Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Inactivatie van pathogenen via zichtbaar-licht fotolyse van riboflavine-5′-fosfaat

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Hier presenteren we een protocol om pathogene bacteriën te inactiveren met reactieve zuurstofsoorten geproduceerd tijdens fotolyse van flavine mononucleotide (FMN) onder blauwe en violette lichtbestraling van lage intensiteit. FMN-fotolyse is aangetoond als een eenvoudige en veilige methode voor sanitaire processen.

Abstract

Riboflavine-5'-fosfaat (of flavine mononucleotide; FMN) is gevoelig voor zichtbaar licht. Verschillende verbindingen, waaronder reactieve zuurstofsoorten (ROS), kunnen worden gegenereerd uit FMN-fotolyse bij bestraling met zichtbaar licht. De ROS gegenereerd uit FMN-fotolyse zijn schadelijk voor micro-organismen, waaronder pathogene bacteriën zoals Staphylococcus aureus (S. aureus). Dit artikel presenteert een protocol voor het deactiveren van S. aureus, als voorbeeld , via fotochemische reacties met FMN onder bestraling van zichtbaar licht. Het superoxideradicaal anion (Equation 1) gegenereerd tijdens de FMN-fotolyse wordt geëvalueerd via nitroblauw tetrazolium (NBT) reductie. De microbiële levensvatbaarheid van S. aureus die wordt toegeschreven aan reactieve Equation 1 soorten werd gebruikt om de effectiviteit van het proces te bepalen. De bacteriële inactivatiesnelheid is evenredig met de FMN-concentratie. Violet licht is efficiënter in het inactiveren van S. aureus dan blauw lichtbestraling, terwijl het rode of groene licht geen FMN-fotolyse veroorzaakt. Het huidige artikel demonstreert FMN-fotolyse als een eenvoudige en veilige methode voor sanitaire processen.

Introduction

Riboflavine-5′-fosfaat (FMN) wordt gevormd door fosforylering op de riboflavine 5′-positie van de ribityl side-chain en is vereist door alle flavoproteïnen voor tal van cellulaire processen om energie te genereren. Het speelt ook de rol van vitamine voor sommige functies in het menselijk lichaam1. FMN is ongeveer 200 keer beter oplosbaar in water dan riboflavine2.

De antibacteriële fotodynamische inactivatie (aPDI) van bacteriën is een efficiënte manier om resistentie tegen bacteriën te beheersen 3,4 omdat het niet afhankelijk is van de modus van bacteriële resistentie. Klinisch wordt aPDI gebruikt om wekedeleninfecties te behandelen om de infectie van de nosocomiale huid als gevolg van multiresistente bacteriën te verminderen 5,6,7,8,9. aPDI produceert ook celdood door reactieve zuurstofsoorten (ROS) te genereren. ROS, zoals superoxideradicalen (Equation 1), singletzuurstof, hydroxylradicalen (•OH) en peroxylradicalen, zijn vrije radicalen of moleculen die reactieve zuurstofbevatten 10,11,12 en normaal gesproken reactief zijn13. Net als DNA-schade die wordt veroorzaakt door ROS, zijn membraanperoxidatie en vernietiging van endotheelcellen ook nadelige biochemische reacties die worden toegeschreven aan ROS in cellen12.

Het gebruik van aPDI voor pathogene bacteriën omvat een zichtbare of UV-lichtbron om micro-organismen te inactiveren in aanwezigheid van chemische verbindingen, zoals methylthioniniumchloride14, PEI-ce6-conjugaat 15, porfyrine16, titaandioxide17, toluidineblauw O18 en zinkoxide nanodeeltjes19. Toluidineblauw O en methyleenblauw zijn fenothiaziniumkleurstoffen en methyleenblauw heeft toxische eigenschappen. Zinkoxide nanodeeltjes en UV-bestraling zijn gekoppeld aan nadelige gezondheids- en milieueffecten. Als zodanig verdient de exploitatie van een betrouwbare, veilige en eenvoudige fotosensitizer via fotolyse onder zichtbare bestraling verder onderzoek.

De micronutriënt, riboflavine of FMN, is niet giftig en wordt inderdaad gebruikt voor de productie van voedsel of voeding20. Zowel FMN als riboflavine zijn zeer gevoelig voor lichtbestraling2. Onder UV 1,2,21,22,23 en blauw licht bestraling 10,24 bereiken deze twee verbindingen een aangeslagen toestand. De geactiveerde riboflavine of FMN die wordt geproduceerd door fotolyse wordt gepromoveerd tot zijn triplettoestand en ROS worden tegelijkertijdgegenereerd 2,25. Kumar et al. rapporteerden dat riboflavine geactiveerd door UV-licht selectief verhoogde schade veroorzaakt aan het guaninegedeelte van DNA in pathogene micro-organismen26. Onder bestraling door UV-licht wordt aangetoond dat fotodynamisch geactiveerd riboflavine de generatie van 8-OH-dG, een biomarker voor oxidatieve stress, in dubbelstrengs DNA27 bevordert. Er wordt gemeld dat S. aureus en E. coli worden gedeactiveerd door ROS tijdens riboflavine of FMN-fotolyse 10,24,28. Een eerdere studie van de auteurs toonde aan dat de fotolytische reacties met riboflavine en FMN kristalviolet, een triarylmethaankleurstof en een antibacterieel middel dat het grootste deel van het antimicrobiële vermogen van kristalviolet 28 genereert Equation 1enelimineert, verminderen. Wanneer flavine adenine dinucleotide of FMN wordt bestraald door blauw licht, produceren de resulterende ROS apoptose in HeLa-cellen voor hun vergiftiging in vitro29. Met behulp van fotochemische behandeling in aanwezigheid van riboflavine inactiveerden Cui et al. lymfocyten door hun proliferatie en cytokineproductie te remmen30.

