Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Inaktivering av patogener via fotolyse i synlig lys av riboflavin-5′-fosfat

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å inaktivere patogene bakterier med reaktive oksygenarter produsert under fotolyse av flavin mononukleotid (FMN) under bestråling av blått og fiolett lys med lav intensitet. FMN-fotolyse er vist å være en enkel og sikker metode for sanitære prosesser.

Abstract

Riboflavin-5'-fosfat (eller flavin mononukleotid; FMN) er følsom for synlig lys. Ulike forbindelser, inkludert reaktive oksygenarter (ROS), kan genereres fra FMN-fotolyse ved bestråling med synlig lys. ROS generert fra FMN-fotolyse er skadelig for mikroorganismer, inkludert patogene bakterier som Staphylococcus aureus (S. aureus). Denne artikkelen presenterer en protokoll for deaktivering av S. aureus, som et eksempel, via fotokjemiske reaksjoner som involverer FMN under bestråling av synlig lys. Superoksidradikalanionen () generert under FMN-fotolysen evalueres via reduksjon av nitroblått tetrazolium (Equation 1NBT). Den mikrobielle levedyktigheten til S. aureus som tilskrives reaktive Equation 1 arter, ble brukt til å bestemme effektiviteten av prosessen. Den bakterielle inaktiveringshastigheten er proporsjonal med FMN-konsentrasjonen. Fiolett lys er mer effektivt ved å inaktivere S. aureus enn bestråling av blått lys, mens det røde eller grønne lyset ikke driver FMN-fotolyse. Denne artikkelen demonstrerer FMN-fotolyse som en enkel og sikker metode for sanitære prosesser.

Introduction

Riboflavin-5′-fosfat (FMN) dannes ved fosforylering ved riboflavin 5′-posisjonen til ribityl-sidekjeden og kreves av alle flavoproteiner for mange cellulære prosesser for å generere energi. Det spiller også rollen som vitamin for noen funksjoneri menneskekroppen. FMN er omtrent 200 ganger mer løselig i vann enn riboflavin2.

Den antibakterielle fotodynamiske inaktiveringen (aPDI) av bakterier er en effektiv måte å kontrollere resistens mot bakterier 3,4 fordi den ikke er avhengig av modusen for bakteriell resistens. Klinisk brukes aPDI til å behandle bløtvevsinfeksjoner for å redusere infeksjon av nosokomial hud på grunn av multiresistente bakterier 5,6,7,8,9. aPDI produserer også celledød ved å generere reaktive oksygenarter (ROS). ROS, som superoksidradikaler (), singlet oksygen, hydroksylradikaler (Equation 1•OH) og peroksylradikaler, er frie radikaler eller molekyler som inneholder reaktivt oksygen 10,11,12 og er normalt reaktive 13. I likhet med DNA-skade som er forårsaket av ROS, er membranperoksydasjon og ødeleggelse av endotelceller også uønskede biokjemiske reaksjoner som tilskrives ROS i celler12.

Bruken av aPDI for patogene bakterier innebærer en synlig eller UV-lyskilde for å inaktivere mikroorganismer i nærvær av kjemiske forbindelser, slik som metyltioniniumklorid 14, PEI-ce6 konjugat 15, porfyrin 16, titandioksid 17, toluidinblåttO18 og sinkoksid nanopartikler 19. Toluidinblå O og metylenblå er fenotiaziniumfarger og metylenblå har giftige egenskaper. Sinkoksid nanopartikler og UV-bestråling er knyttet til negative helse- og miljøeffekter. Som sådan fortjener utnyttelsen av en pålitelig, sikker og enkel fotosensibilisator via fotolyse under synlig bestråling videre studier.

Mikronæringsstoffet, riboflavin eller FMN, er ikke giftig og brukes faktisk til matproduksjon eller fôring20. Både FMN og riboflavin er svært følsomme for lysbestråling2. Under UV 1,2,21,22,23 og blålysbestråling 10,24 oppnår disse to forbindelsene en eksitert tilstand. Den aktiverte riboflavin eller FMN som produseres ved fotolyse fremmes til sin tripletttilstand og ROS genereres samtidig 2,25. Kumar og medarbeidere rapporterte at riboflavin aktivert av UV-lys selektivt forårsaker økt skade på guanindelen av DNA i patogene mikroorganismer26. Under bestråling av UV-lys er fotodynamisk aktivert riboflavin demonstrert for å fremme genereringen av 8-OH-dG, som er en biomarkør for oksidativt stress, i dobbeltstrenget DNA27. Det er rapportert at S. aureus og E. coli deaktiveres av ROS under riboflavin eller FMN fotolyse 10,24,28. En tidligere studie av forfatterne viste at de fotolytiske reaksjonene som involverer riboflavin og FMN reduserer krystallfiolett, et triarylmetanfargestoff og et antibakterielt middel som genererer Equation 1, og eliminerer det meste av den antimikrobielle evnen til krystallfiolett28. Når flavin adenin dinukleotid eller FMN bestråles av blått lys, produserer den resulterende ROS apoptose i HeLa-celler for forgiftning in vitro29. Ved bruk av fotokjemisk behandling i nærvær av riboflavin inaktiverte Cui og medarbeidere lymfocytter ved å hemme deres proliferasjon og cytokinproduksjon30.

