Summary
In diesem Manuskript wird die subkonjunktivale Injektion als gültige Vektorabgabemethode für Augengewebe bei Mäusen unter Verwendung eines Injektionssystems demonstriert, das aus einer Infusions-/Entnahmespritzenpumpe und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Dieses Injektionssystem ist auch für andere intraokulare Verabreichungswege anpassbar.
Abstract
Augenerkrankungen umfassen eine breite Palette von erblichen genetischen und erworbenen Erkrankungen, die aufgrund ihrer relativ einfachen Zugänglichkeit über mehrere Verabreichungswege attraktive Ziele für die lokale Medikamentenabgabe sind. Subkonjunktivale (SCJ) Injektionen bieten Vorteile gegenüber anderen intraokularen Verabreichungswegen, da sie einfach, sicher und in der Regel ambulant durchgeführt werden. SCJ-Injektionen bei Kleintieren erfordern aufgrund der Größe des Auges in der Regel die Hilfe eines Operationsmikroskops. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die SCJ-Injektion spezifischer Adeno-assoziierter Virus (AAV) Serotypen eine gültige Genlieferstrategie für die gezielte Transduktion der Augenoberfläche, des Augenmuskels, der Hornhaut und des Sehnervs ist und einen potenziellen Ansatz für die Behandlung vieler Augenerkrankungen bietet.
Hier wird ein detailliertes Protokoll für SCJ-Injektionen in einem Mausmodell unter Verwendung eines Injektionssystems vorgestellt, das aus einer programmierbaren Infusions-/Entnahmespritzenpumpe (die eine konsistente und präzise Injektionsgeschwindigkeit und einen konstanten Druck ermöglicht) und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Das Injektionssystem ist auch für andere intraokulare Verabreichungswege wie intrastromale, intrakameraale, intravitreale und subretinale Injektionen bei Kleintieren anpassbar. Obwohl die Abgabe von adeno-assoziierten viralen Vektoren für okuläre Gentherapiestudien beschrieben wird, kann das hierin enthaltene Protokoll auch für eine Vielzahl von ophthalmologischen Lösungen in Kleintiermodellen angepasst werden. Die wichtigsten praktischen Schritte auf dem Verabreichungsweg, die Einrichtung der Injektionsplattform, die Vorbereitung der Injektion und Tipps aus direkter Erfahrung werden ausführlich besprochen. Darüber hinaus werden auch gängige Validierungstechniken für die AAV-Verabreichungsbestätigung an die gewünschten Gewebe kurz besprochen.
Introduction
Augenerkrankungen umfassen ein breites Spektrum sowohl genetischer als auch erworbener Erkrankungen. Im Jahr 2015 waren schätzungsweise 36 Millionen Menschen weltweit blind, und über 1 Milliarde Menschen leiden zumindest an einem gewissen Grad an Sehbehinderung, was die Notwendigkeit unterstreicht, die Linderungsbemühungen auf allen Ebenen zu verstärken1. Die wichtigsten Methoden zur Verabreichung von Augenmedikamenten umfassen sowohl topische als auch lokale Verabreichung, wie Augentropfen oder subkonjunktivale (SCJ), intrakameraale, intravitreale und subretinale Injektionen. Obwohl die nichtinvasive topische Therapie die gebräuchlichste Verabreichungsmethode für ophthalmologische Arzneimittel ist und häufig für viele Erkrankungen des vorderen Abschnitts eingesetzt wird, stellt das Vorhandensein von anatomischen Barrieren der Hornhaut eine Herausforderung für die Bioverfügbarkeit, Bioverteilung und Wirksamkeit topisch verabreichter Substanzen dar, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise nicht der beste Behandlungsweg für viele Erkrankungen des inneren Auges ist. Die lokale Injektion in das spezifische Augenkompartiment, das von der Krankheit betroffen ist, ist wahrscheinlich ein effektiverer und gezielterer Ansatz zur Medikamentenabgabe2. Nebenwirkungen durch wiederholte Injektionen können jedoch die Verabreichungsstrategien erschweren. Idealerweise sollte eine Therapie nach einmaliger Verabreichung eine langfristige therapeutische Wirksamkeit erhalten. Daher ist die Gentherapie eine vielversprechende Option, um die Anzahl der erforderlichen Injektionen zu minimieren und eine nachhaltige Transgenexpression für die Behandlung von Augenerkrankungenbereitzustellen 3,4.
