Summary
I dette manuskript demonstreres subkonjunktival injektion som en gyldig vektorleveringsmetode for okulært væv hos mus ved hjælp af et injektionssystem bestående af en infusions- / tilbagetrækningssprøjtepumpe og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Dette injektionssystem kan også tilpasses til andre intraokulære administrationsveje.
Abstract
Okulære sygdomme omfatter en bred vifte af arvelige genetiske og erhvervede lidelser, der er tiltalende mål for lokal lægemiddellevering på grund af deres relative lette tilgængelighed via flere administrationsveje. Subkonjunktivale (SCJ) injektioner giver fordele i forhold til andre intraokulære administrationsveje, da de er enkle, sikre og normalt udføres i en ambulant indstilling. SCJ-injektioner i små dyr kræver normalt hjælp fra et operativt mikroskop på grund af øjets størrelse. Tidligere arbejde har vist, at SCJ-injektion af specifikke adeno-associerede virus (AAV) serotyper er en gyldig genleveringsstrategi til målrettet transduktion af den okulære overflade, øjenmuskel, hornhinde og synsnerve, hvilket giver en potentiel tilgang til behandling af mange okulære sygdomme.
Heri præsenteres en detaljeret protokol for SCJ-injektioner i en musemodel ved hjælp af et injektionssystem bestående af en programmerbar infusions-/abstinenssprøjtepumpe (som giver mulighed for ensartet og præcis injektionshastighed og tryk) og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Injektionssystemet kan også tilpasses til andre intraokulære administrationsveje såsom intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner hos små dyr. Selvom levering af adeno-associerede virale vektorer til okulære genterapistudier er beskrevet, kan protokollen heri også tilpasses til en række oftalmiske opløsninger i smådyrsmodeller. De vigtigste praktiske trin i administrationsvejen, opsætningen af injektionsplatformen, forberedelsen af injektionen og tip fra direkte erfaring vil blive diskuteret detaljeret. Derudover vil almindelige valideringsteknikker til AAV-leveringsbekræftelse til det ønskede væv også blive kort diskuteret.
Introduction
Okulære sygdomme omfatter en bred vifte af både genetiske og erhvervede lidelser. I 2015 var anslået 36 millioner mennesker juridisk blinde på verdensplan, og over 1 milliard mennesker lider af mindst en vis grad af synshandicap, hvilket understreger behovet for at opskalere lindringsindsatsen på alle niveauer1. De vigtigste metoder til levering af okulær medicin omfatter både topisk og lokal administration, såsom øjendråber eller subkonjunktivale (SCJ), intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner. Selvom ikke-invasiv topisk terapi er den mest almindelige leveringsmetode for oftalmiske lægemidler og i vid udstrækning anvendes til mange forreste segmentforstyrrelser, udgør tilstedeværelsen af hornhinde anatomiske barrierer en udfordring for biotilgængeligheden, biodistributionen og effektiviteten af topisk administrerede stoffer, hvilket tyder på, at det måske ikke er den bedste kandidatbehandlingsrute for mange sygdomme i det indre øje. Lokal injektion i det specifikke okulære rum, der er ramt af sygdommen, vil sandsynligvis være en mere effektiv og målrettet lægemiddelafgivelsesmetode2. Imidlertid kan bivirkninger som følge af gentagne injektioner komplicere administrationsstrategier. Ideelt set bør en terapi opretholde langsigtet terapeutisk effekt efter en enkelt administration. Genterapi er således en lovende mulighed for at minimere antallet af nødvendige injektioner og tilvejebringe vedvarende transgenekspression til behandling af okulær sygdom 3,4.