Fotolysen av riboflavin brukes til inaktivering av blodpatogen ved UV 10,24, men blodkomponenter kan svekkes under UV-lysbestråling30. Det er også rapportert at blodplater utsatt for UV gradvis forbedrer ytelsen til aktiveringsmarkørene P-selectin og LIMP-CD63 på membranene. Cytotoksisiteten til UV og høyintensitetsbestråling må undersøkes, og en fotosensibilisator som er ukomplisert og sikker under en FMN-fotoreaksjon som involverer synlig lys, vil være til stor nytte.

Lys med kortere bølgelengder har mer energi og er mye mer sannsynlig å forårsake alvorlig skade på celler. Men i nærvær av en egnet fotosensibilisator kan bestråling med fiolett lys med lav intensitet hemme patogene mikroorganismer. Fotosensibiliseringen og genereringen av av FMN når den bestråles med fiolett lys er derfor viktig å studere, for å bestemme banen som ROS fra FMN-fotolyse øker inaktiveringen av Equation 1 bakterier.

Antimikrobiell kontroll er et vanlig problem, og utviklingen av nye antibiotika tar ofte flere tiår. Etter bestråling med fiolett lys kan fotoinaktivering som formidles av FMN tilintetgjøre miljøpatogene bakterier. Denne studien presenterer en effektiv antimikrobiell protokoll in vitro ved bruk av fiolett lys for å drive FMN-fotolyse og dermed generere Equation 1 for aPDI. Den mikrobielle levedyktigheten til S. aureus brukes til å bestemme muligheten for FMN-indusert aPDI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Oppsett av fotolysesystem

  1. Monter seks lysdioder (LED) (DC 12 V) på innsiden av en ugjennomsiktig plastkopp (8 cm x 7 cm) som vist i figur 1 for å etablere et fotolysesystem31.
  2. Tilsett reaktanter (se nedenfor) i glassreagensrørene (13 mm i diameter og 100 mm i høyden) og fest rørene på toppen av koppen som vist i figur 1. Plasser det eksperimentelle oppsettet i et rom med en jevn temperatur på 25 ± 3 °C.
  3. Overvåk og registrer temperaturen på testenheter gjennom de fotolytiske reaksjonene med et infrarødt termometer.
    MERK: Figur 2 viser utslippsspektrene for blått, grønt, rødt og fiolett lys, som registrert med et kalibrert UV-Vis optisk spektrometer. Bølgelengdene som tilsvarer absorbansmaksimumet for blå, grønne, røde og fiolette LED-lys som ble brukt i studien er henholdsvis 465, 529, 632 og 405 nm. LED-brikkene kan varme opp apparatet under bestrålingseksperimenter. Hele fotoreaksjonssystemet i hvert eksperiment ble derfor plassert i et rom der temperaturen ble holdt konstant på 25 ± 3 °C.

2. Effekten av lysbølgelengde på fotolysen av FMN (figur 3)

  1. Forklar en 0,1 mM FMN-løsning i 100 mM kaliumfosfatbuffer (PB) (pH 7,8). Utsett FMN-prøver (3 ml hver) for blått, grønt, rødt eller fiolett lys med en intensitet på 10 W/m2 i 5 minutter. Hold 3 ml FMN-løsning i mørket som en kontroll.
  2. Registrer absorbansen til bestrålte FMN-prøver i området 250-750 nm ved hjelp av et UV / synlig spektrofotometer.

3. Nitroblå tetrazolium (NBT) reduksjonsmetode for å oppdage Equation 1 (figur 4).

MERK: NBT-reduksjonsmetoden som brukes her, ble litt modifisert fra analysen for riboflavinfotoreaksjon. NBT-reduksjonsmetoden brukes til å evaluere nivået av Equation 1 generert fra FMN-fotolyse. Den fotokjemisk opphissede FMN reduseres først av L-metionin til et semikinon, som deretter donerer et elektron til oksygen som gir opphav til Equation 131. Den as-genererte Equation 1 reduserer NBT til formazan, som har en karakteristisk absorbans ved 560 nm32.

  1. Tilsett 109,3 mg L-metionin til 73,3 ml PB (100 mM; pH 7,8). Vortex løsningen for å oppløse L-metionin.
  2. Etter at L-metionin er fullstendig oppløst, tilsett 10 mg NBT pulver og 1,53 ml 0,117 mM FMN til løsningen. For hver 1 ml av reaksjonsoppløsningen (dvs. en blanding av FMN, L-metionin og NBT) som påføres, er de endelige konsentrasjonene av FMN, metionin og NBT henholdsvis 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M og 1,6 x 10-4 M.
  3. Utsett reaksjonsoppløsningen (1 ml) for bestråling av blått eller fiolett LED-lys ved 10 W/m2 i 1-5 minutter.
  4. Oppdag Equation 1 arten (fra absorbansen ved 560 nm) produsert av den fotokjemiske reaksjonen, noe som reduserer NBT og produserer formazan.

4. S. aureus levedyktighet etter FMN-fotolyse (figur 5)

  1. Overfør en koloni av S. aureus (BCRC 10451) fra en kultivert plate til 10 ml Lysogeny-buljong tatt i et 15 ml skruekappet reagensrør. Kultur i shaker ved 37 °C i 16 timer.
  2. Overfør 0,5 ml av kulturen til et 1,5 ml sentrifugerør. Tilsett sterilisert vann i sentrifugerøret for å fortynne kulturen til en optisk tetthet på 0,5 ved 600 nm (OD600) (~ 6 x 107 CFU / ml).
  3. Overfør 0,5 ml av kulturen til et 1,5 ml sentrifugerør, sentrifuge ved 14 000 x g i 10 minutter og dekanter supernatanten for å oppnå en cellepellet.
  4. Tilsett 1 ml FMN-bufret løsning (30, 60 og 120 μM FMN i PB) til cellepellets oppnådd som i trinn 4.3 og virvel. For bestrålt kontroll, tilsett 1 ml PB alene.
  5. Overfør 1 ml hver av levedyktige bakteriecelleløsninger som inneholder 30 μM FMN og PB alene i glassrør, og bestråle dem med fiolett lys ved 10 W / m2 i 30 minutter.
  6. Overfør 1 ml hver av levedyktige bakteriecelleløsninger som inneholder 30, 60 og 120 μM FMN og PB alene til glassrør og bestråling dem med blått lys ved 20 W / m2 i 120 minutter. Sett opp et annet glassrør med 1 ml levedyktig bakteriell celleoppløsning som inneholder 120 μM FMN og bestråling det med blått lys ved 20 W / m2 i 60 minutter.
  7. Sett opp reagensrør som beskrevet i trinn 4.5 og 4.6 og dekk dem med tykke aluminiumsfolier. Disse rørene fungerer som mørke kontroller.
  8. Hold bestrålingskammeret (samt de mørke kontrollene) i et kjølerom ved 9 ± 1 °C i løpet av bestrålingsperioden på 30-120 minutter.
    MERK: Varme som frigjøres av LED-lys kan ikke ignoreres, da LED-brikkene plassert inne i koppen kan varme opp fotoreaksjonssystemet under bestrålingseksperimenter. Forsøkene ble derfor utført i et kjølerom opprettholdt ved 9 ± 1 °C.
  9. Etter bestråling, overfør 0,2 ml fra hver av reaksjonsløsningene til en Luria agar (LA) plate. Fordel bakteriene over tallerkenen med en L-formet glassstang og inkuber over natten ved 37 °C.
  10. Beregn levedyktig platetall og inaktiveringshastighetene til S. aureus etter vekst over natten.
    MERK: Inaktiveringsgraden til S. aureus beregnes som prosentvis reduksjon, som er lik [1 -I / D] ×100%, hvor I og D angir henholdsvis antall CFUer i den bestrålte prøven og mørk kontroll. Den prosentvise reduksjonen er definert som en negativ verdi av inaktiveringsraten.

5. Påvisning av Equation 1 in S. aureus (figur 6)

  1. Klargjør S. aureus-prøvene som beskrevet i trinn 4.
  2. Fortynn bakterietettheten til prøvene med sterilisert vann til en optisk tetthet på 0,5 ved 600 nm (OD600, ~6 x 106 CFU/ml). Overfør 0,5 ml av kulturen til et 1,5 ml sentrifugerør. Sentrifuge ved 14 000 x g i 10 minutter og dekanter supernatanten for å oppnå en cellepellet.
  3. Tilsett 0,1093 g L-metionin, 0,1 g NBT og 25 ml FMN (400, 240 eller 120 μM) til 75 ml PB. For hver 1 ml av reaktanten som påføres, er de endelige konsentrasjonene av FMN, metionin og NBT henholdsvis 100 (60 eller 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M og 1,2 x 10-3 M.
  4. Tilsett 1 ml av hver reaktantløsning (dvs. med varierende FMN-konsentrasjoner) til cellepellets oppnådd som i trinn 5.2. Bestråle løsningene med fiolett lys ved 10 W / m2 i 10 min.
  5. Sentrifuger blandingen ved 14 000 x g i 10 minutter og dekanter supernatanten. Resuspend pelleten i 1 ml dimetylsulfoksid (DMSO) for å trekke ut den reduserte NBT. Oppdag de produserte Equation 1 artene fra absorbansen ved 560 nm.

