter Descemets strippning. Dystrofa mänskliga hornhinnor avlägsnades från de centrala 4 mm av Descemets membran och inkuberades med eller utan eFGF1 (NM141) (100 ng / ml) i 14 dagar. Lesioner visualiserades av Trypan Blue-färgning på dag 0, 3, 6, 9, 12 och 14. CEC-gränserna visualiserades av Alizarin Red-färgning på dag 14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dystrofa mänskliga hornhinnor visar signifikant större läkning från DSO när de odlas med eFGF1 (NM141). (A) Procent läkning bestämdes genom att mäta det färgade området vid dag 14 med ImageJ och jämföra det med procenten färgade vid dag 0. (B) Den genomsnittliga procenten färgad graferad över tid visar en konsekvent minskning av normala hornhinnor medan den toppar vid dag 3 i dystrofa hornhinnor på grund av den högre förekomsten av perifer färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Vital färgfärgning av dystrofa hornhinnor med perifer färgning. (A) Trypanfärgning av det intakta Descemets membran kan ses avancera mot mitten och sedan rensa över tiden i både kontroll- och behandlade hornhinnor. (B) Alizarinmönster runt limbus representerar en typisk observation av perifer skada och oorganiserad återetablering av endotelet som ses i många donator hornhinnor - i detta fall dystrofisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Stimulering av migration och spridning av CEC med eFGF1 (NM141) i strippade dystrofa hornhinnor. Konfokala mikrografer av Descemets avskalade hornhinnor färgade för ZO-1 (röd), EdU (grön) och Hoechst 33342 (blå). Den streckade linjen representerar lesionskanten med det avskalade området på vänster sida av bilden och det intakta Descemets membran till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Kvantifiering av prolifererande celler från normala hornhinnor kvartade med hjälp av en skalpell och inkuberade i media innehållande EdU med eller utan eFGF-1 (NM141) i 48 timmar. Kvartal avbildades i tre exemplar vid den ostörda mittzonen och längs skärkanten, och räkningar i genomsnitt för att bestämma procentandelen celler som innehåller EdU i mitt- och kantzonerna. Figur modifierad från Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, använd med tillstånd16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Normala mänskliga hornhinnor visar signifikant större läkning från DSO när de odlas med eFGF1 (NM141). ImageJ användes för att mäta de färgade områdena och bestämma % läkning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Många ögonläkare har oro över att rekommendera DSO till sina patienter av två huvudskäl: 1) den långa läkningsprocessen och 2) brist på data (DSO är ett nytt koncept inom ögonkirurgi). Den forskning vi har presenterat skulle vara till stor nytta för att lindra båda dessa problem. Baserat på data från denna studie och andra har FDA godkänt en klinisk fas 2-studie där eFGF1 (NM141) kommer att administreras enligt varierande doseringsscheman till patienter som genomgår DSO17.
Metoden som beskrivs ovan modellerades efter en studie utförd av Soh et al., där hornhinnans endotelläkning utvärderades med och utan ROCK-hämmaren Y-27632 i både repade och skalade sår18. Medan Y-27632 accelererade endotelregenerering med Descemets membran fortfarande intakt, hittades ingen väsentlig läkning i avskalade sår även med behandling. Med hjälp av en liknande strippningsteknik följt av behandling med eller utan eFGF1 (NM141) överensstämde de observationer vi hittade inte med Soh och kollegor. Frånvaron av Trypan Blue-färgning i många behandlade hornhinnor vid dag 14 och närvaron av ZO-1-positiva täta korsningar inom det reformerade endotelskiktet hävdar att en intakt barriär, en del av CEC: s naturliga funktion, återställdes i både normala och dystrofa hornhinnor. Även om det inte kvantifieras i denna studie, tyder närvaron av EdU-positiva celler i och runt det avskalade området också på spridning som en läkningsmekanism, en som vi tidigare har fastställt kan stimuleras av eFGF1 (NM141) i skadade hornhinnor16. Statistisk analys visade att behandling med eFGF1 (NM141) resulterade i signifikant större läkning från DSO, i genomsnitt över dubbelt så hög som kontroll hornhinnor vid 14 dagars tidpunkt. Även om läkningsgraden varierar måttligt mellan individer - en typisk egenskap hos donatorkorneor - visar resultatens replikerbarhet över stora provstorlekar också en mycket mätbar metod. Vad vi vet finns det inga andra exempel på en ex vivo Descemets strippningsmodell i litteraturen.
Viktiga komponenter i själva protokollet som skulle vara värdefulla för andra forskare som studerar DSO är användningen av Trypan Blue för att upptäcka bar stroma och bildbehandlingstekniken som används för att mäta det färgade området. Trypan Blue används ofta vid oftalmisk kirurgi, särskilt när man arbetar med Descemets membran för att upptäcka icke-livskraftiga celler och hjälpa till att synliggöra vävnaden. Färgningstidpunkterna som ingår i detta protokoll möjliggjorde effektiv upprepad färgning utan att överexponera hornhinnor för Trypan Blue, eftersom det har visat sig vara giftigt för CEC vid höga koncentrationer19. Minskningen av färgat område under 14 dagar i alla hornhinnor, bekräftat av Alizarin Red och immunohistokemi att vara resultatet av migrerade CEC, visar en enkel och reproducerbar metod för att mäta läkning. Med hjälp av ImageJ:s färgtröskelmeny samlade flera analytiker in data med standardavvikelser konsekvent under 1 % (data visas inte). Även om alternativa program kan fungera på samma sätt, är ImageJ en programvara med öppen källkod som kan producera exakta områdesmätningar för att spåra läkning.
Det finns dock en aspekt av strippningsprotokollet som vi fann vara både nödvändig för sårskapande, men ändå hindrande för den övergripande läkningsprocessen. Att använda en skarp 30 G nål för att göra Descemets membran längs märket som lämnas av biopsistansen möjliggör skapandet av ett slätt, cirkulärt sår som noteras av kliniker för att stödja snabbare läkning10. Samtidigt är detta steg skadligt för hornhinnan, eftersom det kan skapa tårar i stromafibrerna som orsakar stromal celldöd, hindrar migrering av endotelceller över sårkanten och inducerar bildandet av knölar som resulterar i mer ihållande postoperativt ödem20. Kliniker som utför DSO använder vanligtvis en omvänd Sinskey-krok för att initiera såret, men utan något intraokulärt tryck som håller hornhinnan spänt är detta verktyg mindre effektivt i ex vivo-modellen . Ett alternativt verktyg som kan riva Descemets membran utan att skada den underliggande stroma skulle förbättra protokollet, till exempel bevattnings- och aspirationshandstycket som rekommenderas av Macsai och Shiloach10. Ytterligare experiment kommer att behövas för att avgöra om denna teknik är kompatibel med ex vivo-modellen .
En utmaning som verkar inneboende i ex vivo-modellen är den frekventa förekomsten av CEC-död i området perifert till såret, särskilt i dystrofa hornhinnor. Denna ibland dolda kvantifiering av sårområdet, eftersom noggrannheten hos färgtröskelverktyget blir mer begränsad eftersom det färgade området sträcker sig bortom hornhinnans centrum där dess krökning resulterar i ojämn ljusfördelning. Dessa variabla mätningar inträffade dock främst vid tidigare tidpunkter innan perifer färgning gradvis avtog när skadade CEC rensades och angränsande celler sträckte sig, migrerade eller förökade sig för att ersätta dem. Vid den sista 14-dagarspunkten hade det färgade området lokaliserats tillbaka till mitten av hornhinnan, och alla bilder var mätbara. En liknande observation gjordes med jämförbar frekvens av Soh et al., där fem av 14 normala hornhinnor presenterade vad de kallade "Premature Culture Failure" (PCF) tidigt under kulturperioden18. Även om skadan vände sig med tiden i våra hornhinnor och ändå var permanent i deras fall, kan detta tillskrivas det faktum att deras metod krävde sårning av ett större område av hornhinnan. Observationen av mer utbredd perifer Trypan-färgning i dystrofa hornhinnor kan indikera att dystrofa hornhinnor är mer mottagliga för endotelcelldöd än friska hornhinnor. Även om den exakta orsaken till denna celldöd ännu inte har klarlagts, tror vi att det är osannolikt att denna fråga kommer att vara relevant för mänskliga hornhinnor in vivo. Skador på det perifera endotelet har inte rapporterats i några kliniska fallstudier av DSO såvitt vi vet, vilket tyder på att detta fenomen är unikt för donatorhornhinnor odlade ex vivo 6,8,10,11,21. Bortsett från två fall där endast kontrollhornhinnor färgades, parades alla observationer av perifer färgning, så det är osannolikt att orsaken var exponering för eFGF1 (NM141). Det är emellertid möjligt att behandlingen i dessa fall kan ha gett en skyddande effekt mot den skada som annars skulle ha framkallat perifer färgning i båda hornhinnorna. Ytterligare undersökning av denna hypotes behövs.
En annan begränsning för denna metod är att köpa donatorhornhinnor som är representativa för den FECD-fenotyp som DSO är avsedd för. Donator hornhinnor av något slag är knappa, därav behovet av en operation som undviker användning av donatorvävnad. För våra ändamål är de enda hornhinnorna som finns tillgängliga de som avvisas från transplantation av olika skäl. Ögonbanker klassificerar vidare dessa hornhinnor som normala eller dystrofa baserat på kriterier inklusive förekomst av guttae, låg eller o mätbar ECD och oregelbunden CEC-morfologi. Att bekräfta en dystrofisk diagnos innan vävnad accepteras från en ögonbank är också nästan omöjligt, eftersom de flesta givares medicinska historia inte inkluderar tidigare okulär historia och den enda informationen som tillhandahålls är ECD-värdet, teknikerns anteckningar och i vissa fall en representativ spekulär bild. De dystrofa hornhinnorna som erhölls för denna studie visade inte sammanflytande centrala guttae vid konfokalmikroskopi utförd efter att odlingsperioden var klar, vilket tyder på att de kan representera "tidiga" stadier av FECD. Vi förväntar oss inte att detta kommer att ha någon betydande inverkan på konsekvenserna av studien, eftersom syftet med DSO är att avlägsna sammanflytande områden av guttae, så att friska perifera celler kan migrera inåt.
Denna metod ger en mycket tillämplig och reproducerbar teknik för att utvärdera medel som kan påverka CEC-spridning och migration. Modellen har flera funktioner som gör den mer fysiologiskt relevant än in vitro-modeller som involverar odlade CEC, även när den sås på humant hornhinnevävnadstransplantat 22,23,24. För det första är de CEC som ska stimuleras i ett monolager exakt som de existerar i patientens öga och migrerar över hornhinnans stroma som de skulle göra efter klinisk DSO. Stroma i fråga kommer från samma patient som CEC, vilket styr för potentiella FECD-relaterade stromaskillnader. Det finns inget behov av att explantera, dissociera och expandera kulturer i CEC med tillhörande utmaningar och potential för endotel till mesenkymal övergång (EnMT) under odlingsprocessen. Det beskrivna protokollet är i sig mycket likt det kliniska DSO-förfarandet. Även om den kringgår kultur- och expansionsstegen, har denna metod begränsningen att studietiden begränsas av hornhinnesvullnad, eftersom epitelskiktet inte upprätthålls. Detta hindrar oss från att undersöka morfologin hos CEC: er som har migrerat för att täcka det avskalade området, vilket gör det oklart om de så småningom kommer att ordna om till en sexkantig matris i denna modell. har utvecklat en potentiell lösning med sin aktiva lagringsmaskin (ASM), en anordning som visat sig hålla hornhinnor i odling i upp till 3 månader med betydligt mindre ödem än hornhinnor som upprätthålls i traditionell organkultur25. En sådan anordning kan vara till hjälp för att replikera och utöka detta arbete.
Denna modell har potentiell nytta när det gäller att testa andra sårläkningsterapier (t.ex. ROCK-hämmare), utvärdera modifieringar av kirurgisk teknik och jämföra läkning över olika givarpopulationer eller sjukdomsstadier. Vi hoppas att denna forskning, i kombination med kliniska prövningsdata när den kommer ut, uppmuntrar kliniker att överväga DSO som ett värdefullt behandlingsalternativ för sina berättigade FECD-patienter.
Disclosures
DDE, SP, GD och JW är anställda av och innehar eget kapital i Trefoil Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Finansiering för detta arbete stöddes av Trefoil Therapeutics och NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. Författarna vill tacka Tony Wong för histopatologiska råd och tjänster, Nikon Imaging Center vid UC San Diego för användning av deras konfokala mikroskop och Drs. Natalie Afshari och Marian Macsai för deras råd om kirurgisk teknik. Dessutom uttrycker författarna sin tacksamhet till givarna av ögon och ögonbankerna för att de gav hornhinnor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
| 0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
| 0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
| 10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
| 12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
| 15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| 2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
| 310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
| 5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
| 6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
| Analytical balance | Sartorious | R200D | |
| Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
| Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
| Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
| Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
| Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
| Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
| Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
| Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
| Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
| Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
| ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
| Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
| Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
| Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
| L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
| Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
| Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
| N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
| Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
| Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
| Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
| Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
| Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
| Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
| Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
| Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
| Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
| Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
| Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
| Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
| Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
| Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
| Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
| VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |
References
- Eghrari, A. O., Gottsch, J. D.
- Ku, B., et al. Endothelial cell loss in penetrating keratoplasty, endothelial keratoplasty, and deep anterior lamellar keratoplasty. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (4), 199 (2017).
- Gain, P., et al. Global survey of corneal transplantation and eye banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Braunstein, R. E., Airiani, S., Chang, M. A., Odrich, M. G. Corneal edema resolution after "descemetorhexis". Journal of Cataract and Refractive Surgery. 29 (7), 1436-1439 (2003).
- Pan, J. C., Eong, K. G. A. Spontaneous resolution of corneal oedema after inadvertent 'descemetorhexis' during cataract surgery. Clinical and Experimental Ophthalmology. 34 (9), 896-897 (2006).
- Shah, R. D., et al. Spontaneous corneal clearing after Descemet's stripping without endothelial replacement. Ophthalmology. 119 (2), 256-260 (2012).
- Ziaei, M., Barsam, A., Mearza, A. Spontaneous corneal clearance despite graft removal in Descemet stripping endothelial keratoplasty in Fuchs endothelial dystrophy. Cornea. 32 (7), 164-166 (2013).
- Huang, M. J., Kane, S., Dhaliwal, D. K. Descemetorhexis without endothelial keratoplasty versus DMEK for treatment of fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 37 (12), 1497 (2018).
- Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Pilot study of corneal clearance with the use of a rho-kinase inhibitor after descemetorhexis without endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 40 (7), 899-902 (2021).
- Macsai, M. S., Shiloach, M. Use of topical rho kinase inhibitors in the treatment of Fuchs dystrophy after Descemet stripping only. Cornea. 38 (5), 529-534 (2019).
- Moloney, G., et al. Descemetorhexis without grafting for Fuchs endothelial dystrophy-supplementation with topical ripasudil. Cornea. 36 (6), 642-648 (2017).
- Thalmann-Goetsch, A., Engelmann, K., Bednarz, J. Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 75 (5), 490-495 (1997).
- Landshman, N., et al. Regeneration of cat corneal endothelium induced in vivo by fibroblast growth factor. Experimental Eye Research. 45 (6), 805-811 (1987).
- Lee, J., Blaber, M. Increased functional half-life of fibroblast growth factor-1 by recovering a vestigial disulfide bond. Journal of Proteins & Proteomics. 1, 37-42 (2010).
- Xia, X., et al. Engineering a cysteine-free form of human fibroblast growth factor-1 for "second generation" therapeutic application. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (4), 1444-1453 (2016).
- Eveleth, D., Pizzuto, S., Weant, J., Jenkins-Eveleth, J., Bradshaw, R. Proliferation of human corneal endothelia in organ culture stimulated by wounding and the engineered human fibroblast growth factor 1 derivative TTHX1114. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: the Official Journal of the. 36 (9), 686-696 (2020).
- Tremblay, T. M. TTHX1114(NM141) in Combination With DWEK/DSO. ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&draw=2&rank=2 (2020).
- Soh, Y. Q., et al. Predicative factors for corneal endothelial cell migration). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 338-348 (2016).
- van Dooren, B. T. H., Beekhuis, W. H., Pels, E. Biocompatibility of trypan blue with human corneal cells. Archives of Ophthalmology. 122, Chicago, Ill: 1960 (2004).
- Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Predictive Factors for Corneal Clearance After Descemetorhexis Without Endothelial Keratoplasty. Cornea. 37 (2), 736-742 (2018).
- Borkar, D. S., Veldman, P., Colby, K. A. Treatment of Fuchs endothelial dystrophy by Descemet stripping without endothelial keratoplasty. Cornea. 35 (10), 1267-1273 (2016).
- Amano, S., Mimura, T., Yamagami, S., Osakabe, Y., Miyata, K. Properties of corneas reconstructed with cultured human corneal endothelial cells and human corneal stroma. Japanese Journal of Ophthalmology. 49 (6), 448-452 (2005).
- Rolev, K., OʼDonovan, D. G., Coussons, P., King, L., Rajan, M. S. Feasibility study of human corneal endothelial cell transplantation using an in vitro human corneal model. Cornea. 37 (6), 778-784 (2018).
- Spinozzi, D., et al. In vitro evaluation and transplantation of human corneal endothelial cells cultured on biocompatible carriers. Cell Transplantation. 29, 1-11 (2020).
- Garcin, T., et al. Three-month storage of human corneas in an active storage machine. Transplantation. 104 (6), 1159-1165 (2020).