Für die Gentherapie stehen zahlreiche virale und nichtvirale Vektoren zur Verfügung; AAV-Vektoren sind jedoch aufgrund ihres hervorragenden Sicherheitsprofils von großem Interesse. AAV ist ein kleines, einzelsträngiges, unbehülltes DNA-Virus, das ursprünglich 1965 von Atchison et al. als Kontaminante eines Adenovirus-Präparats entdeckt wurde.5,6 AAV wurde später in den 1980er Jahren als effizienter viraler Vektor für die Genabgabe entwickelt und ist zum Gentherapievektor der Wahl für viele Krankheiten, einschließlich Augenerkrankungen, geworden. in den letzten Jahrzehnten. Das bemerkenswerteste davon ist das erste kommerziell erhältliche Gentherapeutikum, Voretigene neparvovec, das von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zur Behandlung der Leberschen kongenitalen Amaurose, einer seltenen hinteren Augenerkrankung, zugelassen wurde. Obwohl Voretigene Neparvovec die Hindernisse für die klinische Entwicklung erfolgreich überwunden hat, bleiben Herausforderungen für die Kommerzialisierung zusätzlicher okulärer Gentherapien bestehen. Zum Beispiel wird Voretigene neparvovec Patienten verabreicht, die lebensfähige Netzhautzellen durch subretinale Injektion erhalten. Daher sind Patienten mit fortgeschritteneren Formen der Krankheit, denen lebensfähige Netzhautzellen fehlen, nicht für eine Behandlung geeignet, da dies keinen klinischen Nutzen bringen würde. Darüber hinaus wurden bekannte Komplikationen im Zusammenhang mit dem subretinalen Injektionsverfahren beobachtet, darunter Augenentzündungen, Katarakte, Netzhautrisse, Makulopathie und Schmerzen 7,8. Andere Bedenken im Zusammenhang mit diesem Verfahren umfassen die Möglichkeit von Blutungen, Netzhautablösung, Endophthalmitis und Aufhebung des privilegierten Status des okulären Immunsystems durch Augengewebezerstörung 9,10,11,12. Daher sind Bemühungen, weniger invasive Gentransportwege wie die SCJ-Injektion zu erforschen, immer wichtiger geworden 13,14,15,16,17.
Die Bindehaut ist eine dünne Membran, die 3-5 Zellschichten enthält und das vordere Auge mit dem inneren Augenlid verbindet. SCJ-Injektionen werden klinisch zur ophthalmologischen Arzneimittelabgabe sowohl an das vordere als auch an das hintere Augensegment zur Behandlung von Augenerkrankungen wie altersbedingter Makuladegeneration, Glaukom, Retinitis und posteriorer Uveitis eingesetzt18,19. Sie sind relativ einfach durchzuführen, routinemäßig für die ophthalmologische Medikamentenabgabe in einer ambulanten Umgebung20, etwas schmerzlos, beeinträchtigen nicht das okuläre Immunprivileg und ermöglichen es verabreichten Medikamenten, sich durch eine große periorbitale Region auszubreiten, die den Sehnerv umfasst. Daher sind SCJ-Injektionen ein attraktiver Verabreichungsweg für AAV-Gentherapieanwendungen. Natürliche AAV-Serotypen, die durch SCJ-Injektion bei Mäusen verabreicht wurden, wurden zuvor hinsichtlich Sicherheit, Transduktionseffizienz, Serumimmunogenität, Bioverteilung und Gewebespezifität charakterisiert13,16,21. Diese Daten zeigten, dass die Genabgabe an einzelne Augengewebe durch SCJ-Verabreichung eine formale Möglichkeit ist.
Dieser Artikel beschreibt ein einfaches und anpassungsfähiges Protokoll für die SCJ-Injektion, um AAV-Vektoren in einem Mausmodell zu liefern. Um die Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes zu gewährleisten, wird ein Injektionssystem beschrieben, das aus einem Stereomikroskop, einer programmierbaren Infusions-/Entnahmespritzenpumpe (die eine konsistente und präzise Einspritzgeschwindigkeit und einen konstanten Druck ermöglicht) und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Dieses System ist für andere intraokulare Verabreichungswege wie intrastromale, intrakameraale, intravitreale und subretinale Injektionen bei Kleintieren anpassbar. Darüber hinaus wird häufig ein Fluoreszenzfarbstoff verwendet, um die AAV-Injektionsstelle zu visualisieren. Die wichtigsten praktischen Schritte auf dem Verabreichungsweg, die Einrichtung der Injektionsplattform, die Vorbereitung der Injektion und Tipps aus direkter Erfahrung werden ausführlich besprochen. Schließlich werden gängige Validierungstechniken zur Bestätigung der AAV-Abgabe an das gewünschte Gewebe kurz diskutiert.