De fotolyse van riboflavine wordt gebruikt voor de inactivatie van bloedpathogenen door UV10,24, maar bloedbestanddelen kunnen worden aangetast bij UV-lichtbestraling30. Er wordt ook gemeld dat bloedplaatjes blootgesteld aan UV geleidelijk de prestaties van de activeringsmarkers P-selectin en LIMP-CD63 op hun membranen verbeteren. De cytotoxiciteit van UV en hoge intensiteit bestraling moet worden onderzocht en een fotosensitizer die ongecompliceerd en veilig is tijdens een FMN-fotoreactie met zichtbaar licht zou van groot nut zijn.

Licht van kortere golflengten heeft meer energie en heeft veel meer kans om ernstige schade aan cellen te veroorzaken. In aanwezigheid van een geschikte fotosensitizer kan bestraling met violet licht met lage intensiteit pathogene micro-organismen remmen. De fotosensibilisatie en het genereren van Equation 1 FMN bij bestraling met violet licht is dus belangrijk om te bestuderen, om de route te bepalen waarmee ROS van FMN-fotolyse de inactivatie van bacteriën verhoogt.

Antimicrobiële controle is een veel voorkomend probleem en de ontwikkeling van nieuwe antibiotica duurt vaak tientallen jaren. Na bestraling met violet licht kan foto-inactivatie die wordt bemiddeld door FMN milieupathogene bacteriën vernietigen. Deze studie presenteert een effectief antimicrobieel protocol in vitro met violet licht voor het aansturen van FMN-fotolyse en dus het Equation 1 genereren van aPDI. De microbiële levensvatbaarheid van S. aureus wordt gebruikt om de haalbaarheid van FMN-geïnduceerde aPDI te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fotolyse systeem instellen

  1. Monteer zes light-emitting diodes (LED) (DC 12 V) aan de binnenkant van een ondoorzichtige plastic beker (8 cm x 7 cm) zoals weergegeven in figuur 1 om een fotolysesysteem op te zetten31.
  2. Voeg reactanten (zie hieronder) toe aan de glazen reageerbuizen (13 mm in diameter en 100 mm hoog) en zet de buisjes aan de bovenkant van de beker vast zoals aangegeven in figuur 1. Plaats de proefopstelling in een ruimte met een constante temperatuur van 25 ± 3 °C.
  3. Bewaak en registreer de temperatuur van testeenheden gedurende de fotolytische reacties door een infraroodthermometer.
    OPMERKING: Figuur 2 toont de emissiespectra voor blauwe, groene, rode en violette lichten, zoals geregistreerd met een gekalibreerde UV-Vis optische spectrometer. De golflengten die overeenkomen met het absorptiemaximum voor blauwe, groene, rode en violette LED-lampen die in de studie worden gebruikt, zijn respectievelijk 465, 529, 632 en 405 nm. De LED-chips kunnen het apparaat verwarmen tijdens bestralingsexperimenten. Het hele fotoreactiesysteem in elk experiment werd daarom in een ruimte geplaatst waar de temperatuur constant werd gehouden op 25 ± 3 °C.

2. Het effect van de lichtgolflengte op de fotolyse van FMN (figuur 3)

  1. Bereid een 0,1 mM FMN-oplossing in 100 mM kaliumfosfaatbuffer (PB) (pH 7,8). Stel FMN-monsters (elk 3 ml) gedurende 5 minuten bloot aan blauw, groen, rood of violet licht met een intensiteit van 10 W/m2 . Houd 3 ml FMN-oplossing in het donker als controle.
  2. Registreer de absorptie van bestraalde FMN-monsters in het bereik van 250-750 nm met behulp van een UV / zichtbare spectrofotometer.

3. Nitroblauw tetrazolium (NBT) reductiemethode om te detecteren Equation 1 (figuur 4).

OPMERKING: De NBT-reductiemethode die hier wordt gebruikt, is enigszins gewijzigd ten opzichte van de test voor riboflavine-fotoreactie. De NBT-reductiemethode wordt gebruikt om het niveau van Equation 1 gegenereerde FMN-fotolyse te evalueren. Het fotochemisch geëxciteerde FMN wordt eerst door L-methionine gereduceerd tot een semichinon, dat vervolgens een elektron aan zuurstof doneert dat aanleiding geeft tot Equation 131. De as-gegenereerde Equation 1 reduceert NBT tot formazan, die een karakteristieke absorptie heeft bij 560 nm32.

  1. Voeg 109,3 mg L-methionine toe aan 73,3 ml PB (100 mM; pH 7,8). Vortex de oplossing om de L-methionine op te lossen.
  2. Nadat de L-methionine volledig is opgelost, voegt u 10 mg NBT-poeder en 1,53 ml 0,117 mM FMN toe aan de oplossing. Voor elke 1 ml van de toegepaste reactieoplossing (d.w.z. een mengsel van FMN, L-methionine en NBT) zijn de uiteindelijke concentraties FMN, methionine en NBT respectievelijk 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M en 1,6 x 10-4 M.
  3. Stel de reactieoplossing (1 ml) gedurende 1-5 minuten bloot aan blauwe of violette LED-lichtstraling bij 10 W/m2 .
  4. Detecteer de Equation 1 soort (uit de absorptie bij 560 nm) geproduceerd door de fotochemische reactie, die NBT vermindert en formazan produceert.

4. Levensvatbaarheid van S. aureus na FMN-fotolyse (figuur 5)

  1. Breng een kolonie S. aureus (BCRC 10451) van een gekweekte plaat over in 10 ml Lysogeny-bouillon in een 15 ml met schroefdeksel bedekte reageerbuis. Kweek in een shaker bij 37 °C gedurende 16 uur.
  2. Breng 0,5 ml van de cultuur over in een centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg gesteriliseerd water toe aan de centrifugebuis om de cultuur te verdunnen tot een optische dichtheid van 0,5 bij 600 nm (OD600) (~ 6 x 107 CFU / ml).
  3. Breng 0,5 ml van de cultuur over naar een centrifugebuis van 1,5 ml, centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant om een celpellet te verkrijgen.
  4. Voeg 1 ml FMN-gebufferde oplossing (30, 60 en 120 μM FMN in PB) toe aan de celpellets verkregen zoals in stap 4.3, en vortex. Voeg voor bestraalde controle alleen 1 ml PB toe.
  5. Breng elk van de levensvatbare bacteriële celoplossingen met alleen 30 μM FMN en PB over in glazen buizen en bestraal ze met violet licht bij 10 W/m2 gedurende 30 minuten.
  6. Breng elk van de levensvatbare bacteriële celoplossingen met 30, 60 en 120 μM FMN en PB alleen over in glazen buizen en bestraal ze met blauw licht bij 20 W/m2 gedurende 120 min. Plaats een andere glazen buis met 1 ml levensvatbare bacteriële celoplossing met 120 μM FMN en bestraal deze met blauw licht bij 20 W/m2 gedurende 60 minuten.
  7. Stel reageerbuizen in zoals beschreven in stap 4.5 en 4.6 en bedek ze met dikke aluminiumfolies. Deze buizen dienen als donkere bedieningselementen.
  8. Houd de bestralingskamer (evenals de donkere bedieningselementen) in een koelcel op 9 ± 1 °C gedurende de bestralingsperiode van 30-120 minuten.
    OPMERKING: Warmte die vrijkomt door LED-lampen kan niet worden genegeerd, omdat de LED-chips die in de beker zijn geplaatst, het fotoreactiesysteem kunnen verwarmen tijdens bestralingsexperimenten. De experimenten werden daarom uitgevoerd in een koelcel met een temperatuur van 9 ± 1 °C.
  9. Breng na bestraling 0,2 ml van elk van de reactieoplossingen over op een Luria agar (LA) plaat. Verdeel de bacteriën over de plaat met een L-vormige glazen staaf en incubeer een nacht bij 37 °C.
  10. Bereken het aantal levensvatbare platen en de inactivatiesnelheden van S. aureus na nachtelijke groei.
    OPMERKING: De inactivatiesnelheid van S. aureus wordt berekend als de procentuele reductie, die gelijk is aan [1 -I / D] ×100%, waarbij I en D respectievelijk het aantal CFU's in het bestraalde monster en de donkere controle aangeven. De procentuele reductie wordt gedefinieerd als een negatieve waarde van het inactiveringspercentage.

5. Detectie van Equation 1 in S. aureus (figuur 6)

  1. Bereid de S. aureusmonsters voor zoals beschreven in stap 4.
  2. Verdun de bacteriële dichtheid van de monsters met gesteriliseerd water tot een optische dichtheid van 0,5 bij 600 nm (OD600, ~ 6 x 106 CFU / ml). Breng 0,5 ml van de cultuur over in een centrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant om een celpellet te verkrijgen.
  3. Voeg 0,1093 g L-methionine, 0,1 g NBT en 25 ml FMN (400, 240 of 120 μM) toe aan 75 ml PB. Voor elke 1 ml van de toegepaste reactant zijn de eindconcentraties van FMN, methionine en NBT respectievelijk 100 (60 of 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M en 1,2 x 10-3 M.
  4. Voeg 1 ml van elke reactante oplossing (d.w.z. met verschillende FMN-concentraties) toe aan de celpellets die zijn verkregen zoals in stap 5.2. Bestraal de oplossingen door violet licht op 10 W/m2 gedurende 10 min.
  5. Centrifugeer het mengsel op 14.000 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om de gereduceerde NBT te extraheren. Detecteer de geproduceerde Equation 1 soorten uit de absorptie bij 560 nm.

6. Statistische analyse

  1. Druk gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van drie onafhankelijke tests.
  2. Pas een homoscedastische t-test met twee monsters toe om te evalueren of twee metingen verschillend zijn. p-waarden < 0,05 worden als statistisch significant beschouwd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Effect van lichtgolflengte op FMN
De absorptiespectra van 0,1 mM FMN die wordt bestraald met blauwe, groene, rode en violette LED's zijn weergegeven in figuur 3. Er zijn twee pieken voor FMN (372 nm en 444 nm) voor de donkere controle. Groen en rood licht hebben geen effect omdat veranderingen in de spectra onbeduidend zijn. Aan de andere kant wordt de respectieve absorptie van FMN bij 444 nm verminderd met respectievelijk ongeveer 19% en 34% na blauwe en violette lichtbestraling bij 10 W/m2 gedurende 5 min, wat suggereert dat bestraling met blauw/violet licht fmn-fotolyse verhoogt.

Detectie van Equation 10 van FMN dat wordt bestraald met blauw of violet licht
NBT-reductie werd gebruikt om de vorming van Equation 132 te bepalen. FMN is zeer gevoelig voor zichtbaar en UV-licht, zelfs voor korte perioden van straling. Equation 1 wordt gevormd uit de intermediaire fotochemische reacties tijdens de fotolyse van FMN. Figuur 4 laat zien dat het fotochemische effect van FMN op NBT-reductie afhankelijk is van de bestralingstijd, zoals Equation 1 gevormd door FMN dat op tijdsafhankelijke wijze wordt blootgesteld aan blauwe of violette lichtstraling. Het gemiddelde fotolytische effect van blauw licht en violet licht is echter vergelijkbaar met figuur 4.

Effect van FMN-fotolyse op de levensvatbaarheid van S. aureus
Het effect van FMN blootgesteld aan violette of blauwe lichtbestraling op de levensvatbaarheid van S. aureus werd bepaald. FMN-fotolyse met behulp van blauwe of violette lichtbestraling resulteert in significante inactivatie van S. aureus. Hoe groter de concentratie FMN, hoe hoger de inactivatiesnelheid van S. aureus die wordt blootgesteld aan blauwlichtstraling bij 20 W/m2 gedurende 120 minuten, zoals weergegeven in figuur 5A. Inactivatiepercentages van 26%, 39%, 43% en 97% werden bereikt voor S. aureus met respectievelijk 0, 30, 60 en 120 μM FMN, onder 20 W/m2 blauwlichtstraling gedurende 120 min. Zoals weergegeven in figuur 5A is er geen significant verschil (p-waarde = 0,20) in de inactivatiesnelheid voor S. aureus met behulp van blauwlichtbestraling met ofwel 60 μM FMN bij 20 W/m2 gedurende 120 min (energiedosis, 14,4 J/cm2) of 120 μM FMN bij 20 W/m2 gedurende 60 min (energiedosis, 7,2 J/cm2). Aan de andere kant, zoals weergegeven in figuur 5B, werden inactivatiepercentages van 53% en 96% bereikt voor S. aureus zonder respectievelijk en met 30 μM FMN, onder violette lichtbestraling bij 10 W/m2 gedurende 30 min (energiedosis van 1,8 J/cm2). Daarom heeft FMN blootgesteld aan blauwe of violette lichtbestraling een groter effect op de levensvatbaarheid van S. aureus door de bacteriële inactivatie te verhogen. FMN behandeld met violette lichtbestraling is efficiënter bij S. aureus inactivatie.

Detectie van Equation 10 bij fmn-behandelde S. aureus onder violette lichtbestraling
De productie van Equation 1 in FMN behandelde S. aureus onder violette lichtbestraling werd bepaald met behulp van de NBT-reductiemethode. De absorptiewaarde bij 560 nm werd gebruikt om de omvang van Equation 1 de productie te evalueren. Het fotochemische effect van FMN op Equation 1 de generatie in S. aureus is evenredig met de FMN-concentratie (figuur 6). De absorptiewaarden van 560 nm voor S. aureus zonder FMN-behandeling zijn respectievelijk 0,31 en 0,07 onder 10 W/m2 violette lichtstraling gedurende 10 minuten en in het donker (figuur 6). Dit suggereert dat er weinig Equation 1 werd geproduceerd in onbehandelde S. aureus na bestraling van violet licht. De respectieve absorptiewaarden van 560 nm voor S. aureus behandeld met 100 μM FMN zijn respectievelijk 1,36 en 0,08 onder 10 W/m2 violette lichtstraling gedurende 10 minuten en in het donker. Daarom neemt het fotochemische effect op NBT-reductie in met FMN behandelde S. aureus toe onder violette bestraling, zoals Equation 1 overvloedig wordt geproduceerd.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van het fotoreactiesysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: De emissiespectra van blauwe, groene, rode en violette LED-lampen in deze studie. De emissiemaxima voor de blauwe, groene, rode en violette lichten liggen respectievelijk op 465, 529, 632 en 405 nm en de spectrale breedtes op halve hoogte (W1/2) zijn respectievelijk 26, 31, 14 en 12 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Absorptiespectra van FMN behandeld met LED's van verschillende golflengten bij 10 W/m2 gedurende 5 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: NBT-reductie om het effect van blauwe en violette lichtbestraling bij 10 W/m2 gedurende 1-5 min op FMN-fotolyse te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Effect van FMN-fotolyse op de levensvatbaarheid van S. aureus . De procentuele reductie wordt gedefinieerd als een negatieve waarde van de inactivatiesnelheid voor S. aureus behandeld met (A) FMN onder blauwlichtbestraling bij 20 W/m2 gedurende 120 min en (B) FMN bij violette lichtbestraling bij 10 W/m2 gedurende 30 min. FMN-concentraties en bestralingstijden worden bovenaan de figuur aangegeven. Merk op dat er geen significant verschil (p = 0,20) is in de inactivatiesnelheid voor S. aureus met 60 μM FMN bij 20 W/m2 blauwlichtbestraling gedurende 120 min of 120 μM FMN bij 20 W/m2 blauwlichtbestraling gedurende 60 min (A). De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD, waarbij n = 3. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Effect van fmn-concentratie op Equation 10 de generatie in S. aureus die gedurende 10 min wordt blootgesteld aan violette lichtbestraling bij 10 W/m2 . Over het algemeen wordt er weinig Equation 1 geproduceerd in S. aureus in afwezigheid van FMN, hoewel de bestraling van violet licht in het bestraalde monster (PB (violet licht)) iets toeneemt Equation 1 ten opzichte van donkere controle (PB (donker)). De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD, waarbij n = 3. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een fotosensitizer verhoogt de fotochemische reactie van chemische verbindingen om ROS te genereren. Pathogene micro-organismen kunnen worden geïnactiveerd door lichtbestraling in aanwezigheid van fotosensitizers. Deze studie bepaalt de aPDI van S. aureus als gevolg van ROS gegenereerd door violette lichtbestraling van een exogene fotosensitizer, FMN.

Zoals te zien is in figuur 3, is voor FMN de absorptie bij 444 nm aanzienlijk verminderd na 5 minuten bestraling met violet of blauw licht en is er geen significante verandering in de FMN-absorptie bij bestraling met groen of rood licht. NBT-reductie wordt gebruikt om de vorming van Equation 1via een laadoverdrachtsproces10,33 te bepalen. Een eerdere studie door de auteurs gebruikte FMN onder blauwe, groene of roodlichtbestraling om de vorming van het gebruik van Equation 1 NBT-reductie te bepalen. Blauw licht bestraling produceert een enorme hoeveelheid terwijl Equation 1 de fotolytische efficiëntie van groen en rood licht minder dan 3% is van die bereikt door blauw licht10. Deze resultaten tonen aan dat een ladingsoverdrachtsproces wordt geproduceerd wanneer FMN wordt blootgesteld aan blauwe of violette lichtbestraling en dat er geen significante verandering optreedt bij bestraling door groen of rood licht.

Een eerdere studie van de auteurs34 toonde aan dat het mechanisme voor FMN-fotolyse kan worden beschreven met primaire FMN-fotolytische reacties (vergelijking 1):

Equation 2 (1),

waarbij 1FMN* en 3FMN* respectievelijk de singlet- en triplettoestand van het geëxciteerde FMN zijn. De fotolytische reactiemechanismen voor deze foto-geïnduceerde FMN worden mogelijk geïnitieerd door een triplet-triplet annihilatie of een triplet-ground state quenching process 35,36,37,38. De grondtoestand van FMN (FMN0) is een elektronendonor die een elektron levert aan 3FMN* en de semi-gereduceerde (FMN•-) en semi-geoxideerde (FMN•+) vormen genereert, zoals weergegeven in vergelijking 2

Equation 3 (2)

De fotodegradatiepaden voor FMN zijn het resultaat van fotosensibilisatie. FMN wordt gepromoveerd tot de elektronisch geëxciteerde toestand, FMN•, via een fotolytische reactie en vervolgens wordt een neutraal FMN verminderd wanneer FMN• een elektron verliest, zoals weergegeven in vergelijkingen 3-8 hieronder:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

waarbij FMN•+ een radicale kationsoort is.