Talrige virale og ikke-virale vektorer er tilgængelige til genterapi; AAV-vektorer er dog af stor interesse på grund af deres fremragende sikkerhedsprofil. AAV er en lille, enkeltstrenget, ikke-indhyllet DNA-virus, der oprindeligt blev opdaget som en forurening af et adenoviruspræparat i 1965 af Atchison et al.5,6 AAV blev efterfølgende konstrueret som en effektiv viral vektor til genlevering i 1980'erne og er blevet den valgte genterapivektor for mange sygdomme, herunder okulære lidelser, i løbet af de sidste par årtier. Den mest bemærkelsesværdige af disse er det første kommercielt tilgængelige genterapilægemiddel, voretigene neparvovec, som blev godkendt af USA's Food and Drug Administration til behandling af Lebers medfødte amaurose, en sjælden bageste øjensygdom. Selvom voretigene neparvovec med succes har overvundet barrierer for klinisk udvikling, er der stadig udfordringer for kommercialisering af yderligere okulære genterapier. For eksempel administreres voretigene neparvovec til patienter, der bevarer levedygtige retinale celler via subretinal injektion. Således er patienter med mere avancerede former for sygdommen, der mangler levedygtige retinale celler, ikke berettiget til behandling, da det ikke ville give nogen klinisk fordel. Derudover blev der observeret kendte komplikationer forbundet med subretinal injektionsproceduren, herunder øjenbetændelse, grå stær, retinal rive, makulopati og smerte 7,8. Andre bekymringer i forbindelse med denne procedure omfatter muligheden for blødning, retinal løsrivelse, endophthalmitis og tilbagekaldelse af den okulære immun privilegerede status gennem øjenvævsdestruktion 9,10,11,12. Således er bestræbelser på at udforske mindre invasive genleveringsruter såsom SCJ-injektion blevet stadig vigtigere 13,14,15,16,17.
Bindehinden er en tynd membran, der indeholder 3-5 lag celler og forbinder det forreste øje med det indre øjenlåg. SCJ-injektioner anvendes klinisk til oftalmisk lægemiddelafgivelse til både de forreste og / eller bageste segmenter af øjet til behandling af okulære sygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration, glaukom, retinitis og posterior uveitis18,19. De er relativt enkle at udføre, anvendes rutinemæssigt til oftalmisk lægemiddelafgivelse i en ambulant indstilling20, noget smertefri, kompromitterer ikke okulært immunprivilegium og tillader administrerede lægemidler at sprede sig gennem en stor periorbital region, der omfatter synsnerven. Derfor er SCJ-injektioner en attraktiv administrationsvej for AAV-genterapiapplikationer. Naturlige AAV-serotyper administreret via SCJ-injektion i mus har tidligere været karakteriseret for sikkerhed, transduktionseffektivitet, serumimmunogenicitet, biodistribution og vævsspecificitet13,16,21. Disse data viste, at genlevering til individuelle okulære væv via SCJ-administration er en formel mulighed.
Dette papir beskriver en enkel og tilpasningsdygtig protokol til SCJ-injektion til at levere AAV-vektorer i en musemodel. For at sikre, at denne fremgangsmåde kan reproduceres, beskrives et injektionssystem bestående af et stereomikroskop, en programmerbar infusions-/abstinenssprøjtepumpe (som muliggør ensartet og præcis injektionshastighed og -tryk) og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Dette system kan tilpasses til andre intraokulære administrationsveje såsom intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner hos små dyr. Derudover bruges et fluoresceinfarvestof ofte til at muliggøre visualisering af AAV-injektionsstedet. De vigtigste praktiske trin i administrationsvejen, opsætningen af injektionsplatformen, forberedelsen af injektionen og tip fra direkte erfaring vil blive diskuteret detaljeret. Endelig vil fælles valideringsteknikker til bekræftelse af AAV-levering til det ønskede væv kort blive diskuteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med reglerne fra Institutional Animal Care and Use Committee ved University of North Carolina i Chapel Hill. Brugen af AAV-vektorer er en biosikkerhedsniveau 1 biohazard risiko. Brug korrekt personligt beskyttelsesudstyr, herunder en laboratoriefrakke, handsker og beskyttelsesbriller, når du håndterer AAV. Til eksperimentet beskrevet heri blev der anvendt en rekombinant AAV-vektor pakket med serotype 8-kapsidet og kodning af en generisk allestedsnærværende cytomegalovirus (CMV) promotor, der styrer ekspressionen af grønt fluorescensprotein (GFP).
1. AAV-vektorhåndtering og opbevaring
- Virus opbevares i en -80 °C fryser i 100 μL aliquoter i siliciumiserede mikrocentrifugerør med lav retention.
- Optø alle vektorlageropløsninger på is før brug.
BEMÆRK: Farvestoffer såsom natriumfluoresceinopløsning (ved en endelig koncentration på 0,1-2%) blandes ofte med AAV-vektorerne for at visualisere den injicerede opløsning. Derudover hjælper visualisering af injicerede opløsninger med at detektere luftbobler og overvåge AAV-distribution og / eller lækage efter injektion.
2. Subkonjunktival (SCJ) injektion
- Saml injektionssystemet.
- For at samle injektionssystemet skal du placere et stereomikroskop og en sprøjtepumpe i et biosikkerhedsskab.
BEMÆRK: En infusionspumpe er nødvendig for at udføre injektioner med høj præcision. Heri anvendes en standardinfusions-/udtræksprogrammerbar sprøjtepumpe (se materialetabellen), som inkluderer et stramt greb og en sikker sprøjteklemme til sprøjter i volumen fra 0,5 μL til 60 ml. Denne pumpe tilbyder også forbedret flowydelse med høj nøjagtighed og jævne strømningshastigheder fra 1,28 pl/min til 88,28 ml/min. - Skær polyethylenrøret i en længde på ca. 50 cm (se materialetabellen).
- Indsæt navenden af en 36 G nål i en af enderne af slangen.
BEMÆRK: Skub nålenavets ende ind i røret i ~ 3 mm for at sikre, at der ikke opstår lækage. 36 G-nålen bruges til den efterfølgende SCJ-injektion. Nåle mellem 32 G og 36 G er de mest almindeligt anvendte størrelser til SCJ-injektioner. Brug af en hæmostat til at hjælpe dette trin anbefales stærkt for at undgå den potentielle risiko for skarpe skader. - Fyld en engangs 3 ml sprøjte med sterilt vand; Indsæt denne engangssprøjte i siden af røret modsat nålen, og skyl vandet gennem slangen/nålen. Gentag dette trin med 70% alkohol.
- Gentag trin 2.1.4 yderligere tre gange, skiftevis skylninger med sterilt vand og 70% alkohol, for at desinficere slangen og sikre, at der ikke observeres lækager, træsko eller skader i hele slangen.
- Brug engangssprøjten på 3 ml til at fylde slangen med sterilt vand og lad slangen sidde fast på engangssprøjten.
- Placer et stykke parafilm på bænkens overflade og tilsæt en pool med sterilt vand til det (~ 1 ml). Nedsænk den del af slangen, der er forbundet med nålen, i puljen af sterilt vand. Træk engangssprøjten ud af røråbningen i den modsatte ende for at forhindre luft i at trænge ind i slange-/kanylesystemet, når sprøjten fjernes. Lad den del af slangen, der er forbundet med nålen, være nedsænket i vandbassinet.
BEMÆRK: Udfør procedurer 2.1.4 til 2.1.7 i en laminær hætte. - Fyld en 10 μL Hamilton sprøjte/kanyle med sterilt vand og undgå luft i sprøjten. Tilslut Hamilton-sprøjten/kanylen til den resterende åbne ende af slangen ved at nedsænke slangen og kanylespidsen på Hamilton-sprøjten ned i puljen af sterilt vand på parafilmen.
- Tryk på den hurtige omvendt knap på pumpeskærmen for at flytte skubbeblokken til sprøjtens omtrentlige længde. Skru beslagets fastspændingsknapper af for at løsne fastholdelsesbeslagene på skubberen og sprøjteholderblokkene. Læg Hamilton-sprøjten på sprøjteholderblokken, og fastgør sprøjten i overensstemmelse med producentens anvisninger.
BEMÆRK: For at fastgøre sprøjten skal sprøjtetøndeklemmen være tæt mod sprøjtetønden; Stram dog ikke for meget, især når du bruger glassprøjter. Sprøjtestemplet skal fastgøres med skubbeblokkens fastholdelsesbeslag. - Juster parametrene på skærmen med pumpeindstillinger.
- Tryk på knappen Force , og indstil kraftniveauet til 30%. Accepter ændringerne for at gå tilbage til indstillingsskærmen .
- Tryk på hurtigstartknappen , og vælg Metode | Tilfør/træk dig tilbage.
- Til sprøjten skal du vælge Hamilton 1700, glas, 10 μL. Vælg infusions - og udtagningshastighed og injektionsvolumen.
BEMÆRK: Kraftniveauet indstilles afhængigt af sprøjtetype/materiale/kapacitet/producenter; Se fabriksproducentens instruktioner for foreslået kraft for hver sprøjte. Den injektionshastighed, der blev brugt i dette eksperiment, var 200 nL / s. SCJ-injektioner er relativt sikre, og der er mindre bekymring for induktion af forhøjet intraokulært tryk (IOP) som følge af injektionen. En langsommere injektionshastighed er ofte ønskelig til visse anvendelser for at undgå tilbagesvaling i nålen og opretholde konsistens i injektioner blandt dyr.
- Skub vandet ud af Hamilton-sprøjten, men lad slangen og kanylen være fuld af vand. Træk lidt tilbage på Hamilton-sprøjten ved at trykke på knappen Omvendt for at introducere en lille luftboble i slangen/nålen.
BEMÆRK: Luftboblen vil tjene som en barriere mellem vandet i røret og det terapeutiske lægemiddel (i dette tilfælde AAV), hvilket sikrer nøjagtigheden af den administrerede dosis. - Træk virussen tilbage ved at placere kanylen i en aliquot af virusbestanden. Sørg for, at der forbliver en synlig luftboble mellem virussen og vandet i slangen.
BEMÆRK: AAV-vektorer kan binde til plastrøret og metalnålen, hvilket fører til tab af virus og / eller unøjagtige doseringsregimer. For at sikre stringens, reproducerbarhed og en nøjagtig dosis AAV anbefales det således at præcoating de overflader, der efterfølgende kommer i kontakt med AAV. For at belægge slange-/nålesystemet med virussen trækkes den virale vektoropløsning ind i slangen/nålen og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter for at muliggøre mætning af virusbinding til nålens og/eller slangens væg. Kassér virussen.
- For at samle injektionssystemet skal du placere et stereomikroskop og en sprøjtepumpe i et biosikkerhedsskab.
- Virus injektion
- Anæstetik musen med inhaleret anæstesi (isofluran) eller intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin/acepromazin. Bekræft det kirurgiske anæstesiplan ved manglende reaktion på faste tåspidser.
BEMÆRK: Brug hun- og/eller hanmus C57BL/6J eller BALB/c, der er mindst 6 uger gamle. Ketamin/xylazin/acepromazindoser er som følger: ketamin ved 70 mg/kg, xylazin ved 7 mg/kg og acepromazin ved 1,5 mg/kg. - Påfør topisk anæstesi på øjet, der vil modtage injektionen.
BEMÆRK: Brug 0,1% proparacainhydrochlorid og / eller tetracainhydrochlorid oftalmisk opløsning (0,5%) til topisk anæstesi. - Påfør topisk salve på det andet øje, der ikke får en injektion for at forhindre tørhed og skade.
- Placer musen på det mikroskopiske trin, og udsæt museøjet under stereomikroskopet.
- Placer to fingre på øjenlåget og træk det lidt væk fra musens øje for at udsætte bindehinden, som er den indre membran, der forbinder øjenlåget med scleraen.
- Grib bindehinden med tang.
- Slip øjenlåget, og hold nålen med skrånen opad ved hjælp af den dominerende hånd.
- Indsæt nålen i bindehinden. Indsæt nålen, indtil skrånen er helt dækket af konjunktivalmembranen. Læg nålen mod kloden.
BEMÆRK: Da bindehinden er en klar membran, er nålespidsen / skråningen let synlig. - Start injektionen ved at trykke på Start-knappen ved hjælp af fodkontakten.
BEMÆRK: Luftens bevægelse og Hamilton-stemplet synkroniseres; Enhver forsinkelse indikerer overskydende luft i injektionssystemet eller muligvis en løs forbindelse mellem slange-, kanyle- og/eller sprøjtekomponenterne. - Når injektionen er færdig, skal du holde nålen på plads i 10 s, før du trækker nålen ud af bindehinden for at mindske chancerne for tilbagestrømning.
BEMÆRK: Det er almindeligt, at der vises en bleb på stedet for SCJ-injektionen. Sådanne blebs forsvinder normalt fuldstændigt inden for få timer efter injektionen. - Sæt en dråbe af den topiske smøregel på musens øjne for at forhindre okulær tørhed / skade, og placer derefter musen på en varmepude for at komme sig.