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Protocol
Alle Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of North Carolina at Chapel Hill durchgeführt. Die Verwendung von AAV-Vektoren ist ein Biosicherheitsrisiko der Stufe 1. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille, wenn Sie mit AAV umgehen. Für das hierin beschriebene Experiment wurde ein rekombinanter AAV-Vektor verwendet, der mit dem Serotyp-8-Kapsid verpackt ist und für einen generischen ubiquitären Cytomegalovirus (CMV)-Promotor kodiert, der die Expression des grünen Fluoreszenzproteins (GFP) steuert.
1. Handhabung und Speicherung von AAV-Vektoren
- Lagern Sie das Virus in einem -80 °C Gefrierschrank in 100 μL Aliquots in silikonisierten oder retentionsarmen Mikrozentrifugenröhrchen.
- Alle Vektor-Stammlösungen vor Gebrauch auf Eis auftauen.
HINWEIS: Farbstoffe wie Natriumfluoresceinlösung (in einer Endkonzentration von 0,1-2%) werden häufig mit den AAV-Vektoren gemischt, um die injizierte Lösung sichtbar zu machen. Darüber hinaus hilft die Visualisierung von injizierten Lösungen, Luftblasen zu erkennen und die AAV-Verteilung und/oder Leckage nach der Injektion zu überwachen.
2. Subkonjunktivale (SCJ) Injektion
- Montieren Sie das Einspritzsystem.
- Um das Injektionssystem zusammenzubauen, platzieren Sie ein Stereomikroskop und eine Spritzenpumpe in einer Biosicherheitswerkbank.
HINWEIS: Eine Infusionspumpe wird benötigt, um Injektionen mit hoher Präzision durchzuführen. Hier wird eine programmierbare Standardspritzenpumpe verwendet (siehe Materialtabelle), die einen festen Griff und eine sichere Spritzenklemme für Spritzen mit einem Volumen von 0,5 μL bis 60 ml enthält. Diese Pumpe bietet auch eine verbesserte Durchflussleistung mit hoher Genauigkeit und gleichmäßigen Durchflussraten von 1,28 pl/min bis 88,28 ml/min. - Schneiden Sie den Polyethylenschlauch auf eine Länge von ca. 50 cm (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie das Nabenende einer 36-G-Nadel in eines der Enden des Schlauchs ein.
HINWEIS: Schieben Sie das Nadelnabenende ~3 mm in das Rohr, um sicherzustellen, dass keine Leckage auftritt. Die 36 G Nadel wird für die anschließende SCJ-Injektion verwendet. Nadeln zwischen 32 G und 36 G sind die am häufigsten verwendeten Größen für SCJ-Injektionen. Die Verwendung eines Hämostats zur Unterstützung dieses Schritts wird dringend empfohlen, um das potenzielle Risiko einer Verletzung durch scharfe Gegenstände zu vermeiden. - Füllen Sie eine Einwegspritze von 3 ml mit sterilem Wasser; Führen Sie diese Einwegspritze in die Seite des Röhrchens gegenüber der Nadel ein und spülen Sie das Wasser durch den Schlauch / die Nadel. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 70% Alkohol.
- Wiederholen Sie Schritt 2.1.4 noch dreimal abwechselnd mit sterilem Wasser und 70% Alkohol, um den Schlauch zu desinfizieren und sicherzustellen, dass keine Lecks, Verstopfungen oder Beschädigungen im gesamten Schlauch festgestellt werden.
- Verwenden Sie die 3-ml-Einwegspritze, um den Schlauch mit sterilem Wasser zu füllen, und lassen Sie den Schlauch an der Einwegspritze befestigt.
- Legen Sie ein Stück Parafilm auf die Bankoberfläche und fügen Sie ein Becken mit sterilem Wasser hinzu (~ 1 ml). Tauchen Sie den Teil des Schlauchs, der mit der Nadel verbunden ist, in den Pool mit sterilem Wasser. Ziehen Sie die Einwegspritze aus der Schlauchöffnung am gegenüberliegenden Ende, um zu verhindern, dass beim Entfernen der Spritze Luft in das Schlauch-/Nadelsystem eindringt. Lassen Sie den Teil des Schlauchs, der mit der Nadel verbunden ist, im Wasserbecken untergetaucht.