6. Statistisk analyse

  1. Ekspressdata som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) for tre uavhengige tester.
  2. Bruk en homoscedastisk to-prøve t-test for å vurdere om to målinger er forskjellige. p-verdier < 0,05 regnes som statistisk signifikante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Effekt av lysbølgelengde på FMN
Absorbansspektrene på 0,1 mM FMN som bestråles ved hjelp av blå, grønne, røde og fiolette lysdioder er vist i figur 3. Det er to topper for FMN (372 nm og 444 nm) for den mørke kontrollen. Grønt og rødt lys har ingen effekt fordi endringer i spektrene er ubetydelige. På den annen side reduseres den respektive absorbansen av FMN ved 444 nm med henholdsvis ca. 19% og 34% etter bestråling av blått og fiolett lys ved 10 W / m2 i 5 minutter, noe som tyder på at bestråling med blått / fiolett lys øker FMN-fotolyse.

Påvisning av Equation 10 fra FMN som bestråles ved hjelp av blått eller fiolett lys
NBT-reduksjon ble brukt til å bestemme dannelsen av Equation 132. FMN er svært følsomt for synlig og UV-lys selv i korte perioder med stråling. Equation 1 dannes fra de mellomliggende fotokjemiske reaksjonene under fotolysen av FMN. Figur 4 viser at den fotokjemiske effekten av FMN på NBT-reduksjon avhenger av bestrålingstiden, som Equation 1 dannes fra FMN utsatt for bestråling av blått eller fiolett lys på en tidsavhengig måte. Den gjennomsnittlige fotolytiske effekten av blått lys og fiolett lys er imidlertid lik som vist i figur 4.

Effekt av FMN-fotolyse på S. aureus levedyktighet
Effekten av FMN utsatt for bestråling av fiolett eller blått lys på S. aureus levedyktighet ble bestemt. FMN-fotolyse ved bruk av bestråling av blått eller fiolett lys resulterer i signifikant inaktivering av S. aureus. Jo større konsentrasjonen av FMN er, desto høyere er inaktiveringshastigheten til S. aureus som er utsatt for bestråling av blått lys ved 20 W / m2 i 120 minutter som vist i figur 5A. Inaktiveringsrater på 26 %, 39 %, 43 % og 97 % ble oppnådd for S. aureus ved bruk av henholdsvis 0, 30, 60 og 120 μM FMN under 20 W/m2 blålysbestråling i 120 minutter. Som vist i figur 5A er det ingen signifikant forskjell (p-verdi = 0,20) i inaktiveringsraten for S. aureus ved bruk av blålysbestråling med enten 60 μM FMN ved 20 W/m 2 i 120 minutter (energidose, 14,4 J/cm 2) eller 120 μM FMN ved 20 W/m 2 i 60 minutter (energidose, 7,2 J/cm2). På den annen side, som vist i figur 5B, ble inaktiveringsrater på 53% og 96% oppnådd for S. aureus uten og med henholdsvis 30 μM FMN under bestråling av fiolett lys ved 10 W / m 2 i 30 minutter (energidose på 1,8 J / cm2). Derfor har FMN utsatt for bestråling av blått eller fiolett lys større effekt på levedyktigheten til S. aureus ved å øke bakteriell inaktivering. FMN behandlet med bestråling av fiolett lys er mer effektivt ved S. aureus-inaktivering.

Påvisning av Equation 10 i FMN-behandlet S. aureus under bestråling av fiolett lys
Produksjonen av i FMN-behandlet S. aureus under fiolett lysbestråling ble bestemt ved hjelp av Equation 1 NBT-reduksjonsmetoden. Absorbansverdien ved 560 nm ble brukt til å evaluere omfanget av Equation 1 produksjonen. Den fotokjemiske effekten av FMN på Equation 1 generering i S. aureus er proporsjonal med FMN-konsentrasjonen (figur 6). 560 nm absorbansverdiene for S. aureus uten FMN-behandling er 0,31 og 0,07 under 10 W/m2 fiolett lysbestråling i henholdsvis 10 minutter og i mørket (figur 6). Dette antyder at lite Equation 1 ble produsert i ubehandlet S. aureus etter fiolett lysbestråling. De respektive absorbansverdiene på 560 nm for S. aureus behandlet med 100 μM FMN er bestråling av 1,36 og 0,08 under 10 W/m2 fiolett lys i henholdsvis 10 minutter og i mørket. Derfor øker den fotokjemiske effekten på NBT-reduksjon i FMN-behandlet S. aureus under fiolett bestråling, som Equation 1 produseres rikelig.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av fotoreaksjonssystemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Utslippsspektrene til blå, grønne, røde og fiolette LED-lys i denne studien. Utslippsmaksimum for de blå, grønne, røde og fiolette lysene er henholdsvis 465, 529, 632 og 405 nm, og spektralbreddene i halv høyde (W1/2) er henholdsvis 26, 31, 14 og 12 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Absorbansspektra av FMN behandlet med lysdioder med forskjellige bølgelengder ved 10 W / m2 i 5 min.

Figure 4
Figur 4: NBT-reduksjon for å bestemme effekten av bestråling av blått og fiolett lys ved 10 W / m2 i 1-5 minutter på FMN-fotolyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Effekt av FMN-fotolyse på S. aureus levedyktighet. Den prosentvise reduksjonen er definert som en negativ verdi av inaktiveringsraten for S. aureus behandlet med (A) FMN under blålysbestråling ved 20 W/m 2 i 120 minutter og (B) FMN under fiolett lysbestråling ved 10 W/m2 i 30 min. FMN-konsentrasjoner og bestrålingstider er angitt øverst i figuren. Merk at det ikke er noen signifikant forskjell (p = 0,20) i inaktiveringsraten for S. aureus ved bruk av 60 μM FMN ved 20 W/m 2 blålysbestråling i 120 minutter eller 120 μM FMN ved 20 W/m2 blålysbestråling i 60 minutter (A). Resultatene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD, hvor n = 3. *p < 0,05; **p < 0,01; s < 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Effekt av FMN-konsentrasjon på Equation 10 generering i S. aureus utsatt for bestråling av fiolett lys ved 10 W/m2 i 10 min. Samlet sett produseres lite Equation 1 i S. aureus i fravær av FMN, selv om bestråling av fiolett lys øker Equation 1 noe i den bestrålte prøven (PB (fiolett lys)) i forhold til mørk kontroll (PB (mørk)). Resultatene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD, hvor n = 3. * s < 0,05; ** p < 0,01; s < 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fotosensibilisator øker den fotokjemiske reaksjonen av kjemiske forbindelser for å generere ROS. Patogene mikroorganismer kan inaktiveres ved lysbestråling i nærvær av fotosensibilisatorer. Denne studien bestemmer aPDI av S. aureus på grunn av ROS generert av fiolett lysbestråling av en eksogen fotosensibilisator, FMN.

Som vist i figur 3, for FMN, reduseres absorbansen ved 444 nm signifikant etter 5 minutters bestråling ved bruk av fiolett eller blått lys, og det er ingen signifikant endring i FMN-absorbansen under bestråling med grønt eller rødt lys. NBT-reduksjon brukes til å bestemme dannelsen av Equation 1via en ladningsoverføringsprosess10,33. En tidligere studie av forfatterne brukte FMN under blå, grønn eller rødt lysbestråling for å bestemme dannelsen av bruk av Equation 1 NBT-reduksjon. Bestråling av blått lys produserer en enorm mengdeEquation 1, mens den fotolytiske effektiviteten til grønt og rødt lys er mindre enn 3% av det som oppnås ved blått lys10. Disse resultatene viser at en ladningsoverføringsprosess produseres når FMN blir utsatt for bestråling av blått eller fiolett lys, og at det ikke er noen signifikant endring ved bestråling ved grønt eller rødt lys.

En tidligere studie av forfatterne34 viste at mekanismen for FMN-fotolyse kan beskrives med primære FMN-fotolytiske reaksjoner (ligning 1):

Equation 2 (1),

hvor 1FMN* og 3FMN* er henholdsvis singlet- og tripletttilstandene til det eksiterte FMN. De fotolytiske reaksjonsmekanismene for disse fotoinduserte FMN er muligens initiert av en triplet-triplet annihilation eller en triplet-ground state quenching prosess35,36,37,38. Grunntilstanden til FMN (FMN0) er en elektrondonor som gir et elektron til 3FMN * og genererer de halvreduserte (FMN • -) og halvoksyderte (FMN • +) formene, som vist i ligning 2

Equation 3 (2)

Fotodegraderingsveiene for FMN er et resultat av fotosensibilisering. FMN fremmes til elektronisk eksitert tilstand, FMN •, via en fotolytisk reaksjon, og deretter reduseres en nøytral FMN når FMN • mister et elektron, som vist i ligningene 3-8 nedenfor:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

hvor FMN•+ er en radikal kationart.

Samspillet mellom FMN • - med O2 (3Σg-) produserer det reaktive superoksidradikalet, etterfulgt av hydroperoksylradikalet, HOO •,Equation 1 som genereres i reaksjonen mellom Equation 1 og et proton og til slutt fører til nedbrytning av FMN0:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

hvor FMN •- er en radikal anion.