- Udfør okulære undersøgelser såsom tåreproduktion, IOP og spaltelampeundersøgelse i forbindelse med hornhindefluoresceinfarvning for at vurdere okulære abnormiteter efter injektionen.
BEMÆRK: Tåreproduktion måles ved en phenolrød trådtest, og et tonometer bruges ofte til at undersøge museøjets IOP. Det rapporteres, at nogle intraokulære injektioner, såsom intravitreale injektioner, kan resultere i en signifikant stigning i IOP; IOP-ændringer efter SCJ-injektion er dog ikke indlysende 13,22,23,24.
- Anæstetik musen med inhaleret anæstesi (isofluran) eller intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin/acepromazin. Bekræft det kirurgiske anæstesiplan ved manglende reaktion på faste tåspidser.
- AAV biodistribution og transduktionseffektivitetsundersøgelse efter subkonjunktival injektion
- For at undersøge den virale genombiodistribution og / eller transduktionsprofil af AAV-vektorer leveret via SCJ, aflives musene ved AVMA-godkendt metode.
BEMÆRK: I dette forsøg blev musene ofret 8 uger efter injektion. - Til biodistribution og transgenekspression i målrettede okulære rum dissekeres det relevante væv af interesse, såsom øjenlåg, hornhinde, bindehinde, øjenmuskel, nethinden og synsnerven. Flash-frys alle væv og opbevares ved -80 °C. For at undersøge hele kroppen AAV biodistribution, indsamle organer såsom submandibulære lymfeknuder og lever, og flash-fryse og opbevare dem ved -80 ° C.
- Ved hjælp af et DNA / RNA-ekstraktionssæt skal du indsamle gDNA og RNA fra den samme prøve for at undersøge henholdsvis transgenekspression og AAV-biodistribution. Hvis der kun ønskes vektorbiodistribution, skal du bruge et DNA-ekstraktionssæt til at ekstrahere gDNA.
- Udfør standard qPCR og RT-qPCR for at bestemme AAV-vektorbiodistribution og cDNA-overflod ved hjælp af vektortransgenspecifikke primere / sonder13,25.
- Til histologianalyse skal du rette øjnene, indlejre dem i paraffin og sektionere dem med en tykkelse på 5 μm. Udfør standard immunfluorescensfarvning for at afsløre transgenekspression26.
- For at undersøge den virale genombiodistribution og / eller transduktionsprofil af AAV-vektorer leveret via SCJ, aflives musene ved AVMA-godkendt metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opløsning injiceret i det subkonjunktivale rum præsenterer som en bleb afhængigt af injektionsvolumenet.
I dette forsøg blev 7 μL AAV (7 × 109 virale genomer (vg)/øje) blandet med fluorescein i en slutkoncentration på 0,1% injiceret med en 36 G nål under et stereomikroskop, og injektionshastigheden / trykket blev holdt konstant ved hjælp af en programmerbar sprøjtepumpe ved 1 μL / s. En bleb kan vises ved injektion (pil). En mikroskopisk visning af AAV-vektoradministration til murine SCJ-rummet er vist i figur 1.
Stoffer injiceret i det subkonjunktive rum diffunderer rundt om øjets klode og fordeles gennem periokulært væv.
For at definere fordelingen af AAV administreret via SCJ-injektion blev 7 μL fortyndet indisk blæk injiceret i det subkonjunktive rum i en 10 måneder gammel mus efter anæstesi. Der blev ikke registreret blødning, lækage eller tilbagestrømning under eller efter SCJ-injektionen. Tredive minutter efter injektion blev det okulære og omgivende væv høstet og efterfølgende farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E) for at visualisere fordelingen af indisk blæk. De repræsentative sagittale sektioner, der er afbildet i figur 2, viser, at spredningen af indisk blæk hovedsageligt skete ved siden af de ekstraokulære muskler, i den ydre overflade af scleraen og det periokulære løse bindevæv (figur 2).
Selvkomplementær AAV8 transducerer med succes hornhinden og periokulære muskler efter SCJ.
For at bestemme transduktionsprofilen for selvkomplementær AAV8 otte uger efter injektion blev GFP-overflod i hele klodens tværsnit undersøgt via immunfluorescensfarvning ved anvendelse af et anti-GFP-antistof ved en fortynding på 1:500. Billederne blev taget under et fluorescensmikroskop (figur 3). Disse resultater afslørede, at AAV-vektorer administreret via SCJ-injektion effektivt transducerer de periokulære muskler bagud til øjet og hornhinden.
Rigelig vektorgenom og transgenekspression i forskellige øjenrum efter SCJ-injektion
For kvantitativt at analysere vektorbiodistribution og transgenekspression blev vektorgenomkopinumre i forskellige øjenrum og organer såsom lever og hjerte undersøgt ved qPCR (figur 4A), mens transgenekspressionen blev testet ved qRT-PCR (figur 4B). Disse resultater tyder på, at SCJ-injektion af AAV8 resulterer i transgenekspression i øjenlåg, bindehinde, hornhinde og synsnerve.
Figur 1: Mikroskopisk visning af AAV-vektoradministration i murine SCJ-rummet. For at muliggøre visualisering af dannelsen af en bleb under proceduren blev 1% fluorescein direkte tilsat til AAV-vektorpræparatet. Billederne blev taget ved hjælp af et digitalt kamera fastgjort til et stereomikroskop. (A) repræsentativt billede af et ikke-injiceret øje; B) repræsentativt billede af et injiceret øje. Pilen angiver den injicerede AAV-opløsning indeholdende fluorescein i SCJ-rummet. Forkortelser: AAV = Adeno-associeret virus; SCJ = subkonjunktival. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: H&E farvning af Indiens blækfordeling (pil) efter SCJ-injektion i museøjet. Sagittale sektioner af et øje injiceret med Indien blæk præsenteres; 7 μL indisk blæk blev injiceret på det angivne sted. *, Injektionssted. Skala bar = 500 μm. Forkortelser: SCJ = subkonjunktiv; H&E = hæmatoxylin og eosin; C = hornhinde; I = iris; L = linse; R = Nethinden; E = øjenlåg; H = Hårdere kirtel; M = muskel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative GFP-histologibilleder af selvkomplementær AAV8 efter SCJ-injektion. Transduktion af hornhinden (A) og øjenmusklerne (B) efter SCJ-injektion. GFP-ekspression (grøn) blev visualiseret via immunostaining i paraffinindlejrede vævssektioner med et anti-GFP-antistof. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Skalastang = 100 μm (øjenmuskel), 20 μm (hornhinde). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; AAV = adeno-associeret virus; SCJ = subkonjunktiv; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kvantitativ analyse af vektorbiodistribution og transgenekspression. (A) Vektorbiodistribution i øjenrum (øjenlåg, bindehinde, hornhinde, synsnerve og nethinden) og andre organer (lever og hjerte) efter SCJ præsenteres som vektorgenomkopinummer/μg af værtsgenom-DNA. (B) GFP-overflod bestemt af qRT-PCR præsenteres som vektor cDNA-kopinummer / værtstranskription. Dette tal er ændret fra 13. Forkortelser: SCJ = subkonjunktiv; qRT-PCR = kvantitativ revere-transkription PCR; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AAV-medieret genterapi rummer et stort potentiale for behandling af øjensygdomme. Den nuværende okulære genterapi er afhængig af to store lokale administrationsveje, intravitreale og subretinale injektioner. Desværre er begge ruter invasive og kan forårsage alvorlige komplikationer, herunder nethindeløsning, dannelse af grå stær og endophthalmitis. Således er undersøgelsen af relativt mindre invasive ruter, såsom SCJ-injektion, af stor interesse.
Selvom denne teknik er relativt ligetil og betydeligt mindre invasiv, er der flere vigtige aspekter af AAV-levering, der skal fremhæves. Det anbefales, at AAV-vektoren opbevares ved -80 °C i alikvoter af det ønskede volumen (100 μL her) i siliciumiserede mikrocentrifugerør med lav retention for at undgå flere fryse-optøningscyklusser og forhindre en reduktion i viral titer. Vektoren, der blev brugt i dette eksperiment, blev opbevaret ved -80 °C i ~6 år uden et signifikant tab af titer. Derudover kan køretøjets sammensætning påvirke vektorens stabilitet. I dette eksperiment var viruskøretøjet PBS med 350 mM NaCl + 5% D-sorbitol. Titeren af den virus, der blev anvendt i denne undersøgelse, var 5,1 × 10 9 vg/μL (bestemt ved qPCR), og der blev administreret i alt 7 × 109 vg/øje. Et interval på 1 × 108-1 × 1010 vg / øje er imidlertid passende afhængigt af målvævet og transgenet.
SCJ-injektioner er relativt mindre restriktive med hensyn til det administrerede volumen (1-100 μL for en mus). Imidlertid menes volumenforskelle at spille en rolle i AAV-biodistribution og transduktion, og større injektionsvolumener er angiveligt blevet brugt til at skabe en konjunktival ardannelsesmodel27. Et vigtigt aspekt er konjunktivaens vaskulære natur, hvilket kan føre til betydelig systemisk clearance af AAV-vektoren, hvilket resulterer i dannelsen af neutraliserende antistoffer mod AAV-vektoren. Igangværende forskning studerer aktivt potentielle strategier til at reducere den systemiske clearance af AAV terapeutiske vektorer.
Desuden er in vivo-fordelingen efter SCJ-injektion en kritisk overvejelse for den potentielle anvendelse af denne injektionsvej. I den nuværende protokol undersøges fordelingen ved hjælp af et farvestof (indisk blæk) på et tidspunkt i stedet for flere tidspunkter eller i realtid. Selv om disse data giver en vis indikation af, hvordan AAV-vektoropløsningen spredes umiddelbart efter injektionen, kan fordelingen og de kinetiske egenskaber af AAV-vektoren og andre stoffer variere betydeligt over tid. Selvom biodistributionen af AAV-vektoren blev detekteret i forskellige øjenrum ved qPCR, som nævnt i ovenstående metodeafsnit ved det eksperimentelle endepunkt, ville der ideelt set blive anvendt en teknik, der kunne overvåge handelen med de terapeutiske reagenser i hele øjet i realtid; Dette er dog ofte udfordrende i praksis. Endelig kan AAV-transduktionsprofilen, der observeres hos mus efter SCJ-injektion, variere i menneskelige øjne på grund af den åbenlyse størrelse, anatomiske og fysiologiske forskelle mellem et museøje og et menneskeligt øje.
Nethindesygdomme er også et vigtigt mål for genterapi28; således er bestemmelsen af, om AAV administreret via SCJ-injektion kan nå nethindevævet, værd at undersøge yderligere13,17,29. Tidligere undersøgelser har vist, at nanopartikler administreret via SCJ-injektioner kan nå den indre nethinde. De specifikke veje for menneskehandel er imidlertid uklare. Distributionsdataene for indisk blæk (figur 2) viser, at det meste af opløsningen spredes ind i det periokulære bindevæv, hvilket indikerer, at AAV kan nå den indre nethinde gennem periokulær gennemtrængning ved at trænge ind i sclera, choroid og retinal pigmenteret epitel.
Hornhindetransduktionsdataene, der præsenteres i figur 3A , tyder på, at AAV injiceret i SCJ-rummet kan trænge ind i sclera og hornhinde. Dette tyder yderligere på, at AAV-administration via SCJ-injektion kan nå det forreste kammer eller endda de bageste og glasagtige kamre, selvom en signifikant højere dosis kan være nødvendig for at opnå ønskelige virkninger i nethinden30. Ikke desto mindre er SCJ-injektion en af de enkleste okulære administrationsveje og har et stort løfte om AAV-levering til behandling af flere okulære sygdomme, herunder men ikke begrænset til okulære overfladesygdomme såsom limbal stamcellemangel, tør øjensygdom og / eller sygdomme i okulære muskler, såsom oculopharyngeal muskeldystrofi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Vector Core ved University of North Carolina for at levere scAAV8-GFP-vektorerne, der blev brugt i denne undersøgelse, CGIBD Histology Core og laboratoriet hos Dr. Brian C. Gilger for deres hjælp med de kliniske vurderingsaspekter af denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev støttet af Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship og en karriereudviklingspris fra American Society of Gene & Cell Therapy og Cystic Fibrosis Foundation. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra American Society of Gene & Cell Therapy eller Cystic Fibrosis Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K.
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S.
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