HINWEIS: Führen Sie die Verfahren 2.1.4 bis 2.1.7 in einer Laminarhaube durch. - Füllen Sie eine 10-μL-Spritze/-Nadel von Hamilton mit sterilem Wasser und vermeiden Sie Luft in der Spritze. Verbinden Sie die Spritze/Nadel von Hamilton mit dem verbleibenden offenen Ende des Schlauchs, indem Sie den Schlauch und die Nadelspitze der Hamilton-Spritze in den Pool mit sterilem Wasser auf dem Parafilm tauchen.
- Drücken Sie die Schnellrückwärtstaste auf dem Pumpenbildschirm, um den Drückerblock auf die ungefähre Länge der Spritze zu bewegen. Schrauben Sie die Klemmknöpfe der Halterung ab, um die Haltebügel am Drücker und an den Spritzenhalterblöcken zu lösen. Legen Sie die Hamilton-Spritze auf den Spritzenhalterblock und befestigen Sie die Spritze gemäß den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Um die Spritze zu sichern, sollte die Klemme des Spritzenzylinders fest am Spritzenzylinder befestigt sein. Ziehen Sie jedoch nicht zu fest an, insbesondere wenn Sie Glasspritzen verwenden. Der Spritzenkolben sollte durch die Haltehalterung des Drückerblocks gesichert werden. - Passen Sie die Parameter im Bildschirm mit den Pumpeneinstellungen an.
- Drücken Sie die Krafttaste und stellen Sie die Kraftstufe auf 30 % ein. Akzeptieren Sie die Änderungen, um zum Einstellungsbildschirm zurückzukehren.
- Drücken Sie die Schnellstarttaste und wählen Sie Methode | Aufgießen/zurückziehen.
- Wählen Sie für die Spritze Hamilton 1700, Glas, 10 μL. Wählen Sie die Infusions- und Entnahmerate sowie das Injektionsvolumen.
HINWEIS: Die Kraftstufe wird abhängig von Spritzentyp/Material/Kapazität/Hersteller eingestellt; Informationen zur empfohlenen Kraft für jede Spritze finden Sie in den Anweisungen des Werksherstellers. Die in diesem Experiment verwendete Injektionsgeschwindigkeit betrug 200 nL / s. SCJ-Injektionen sind relativ sicher, und es gibt weniger Bedenken hinsichtlich der Induktion eines erhöhten Augeninnendrucks (IOD), der aus der Injektion resultiert. Eine langsamere Injektionsgeschwindigkeit ist für bestimmte Anwendungen oft wünschenswert, um Rückfluss in die Nadel zu vermeiden und die Konsistenz der Injektionen zwischen Tieren aufrechtzuerhalten.
- Werfen Sie das Wasser aus der Hamilton-Spritze aus, aber lassen Sie den Schlauch und die Injektionsnadel mit Wasser füllen. Ziehen Sie die Hamilton-Spritze leicht zurück, indem Sie die Rückwärtstaste drücken, um eine kleine Luftblase in den Schlauch/die Nadel einzuführen.
HINWEIS: Die Luftblase dient als Barriere zwischen dem Wasser in der Röhre und dem therapeutischen Medikament (in diesem Fall AAV) und gewährleistet die Genauigkeit der verabreichten Dosis. - Ziehen Sie das Virus zurück, indem Sie die Injektionsnadel in ein Aliquot des Virusvorrats stecken. Stellen Sie sicher, dass eine sichtbare Luftblase zwischen dem Virus und dem Wasser im Schlauch verbleibt.
HINWEIS: AAV-Vektoren können sich an den Kunststoffschlauch und die Metallnadel binden, was zu einem Virusverlust und/oder ungenauen Dosierungsschemata führt. Um Strenge, Reproduzierbarkeit und eine genaue Dosierung von AAV zu gewährleisten, wird daher empfohlen, die Oberflächen, die anschließend mit dem AAV in Kontakt kommen, vorzubeschichten. Um das Schlauch-/Nadelsystem mit dem Virus zu beschichten, ziehen Sie die virale Vektorlösung in den Schlauch / die Nadel und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um eine Sättigung der Virusbindung an die Wand der Nadel und / oder des Schlauchs zu ermöglichen. Verwerfen Sie den Virus.
- Um das Injektionssystem zusammenzubauen, platzieren Sie ein Stereomikroskop und eine Spritzenpumpe in einer Biosicherheitswerkbank.
- Virusinjektion
- Betäuben Sie die Maus mit inhalativer Anästhesie (Isofluran) oder intraperitonealer Injektion von Ketamin / Xylazin / Acepromazin. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch eine mangelnde Reaktion auf feste Zehenklemmungen.
HINWEIS: Verwenden Sie weibliche und/oder männliche C57BL/6J- oder BALB/c-Mäuse, die mindestens 6 Wochen alt sind. Ketamin / Xylazin / Acepromazin Dosen sind wie folgt: Ketamin bei 70 mg / kg, Xylazin bei 7 mg / kg und Acepromazin bei 1,5 mg / kg. - Wenden Sie eine topische Anästhesie auf das Auge an, das die Injektion erhält.
HINWEIS: Verwenden Sie 0,1% Proparacainhydrochlorid und / oder Tetracainhydrochlorid Augenlösung (0,5%) für die topische Anästhesie. - Tragen Sie eine topische Salbe auf das andere Auge auf, das keine Injektion erhält, um Trockenheit und Verletzungen zu verhindern.
- Positionieren Sie die Maus auf dem mikroskopischen Tisch und belichten Sie das Mausauge unter dem Stereomikroskop.
- Legen Sie zwei Finger auf das Augenlid und ziehen Sie es leicht vom Auge der Maus weg, um die Bindehaut freizulegen, die die innere Membran ist, die das Augenlid mit der Sklera verbindet.
- Schnappen Sie die Bindehaut mit einer Pinzette.
- Lassen Sie das Augenlid los und halten Sie die Nadel mit der Fase nach oben mit der dominanten Hand.
- Führen Sie die Nadel in die Bindehaut ein. Führen Sie die Nadel ein, bis die Fase vollständig von der Bindehautmembran bedeckt ist. Lege die Nadel gegen den Globus.
HINWEIS: Da die Bindehaut eine klare Membran ist, ist die Nadelspitze/-fase gut sichtbar. - Starten Sie die Einspritzung, indem Sie die Starttaste mit dem Fußschalter drücken.
HINWEIS: Die Bewegung der Luft und des Hamilton-Kolbens sind synchronisiert; Jede Verzögerung weist auf überschüssige Luft im Einspritzsystem oder möglicherweise auf eine lose Verbindung zwischen den Komponenten für Schläuche, Nadel und/oder Spritze hin. - Nachdem die Injektion beendet ist, halten Sie die Nadel 10 s lang an Ort und Stelle, bevor Sie die Nadel aus der Bindehaut ziehen, um die Wahrscheinlichkeit eines Rückflusses zu verringern.
HINWEIS: Es ist üblich, dass an der Stelle der SCJ-Injektion eine Blase auftritt. Solche Bläschen klingen normalerweise innerhalb weniger Stunden nach der Injektion vollständig ab. - Geben Sie einen Tropfen des topischen Gleitgels auf die Augen der Maus, um Augentrockenheit / -verletzung zu vermeiden, und legen Sie die Maus dann auf ein Heizkissen, um sich zu erholen.
- Führen Sie Augenuntersuchungen wie Tränenproduktion, IOD und Spaltlampenuntersuchung in Verbindung mit Hornhautfluoreszenzfärbung durch, um Augenanomalien nach der Injektion zu beurteilen.
HINWEIS: Die Tränenproduktion wird durch einen Phenol-Rotfadentest gemessen, und ein Tonometer wird häufig verwendet, um den IOD des Mausauges zu untersuchen. Es wird berichtet, dass einige intraokulare Injektionen, wie intravitreale Injektionen, zu einem signifikanten Anstieg des IOD führen können; IOD-Änderungen nach SCJ-Injektion sind jedoch nicht offensichtlich 13,22,23,24.
- Betäuben Sie die Maus mit inhalativer Anästhesie (Isofluran) oder intraperitonealer Injektion von Ketamin / Xylazin / Acepromazin. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch eine mangelnde Reaktion auf feste Zehenklemmungen.
- Untersuchung der AAV-Bioverteilung und Transduktionseffizienz nach subkonjunktivaler Injektion
- Um die Bioverteilung des viralen Genoms und/oder das Transduktionsprofil von AAV-Vektoren, die über SCJ abgegeben werden, zu untersuchen, werden die Mäuse mit einer AVMA-zugelassenen Methode eingeschläfert.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden die Mäuse 8 Wochen nach der Injektion geopfert. - Für die Bioverteilung und Transgenexpression in gezielten Augenkompartimenten sezieren Sie das relevante Gewebe von Interesse wie Augenlider, Hornhaut, Bindehaut, Augenmuskel, Netzhaut und Sehnerv. Alle Gewebe schockgefrieren und bei -80 °C lagern. Um die Ganzkörper-AAV-Bioverteilung zu untersuchen, sammeln Sie Organe wie die submandibulären Lymphknoten und die Leber, frieren Sie sie ein und lagern Sie sie bei -80 °C.
- Sammeln Sie mit einem DNA/RNA-Extraktionskit gDNA und RNA aus derselben Probe, um die Transgenexpression bzw. die AAV-Bioverteilung zu untersuchen. Wenn nur eine Vektor-Biodistribution gewünscht wird, verwenden Sie ein DNA-Extraktionskit, um gDNA zu extrahieren.
- Durchführung von Standard-qPCR und RT-qPCR zur Bestimmung der AAV-Vektorbioverteilung und cDNA-Häufigkeit unter Verwendung von vektortransgenspezifischen Primern/Sonden13,25.
- Für die histologische Analyse fixieren Sie die Augen, betten Sie sie in Paraffin ein und schneiden Sie sie in einer Dicke von 5 μm. Führen Sie eine Standard-Immunfluoreszenzfärbung durch, um die Transgenexpressionaufzudecken 26.
- Um die Bioverteilung des viralen Genoms und/oder das Transduktionsprofil von AAV-Vektoren, die über SCJ abgegeben werden, zu untersuchen, werden die Mäuse mit einer AVMA-zugelassenen Methode eingeschläfert.
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Representative Results
Lösung, die in den subkonjunktivalen Raum injiziert wird, präsentiert sich je nach Injektionsvolumen als Blase.
In diesem Experiment wurden 7 μL AAV (7 × 109 virale Genome (vg)/Auge), gemischt mit Fluorescein in einer Endkonzentration von 0,1%, mit einer 36 G-Nadel unter einem Stereomikroskop injiziert, und die Injektionsgeschwindigkeit/der Injektionsdruck wurde mit einer programmierbaren Spritzenpumpe bei 1 μL/s konstant gehalten. Bei der Injektion kann eine Blase auftreten (Pfeil). Eine mikroskopische Ansicht der AAV-Vektorverabreichung in das murine SCJ-Kompartiment ist in Abbildung 1 dargestellt.
Substanzen, die in den subkonjunktivalen Raum injiziert werden, diffundieren um den Globus des Auges und werden im gesamten periokularen Gewebe verteilt.
Um die Verteilung der mittels SCJ-Injektion verabreichten AAV zu definieren, wurden nach der Anästhesie 7 μL verdünnte indische Tinte in den Unterkonjunktivalraum einer 10 Monate alten Maus injiziert. Während oder nach der SCJ-Injektion wurden keine Blutungen, Leckagen oder Rückflüsse festgestellt. Dreißig Minuten nach der Injektion wurden das Augen- und umgebende Gewebe entnommen und anschließend mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt, um die Verteilung der indischen Tinte zu visualisieren. Die in Abbildung 2 dargestellten repräsentativen sagittalen Schnitte zeigen, dass die Dispersion der indischen Tinte hauptsächlich neben den extraokularen Muskeln, in der äußeren Oberfläche der Sklera und dem periokularen lockeren Bindegewebe auftrat (Abbildung 2).
Selbstkomplementäres AAV8 transduziert erfolgreich die Hornhaut und die periokularen Muskeln nach SCJ.
Um das Transduktionsprofil von selbstkomplementärem AAV8 acht Wochen nach der Injektion zu bestimmen, wurde die GFP-Häufigkeit in Ganzkugelquerschnitten mittels Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung eines Anti-GFP-Antikörpers in einer Verdünnung von 1:500 untersucht. Die Bilder wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen (Abbildung 3). Diese Ergebnisse zeigten, dass AAV-Vektoren, die mittels SCJ-Injektion verabreicht werden, die periokularen Muskeln hinter dem Auge und der Hornhaut effizient transduzieren.
Reichhaltige Vektorgenom- und Transgenexpression in verschiedenen Augenkompartimenten nach SCJ-Injektion
Um die Vektorbioverteilung und Transgenexpression quantitativ zu analysieren, wurden die Kopienzahlen des Vektorgenoms in verschiedenen Augenkompartimenten und Organen wie Leber und Herz mittels qPCR untersucht (Abbildung 4A), während die Transgenexpression mittels qRT-PCR getestet wurde (Abbildung 4B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die SCJ-Injektion von AAV8 zu einer Transgenexpression im Augenlid, in der Bindehaut, in der Hornhaut und im Sehnerv führt.
Abbildung 1: Mikroskopische Ansicht der AAV-Vektorverabreichung in den murinen SCJ-Raum. Um die Bildung einer Blase während des Verfahrens sichtbar zu machen, wurde 1% Fluorescein direkt zur AAV-Vektorzubereitung gegeben. Die Bilder wurden mit einer Digitalkamera aufgenommen, die an einem Stereomikroskop befestigt war. (A) Repräsentatives Bild eines nicht injizierten Auges; (B) repräsentatives Bild eines injizierten Auges. Der Pfeil zeigt die injizierte AAV-Lösung an, die Fluorescein im SCJ-Raum enthält. Abkürzungen: AAV = Adeno-associated virus; SCJ = subkonjunktival. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: H&E-Färbung der indischen Tintenverteilung (Pfeil) nach SCJ-Injektion in das Mausauge. Sagittale Abschnitte eines Auges, die mit Tusche injiziert wurden, werden präsentiert; 7 μL indische Tinte wurden an der angegebenen Stelle injiziert. *, Injektionsstelle. Maßstabsbalken = 500 μm. Abkürzungen: SCJ = subkonjunktival; H&E = Hämatoxylin und Eosin; C = Hornhaut; I = Iris; L = Linse; R = Netzhaut; E = Augenlid; H = Hardersche Drüse; M = Muskel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative GFP-Histologiebilder von selbstkomplementärem AAV8 nach SCJ-Injektion. Transduktion der Hornhaut (A) und der Augenmuskeln (B) nach SCJ-Injektion. Die GFP-Expression (grün) wurde durch Immunfärbung in paraffineingebetteten Gewebeschnitten mit einem Anti-GFP-Antikörper visualisiert. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) angefärbt. Maßstabsbalken = 100 μm (Augenmuskel), 20 μm (Hornhaut). Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; AAV = Adeno-assoziiertes Virus; SCJ = subkonjunktival; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Quantitative Analyse der Vektorbioverteilung und Transgenexpression. (A) Die Vektorbioverteilung in Augenkompartimenten (Augenlid, Bindehaut, Hornhaut, Sehnerv und Netzhaut) und anderen Organen (Leber und Herz) nach SCJ wird als Vektorgenomkopienzahl/μg der Wirtsgenom-DNA dargestellt. (B) Die durch qRT-PCR bestimmte GFP-Häufigkeit wird als Vektor-cDNA-Kopienzahl/Wirtstranskript dargestellt. Diese Zahl wird von 13 geändert. Abkürzungen: SCJ = subkonjunktival; qRT-PCR = quantitative Revere-Transkriptions-PCR; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die AAV-vermittelte Gentherapie birgt großes Potenzial für die Behandlung von Augenerkrankungen. Die derzeitige okuläre Gentherapie beruht auf zwei wichtigen lokalen Verabreichungswegen, intravitrealen und subretinalen Injektionen. Leider sind beide Wege invasiv und können schwerwiegende Komplikationen verursachen, einschließlich Netzhautablösung, Kataraktbildung und Endophthalmitis. Daher ist die Untersuchung von relativ weniger invasiven Wegen, wie der SCJ-Injektion, von großem Interesse.
Obwohl diese Technik relativ einfach und deutlich weniger invasiv ist, gibt es einige wichtige Aspekte der AAV-Lieferung, die hervorgehoben werden müssen. Es wird empfohlen, den AAV-Vektor bei -80 °C in Aliquots des gewünschten Volumens (hier 100 μL) in silikonisierten oder retentionsarmen Mikrozentrifugenröhrchen zu lagern, um mehrere Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden und eine Verringerung des Virustiters zu verhindern. Der in diesem Experiment verwendete Vektor wurde bei -80 °C für ~6 Jahre ohne signifikanten Titerverlust gespeichert. Darüber hinaus kann die Fahrzeugzusammensetzung die Stabilität des Vektors beeinflussen. In diesem Experiment war das Virusvehikel PBS mit 350 mM NaCl + 5% D-Sorbitol. Der Titer des in dieser Studie verwendeten Virus betrug 5,1 × 10 9 vg/μL (bestimmt durch qPCR), und insgesamt wurden 7 × 109 vg/Auge verabreicht. Abhängig vom Zielgewebe und dem Transgen ist jedoch ein Bereich von 1 × 108-1 ×10 10 vg/Auge angemessen.
SCJ-Injektionen sind relativ weniger restriktiv in Bezug auf das verabreichte Volumen (1-100 μL für eine Maus). Es wird jedoch angenommen, dass Volumenunterschiede eine Rolle bei der AAV-Bioverteilung und -Transduktion spielen, und Berichten zufolge wurden größere Injektionsvolumina verwendet, um ein Bindehautnarbenmodellzu erstellen 27. Ein wichtiger Aspekt ist die vaskuläre Natur der Bindehaut, die zu einer erheblichen systemischen Clearance des AAV-Vektors führen kann, was zur Bildung neutralisierender Antikörper gegen den AAV-Vektor führt. Die laufende Forschung untersucht aktiv mögliche Strategien zur Verringerung der systemischen Clearance von AAV-therapeutischen Vektoren.
Darüber hinaus ist die In-vivo-Verteilung nach SCJ-Injektion ein kritischer Aspekt für die mögliche Anwendung dieses Injektionsweges. Im aktuellen Protokoll wird die Verteilung mit einem Farbstoff (Tusche) zu einem Zeitpunkt und nicht zu mehreren Zeitpunkten oder in Echtzeit untersucht. Obwohl diese Daten einen Hinweis darauf geben, wie sich die AAV-Vektorlösung unmittelbar nach der Injektion ausbreitet, können die Verteilung und die kinetischen Eigenschaften des AAV-Vektors und anderer Substanzen im Laufe der Zeit erheblich variieren. Obwohl die Bioverteilung des AAV-Vektors in verschiedenen Augenkompartimenten mittels qPCR nachgewiesen wurde, wie im obigen Methodenabschnitt am experimentellen Endpunkt erwähnt, würde idealerweise eine Technik verwendet werden, die den Transport der therapeutischen Reagenzien durch das Auge in Echtzeit überwachen könnte; In der Praxis ist dies jedoch oft eine Herausforderung. Schließlich kann sich das AAV-Transduktionsprofil, das bei Mäusen nach SCJ-Injektion beobachtet wurde, in menschlichen Augen aufgrund der offensichtlichen Größe, anatomischen und physiologischen Unterschiede zwischen einem Mausauge und einem menschlichen Auge unterscheiden.
Netzhauterkrankungen sind auch ein Hauptziel der Gentherapie28; Daher ist die Bestimmung, ob AAV, das durch SCJ-Injektion verabreicht wird, das Netzhautgewebe erreichen kann, eine weitere Untersuchung wert 13,17,29. Frühere Studien haben gezeigt, dass Nanopartikel, die über SCJ-Injektionen verabreicht werden, die innere Netzhaut erreichen können. Die spezifischen Wege des Menschenhandels sind jedoch unklar. Die Verteilungsdaten der indischen Tinte (Abbildung 2) zeigen, dass sich der größte Teil der Lösung in das periokulare Bindegewebe ausbreitet, was darauf hindeutet, dass AAV die innere Netzhaut durch periokulare Permeation erreichen kann, indem es in die Sklera, Aderhaut und das retinale pigmentierte Epithel eindringt.
Die in Abbildung 3A dargestellten Hornhauttransduktionsdaten deuten darauf hin, dass AAV, das in den SCJ-Raum injiziert wird, die Sklera und Hornhaut durchdringen kann. Dies deutet weiter darauf hin, dass die AAV-Verabreichung durch SCJ-Injektion die Vorderkammer oder sogar die hinteren und Glaskörperkammern erreichen kann, obwohl eine signifikant höhere Dosis erforderlich sein kann, um wünschenswerte Wirkungen in der Netzhaut zu erzielen30. Dennoch ist die SCJ-Injektion einer der einfachsten Verabreichungswege des Auges und vielversprechend für die AAV-Verabreichung zur Behandlung mehrerer Augenerkrankungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Erkrankungen der Augenoberfläche wie limbaler Stammzellmangel, Erkrankung des trockenen Auges und / oder Erkrankungen der Augenmuskulatur, wie okulopharyngeale Muskeldystrophie.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Vector Core an der University of North Carolina für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten scAAV8-GFP-Vektoren, dem CGIBD Histology Core und dem Labor von Dr. Brian C. Gilger für ihre Unterstützung bei den klinischen Bewertungsaspekten dieser Studie. Diese Studie wurde durch das Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship und einen Career Development Award der American Society of Gene & Cell Therapy und der Cystic Fibrosis Foundation unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der American Society of Gene & Cell Therapy oder der Cystic Fibrosis Foundation dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
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