De interactie van FMN•- met O2 (3Σg-) produceert het reactieve superoxideradicaal, Equation 1gevolgd door het hydroperoxylradicaal, HOO•, dat wordt gegenereerd in de reactie tussen Equation 1 en een proton en uiteindelijk leidt tot de afbraak van FMN0:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

waar FMN•- een radicaal anion is.

In deze studie is, bij afwezigheid van FMN, de inactivatiesnelheid in het geval van S. aureus 53% bij violette lichtbestraling bij 10 W/m2 gedurende 30 min en 26% bij blauwe lichtbestraling bij 20 W/m2 gedurende 120 min, wat suggereert dat blauwlichtbestraling minder bacteriën deactiveert dan violet licht (figuur 5). Eerder is gemeld dat bestraling op golflengten langer dan 430 nm zonder een exogene fotosensitizer S. aureuscellen niet inactiveert, hoewel porfyrines in S. aureus een maximale absorptie hebben bij 405 ± 5 nm en bacteriële inactivatie veroorzaken na bestraling39.

Een eerdere studie van de huidige auteurs toonde aan dat E. coli en S. aureus worden gedeactiveerd door DNA-splitsing die wordt geïnduceerd door de vorming van door fotolyse van riboflavine of FMN 10,24,40. De respectieve inactivatiepercentages voor S. aureus zijn respectievelijk 97% en 96%, met behulp van 120 μM FMN onder 20 W/m2 blauw licht bestraling (energiedosis van 14,4 J/cm2) gedurende 120 min en 30 μM FMN onder 10 W/m2 violette lichtstraling (energiedosis van 1,8 J/cm2) gedurende 30 min (figuur 5). Daarom is violette lichtbestraling effectiever in het deactiveren van S. aureus, omdat laagenergetische doses violet licht S. aureus kunnen deactiveren in de aanwezigheid van lagere FMN-concentraties en kortere verlichtingsperioden in vergelijking met blauw licht. Hoewel de mate van FMN-fotolyse die door violet licht wordt bereikt hoger is in vergelijking met blauw licht (figuur 3), zijn de gemiddelde fotolytische effecten van FMN op NBT-reductie onder blauwe en violette lichtbestraling vergelijkbaar (figuur 4).

E. coli is een veel voorkomende Gram-negatieve bacterie. Riboflavine of FMN-fotolyse door bestraling door blauw licht inactiveert E. coli via ROS 10,24,41 met een inactivatiepercentage van 96% bij gebruik van FMN10,24. S. aureus daarentegen is een Gram-positieve bacterie, die effectief wordt geïnactiveerd door FMN-fotolyse onder violette lichtbestraling, zoals hier aangetoond (figuur 5). Daarom kan FMN-fotolytische reactie onder blauwe of violette lichtbestraling ROS produceren en zowel Gram-negatieve als Gram-positieve bacteriën inactiveren.

Bij afwezigheid van FMN wordt echter weinig Equation 1 geproduceerd in S. aureus die wordt blootgesteld aan violette lichtbestraling (figuur 6); daarom verminderen endogene fotosensitizers de levensvatbaarheid van S. aureus onder violette lichtbestraling slechts in geringe mate, vergeleken met het effect in de aanwezigheid van exogene fotosensitizer zoals FMN. Onder dezelfde omstandigheden vermindert FMN dat wordt blootgesteld aan violette lichtbestraling de levensvatbaarheid van S. aureus om te resulteren in een inactivatiesnelheid van 96%, wat veel hoger is dan die voor endogene intracellulaire fotosensitizers alleen. De productie van Equation 1 in FMN behandelde S. aureus onder violette lichtbestraling is aanzienlijk toegenomen, zoals te zien is in figuur 6. Deze resultaten tonen aan dat FMN bij blootstelling aan violette lichtbestraling een verhoogd niveau van bacteriële inactivatie veroorzaakt.

FMN kan een foto-geëxciteerde toestand bereiken wanneer het wordt bestraald met UV 1,2,21,22,23, blauw10,24 en violet licht31; de cytotoxiciteit die wordt veroorzaakt door UV-straling en hoge intensiteit kortegolflengtestraling moet echter als42 worden beschouwd. Aan de andere kant produceren rode en groene stralingen met langere golflengten geen significante hoeveelheden ROS tijdens FMN-fotolyse10. Daarom vereist de ROS-geïnduceerde aPDI van S. aureus het bestralen van FMN met violet licht met een tussenliggende golflengte. De spectrale breedte op halve hoogte (W1/2) voor violet licht moet smal zijn om overlapping met de UV-absorptie te voorkomen en het risico als gevolg van UV-straling te remmen31. De micronutriënt, FMN, is als zodanig onschadelijk en is een essentiële vitamine voor het menselijk lichaam. Met behulp van een geschikte fotosensitizer zoals FMN kan laagenergetische violette lichtbestraling pathogene bacteriën onderdrukken, waardoor een veilig en effectief middel voor het sanitaire proces wordt geboden. Naast de fotolytische reactie van FMN op S. aureus, verdienen andere kwesties verder onderzoek, zoals de fototoxiciteit van FMN op microben, voortkomend uit de stress veroorzaakt door Equation 1 , die kan worden bestudeerd met behulp van een RNA-seq-techniek samen met qPCR.

FMN-fotolyse via violette lichtbestraling leidt tot fotochemische oxidatie waardoor ROS wordt gegenereerd en verbetert op zijn beurt de inactivatie van pathogene bacteriën. Het gebruik van violet licht wordt beschouwd als een cruciale stap in FMN-fotodecompositie. De beperking van de huidige techniek is dat het golflengte-interval van violet licht vrij smal moet zijn om het risico als gevolg van UV-bestraling te vermijden. De huidige methode heeft het potentieel voor toekomstige medische toepassingen, zoals infectiebehandeling van de oppervlaktehuid samen met diepe onderhuidse weefsels of spieren door een optische vezel in te brengen om het violette licht naar de geïnfecteerde gebieden te leiden. Fotochemische behandeling met FMN is daarom een veilige en eenvoudige manier om effectieve hygiënepraktijken te garanderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs zijn Dr. Tak-Wah Wong en Mr. Zong-Jhe Hsieh dankbaar voor hun steun bij experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jian, H. L., Cheng, C. W., Chen, L. Y., Liang, J. Y. The photochemistry of riboflavin. MC-Transaction on Biotechnology. 3, 1-11 (2011).
  2. Lin, Y., Eitenmiller, R. R., Landen, W. O. Riboflavin. Vitamin analysis for the health and food sciences. , CRC Press. 329-360 (2008).
  3. Xie, L. J., Wang, R. L., Wang, D., Liu, L., Cheng, L. Visible-light-mediated oxidative demethylation of N(6)-methyl adenines. Chemical Communications. 53 (77), 10734-10737 (2017).
  4. Tim, M. Strategies to optimize photosensitizers for photodynamic inactivation of bacteria. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 150, 2-10 (2015).
  5. Maisch, T., et al. Photodynamic inactivation of multi-resistant bacteria (PIB) - a new approach to treat superficial infections in the 21st century. Journal of the German Society of Dermatology. 9 (5), 360-366 (2011).
  6. Hamblin, M. R. Antimicrobial photodynamic inactivation: a bright new technique to kill resistant microbes. Current Opinion in Microbiology. 33, 67-73 (2016).
  7. Del Rosso, J. Q. Oral Doxycycline in the management of acne vulgaris: Current perspectives on clinical use and recent findings with a new double-scored small tablet formulation. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 8 (5), 19-26 (2015).
  8. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dematologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  9. Yuann, J. M. P., et al. Effects of free radicals from doxycycline hyclate and minocycline hydrochloride under blue light irradiation on the deactivation of Staphylococcus aureus, including a methicillin-resistant strain. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 226, 112370 (2022).
  10. Liang, J. Y., Cheng, C. W., Yu, C. H., Chen, L. Y. Investigations of blue light-induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide on inactivation of E. coli. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 143, 82-88 (2015).
  11. Yang, M. J., et al. Effects of blue-light-induced free radical formation from catechin hydrate on the inactivation of Acinetobacter baumannii, Including a carbapenem-resistant strain. Molecules. 23 (7), 1631 (2018).
  12. Yuann, J. M. P., et al. A study of catechin photostability using photolytic processing. Processes. 9 (2), 293 (2021).
  13. Yuann, J. M. P., Wang, J. S., Jian, H. L., Lin, C. C., Liang, J. Y. Effects of Clinacanthus nutans (Burm. f) Lindau leaf extracts on protection of plasmid DNA from riboflavin photoreaction. MC-Transaction on Biotechnology. 4 (1), 45-59 (2012).
  14. Rineh, A., et al. Attaching NorA efflux pump inhibitors to methylene blue enhances antimicrobial photodynamic inactivation of Escherichia coli and Acinetobacter baumannii in vitro and in vivo. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 28 (16), 2736-2740 (2018).
  15. Dai, T., et al. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  16. Nitzan, Y., Ashkenazi, H. Photoinactivation of Acinetobacter baumannii and Escherichia coli B by a cationic hydrophilic porphyrin at various light wavelengths. Current Microbiology. 42 (6), 408-414 (2001).
  17. Tseng, C. C., et al. Altered susceptibility to the bactericidal effect of photocatalytic oxidation by TiO2 is related to colistin resistance development in Acinetobacter baumannii. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (19), 8549-8561 (2016).
  18. Boluki, E., et al. Antimicrobial activity of photodynamic therapy in combination with colistin against a pan-drug resistant Acinetobacter baumannii isolated from burn patient. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 18, 1-5 (2017).
  19. Yang, M. Y., et al. Blue light irradiation triggers the antimicrobial potential of ZnO nanoparticles on drug-resistant Acinetobacter baumannii. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 180, 235-242 (2018).
  20. Code of Federal Regulations. , Available from: https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2009-title21-vol6/pdf/CFR-2009-title21-vol6-sec582-5695.pdf (2022).
  21. Lu, C. Y., et al. Generation and photosensitization properties of the oxidized radical of riboflavin: a laser flash photolysis study. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 52 (1-3), 111-116 (1999).
  22. Sato, K., et al. The primary cytotoxicity in ultraviolet-a-irradiated riboflavin solution is derived from hydrogen peroxide. The Journal of Investigative Dermatology. 105 (4), 608-612 (1995).
  23. Tripathi, A. K., et al. Attenuated neuroprotective effect of riboflavin under UV-B irradiation via miR-203/c-Jun signaling pathway in vivo and in vitro. Journal of Biomedical Science. 21 (1), 39 (2014).
  24. Liang, J. Y., et al. Blue light induced free radicals from riboflavin on E. coli DNA damage. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 119, 60-64 (2013).
  25. Ottaway, P. B. The Technology of Vitamins in Food. , Chapman and Hall. London. Ch. 5 233-244 (1993).
  26. Kumar, V., et al. Riboflavin and UV-light based pathogen reduction: extent and consequence of DNA damage at the molecular level. Photochemistry and Photobiology. 80 (1), 15-21 (2004).
  27. Ito, K., Inoue, S., Yamamoto, K., Kawanishi, S. 8-Hydroxydeoxyguanosine formation at the 5'site of 5'-GG-3'sequences in double-stranded DNA by UV radiation with riboflavin. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13221-13227 (1993).
  28. Liang, J. Y., Yuann, J. M. P., Hsie, Z. J., Huang, S. T., Chen, C. C. Blue light induced free radicals from riboflavin in degradation of crystal violet by microbial viability evaluation. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 174, 355-363 (2017).
  29. Yang, M. Y., Chang, C. J., Chen, L. Y. Blue light induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide on lethality of HeLa cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 173, 325-332 (2017).
  30. Cui, Z., Huang, Y., Mo, Q., Wang, X., Qian, K. Inactivation of lymphocytes in blood products using riboflavin photochemical treatment with visible light. Photochemistry and Photobiology. 84 (5), 1195-1200 (2008).
  31. Wong, T. W., Cheng, C. W., Hsieh, Z. J., Liang, J. Y. Effects of blue or violet light on the inactivation of Staphylococcus aureus by riboflavin-5′-phosphate photolysis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 173, 672-680 (2017).
  32. Russell, L. F., Vanderslice, J. T. Comprehensive review of vitamin B2 analytical methodology. Journal of Micronutrient Analysis. 8, 257-310 (1990).
  33. Cheng, C. W., Chen, L. Y., Chou, C. W., Liang, J. Y. Investigations of riboflavin photolysis via coloured light in the nitro blue tetrazolium assay for superoxide dismutase activity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 148, 262-267 (2015).
  34. Huang, S. T., et al. Effects of 462 nm light-emitting diode on the inactivation of Escherichia coli and a multidrug-resistant by tetracycline photoreaction. Journal of Clinical Medicine. 7 (9), 278 (2018).
  35. Barua, M. G., Escalada, J. P., Bregliani, M., Pajares, A., Criado, S. Antioxidant capacity of (+)-catechin visible-light photoirradiated in the presence of vitamin B2. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 22 (6), 282-289 (2017).
  36. Castillo, C., Criado, S., Díaz, M., García, N. A. Riboflavin as a sensitiser in the photodegradation of tetracyclines. Kinetics, mechanism and microbiological implications. Dyes and Pigments. 72 (2), 178-184 (2007).
  37. Huvaere, K., Sinnaeve, B., Van Bocxlaer, J., Skibsted, L. H. Flavonoid deactivation of excited state flavins: reaction monitoring by mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (36), 9261-9272 (2012).
  38. Massad, W. A., Bertolotti, S., Garcia, N. A. Kinetics and mechanism of the vitamin B2-sensitized photooxidation of isoproterenol. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 428-433 (2004).
  39. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. High-intensity narrow-spectrum light inactivation and wavelength sensitivity of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 285 (2), 227-232 (2008).
  40. Huang, S. T., et al. The influence of the degradation of tetracycline by free radicals from riboflavin-5'-phosphate photolysis on microbial viability. Microorganisms. 7 (11), 500 (2019).
  41. Maisch, T., et al. Fast and effective photodynamic inactivation of multiresistant bacteria by cationic riboflavin derivatives. PLoS One. 9 (12), 111792 (2014).
  42. Grijzenhout, M., et al. Ultraviolet-B irradiation of platelets induces a dose-dependent increase in the expression of platelet activation markers with storage. British Journal of Haematology. 83 (4), 627-632 (1993).

Tags

Bio-engineering FMN photolysis ROS S. aureus violet licht
Inactivatie van pathogenen <em>via</em> zichtbaar-licht fotolyse van riboflavine-5′-fosfaat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T.… More

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T. Y., Yuann, J. M. P., Chiu, C. M., Huang, S. T., Liang, J. Y. Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5′-Phosphate. J. Vis. Exp. (182), e63531, doi:10.3791/63531 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter