Summary
Le Stripping Only de Descemet est une procédure expérimentale dans laquelle les patients atteints de guttase cornéenne centrale résultant d’une dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs ont la membrane de Descemet dépouillée pour que les cellules périphériques régénèrent la couche endothéliale. Nous présentons une nouvelle méthodologie simulant le DSO dans les cornées humaines dystrophiques ex vivo avec une guérison accélérée stimulée par eFGF1 (NM141).
Abstract
La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD) résulte de cellules endothéliales cornéennes dysfonctionnelles (CEC) et est actuellement traitée par transplantation de la cornée entière ou de la membrane de Descemet. Les développements récents en chirurgie oculaire ont établi le Stripping Only (DSO) de Descemet, une technique chirurgicale dans laquelle un cercle central de la membrane de Descemet dense en guttées est enlevé pour permettre la migration des CEC sur le stroma lisse, rétablissant la fonction et la vision de la cornée. Bien que cette option de traitement potentielle soit d’un grand intérêt dans le domaine de la recherche ophtalmique, aucun modèle ex vivo réussi de DSO n’a été établi et les données cliniques sont limitées. Ce travail présente un nouveau modèle de cicatrisation des plaies simulant le DSO dans les cornées de donneurs humains. En utilisant cette approche pour évaluer l’efficacité du FGF1 (NM141) conçu par l’homme, nous avons constaté que le traitement accélérait la guérison par la stimulation de la migration et de la prolifération des CEC. Cette découverte a été confirmée dans 11 paires de cornées humaines présentant des signes de dystrophie signalés par les banques d’yeux afin de vérifier que ces résultats peuvent être reproduits chez les patients atteints de dystrophie de Fuchs, en tant que population cible de la procédure DSO.
Introduction
La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD) est une maladie caractérisée par une perte de la fonction de pompe dans les cellules endothéliales cornéennes (CEC) et l’accumulation excessive de collagène et d’autres protéines de la matrice extracellulaire à la surface de la membrane de Descemet, formant des guttescornéennes 1. Le seul traitement connu pour la FECD est la kératoplastie endothéliale sous différentes formes, qui comportent toutes un risque de rejet et de perte de cellules endothéliales2. Alors que les progrès de la chirurgie ophtalmique ont permis à ces procédures de devenir moins invasives au fil du temps, toute forme de transplantation comporte un risque de rejet et la possibilité d’utilisation de stéroïdes à vie, un traitement avec ses propres événements indésirables concomitants. De plus, la pénurie mondiale de tissus de donneurs est telle qu’une seule cornée de donneur est disponible pour 70 patients dans le besoin3. Compte tenu de ces défis, les chercheurs et les cliniciens explorent des méthodes chirurgicales qui évitent complètement le besoin de tissu de donneur. L’une de ces techniques expérimentales est le Stripping Only (DSO) ou Le Descemetorhexis sans kératoplastie endothéliale (DWEK) de Descemet, dans lequel les patients FECD atteints de guttées localisées au centre de la cornée ont un cercle central de 4 mm de la membrane de Descemet dépouillé sans placement de greffe. L’élimination des guttées encourage les cellules périphériques saines à migrer vers l’intérieur et à reformer la monocouche endothéliale, inversant éventuellement l’œdème stromal et améliorant la vision. Le concept a été décrit à l’origine dans une série d’études de cas dans lesquelles les patients ont subi une intervention chirurgicale compliquée par le détachement de la membrane de Descemet, mais le repeuplement de la CEC s’est encore produit 4,5,6,7. Bien qu’il y ait de nombreux avantages à cette méthode, le processus de guérison est long et incohérent, car certains patients ont besoin d’une greffe de secours si aucune guérison n’est observée dans les mois suivant la chirurgie8. Pour ces raisons, un médicament qui stimule une migration et une prolifération plus rapides des CEC peut être bénéfique dans le processus de récupération des patients FECD qui ont subi un DSO.
Plusieurs études récentes ont évalué les inhibiteurs de ROCK en tant que traitement supplémentaire pour les patients subissant un DSO, et ont constaté que les patients traités se rétablissaient plus rapidement et présentaient des densités de cellules endothéliales centrales (DPE) plus élevées que ceux du groupeDSO uniquement 9,10,11. Cependant, en raison de la petite taille des échantillons et des différences entre les schémas posologiques, davantage de données sont nécessaires pour mieux comprendre l’efficacité des inhibiteurs de ROCK dans ce contexte.
Il a également été démontré que les facteurs de croissance des fibroblastes stimulent la régénération de l’endothélium cornéen à la fois in vitro avec les CEC bovins et in vivo dans les cornées félines12,13. eFGF1 (NM141) est une version modifiée du FGF-1 contenant plusieurs substitutions d’acides aminés pour stabiliser la molécule, par opposition au FGF-1 natif, qui a une demi-vie beaucoup plus courte 14,15. Nous avons déjà démontré la capacité de l’eFGF1 (NM141) à stimuler la prolifération des CEC ex vivo dans les cornées humaines écartelées16. Cette étude visait à améliorer ce travail en établissant le premier modèle ex vivo réussi de DSO dans les cornées normales et dystrophiques afin de déterminer si des traitements d’appoint tels que eFGF1 (NM141) accélèrent la guérison dans cette application.
Protocol
Ce travail a utilisé des spécimens existants sans identification des sujets et est exempté de l’approbation de la CISR en vertu du 45 CFR 46.101(b)(4).
Les cornées de donneurs humains ont été obtenues à partir de diverses banques d’yeux à travers les États-Unis (voir table des matériaux). Les cornées ont été jugées individuellement dystrophiques par les banques d’yeux sur la base de résultats tels que les guttées, le pléomorphisme, le polymégathisme et / ou un faible DPE lors de l’évaluation spéculaire. La figure 1 présente la coloration du bleu trypan dans la cornée lors de la création de la plaie, immédiatement après le décapage et après 2 semaines de culture.
Figure 1 : Diagramme représentant la cornée pendant la création de la plaie, immédiatement après le décapage et après 14 jours en culture, tel que visualisé par Trypan Blue. La réduction de la surface tachée entre ces points temporels a été mesurée pour déterminer le niveau de guérison. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. Création de plaies
- À l’aide de pinces stériles, retirez la cornée du milieu et rincez dans 1x PBS pour éliminer les milieux résiduels et les débris cellulaires. Après le rinçage, placez le côté endothélial de la cornée sur le couvercle d’une boîte de Pétri.
- Pipette 30 μL de Trypan Blue dans un plat bien garni. Trempez un nouveau poinçon de biopsie de 4 mm dans Trypan Blue et tapotez tout excès.
- À l’aide des deux mains, placez le poinçon au-dessus du centre de la cornée et abaissez-le directement sur la surface endothéliale, en appliquant une pression minimale.
- Sans changer la position ou la pression sur la cornée, déplacez le poinçon d’une main et tendez la main avec la main nouvellement libérée. Utilisez la pince pour maintenir la cornée en place tout en tordant doucement le coup de poing de biopsie d’environ 90 ° d’avant en arrière plusieurs fois.
- Soulevez le poinçon directement de la cornée et réservez.
- Rincez à nouveau dans 1x PBS pour enlever l’excès de Trypan Blue.
2. Le décapage de Descemet
- Transférer la cornée sur un couvercle de boîte de Petri dans une lunette de dissection.
REMARQUE: Ne laissez pas la cornée sèche plus de 5 min. Si plus de temps est nécessaire pour terminer le processus, rincez à nouveau dans 1x PBS pour réhydrater l’endothélium. - En maintenant la cornée en place avec une pince incurvée, marquez la membrane de Descemet en traînant légèrement la pointe d’une aiguille pointue de 30 G le long de l’anneau de Trypan Blue laissé par le coup de poing de biopsie. Utilisez une pression minimale pour éviter de perturber le stroma sous-jacent.
- Avec un crochet Sinskey, utilisez des mouvements de ramassage doux pour soulever et peler la membrane de Descemet autour du bord de la plaie, en travaillant vers le centre de la lésion.
REMARQUE: La membrane de Descemet devrait présenter très peu de résistance. Si la difficulté est expérimentée, on est susceptible de tirer vers le haut stroma. Si cela se produit, recommencez, en soulevant à partir d’un nouveau point le long du bord de la plaie. - Une fois que la majorité de la membrane de Descemet a été séparée du stroma, utilisez une pince Gorovoy pour retirer la membrane et la réserver.
- Examinez la zone dépouillée à la recherche de tout morceau de membrane restant et retirez-la avec une pince Gorovoy.
3. Coloration bleu trypan
REMARQUE: Après le décapage de Descemet, tachez la cornée avec Trypan Blue pour visualiser la zone de la plaie.
- Retourner la cornée sur un couvercle de boîte de Petri dans l’armoire de biosécurité et rincer dans 1x PBS contenant 0,01% (p / v) CaCl2 et MgCl2 pour éliminer les débris cellulaires et faciliter l’adhésion étroite des CEC restants à la membrane intacte de Descemet.
- Placer la cornée dans un plat bien garni et pipeter 30 μL de Trypan Blue sur la couche endothéliale pendant 30 s.
- Utilisez des pinces pour bercer doucement la cornée afin de vous assurer que toute la surface endothéliale est couverte.
- Rincez l’excès de Trypan Blue dans 1x PBS avec 0,01% (p / v) CaCl2 et MgCl2 et imagez la cornée tachée sous un microscope à dissection pour le point de temps du jour 0.
- Assurez-vous que la cornée est équilibrée de manière à ce que la lumière soit transmise uniformément et que le positionnement soit reproductible à travers les points temporels.
REMARQUE: Les forceps peuvent être utilisés pour maintenir la cornée en place pendant l’imagerie si nécessaire.
- Assurez-vous que la cornée est équilibrée de manière à ce que la lumière soit transmise uniformément et que le positionnement soit reproductible à travers les points temporels.
4. Période culturelle
- Cultiver des cornées dans une plaque de six puits contenant des milieux à faible teneur en sérum constitués d’OptiMEM; 1x insuline, transferrine et sélénium; 1x antibiotique / antimycotique; 0,02 mg/mL de CaCl2; 0,2 mg/mL d’acide ascorbique; et 0,8 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur. Cultiver la cornée gauche dans 8 mL de milieux à faible teneur en sérum seuls, et la cornée droite dans 8 mL de milieux à faible teneur en sérum complétés par 100 ng/mL d’eFGF1 (NM141).
- Incuber à 37 °C avec 6 % de CO2 pendant 14 jours avec des changements quotidiens de support.
- Répétez la procédure de coloration Trypan Blue les jours 3, 6, 9, 12 et 14, et imagez chaque cornée immédiatement après la coloration. Assurez-vous de garder les paramètres de l’appareil photo cohérents sur tous les points temporels.
- Le jour 12, ajouter 10 μM d’EdU aux milieux témoins et supplémentés en eFGF1 (NM141) et incuber pendant 48 h pour marquer les cellules proliférantes. Renouvelez les médias avec EdU ajouté à nouveau le jour 13.
- Le jour 14, 48 h après l’ajout d’EdU, la coloration de Trypan et les cornées d’image comme d’habitude, sauf qu’au lieu de 1x PBS avec CaCl2 et MgCl2, utilisez 1x PBS ordinaire pour les rinçages afin d’empêcher le calcium d’interagir avec la tache rouge Alizarin.
5. Coloration rouge Alizarin
- Le jour 14, préparez 5% Alizarin Red dans une solution saline à 0,9%.
REMARQUE: Alizarin Red ne se dissoudra pas complètement dans une solution saline. Lors de la combinaison, solution vortex et roche pendant au moins 1 h. Vortex une fois de plus et filtrer avant utilisation pour éliminer les particules non dissoutes. - Une fois la coloration et l’imagerie du trypan terminées, transférez les cornées dans un plat bien desservi et ajoutez 200 μL d’Alizarin Red à la surface endothéliale de chaque cornée.
- Tacher pendant 2 min, puis rincer chaque cornée dans une boîte de Petri de 1x PBS pour enlever l’excès d’Alizarin Red avant de placer dans une plaque de six puits pré-remplie de 8 mL de 1x PBS pour deux lavages de 5 min.
- Après le deuxième lavage, imagez la zone dépouillée de chaque cornée sous un microscope à dissection.
REMARQUE: Contrairement à l’imagerie Trypan, les cornées peuvent être laissées dans 1x PBS pour imager la coloration à l’alizarine afin de les empêcher de se dessécher pendant le processus.
6. Fixation et perméabilisation
- Une fois les images d’Alizarine capturées, transférez les cornées sur une plaque de 12 puits et lavez-les dans 4 mL de 1x PBS contenant 0,05% de Tween-20 (PBS-T) pendant 30 minutes pour éliminer toutes les particules des tissus avant la fixation.
- Fixer les cornées dans 4 mL de PFA à 4 % pendant 30 min à température ambiante.
- Perméabiliser les cellules pendant 5 min dans 4 mL de 1x PBS contenant 1% de Triton X-100, puis laver trois fois dans 4 mL de PBS ordinaire pendant 30 min chacune.
7. Immunohistochimie
- Bloquer les cornées pendant 1 h à 37°C dans 4 mL de 1x PBS contenant 2% d’albumine sérique bovine et 2% de sérum de chèvre.
- Incuber dans 1 mL de solution bloquante contenant 2,5 μg/mL d’anticorps primaires de souris anti-ZO-1 pendant 1 h à 37°C, puis laver trois fois dans 4 mL de 1x PBS pendant 30 min chacun.
REMARQUE: La plaque peut être inclinée pendant la coloration des anticorps pour minimiser le volume de réactifs nécessaires. Assurez-vous simplement que toute la cornée est complètement immergée dans une solution d’anticorps. - Effectuer la réaction EdU Click-iT à l’aide d’un cocktail contenant 0,88 mg/mL d’acide ascorbique, 0,26 mg/mL de CuSO4 et 2,5 μM d’azoture Alexa Fluor 488.
- Préparer les composants de réaction
- Ajouter 500 μL de 1x PBS à 88 mg d’acide ascorbique et vortex jusqu’à dissolution.
- Ajouter 840 μL d’eau désionisée à 44 mg de CuSO4 et vortex jusqu’à dissolution.
- Préparer le cocktail en ajoutant les réactifs suivants à 6 mL de 1x PBS dans cet ordre, en inversant le tube à mélanger après chaque addition : 30 μL de solution d’acide ascorbique, 30 μL de solution de CuSO4 , puis 15 μL d’Alexa Fluor 488
REMARQUE: Une fois préparée, cette solution est sensible à la lumière. Pour le reste du protocole, les cornées doivent être protégées de la lumière dans la mesure du possible. - Ajouter 1 mL de cocktail de réaction EdU à chaque cornée et réagir pendant 1 h à température ambiante.
- Préparer les composants de réaction
- Ajouter 4 mL de 10 μg/mL De Hoechst 33342 à chaque cornée et réagir pendant 2 min à température ambiante, puis laver trois fois dans 1x PBS-T pendant 30 min chacun.
- Incuber dans 1 mL de solution bloquante contenant 2 μg/mL d’IgG anti-souris Alexa Fluor 555 marquée chèvre pendant 1 h à 37°C, puis laver trois fois dans 1x PBS-T pendant 30 min chacun.
- Conserver les cornées à 4 °C dans 4 mL de 1x PBS avec 1 % d’anti/anti, 0,1 % de ciprofloxacine et 0,1 % d’amphotéricine B pour prévenir la croissance microbienne.
- Lorsque vous effectuez une imagerie confocale, montez des cornées entières dans 200 μL de support de montage sur des lames de verre avec un couvercle scotché pour aplatir.
8. Analyse d’image Trypan
- Effectuez toutes les analyses d’images à l’aide du logiciel open source ImageJ des NIH. Ouvrez une image à l’aide de fichier > Ouvrir et cliquez sur Image > Ajuster > seuil de couleur.
- Utilisez les curseurs « Teinte » pour englober uniquement la plage bleue et ajustez le curseur supérieur « Luminosité » jusqu’à gauche pour inclure une plus grande partie de la zone colorée.
REMARQUE: Si cette action entraîne l’inclusion de parties de l’image qui ne sont pas colorées trypan, le curseur « Luminosité » peut être ramené à son niveau d’origine. - Ajustez lentement le curseur supérieur « Saturation » jusqu’à ce que le seuil définisse avec précision la zone colorée.
REMARQUE: Il est utile d’avoir une copie de l’image originale ouverte pour s’y référer au cours de ce processus. - Cliquez sur le bouton Sélectionner dans le menu Seuil de couleur, puis utilisez l’outil Pinceau de sélection pour désélectionner les zones situées à l’extérieur de la plaie qui ont été ramassées.
- Cliquez sur Analyser > Mesure pour signaler la zone colorée en pixels.
- Désélectionnez tout à l’aide de l’option Modifier > Sélection > Sélectionner aucune et utilisez l’outil de sélection ovale pour ajuster le limbe aussi étroitement que possible, puis cliquez sur Analyser > Mesure pour indiquer la zone de la cornée en pixels.
REMARQUE: La luminosité peut être augmentée temporairement pour faciliter la visualisation des limbes si cette partie de l’image est trop sombre. - Enregistrez les valeurs de surface et divisez la zone tachée par la surface de toute la cornée, puis multipliez par 100 pour calculer le pourcentage de taches.
- Répétez ce processus deux fois de plus pour chaque image, puis prenez la moyenne des trois mesures.
9. Analyse statistique
- Une fois que toutes les images ont été analysées, divisez le pourcentage moyen de taches le jour 14 par le pourcentage de taches le jour 0 pour déterminer la zone résiduelle non cicatrisée. Soustrayez ce montant de 100% pour calculer le pourcentage de la zone dépouillée guérie sur 14 jours.
- Utilisez un test t apparié pour comparer les valeurs de pourcentage guéri entre les groupes témoins et de traitement.
Representative Results
Cette expérience a été initialement réalisée dans 10 paires de cornées de recherche normales, car elles sont les plus facilement disponibles. Une fois que la méthode s’est avérée efficace, l’étude a été répliquée dans 11 paires de cornées dystrophiques - marquées comme telles par des banques d’yeux basées sur une évaluation spéculaire - pour étudier les effets de l’eFGF1 (NM141) dans des cornées représentatives de la population de patients FECD. Pour une plus grande pertinence clinique, les chiffres inclus dans le présent travail représentent des données recueillies à partir de cornées dystrophiques, sauf indication contraire.
Après avoir simulé le résultat chirurgical du DSO, la coloration trypan blue a été effectuée et répétée tout au long de la période de culture de 14 jours, et la réduction de la coloration positive a été quantifiée pour évaluer la cicatrisation des plaies (Figure 2). La coloration rouge Alizarin a également été effectuée le jour 14 pour délimiter les bordures des cellules. Des zones rouge foncé sans motif clair visible (ci-après dénommées coloration négative) sont apparues de manière constante dans la section non guérie de la lésion et dans d’autres zones de la cornée où les cellules étaient présumées endommagées ou manquantes. Les zones qui se sont tachées de trypan bleu le jour 14 correspondaient bien à une coloration négative par Alizarin Red (Figure 2). Toutes les cornées dystrophiques traitées par eFGF1 (NM141) ont montré une plus grande guérison au jour 14 par rapport au partenaire non traité. En moyenne, les cornées traitées ont montré une guérison de 91 % contre 38 % dans les cornées témoins, et cette différence était statistiquement significative (p < 0,001) (figure 3A). Ceci est comparable aux résultats obtenus à partir de 20 cornées normales, où les témoins ont montré une guérison moyenne de 32% et les cornées traitées ont atteint 81%, ce qui était encore une fois statistiquement significatif (p < 0,001) (Figure supplémentaire 1). Le pourcentage guéri a été comparé entre les cornées normales et dystrophiques à l’aide de deux tests t d’échantillons supposant une variance égale, et aucune différence significative n’a été observée dans les groupes témoin ou de traitement (données non montrées).
Les renseignements sur les donneurs fournis par les banques d’yeux (tableau 1) pour les cornées normales et dystrophiques ont été analysés afin de déterminer si les caractéristiques, y compris l’âge, les jours stockés dans Optisol, l’intervalle de décès jusqu’au prélèvement, la densité cellulaire et le sexe sont en corrélation avec la guérison. Le coefficient de corrélation (r) de Pearson a été utilisé pour étudier tous les facteurs, à l’exception du sexe, qui a été évalué à l’aide d’un test t non apparié pour comparer la guérison entre les hommes et les femmes. La valeur absolue de r était inférieure à 0,25 dans tous les cas, ce qui indique que toute corrélation entre la guérison et l’âge, les jours stockés dans Optisol, l’intervalle de décès jusqu’au prélèvement ou la densité cellulaire était considérée comme négligeable. La différence de guérison entre les hommes et les femmes n’était pas statistiquement significative (p = 0,53).
Semblable à l’ensemble de données normal, 10 des 22 cornées dystrophiques présentaient une coloration notable au trypan à l’extérieur de la zone dépouillée reliée à la zone colorée à l’intérieur de la lésion dans au moins un point temporel (généralement le jour 3) - une observation que nous avons appelée coloration périphérique (figure 4A). Sur ces 10, seulement deux étaient des cornées témoins dont les homologues traités ne présentaient pas le même effet. Les huit autres étaient toutes des paires appariées et présentaient une gravité similaire entre les cornées du même individu. Bien que les schémas de coloration soient comparables entre les cornées normales et dystrophiques, la fréquence des colorations périphériques était plus élevée dans l’ensemble de données dystrophiques avec 45% des cornées positives, contre 25% dans le groupe normal. La figure 4A montre une paire qui a été considérée comme positive pour la coloration périphérique, car la zone tachée à l’extérieur de la lésion a rencontré le bord de la plaie dans les images du jour 6 et s’est progressivement retirée. Dans les images rouge Alizarin correspondantes, les cellules dans les zones avec une coloration périphérique de Trypan semblaient agrandies et anormalement formées, un peu comme les cellules qui ont migré dans la zone dépouillée, et la coloration négative était corrélée avec les zones où Trypan Blue était présent le jour 14. Malgré la grande partie de la cornée affectée tout au long de la période de culture, un nettoyage partiel ou complet de la périphérie tachée s’est produit dans les 10 cornées. De plus, le pourcentage final guéri au jour 14 se situait dans la plage normale, par rapport au groupe de traitement, pour toutes les cornées sauf une. La valeur aberrante (0811L, illustrée à la figure 4A) a renvoyé une valeur négative en pourcentage guéri en raison des restes de coloration périphérique qui se connectaient encore à la zone de la lésion au jour 14 (figure 3A et figure 4A). Un deuxième motif de coloration, appelé coloration périphérique lointaine, a été capturé dans les images rouge Alizarin de la figure 4B, mais était également apparent dans les images bleu trypan tout au long de la période de culture dans de nombreuses cornées (figure 4B). Cette observation est caractérisée par un anneau de coloration sombre autour du limbe, indiquant un endothélium compromis. Malgré le terme, ce schéma était si fréquent dans les cornées normales et dystrophiques qu’elles n’ont pas été considérées comme positives pour la coloration périphérique. Dans ces images, la cornée témoin a montré une coloration plus vive et plus étendue le jour 14, bien que les deux cornées possèdent une gravité et un motif de coloration similaires au début de la période de culture. La cornée traitée a également noté un nombre apparemment plus important de cellules, qui semblaient plus compactes et hexagonales que le contrôle, bien que ces observations n’aient pas été mesurées quantitativement. En raison de la courbure de la périphérie, seule la coloration au trypan à l’intérieur et entourant immédiatement la zone dépouillée a été incluse dans l’analyse quantitative. Lorsque les valeurs colorées en pourcentage ont été calculées en moyenne dans toutes les cornées dystrophiques, l’apparition de la coloration périphérique a entraîné une augmentation initiale par rapport à celle du jour 0, par opposition à la diminution constante observée dans les cornées normales où la coloration périphérique était moins répandue (figure 3B).
L’immunohistochimie visualisée par imagerie confocale révèle une expression semi-organisée de ZO-1, un marqueur fonctionnel des jonctions serrées cec, dans et autour du bord de la lésion (Figure 5), un motif similaire mis en évidence par la coloration rouge Alizarine (Figure 2 et Figure 4). Le pléomorphisme et le polymégathisme sont visibles par ZO-1 dans la plupart des cornées dystrophiques; cependant, cette observation peut être attribuée à leur état malade et a été notée par la banque d’yeux lors de l’examen spéculaire des cornées avant la culture. Une expression désorganisée de ZO-1 est observée dans la zone lésionnelle des cornées traitées où les cellules avaient migré vers l’intérieur, ce qui est également cohérent avec les motifs rouges d’Alizarine. Les cellules incorporant l’EdU peuvent être vues autour de la bordure de la lésion et à l’intérieur de la zone lésionnée dans les cornées témoins et traitées (Figure 5). Le profil des CEC migrés reflète également les résultats de Trypan Blue, où dans les cornées témoins, la plupart des cellules ont été trouvées dans deux champs du bord de la lésion, tandis que les CEC dans les cornées traitées peuvent être observées dans toute la zone dépouillée (Figure 2).
L’étiquetage de l’EdU a été effectué comme mesure qualitative dans cette étude pour confirmer que la prolifération contribuait à la guérison. Cependant, la quantification des cellules incorporant de l’EdU n’a pas pu être effectuée systématiquement en raison d’un gonflement de la cornée empêchant la capture d’images cohérentes et reproductibles dans et autour de la lésion. En tant que substitut, une analyse quantitative effectuée dans le cadre d’une étude menée avant l’établissement du modèle DSO a été incluse pour démontrer les effets du FEMGF-1 (NM141) sur la prolifération (figure 6). Les cornées normales de donneurs humains ont été coupées en quartiers à l’aide d’un scalpel et cultivées en présence d’EdU, avec ou sans eFGF1 (NM141) pendant 48 h, comme décrit précédemment (Eveleth, 2020)16. L’imagerie et l’analyse ultérieure des cellules marquées Hoechst 33342 et EdU ont été effectuées séparément dans la zone médiane non perturbée des quartiers et dans la zone de bord, dans trois champs d’où la cornée a été coupée. Dans la zone médiane, le pourcentage de cellules incorporant de l’EdU était faible et très variable dans les 10 cornées analysées. En moyenne, les trimestres traités avec eFGF1 (NM141) présentaient des niveaux plus élevés d’incorporation d’EdU dans la zone médiane (4,1 % ± 7,9 %) que les témoins (1,8 % ± 2,9 %), bien que cette différence ne soit pas statistiquement significative (p = 0,239). Au bord de la plaie, les trimestres traités stimulés par l’eFGF1 (NM141) ont montré des taux significativement plus élevés d’incorporation d’EdU en moyenne (18,1 % ± 11,5 %) par rapport aux trimestres témoins (10 % ± 9,6 %, p = 0,012).
Tableau 1 : Renseignements sur les donneurs pour 22 cornées dystrophiques et 20 cornées normales utilisées dans cette étude, ainsi que pour 10 cornées normales utilisées précédemment pour la quantification de l’EdU. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Figure 2 : Coloration vitale des cornées après le décapage de Descemet. Les cornées humaines dystrophiques ont été dépouillées des 4 mm centraux de la membrane de Descemet et incubées avec ou sans eFGF1 (NM141) (100 ng/mL) pendant 14 jours. Les lésions ont été visualisées par coloration Trypan Blue aux jours 0, 3, 6, 9, 12 et 14. Les bordures de la CEC ont été visualisées par Alizarin Red staining le jour 14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Les cornées humaines dystrophiques montrent une guérison significativement plus importante du DSO lorsqu’elles sont cultivées avec eFGF1 (NM141). (A) Le pourcentage de guérison a été déterminé en mesurant la zone tachée au jour 14 à l’aide d’ImageJ et en la comparant au pourcentage de tachés au jour 0. (B) Le pourcentage moyen de taches représentées graphiquement au fil du temps montre une diminution constante des cornées normales tout en culminant au jour 3 dans les cornées dystrophiques en raison de la prévalence plus élevée de la coloration périphérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coloration par colorant vital des cornées dystrophiques avec coloration périphérique. (A) On peut voir la coloration au trypan de la membrane intacte de Descemet avancer vers le centre, puis se dégager au fil du temps dans les cornées témoins et traitées. (B) Les motifs d’alizarine autour du limbe représentent une observation typique de dommages périphériques et de rétablissement désorganisé de l’endothélium observés dans de nombreuses cornées de donneurs - dans ce cas dystrophiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Stimulation de la migration et de la prolifération des CEC par eFGF1 (NM141) dans les cornées dystrophiques dépouillées. Micrographies confocales des cornées dépouillées de Descemet colorées pour ZO-1 (rouge), EdU (vert) et Hoechst 33342 (bleu). La ligne pointillée représente le bord de la lésion avec la zone dépouillée sur le côté gauche de l’image et la membrane intacte de Descemet sur la droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Quantification des cellules proliférantes des cornées normales écartelées à l’aide d’un scalpel et incubées dans des milieux contenant de l’EdU avec ou sans eFGF-1 (NM141) pendant 48 h. Les quarts ont été imagés en trois exemplaires dans la zone médiane non perturbée et le long du bord coupé, et les comptages ont été moyennés pour déterminer le pourcentage de cellules incorporant EdU dans les zones médiane et arête. Figure modifiée à partir du Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, utilisé avec la permission16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Les cornées humaines normales montrent une guérison significativement plus importante du DSO lorsqu’elles sont cultivées avec eFGF1 (NM141). ImageJ a été utilisé pour mesurer les zones colorées et déterminer le pourcentage de guérison. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
De nombreux ophtalmologistes s’inquiètent de recommander le DSO à leurs patients pour deux raisons principales: 1) le long processus de guérison et 2) le manque de données (le DSO est un nouveau concept dans le domaine de la chirurgie ophtalmique). La recherche que nous avons présentée serait d’une grande utilité pour apaiser ces deux préoccupations. Sur la base des données de cette étude et d’autres, la FDA a approuvé un essai clinique de phase 2 dans lequel eFGF1 (NM141) sera administré à des schémas posologiques variables aux patients subissant un DSO17.
La méthode décrite ci-dessus a été modelée d’après une étude réalisée par Soh et al., où la guérison de l’endothélium cornéen a été évaluée avec et sans l’inhibiteur de ROCK Y-27632 dans les plaies rayées et pelées18. Alors que le Y-27632 a accéléré la régénération endothéliale avec la membrane de Descemet encore intacte, aucune guérison substantielle n’a été trouvée dans les plaies dépouillées, même avec un traitement. En utilisant une technique de décapage similaire suivie d’un traitement avec ou sans eFGF1 (NM141), les observations que nous avons trouvées n’étaient pas cohérentes avec celles de Soh et de ses collègues. L’absence de coloration au bleu de trypan dans de nombreuses cornées traitées au jour 14 et la présence de jonctions serrées POSITIVES AU ZO-1 dans la couche endothéliale réformée soutiennent qu’une barrière intacte, faisant partie de la fonction naturelle de la CEC, a été restaurée dans les cornées normales et dystrophiques. Bien qu’elle ne soit pas quantifiée dans cette étude, la présence de cellules EdU positives dans et autour de la zone dépouillée suggère également la prolifération en tant que mécanisme de guérison, dont nous avons précédemment établi qu’il peut être stimulé par eFGF1 (NM141) dans les cornées blessées16. L’analyse statistique a montré que le traitement par eFGF1 (NM141) entraînait une guérison significativement plus importante du DSO, en moyenne plus de deux fois plus élevée que les cornées témoins au point de temps de 14 jours. Bien que les taux de guérison varient modérément d’un individu à l’autre - une caractéristique typique des cornées de donneurs - la reproductibilité des résultats sur de grandes tailles d’échantillons témoigne également d’une méthode hautement mesurable. À notre connaissance, il n’y a pas d’autres exemples de modèle de décapage ex vivo de Descemet dans la littérature.
Les éléments clés du protocole lui-même qui seraient utiles à d’autres chercheurs étudiant le DSO sont l’utilisation de Trypan Blue pour détecter le stroma nu et la technique de traitement d’image utilisée pour mesurer la zone colorée. Trypan Blue est couramment utilisé en chirurgie ophtalmique, en particulier lorsque vous travaillez avec la membrane de Descemet pour détecter les cellules non viables et aider à la visibilité du tissu. Les points temporels de coloration inclus dans ce protocole ont permis une coloration répétée efficace sans surexposer les cornées au bleu de trypan, car il s’est avéré toxique pour les CEC à des concentrations élevées19. La réduction de la zone colorée sur 14 jours dans toutes les cornées, confirmée par Alizarin Red et l’immunohistochimie comme étant le résultat de CEC migrés, démontre une méthode simple et reproductible pour mesurer la guérison. À l’aide du menu de seuil de couleur d’ImageJ, plusieurs analystes ont collecté des données avec des écarts-types constamment inférieurs à 1% (données non affichées). Bien que des programmes alternatifs puissent fonctionner de la même manière, ImageJ est un logiciel open source capable de produire des mesures de surface précises pour suivre la guérison.
Il y a, cependant, un aspect du protocole de décapage que nous avons trouvé à la fois nécessaire pour la création de plaies, mais qui entrave le processus de guérison global. L’utilisation d’une aiguille tranchante de 30 G pour marquer la membrane de Descemet le long de la marque laissée par le poinçon de biopsie permet la création d’une plaie lisse et circulaire qui est notée par les cliniciens pour favoriser une guérison plus rapide10. Dans le même temps, cette étape est dommageable pour la cornée, car elle peut créer des déchirures dans les fibres stromales provoquant la mort des cellules stromales, empêchant la migration des cellules endothéliales à travers le bord de la plaie et induisant la formation de nodules qui entraînent un œdème postopératoire plus persistant20. Les cliniciens effectuant des DSO utilisent généralement un crochet Sinskey inversé pour initier la plaie, mais sans aucune pression intraoculaire maintenant la cornée tendue, cet outil est moins efficace dans le modèle ex vivo . Un outil alternatif capable de déchirer la membrane de Descemet sans endommager le stroma sous-jacent améliorerait le protocole, par exemple la pièce à main d’irrigation et d’aspiration recommandée par Macsai et Shiloach10. D’autres expérimentations seront nécessaires pour déterminer si cette technique est compatible avec le modèle ex vivo .
Un défi qui semble inhérent au modèle ex vivo est la fréquence des décès par CEC dans la zone périphérique de la plaie, en particulier dans les cornées dystrophiques. Cela obscurcit parfois la quantification de la zone de la plaie, car la précision de l’outil de seuil de couleur devient plus limitée à mesure que la zone tachée s’étend au-delà du centre de la cornée où sa courbure entraîne une répartition inégale de la lumière. Cependant, ces mesures variables se sont principalement produites à des moments antérieurs avant que la coloration périphérique ne recule progressivement à mesure que les CEC endommagés se dissipaient et que les cellules voisines s’étiraient, migraient ou proliféraient pour les remplacer. Au dernier point temporel de 14 jours, la zone tachée s’était localisée au centre de la cornée et toutes les images étaient mesurables. Une observation similaire a été faite avec une fréquence comparable par Soh et al., où cinq des 14 cornées normales ont présenté ce qu’ils ont appelé « échec de culture prématuré » (PCF) au début de la période de culture18. Bien que les dommages se soient inversés au fil du temps dans nos cornées et qu’ils soient pourtant permanents dans leur cas, cela peut être attribué au fait que leur méthode nécessitait de blesser une plus grande partie de la cornée. L’observation d’une coloration périphérique plus répandue du trypan dans les cornées dystrophiques peut indiquer que les cornées dystrophiques sont plus sensibles à la mort des cellules endothéliales que les cornées saines. Bien que la cause exacte de cette mort cellulaire n’ait pas encore été élucidée, nous pensons qu’il est peu probable que cette question soit pertinente pour les cornées humaines in vivo. À notre connaissance, aucune lésion de l’endothélium périphérique n’a été rapportée dans aucune étude de cas clinique de DSO, ce qui suggère que ce phénomène est unique aux cornées de donneurs cultivées ex vivo 6,8,10,11,21. Mis à part deux cas où seules les cornées témoins sont colorées, toutes les observations de coloration périphérique ont été appariées, il est donc peu probable que la cause soit l’exposition à l’eFGF1 (NM141). Cependant, il est possible que, dans ces cas, le traitement ait fourni un effet protecteur contre les dommages qui, autrement, auraient induit une coloration périphérique dans les deux cornées. Une enquête plus approfondie sur cette hypothèse est nécessaire.
Une autre limite à cette méthode est l’approvisionnement en cornées donneuses représentatives du phénotype FECD auquel le DSO est destiné. Les cornées de donneurs de toutes sortes sont rares, d’où la nécessité d’une intervention chirurgicale qui évite l’utilisation de tissu de donneur. Pour nos besoins, les seules cornées disponibles sont celles rejetées de la greffe pour diverses raisons. Les banques d’yeux classent en outre ces cornées comme normales ou dystrophiques en fonction de critères tels que la présence de guttae, un DPE faible ou non mesurable et une morphologie irrégulière de la CEC. Confirmer un diagnostic dystrophique avant d’accepter des tissus d’une banque d’yeux est également presque impossible, car les antécédents médicaux de la plupart des donneurs n’incluent pas les antécédents oculaires et les seules informations fournies sont la valeur du DPE, les notes du technicien et, dans certains cas, une image spéculaire représentative. Les cornées dystrophiques obtenues pour cette étude n’ont pas montré de guttes centrales confluentes lors d’une microscopie confocale effectuée après la fin de la période de culture, ce qui suggère qu’elles peuvent représenter des stades « précoces » de feCD. Nous ne nous attendons pas à ce que cela ait un impact significatif sur les implications de l’étude, car le but du DSO est d’éliminer les zones confluentes des guttées, permettant aux cellules périphériques saines de migrer vers l’intérieur.
Cette méthode fournit une technique hautement applicable et reproductible pour évaluer les agents susceptibles d’avoir un impact sur la prolifération et la migration des CEC. Le modèle présente plusieurs caractéristiques qui le rendent plus pertinent sur le plan physiologique que les modèles in vitro qui impliquent des CEC cultivés, même lorsqu’ils sont ensemencés sur un greffe de tissu cornéen humain 22,23,24. Tout d’abord, les CEC à stimuler sont dans une monocouche exactement comme ils existent dans l’œil du patient, et migrent à travers le stroma cornéen comme ils le feraient après DSO clinique. Le stroma en question provient du même patient que les CEC, contrôlant ainsi les différences stromales potentielles liées à la FECD. Il n’est pas nécessaire d’explanter, de dissocier et d’élargir les cultures de CEC avec les défis et le potentiel associés de transition endothéliale à mésenchymateuse (EnMT) pendant le processus de culture. Le protocole décrit est lui-même très similaire à la procédure clinique DSO. Bien qu’elle contourne les étapes de culture et d’expansion, cette méthode a la limitation que la durée de l’étude est limitée par un gonflement de la cornée, car la couche épithéliale n’est pas maintenue. Cela nous empêche d’étudier la morphologie des CEC qui ont migré pour couvrir la zone dépouillée, ce qui ne permet pas de savoir s’ils finiront par se réorganiser en un réseau hexagonal dans ce modèle. Garcin et al. ont développé une solution potentielle avec leur machine de stockage actif (ASM), un dispositif qui maintient les cornées en culture jusqu’à 3 mois avec beaucoup moins d’œdème que les cornées maintenues dans la culture d’organes traditionnels25. Un tel dispositif peut être utile pour reproduire et développer ce travail.
Ce modèle peut être utile pour tester d’autres thérapies de cicatrisation des plaies (p. ex., les inhibiteurs de ROCK), évaluer les modifications apportées à la technique chirurgicale et comparer la guérison entre différentes populations de donneurs ou stades de la maladie. Nous espérons que cette recherche, en conjonction avec les données des essais cliniques au fur et à mesure qu’elles seront publiées, encouragera les cliniciens à considérer le DSO comme une option de traitement précieuse pour leurs patients FECD éligibles.
Disclosures
DDE, SP, GD et JW sont des employés et détiennent des actions dans Trefoil Therapeutics, Inc. DDE est l’inventeur des brevets couvrant eFGF1 (NM141).
Acknowledgments
Le financement de ce travail a été soutenu par Trefoil Therapeutics et NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. Les auteurs tiennent à remercier Tony Wong pour ses conseils et services d’histopathologie, le Nikon Imaging Center de l’UC San Diego pour l’utilisation de son microscope confocal, et les Drs Natalie Afshari et Marian Macsai pour leurs conseils sur la technique chirurgicale. En outre, les auteurs expriment leur gratitude aux donneurs d’yeux et aux banques d’yeux pour avoir fourni des cornées.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
| 0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
| 0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
| 10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
| 12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
| 15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| 2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
| 310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
| 5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
| 6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
| Analytical balance | Sartorious | R200D | |
| Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
| Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
| Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
| Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
| Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
| Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
| Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
| Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
| Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
| Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
| ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
| Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
| Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
| Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
| L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
| Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
| Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
| N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
| Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
| Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
| Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
| Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
| Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
| Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
| Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
| Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
| Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
| Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
| Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
| Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
| Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
| Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
| Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
| VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |
References
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