I denne studien, i fravær av FMN, er inaktiveringsraten i tilfelle S. aureus 53% under fiolett lysbestråling ved 10 W / m 2 i 30 minutter og 26% under bestråling av blått lys ved 20 W / m2 i 120 minutter, noe som tyder på at bestråling av blått lys deaktiverer færre bakterier enn fiolett lys (figur 5). Det har tidligere blitt rapportert at bestråling ved bølgelengder lengre enn 430 nm uten eksogen fotosensibilisator ikke inaktiverer S. aureus-celler, selv om porfyriner i S. aureus har maksimal absorbans ved 405 ± 5 nm og forårsaker bakteriell inaktivering etter bestråling39.

En tidligere studie av de nåværende forfatterne viste at E. coli og S. aureus deaktiveres av DNA-spaltning som induseres ved dannelse av gjennom fotolyse av riboflavin eller FMN10,24,40. De respektive inaktiveringsratene for S. aureus er henholdsvis 97 % og 96 %, ved bruk av 120 μM FMN under 20 W/m 2 blålysbestråling (energidose på 14,4 J/cm 2) i 120 minutter og 30 μM FMN under 10 W/m 2 fiolett lysbestråling (energidose på 1,8 J/cm 2) i 30 minutter (figur 5). Derfor er bestråling av fiolett lys mer effektivt ved deaktivering av S. aureus, da lavenergidoser av fiolett lys kan deaktivere S. aureus i nærvær av lavere FMN-konsentrasjoner og kortere belysningsperioder sammenlignet med blått lys. Selv om omfanget av FMN-fotolyse oppnådd ved fiolett lys er høyere sammenlignet med blått lys (figur 3), er de gjennomsnittlige fotolytiske effektene av FMN på NBT-reduksjon under bestråling av blått og fiolett lys like (figur 4).

E. coli er en vanlig gramnegativ bakterie. Riboflavin eller FMN fotolyse ved bestråling av blått lys inaktiverer E. coli via ROS 10,24,41 med en inaktiveringsrate på 96% ved bruk av FMN 10,24. S. aureus, derimot, er en Gram-positiv bakterie, som effektivt inaktiveres ved FMN-fotolyse under bestråling av fiolett lys, som vist her (figur 5). Derfor kan FMN-fotolytisk reaksjon under bestråling av blått eller fiolett lys produsere ROS og inaktivere både gramnegative og grampositive bakterier.

I fravær av FMN produseres imidlertid lite Equation 1 i S. aureus som er utsatt for bestråling av fiolett lys (figur 6), derfor reduserer endogene fotosensibilisatorer bare litt levedyktigheten til S. aureus under fiolett lysbestråling, sammenlignet med effekten i nærvær av eksogene fotosensibilisatorer som FMN. Under de samme forholdene reduserer FMN som er utsatt for fiolett lysbestråling levedyktigheten til S. aureus for å resultere i en 96% inaktiveringshastighet, noe som er mye høyere enn for endogene intracellulære fotosensibilisatorer alene. Produksjonen av Equation 1 i FMN-behandlet S. aureus under fiolett lysbestråling har økt betydelig, som vist i figur 6. Disse resultatene viser at FMN når det utsettes for bestråling av fiolett lys forårsaker et forhøyet nivå av bakteriell inaktivering.

FMN kan oppnå en fotoopphisset tilstand når den bestråles ved hjelp av UV 1,21,22,23, blå 10,24 og fiolett lys 31; Cytotoksisiteten som er forårsaket av UV-stråling og høyintensiv kortbølget bestråling må imidlertid betraktes som42. På den annen side produserer røde og grønne strålinger med lengre bølgelengder ikke betydelige mengder ROS under FMN-fotolyse10. Derfor krever den ROS-induserte aPDI av S. aureus bestråling av FMN med fiolett lys som har en mellomliggende bølgelengde. Spektralbredden i halv høyde (W1/2) for fiolett lys må være smal for å unngå overlapping med UV-absorpsjonen og hemme risiko på grunn av UV-stråling31. Mikronæringsstoffet, FMN, er som sådan ufarlig, og er et essensielt vitamin for menneskekroppen. Ved hjelp av en passende fotosensibilisator som FMN, kan bestråling av fiolett lys med lav energi undertrykke patogene bakterier, noe som gir et trygt og effektivt middel for sanitærprosessen. I tillegg til den fotolytiske reaksjonen av FMN på S. aureus, fortjener andre problemer ytterligere undersøkelser, for eksempel fototoksisitet av FMN på mikrober, som oppstår ved stress forårsaket av Equation 1 , som kan studeres ved hjelp av en RNA-seq-teknikk sammen med qPCR.

FMN-fotolyse via bestråling av fiolett lys fører til fotokjemisk oksidasjon der ROS genereres og i sin tur forbedrer inaktiveringen av patogene bakterier. Bruken av fiolett lys regnes som et kritisk trinn i FMN-fotodekomponering. Begrensningen av dagens teknikk er at bølgelengdeintervallet for fiolett lys må være ganske smalt for å unngå risikoen på grunn av UV-bestråling. Den nåværende metoden har potensial for fremtidige medisinske anvendelser, for eksempel infeksjonsbehandling av overflatehud sammen med dype subkutane vev eller muskler ved å sette inn en optisk fiber for å lede det fiolette lyset til de infiserte områdene. Fotokjemisk behandling ved hjelp av FMN er derfor en trygg og enkel måte å sikre effektiv hygienepraksis på.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for Dr. Tak-Wah Wong og Mr. Zong-Jhe Hsieh for deres støtte med eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jian, H. L., Cheng, C. W., Chen, L. Y., Liang, J. Y. The photochemistry of riboflavin. MC-Transaction on Biotechnology. 3, 1-11 (2011).
  2. Lin, Y., Eitenmiller, R. R., Landen, W. O. Riboflavin. Vitamin analysis for the health and food sciences. , CRC Press. 329-360 (2008).
  3. Xie, L. J., Wang, R. L., Wang, D., Liu, L., Cheng, L. Visible-light-mediated oxidative demethylation of N(6)-methyl adenines. Chemical Communications. 53 (77), 10734-10737 (2017).
  4. Tim, M. Strategies to optimize photosensitizers for photodynamic inactivation of bacteria. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 150, 2-10 (2015).
  5. Maisch, T., et al. Photodynamic inactivation of multi-resistant bacteria (PIB) - a new approach to treat superficial infections in the 21st century. Journal of the German Society of Dermatology. 9 (5), 360-366 (2011).
  6. Hamblin, M. R. Antimicrobial photodynamic inactivation: a bright new technique to kill resistant microbes. Current Opinion in Microbiology. 33, 67-73 (2016).
  7. Del Rosso, J. Q. Oral Doxycycline in the management of acne vulgaris: Current perspectives on clinical use and recent findings with a new double-scored small tablet formulation. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 8 (5), 19-26 (2015).
  8. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dematologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  9. Yuann, J. M. P., et al. Effects of free radicals from doxycycline hyclate and minocycline hydrochloride under blue light irradiation on the deactivation of Staphylococcus aureus, including a methicillin-resistant strain. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 226, 112370 (2022).
  10. Liang, J. Y., Cheng, C. W., Yu, C. H., Chen, L. Y. Investigations of blue light-induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide on inactivation of E. coli. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 143, 82-88 (2015).
  11. Yang, M. J., et al. Effects of blue-light-induced free radical formation from catechin hydrate on the inactivation of Acinetobacter baumannii, Including a carbapenem-resistant strain. Molecules. 23 (7), 1631 (2018).
  12. Yuann, J. M. P., et al. A study of catechin photostability using photolytic processing. Processes. 9 (2), 293 (2021).
  13. Yuann, J. M. P., Wang, J. S., Jian, H. L., Lin, C. C., Liang, J. Y. Effects of Clinacanthus nutans (Burm. f) Lindau leaf extracts on protection of plasmid DNA from riboflavin photoreaction. MC-Transaction on Biotechnology. 4 (1), 45-59 (2012).
  14. Rineh, A., et al. Attaching NorA efflux pump inhibitors to methylene blue enhances antimicrobial photodynamic inactivation of Escherichia coli and Acinetobacter baumannii in vitro and in vivo. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 28 (16), 2736-2740 (2018).
  15. Dai, T., et al. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  16. Nitzan, Y., Ashkenazi, H. Photoinactivation of Acinetobacter baumannii and Escherichia coli B by a cationic hydrophilic porphyrin at various light wavelengths. Current Microbiology. 42 (6), 408-414 (2001).
  17. Tseng, C. C., et al. Altered susceptibility to the bactericidal effect of photocatalytic oxidation by TiO2 is related to colistin resistance development in Acinetobacter baumannii. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (19), 8549-8561 (2016).
  18. Boluki, E., et al. Antimicrobial activity of photodynamic therapy in combination with colistin against a pan-drug resistant Acinetobacter baumannii isolated from burn patient. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 18, 1-5 (2017).
  19. Yang, M. Y., et al. Blue light irradiation triggers the antimicrobial potential of ZnO nanoparticles on drug-resistant Acinetobacter baumannii. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 180, 235-242 (2018).
  20. Code of Federal Regulations. , Available from: https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2009-title21-vol6/pdf/CFR-2009-title21-vol6-sec582-5695.pdf (2022).
  21. Lu, C. Y., et al. Generation and photosensitization properties of the oxidized radical of riboflavin: a laser flash photolysis study. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 52 (1-3), 111-116 (1999).
  22. Sato, K., et al. The primary cytotoxicity in ultraviolet-a-irradiated riboflavin solution is derived from hydrogen peroxide. The Journal of Investigative Dermatology. 105 (4), 608-612 (1995).
  23. Tripathi, A. K., et al. Attenuated neuroprotective effect of riboflavin under UV-B irradiation via miR-203/c-Jun signaling pathway in vivo and in vitro. Journal of Biomedical Science. 21 (1), 39 (2014).
  24. Liang, J. Y., et al. Blue light induced free radicals from riboflavin on E. coli DNA damage. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 119, 60-64 (2013).
  25. Ottaway, P. B. The Technology of Vitamins in Food. , Chapman and Hall. London. Ch. 5 233-244 (1993).
  26. Kumar, V., et al. Riboflavin and UV-light based pathogen reduction: extent and consequence of DNA damage at the molecular level. Photochemistry and Photobiology. 80 (1), 15-21 (2004).
  27. Ito, K., Inoue, S., Yamamoto, K., Kawanishi, S. 8-Hydroxydeoxyguanosine formation at the 5'site of 5'-GG-3'sequences in double-stranded DNA by UV radiation with riboflavin. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13221-13227 (1993).
  28. Liang, J. Y., Yuann, J. M. P., Hsie, Z. J., Huang, S. T., Chen, C. C. Blue light induced free radicals from riboflavin in degradation of crystal violet by microbial viability evaluation. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 174, 355-363 (2017).
  29. Yang, M. Y., Chang, C. J., Chen, L. Y. Blue light induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide on lethality of HeLa cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 173, 325-332 (2017).
  30. Cui, Z., Huang, Y., Mo, Q., Wang, X., Qian, K. Inactivation of lymphocytes in blood products using riboflavin photochemical treatment with visible light. Photochemistry and Photobiology. 84 (5), 1195-1200 (2008).
  31. Wong, T. W., Cheng, C. W., Hsieh, Z. J., Liang, J. Y. Effects of blue or violet light on the inactivation of Staphylococcus aureus by riboflavin-5′-phosphate photolysis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 173, 672-680 (2017).
  32. Russell, L. F., Vanderslice, J. T. Comprehensive review of vitamin B2 analytical methodology. Journal of Micronutrient Analysis. 8, 257-310 (1990).
  33. Cheng, C. W., Chen, L. Y., Chou, C. W., Liang, J. Y. Investigations of riboflavin photolysis via coloured light in the nitro blue tetrazolium assay for superoxide dismutase activity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 148, 262-267 (2015).
  34. Huang, S. T., et al. Effects of 462 nm light-emitting diode on the inactivation of Escherichia coli and a multidrug-resistant by tetracycline photoreaction. Journal of Clinical Medicine. 7 (9), 278 (2018).
  35. Barua, M. G., Escalada, J. P., Bregliani, M., Pajares, A., Criado, S. Antioxidant capacity of (+)-catechin visible-light photoirradiated in the presence of vitamin B2. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 22 (6), 282-289 (2017).
  36. Castillo, C., Criado, S., Díaz, M., García, N. A. Riboflavin as a sensitiser in the photodegradation of tetracyclines. Kinetics, mechanism and microbiological implications. Dyes and Pigments. 72 (2), 178-184 (2007).
  37. Huvaere, K., Sinnaeve, B., Van Bocxlaer, J., Skibsted, L. H. Flavonoid deactivation of excited state flavins: reaction monitoring by mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (36), 9261-9272 (2012).
  38. Massad, W. A., Bertolotti, S., Garcia, N. A. Kinetics and mechanism of the vitamin B2-sensitized photooxidation of isoproterenol. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 428-433 (2004).
  39. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. High-intensity narrow-spectrum light inactivation and wavelength sensitivity of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 285 (2), 227-232 (2008).
  40. Huang, S. T., et al. The influence of the degradation of tetracycline by free radicals from riboflavin-5'-phosphate photolysis on microbial viability. Microorganisms. 7 (11), 500 (2019).
  41. Maisch, T., et al. Fast and effective photodynamic inactivation of multiresistant bacteria by cationic riboflavin derivatives. PLoS One. 9 (12), 111792 (2014).
  42. Grijzenhout, M., et al. Ultraviolet-B irradiation of platelets induces a dose-dependent increase in the expression of platelet activation markers with storage. British Journal of Haematology. 83 (4), 627-632 (1993).

Tags

Bioteknologi utgave 182 FMN fotolyse ROS S. aureus fiolett lys
Inaktivering av patogener <em>via</em> fotolyse i synlig lys av riboflavin-5′-fosfat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T.… More

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T. Y., Yuann, J. M. P., Chiu, C. M., Huang, S. T., Liang, J. Y. Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5′-Phosphate. J. Vis. Exp. (182), e63531, doi:10.3791/63531 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter