Summary
בכתב יד זה, הזרקה תת-קרקעית מודגמת כשיטת העברה וקטורית תקפה לרקמות עיניים בעכברים באמצעות מערכת הזרקה המורכבת ממשאבת מזרק אינפוזיה/נסיגה ומזרק נשלף גז בשילוב עם מחטי מיקרו-הזרקה. מערכת הזרקה זו ניתנת להתאמה גם לנתיבי ניהול תוך עיניים אחרים.
Abstract
מחלות עיניים כוללות מגוון רחב של הפרעות גנטיות תורשתיות ונרכשות המהוות מטרות מושכות לאספקת תרופות מקומית בשל קלות הנגישות היחסית שלהן באמצעות נתיבי מתן מרובים. זריקות תת-קרקעיות (SCJ) מציעות יתרונות על פני נתיבי מתן תוך עיניים אחרים מכיוון שהן פשוטות, בטוחות ומבוצעות בדרך כלל במסגרת אשפוז יום. זריקות SCJ בבעלי חיים קטנים בדרך כלל דורשות סיוע של מיקרוסקופ ניתוחי בשל גודל העין. עבודות קודמות הראו כי הזרקת SCJ של סרוטיפים ספציפיים הקשורים לאדנו (AAV) היא אסטרטגיית העברת גנים תקפה להתמרה ממוקדת של משטח העין, שרירי העין, הקרנית ועצב הראייה, ומספקת גישה פוטנציאלית לטיפול במחלות עיניים רבות.
כאן מוצג פרוטוקול מפורט להזרקות SCJ במודל עכבר באמצעות מערכת הזרקה המורכבת ממשאבת מזרק עירוי/נסיגה הניתנת לתכנות (המאפשרת מהירות הזרקה ולחץ עקביים ומדויקים) ומזרק נשלף גז בשילוב עם מחטי מיקרו-הזרקה. מערכת ההזרקה ניתנת להתאמה גם לנתיבי ניהול תוך עיניים אחרים כגון זריקות תוך-עיניות, תוך-רחמיות, תוך-עיניות וסוברטינליות בבעלי חיים קטנים. למרות שמתוארת אספקת וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו למחקרי ריפוי גנטי בעיניים, ניתן להתאים את הפרוטוקול כאן גם למגוון תמיסות עיניים במודלים של בעלי חיים קטנים. השלבים המעשיים המרכזיים במסלול הניהול, הגדרת פלטפורמת ההזרקה, הכנת ההזרקה וטיפים מניסיון ישיר יידונו בפירוט. בנוסף, טכניקות אימות נפוצות לאישור אספקת AAV לרקמות הרצויות יידונו גם הן בקצרה.
Introduction
מחלות עיניים מקיפות מגוון רחב של הפרעות גנטיות ונרכשות. בשנת 2015, כ-36 מיליון בני אדם היו עיוורים מבחינה חוקית ברחבי העולם, ויותר ממיליארד בני אדם סובלים לפחות מרמה מסוימת של לקות ראייה, מה שמדגיש את הצורך להרחיב את מאמצי ההקלה בכל הרמות1. השיטות העיקריות למתן תרופות לעיניים כוללות מתן מקומי ומקומי, כגון טיפות עיניים או זריקות תת-קרקעיות (SCJ), תוך-רחמיות, תוך-ורידיות וזריקות תת-קרקעיות. למרות שטיפול מקומי לא פולשני הוא שיטת הלידה הנפוצה ביותר עבור תרופות עיניים והוא נמצא בשימוש נרחב עבור הפרעות מקטעים קדמיים רבות, נוכחותם של מחסומים אנטומיים בקרנית מציבה אתגר לזמינות ביולוגית, פיזור ביולוגי ויעילות של חומרים המנוהלים באופן מקומי, מה שמרמז על כך שזה לא יכול להיות מסלול הטיפול המועמד הטוב ביותר למחלות רבות של העין הפנימית. הזרקה מקומית לתא העין הספציפי המושפע מהמחלה עשויה להיות גישה יעילה וממוקדת יותר להעברת תרופות2. עם זאת, תופעות לוואי הנובעות מזריקות חוזרות ונשנות עלולות לסבך אסטרטגיות ניהול. באופן אידיאלי, טיפול צריך לשמור על יעילות טיפולית ארוכת טווח לאחר מתן יחיד. לפיכך, טיפול גנטי הוא אפשרות מבטיחה למזעור מספר הזריקות הנדרשות ומתן ביטוי טרנסגני מתמשך לטיפול במחלת עיניים 3,4.
וקטורים ויראליים ולא ויראליים רבים זמינים לטיפול גנטי; עם זאת, וקטורים AAV הם בעלי עניין רב בשל פרופיל הבטיחות המצוין שלהם. AAV הוא נגיף דנ"א קטן, חד-גדילי, שאינו עטוף בו, שהתגלה לראשונה כמזהם של תכשיר אדנו-וירוס בשנת 1965 על ידי Atchison et al.5,6 AAV הונדס לאחר מכן כווקטור ויראלי יעיל להעברת גנים בשנות ה-80 והפך לווקטור הריפוי הגנטי המועדף על מחלות רבות, כולל הפרעות עיניים, בעשורים האחרונים. הבולטת שבהן היא התרופה המסחרית הראשונה לטיפול גנטי, voretigene neparvovec, שאושרה על ידי מנהל המזון והתרופות של ארצות הברית לטיפול באמאורוזיס מולד של לבר, מחלת עיניים אחורית נדירה. למרות ש-voretigene neparvovec התגברה בהצלחה על מחסומים להתפתחות קלינית, נותרו אתגרים למסחור של טיפולים גנטיים נוספים בעיניים. לדוגמה, voretigene neparvovec ניתנת לחולים השומרים על תאי רשתית בני קיימא באמצעות הזרקה תת-רשתית. לפיכך, חולים עם צורות מתקדמות יותר של המחלה שאין להם תאי רשתית בני קיימא אינם זכאים לטיפול, מכיוון שהוא לא יספק שום תועלת קלינית. בנוסף, נצפו סיבוכים ידועים הקשורים להליך ההזרקה התת-רשתית, כולל דלקת עיניים, קטרקט, קריעת רשתית, מקולופתיה וכאבים 7,8. חששות אחרים הקשורים להליך זה כוללים את האפשרות של דימום, ניתוק הרשתית, אנדופתלמיטיס, ושלילת מצב חסוי של חיסון העין באמצעות הרס רקמת העין 9,10,11,12. לפיכך, המאמצים לחקור נתיבי העברת גנים פחות פולשניים כגון הזרקת SCJ הפכו חשובים יותר ויותר 13,14,15,16,17.
הלחמית היא קרום דק המכיל 3-5 שכבות של תאים ומחבר את העין הקדמית לעפעף הפנימי. זריקות SCJ משמשות קלינית להעברת תרופות עיניים הן למקטעים הקדמיים ו/או האחוריים של העין לטיפול במחלות עיניים כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל, גלאוקומה, רטיניטיס ואובאיטיס אחורית18,19. הם פשוטים יחסית לביצוע, משמשים באופן שגרתי למתן תרופות עיניים במסגרת אשפוזיום 20, מעט ללא כאבים, אינם פוגעים בפריבילגיה החיסונית של העין, ומאפשרים לתרופות הניתנות להתפשט דרך אזור פריאורביטלי גדול המקיף את עצב הראייה. לפיכך, זריקות SCJ הן מסלול אטרקטיבי של מתן עבור יישומי טיפול גנטי AAV. סרוטיפים טבעיים של AAV הניתנים באמצעות הזרקת SCJ בעכברים אופיינו בעבר לבטיחות, יעילות התמרת, אימונוגניות בסרום, פיזור ביולוגי וספציפיות רקמות13,16,21. נתונים אלה הראו כי העברת גנים לרקמות עיניים בודדות באמצעות מתן SCJ היא אפשרות פורמלית.
מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט וניתן להתאמה להזרקת SCJ כדי לספק וקטורים של AAV במודל עכבר. כדי להבטיח את יכולת השכפול של גישה זו, מתוארת מערכת הזרקה המורכבת מסטריאומיקרוסקופ, משאבת מזרק עירוי/נסיגה הניתנת לתכנות (המאפשרת מהירות הזרקה ולחץ עקביים ומדויקים), ומזרק נשלף גז בשילוב עם מחטי מיקרו-הזרקה. מערכת זו ניתנת להתאמה לנתיבי ניהול תוך עיניים אחרים כגון זריקות תוך-סטרומליות, תוך-עיניות, תוך-עיניות ותת-עיניות בבעלי חיים קטנים. בנוסף, לעתים קרובות משתמשים בצבע פלואורסצין כדי לאפשר הדמיה של אתר ההזרקה AAV. השלבים המעשיים המרכזיים במסלול הניהול, הגדרת פלטפורמת ההזרקה, הכנת ההזרקה וטיפים מניסיון ישיר יידונו בפירוט. לבסוף, טכניקות אימות נפוצות לאישור העברת AAV לרקמות הרצויות יידונו בקצרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל. השימוש בווקטורים של AAV הוא סיכון ביולוגי ברמה 1. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן בעת טיפול ב-AAV. לצורך הניסוי המתואר כאן, נעשה שימוש בווקטור AAV רקומביננטי הארוז עם הסרוטיפ 8 קפסיד וקידוד מקדם ציטומגלווירוס גנרי (CMV) השולט על הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).
1. טיפול ואחסון וקטורי AAV
- אחסן את הנגיף במקפיא של -80 מעלות צלזיוס ב-100 μL aliquots בצינורות מיקרוצנטריפוגה מסיליקון או בשימור נמוך.
- הפשירו את כל פתרונות המלאי הווקטוריים על הקרח לפני השימוש.
הערה: צבעים כגון תמיסת נתרן פלואורסצין (בריכוז סופי של 0.1-2%) מעורבבים לעתים קרובות עם וקטורי AAV כדי לדמיין את התמיסה המוזרקת. בנוסף, הדמיה של פתרונות מוזרקים מסייעת באיתור בועות אוויר ובמעקב אחר התפלגות AAV ו/או דליפה לאחר ההזרקה.
2. הזרקת תת-לחמית (SCJ)
- להרכיב את מערכת ההזרקה.
- כדי להרכיב את מערכת ההזרקה, הניחו סטריאומיקרוסקופ ומשאבת מזרק בארון בטיחות ביולוגית.
הערה: יש צורך במשאבת עירוי כדי לבצע הזרקות בדיוק גבוה. כאן, נעשה שימוש במשאבת מזרק ניתנת לתכנות להחדרה/נסיגה סטנדרטית (ראו טבלת החומרים), הכוללת אחיזה הדוקה ומהדק מזרק מאובטח למזרקים בנפח הנע בין 0.5 μL ל-60 מ"ל. משאבה זו מציעה גם ביצועי זרימה משופרים עם דיוק גבוה וקצבי זרימה חלקים מ-1.28 pl/min עד 88.28 מ"ל/דקה. - חותכים את צינורות הפוליאתילן לאורך של כ-50 ס"מ (ראו טבלת חומרים).
- הכנס את קצה הרכזת של מחט 36 G לאחד הקצוות של הצינור.
הערה: החלק את קצה רכזת המחט לתוך הצינור למשך ~ 3 מ"מ כדי להבטיח שלא תתרחש דליפה. מחט 36 G משמשת להזרקת SCJ הבאה. מחטים הנעות בין 32 גרם ל -36 גרם הן הגדלים הנפוצים ביותר עבור זריקות SCJ. השימוש בהמוסטאט כדי לסייע לשלב זה מומלץ מאוד כדי למנוע את הסיכון הפוטנציאלי של פציעת sharps. - למלא מזרק חד פעמי 3 מ"ל עם מים סטריליים; יש להכניס את המזרק החד פעמי הזה לצד הצינור שמול המחט ולשטוף את המים לאורך כל הצינור/מחט. חזור על שלב זה עם 70% אלכוהול.
- חזור על שלב 2.1.4 שלוש פעמים נוספות, לסירוגין שטיפות עם מים סטריליים ו -70% אלכוהול, כדי לחטא את הצינורות ולוודא שלא נצפו דליפות, סתימות או נזקים לאורך כל הצינורות.
- השתמש במזרק חד פעמי 3 מ"ל כדי למלא את הצינור במים סטריליים ולהשאיר את הצינור מחובר למזרק החד פעמי.
- מניחים חתיכת פרפילם על משטח הספסל ומוסיפים לו בריכה של מים סטריליים (~ 1 מ"ל). טבלו את חלק הצינורות המחוברים למחט בבריכת המים הסטריליים. הוציאו את המזרק החד פעמי מפתח הצינור בקצה הנגדי כדי למנוע כניסת אוויר למערכת הצינורות/מחטים עם הוצאת המזרק. השאירו את החלק של הצינורות מחובר למחט שקוע בבריכת המים.
הערה: בצע הליכים 2.1.4 עד 2.1.7 במכסה מנוע למינרי. - מלאו מזרק/מחט של 10 μL Hamilton במים סטריליים והימנעו מאוויר במזרק. חבר את מזרק המילטון / מחט לקצה הפתוח הנותר של הצינורות על ידי טבילת קצה הצינורות והמחט של מזרק המילטון לתוך בריכת המים הסטריליים על הפרפילם.
- לחץ על כפתור ההיפוך המהיר במסך המשאבה כדי להזיז את בלוק הדחף לאורך המשוער של המזרק. שחררו את ידיות הידוק של התושבת כדי לשחרר את הסוגריים התומכים על הדוחף ואת בלוקי מחזיק המזרק. טען את מזרק המילטון על בלוק מחזיק המזרק ואבטח את המזרק בהתאם להוראות היצרן.
הערה: כדי לאבטח את המזרק, מהדק חבית המזרק צריך להיות הדוק כנגד חבית המזרק; עם זאת, לא overtighten, במיוחד בעת שימוש מזרקי זכוכית. הבוכנה מזרק צריך להיות מאובטח על ידי בלוק דוחף שומר סוגר. - התאם את הפרמטרים במסך הגדרות המשאבה.
- לחץ על לחצן Force והגדר את רמת הכוח על 30%. קבל את השינויים כדי לחזור למסך ההגדרות .
- לחץ על לחצן 'התחלה מהירה ' ובחר שיטה | להחדיר/לסגת.
- עבור המזרק, בחר המילטון 1700, זכוכית, 10 μL. בחר את קצב העירוי והמשיכה ואת נפח ההזרקה.
הערה: רמת הכוח מוגדרת בהתאם לסוג המזרק / חומר / קיבולת / יצרנים; עיין בהוראות היצרן לקבלת הכוח המוצע עבור כל מזרק. מהירות ההזרקה ששימשה בניסוי זה הייתה 200 nL/s. זריקות SCJ בטוחות יחסית, ויש פחות חשש להשראת לחץ תוך עיני גבוה (IOP) כתוצאה מההזרקה. מהירות הזרקה איטית יותר רצויה לעתים קרובות עבור יישומים מסוימים כדי למנוע ריפלוקס לתוך המחט ולשמור על עקביות בזריקות בקרב בעלי חיים.
- הוציאו את המים ממזרק המילטון אך השאירו את הצינורות ומחט ההזרקה מלאים במים. משוך מעט לאחור את מזרק המילטון על ידי לחיצה על כפתור הפוך כדי להציג בועת אוויר קטנה בצינורות / מחט.
הערה: בועת האוויר תשמש כמחסום בין המים בצינור לבין התרופה הטיפולית (במקרה זה, AAV), ותבטיח את דיוק המינון שניתן. - למשוך את הנגיף על ידי הצבת מחט ההזרקה לתוך aliquot של מלאי הנגיף. ודא כי בועת אוויר גלויה נשארת בין הנגיף לבין המים בצינורות.
הערה: וקטורים של AAV יכולים להיקשר לצינורות הפלסטיק ולמחט המתכת, מה שמוביל לאובדן וירוסים ו/או משטרי מינון לא מדויקים. לכן, כדי להבטיח קפדנות, שכפול, ומינון מדויק של AAV, מומלץ להקדים את המשטחים הבאים במגע עם AAV. כדי לצפות את מערכת הצינורות/מחטים בנגיף, משכו את התמיסה הווקטורית הנגיפית לתוך הצינור/מחט ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר רוויה של וירוס שנקשר לדופן המחט ו/או הצינור. השלך את הווירוס.
- כדי להרכיב את מערכת ההזרקה, הניחו סטריאומיקרוסקופ ומשאבת מזרק בארון בטיחות ביולוגית.
- הזרקת וירוסים
- הרדמת העכבר בהרדמה בשאיפה (איזופלוראן) או הזרקה תוך-צפקית של קטמין/קסילזין/אצפרומזין. אשר את המטוס הכירורגי של הרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטות בוהן מוצק.
הערה: יש להשתמש בעכברי C57BL/6J או BALB/c נקביים ו/או זכריים בני 6 שבועות לפחות. מינוני קטמין/קסילזין/אצפרומזין הם כדלקמן: קטמין ב-70 מ"ג/ק"ג, קסילזין ב-7 מ"ג/ק"ג ואצפרומזין ב-1.5 מ"ג/ק"ג. - יש למרוח הרדמה מקומית על העין שתקבל את הזריקה.
הערה: יש להשתמש בתמיסת עיניים של 0.1% פרופרקאין הידרוכלוריד ו/או טטרקאין הידרוכלוריד (0.5%) להרדמה מקומית. - יש למרוח משחה מקומית על העין השנייה שלא תקבל זריקה למניעת יובש ופציעה.
- מקם את העכבר על הבמה המיקרוסקופית וחשוף את עין העכבר מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
- מניחים שתי אצבעות על העפעף ומושכים אותו מעט הרחק מעין העכבר כדי לחשוף את הלחמית, שהיא הממברנה הפנימית המחברת את העפעף לסקלרה.
- תפוס את הלחמית עם מלקחיים.
- שחררו את העפעף והחזיקו את המחט כאשר השיקוע פונה כלפי מעלה באמצעות היד הדומיננטית.
- הכנס את המחט לתוך הלחמית. הכנס את המחט עד שהשיקוע מכוסה לחלוטין על ידי קרום הלחמית. הניחו את המחט על הגלובוס.
הערה: מכיוון שהלחמית היא קרום שקוף, קצה המחט / השיקוע נראים בקלות. - התחל את ההזרקה על ידי לחיצה על לחצן התחל באמצעות מתג הרגליים.
הערה: תנועת האוויר ובוכנת המילטון מסונכרנות; כל עיכוב מעיד על עודף אוויר במערכת ההזרקה או על קשר רופף בין רכיבי הצינורות, המחט ו/או המזרק. - לאחר סיום ההזרקה, החזיקו את המחט במקומה למשך 10 שניות לפני משיכת המחט מהלחמית כדי להקטין את הסיכויים לזרימה חוזרת.
הערה: זה נפוץ עבור bleb להופיע באתר של הזרקת SCJ. blebs כאלה בדרך כלל לפתור לחלוטין בתוך כמה שעות לאחר ההזרקה. - יש להניח טיפה של ג'ל הסיכה המקומי על עיני העכבר כדי למנוע יובש/פציעה בעיניים, ולאחר מכן להניח את העכבר על כרית חימום כדי להתאושש.
- בצע בדיקות עיניים כגון ייצור דמעות, IOP ובדיקת מנורת חריץ בשילוב עם צביעת פלואורסצין בקרנית כדי להעריך את הפרעות העיניים לאחר ההזרקה.
הערה: ייצור דמעות נמדד על ידי בדיקת חוט אדום פנול, וטונומטר משמש לעתים קרובות כדי לבחון את ה- IOP של עין העכבר. הוא דיווח כי כמה זריקות תוך עיניות, כגון זריקות intravitreal, עשוי לגרום לעלייה משמעותית IOP; עם זאת, שינויים IOP לאחר הזרקת SCJ אינם ברורים 13,22,23,24.
- הרדמת העכבר בהרדמה בשאיפה (איזופלוראן) או הזרקה תוך-צפקית של קטמין/קסילזין/אצפרומזין. אשר את המטוס הכירורגי של הרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטות בוהן מוצק.
- בדיקת יעילות פיזור ביולוגי והתמרת AAV לאחר הזרקה תת-קרקעית
- כדי לחקור את ההתפלגות הביולוגית של הגנום הנגיפי ו/או פרופיל ההתמרה של וקטורים AAV המועברים באמצעות SCJ, הרדימו את העכברים בשיטה שאושרה על ידי AVMA.
הערה: בניסוי זה, העכברים הוקרבו 8 שבועות לאחר ההזרקה. - לפיזור ביולוגי וביטוי טרנסגני בתאי עיניים ממוקדים, נתחו את הרקמה הרלוונטית המעניינת כגון העפעפיים, הקרנית, הלחמית, שרירי העין, הרשתית ועצב הראייה. הקפיא את כל הרקמות ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. כדי לבחון את כל הגוף AAV biodistribution, לאסוף איברים כגון בלוטות הלימפה submandibular וכבד, להקפיא הבזק ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס.
- באמצעות ערכת מיצוי DNA/RNA, יש לאסוף gDNA ו-RNA מאותה דגימה כדי לבחון ביטוי טרנסגנים ופיזור ביולוגי של AAV, בהתאמה. אם רוצים רק פיזור ביולוגי וקטורי, השתמשו בערכת מיצוי דנ"א כדי לחלץ gDNA.
- בצע qPCR ו- RT-qPCR סטנדרטיים כדי לקבוע את הפיזור הביולוגי של וקטור AAV ואת שפע ה- cDNA באמצעות פריימרים/בדיקות ספציפיים לטרנסגנים וקטוריים13,25.
- לצורך ניתוח היסטולוגיה, לתקן את העיניים, להטביע אותם פרפין, לחתוך אותם בעובי של 5 מיקרומטר. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית סטנדרטית כדי לחשוף ביטוי טרנסגני26.
- כדי לחקור את ההתפלגות הביולוגית של הגנום הנגיפי ו/או פרופיל ההתמרה של וקטורים AAV המועברים באמצעות SCJ, הרדימו את העכברים בשיטה שאושרה על ידי AVMA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמיסה המוזרקת לחלל תת-הלחמית מוצגת כ-bleb בהתאם לנפח ההזרקה.
בניסוי זה, 7 μL של AAV (7 × 109 גנומים נגיפיים (vg)/עין) מעורבבים עם פלואורסצין בריכוז סופי של 0.1% הוזרק עם מחט 36 G תחת סטריאומיקרוסקופ, ומהירות ההזרקה / לחץ הוחזקה קבועה באמצעות משאבת מזרק ניתנת לתכנות ב 1 μL / s. bleb יכול להופיע עם ההזרקה (חץ). תצוגה מיקרוסקופית של מתן וקטור AAV לתא ה-SCJ של מורין מוצגת באיור 1.
חומרים המוזרקים לחלל התת-קרקעי מתפזרים ברחבי כדור הארץ של העין ומופצים ברחבי הרקמות הפריוקולריות.
כדי להגדיר את התפלגות ה-AAV הניתן באמצעות הזרקת SCJ, הוזרקו 7 μL של דיו הודו מדולל לחלל התת-לחמית של עכבר בן 10 חודשים לאחר ההרדמה. לא זוהה דימום, דליפה או זרימה אחורית במהלך הזרקת SCJ או אחריה. שלושים דקות לאחר ההזרקה, הרקמות העיניות והסביבה נקטפו ולאחר מכן הוכתמו בהמטוקסילין ובאוזין (H&E) כדי לדמיין את התפלגות הדיו בהודו. הקטעים הסגיטליים המייצגים המתוארים באיור 2 מראים שפיזור הדיו בהודו התרחש בעיקר בצמוד לשרירים החוץ-עיניים, בפני השטח החיצוניים של הסקלרה, ולרקמות החיבור הרופפות הפריעיניות (איור 2).
AAV8 משלים את עצמו בהצלחה מתמר את שרירי הקרנית והשרירים הפריים לאחר SCJ.
כדי לקבוע את פרופיל ההתמרה של AAV8 משלים את עצמו בשמונה שבועות לאחר ההזרקה, נבדק שפע GFP בחתכי גלובוס שלם באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה באמצעות נוגדן אנטי-GFP בדילול של 1:500. התמונות צולמו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3). תוצאות אלה גילו כי וקטורים AAV הניתנים באמצעות הזרקת SCJ מתמרים ביעילות את השרירים הפריוקולריים האחוריים לעין ולקרנית.
שפע גנום וקטורי וביטוי טרנסגני בתאי עיניים נפרדים לאחר הזרקת SCJ
כדי לנתח באופן כמותי את ההתפלגות הביולוגית הווקטורית ואת ביטוי הטרנסגנים, מספרי העתקי גנום וקטורי בתאי עיניים ואיברים שונים כגון הכבד והלב נבדקו על-ידי qPCR (איור 4A), בעוד שביטוי הטרנסגנים נבדק על-ידי qRT-PCR (איור 4B). תוצאות אלה מצביעות על כך שהזרקת SCJ של AAV8 גורמת לביטוי טרנסגני בעפעף, בלחמית, בקרנית ובעצב הראייה.
איור 1: מבט מיקרוסקופי של ניהול וקטור AAV לתוך מרחב ה-SCJ של מורין. כדי לאפשר הדמיה של היווצרות של bleb במהלך ההליך, 1% פלואורסצין נוספה ישירות להכנת וקטור AAV. התמונות צולמו באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברת לסטריאומיקרוסקופ. (א) תמונה מייצגת של עין שאינה מוזרקת; (B) תמונה מייצגת של עין מוזרקת. החץ מציין את תמיסת ה-AAV המוזרקת המכילה פלואורסצין במרחב SCJ. קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; SCJ = תת-לחמית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: צביעת H&E של התפלגות דיו בהודו (חץ) לאחר הזרקת SCJ בעין העכבר. מוצגים קטעים סגיטליים של עין מוזרקת בדיו הודו; 7 μL של דיו הודו הוזרק באתר המצוין. *, אתר הזרקה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: SCJ = תת-לחמיה; H&E = המטוקסילין ואאוזין; C = קרנית; I = איריס; L = עדשה; R = רשתית; E = עפעף; H = בלוטה הרדירית; M = שריר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תמונות היסטולוגיה מייצגות של GFP של AAV8 משלים את עצמו לאחר הזרקת SCJ. התמרת הקרנית (A) ושרירי העיניים (B) לאחר הזרקת SCJ. ביטוי GFP (ירוק) הודגם באמצעות אימונוסטינינג במקטעי רקמה משובצים בפרפין עם נוגדן נגד GFP. גרעינים היו מוכתמים ב-DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (שריר העין), 20 מיקרומטר (קרנית). קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; AAV = וירוס הקשור לאדנו; SCJ = תת-לחמית; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח כמותי של התפלגות ביולוגית וקטורית וביטוי טרנסגנים. (A) פיזור ביולוגי וקטורי בתאי עיניים (עפעף, לחמית, קרנית, עצב הראייה ורשתית) ואיברים אחרים (כבד ולב) לאחר SCJ מוצג כמספר העתק גנום וקטורי/מיקרוגרם של דנ"א הגנום המארח. (B) שפע GFP שנקבע על ידי qRT-PCR מוצג כמספר עותק cDNA וקטורי / תעתיק מארח. נתון זה שונה מ-13. קיצורים: SCJ = תת-לחמיה; qRT-PCR = PCR כמותי של שעתוק רוויר; GFP =חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיפול גנטי בתיווך AAV טומן בחובו פוטנציאל גדול לטיפול במחלות עיניים. הטיפול הגנטי הנוכחי בעיניים מסתמך על שני נתיבי מתן מקומיים עיקריים, זריקות תוך-ורידיות וזריקות תת-רשתיות. למרבה הצער, שני המסלולים פולשניים ועלולים לגרום לסיבוכים חמורים, כולל ניתוק רשתית, היווצרות קטרקט ואנדופתלמיטיס. לפיכך, חקירת מסלולים פחות פולשניים יחסית, כגון הזרקת SCJ, מעניינת מאוד.
למרות שטכניקה זו פשוטה יחסית ופחות פולשנית באופן משמעותי, ישנם מספר היבטים חשובים של אספקת AAV שיש להדגיש. מומלץ לאחסן את וקטור ה-AAV בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ב-aliquots של הנפח הרצוי (100 μL כאן) בצינורות מיקרוצנטריפוגה מסיליקון או בשימור נמוך, כדי למנוע מחזורי הפשרה מרובים בהקפאה ולמנוע הפחתה בטיטר הנגיפי. הווקטור ששימש בניסוי זה אוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס במשך ~ 6 שנים ללא אובדן משמעותי של טיטר. בנוסף, הרכב הרכב עשוי להשפיע על יציבות הווקטור. בניסוי זה, רכב הנגיף היה PBS עם 350 mM NaCl + 5% D-סורביטול. הטיטר של הנגיף שבו נעשה שימוש במחקר זה היה 5.1 × 10 9 vg/μL (נקבע על ידי qPCR), ובסך הכל ניתנו 7 × 109 vg/eye. עם זאת, טווח של 1 × 108-1 × 1010 vg / עין מתאים, בהתאם לרקמה ממוקדת המטרה ואת transgene.
זריקות SCJ הן יחסית פחות מגבילות לגבי הנפח הניתן (1-100 μL לעכבר). עם זאת, הבדלי נפח נחשבים כממלאים תפקיד בחלוקה ביולוגית של AAV ובהתמרות, ועל פי דיווחים נעשה שימוש בנפחי הזרקה גדולים יותר ליצירת מודל הצטלקות לחמית27. היבט חשוב אחד הוא האופי הווסקולרי של הלחמית, אשר עשוי להוביל לסילוק מערכתי משמעותי של וקטור ה-AAV, ובכך לגרום ליצירת נוגדנים מנטרלים לווקטור ה-AAV. מחקר מתמשך בוחן באופן פעיל אסטרטגיות פוטנציאליות להפחתת הסילוק המערכתי של וקטורים טיפוליים AAV.
בנוסף, הפצת ה- in vivo לאחר הזרקת SCJ היא שיקול קריטי ליישום הפוטנציאלי של מסלול הזרקה זה. בפרוטוקול הנוכחי, ההתפלגות נבדקת באמצעות צבע (דיו הודו) בנקודת זמן אחת ולא במספר נקודות זמן או בזמן אמת. למרות שנתונים אלה מספקים אינדיקציה מסוימת לאופן שבו התמיסה הווקטורית AAV מתפשטת מיד לאחר ההזרקה, ההתפלגות והתכונות הקינטיות של וקטור AAV וחומרים אחרים עשויות להשתנות באופן משמעותי לאורך זמן. למרות שההתפלגות הביולוגית של וקטור ה- AAV זוהתה בתאי עיניים שונים על ידי qPCR, כפי שצוין בסעיף השיטות לעיל בנקודת הקצה הניסויית, באופן אידיאלי, תשמש טכניקה שיכולה לפקח על הסחר של הריאגנטים הטיפוליים בכל העין בזמן אמת; עם זאת, זה לעתים קרובות מאתגר בפועל. לבסוף, פרופיל ההתמרת AAV שנצפה בעכברים לאחר הזרקת SCJ עשוי להיות שונה בעיניים אנושיות בשל ההבדלים הברורים, האנטומיים והפיזיולוגיים בין עין עכבר לעין אנושית.
מחלות רשתית הן גם מטרה מרכזית לריפוי גנטי28; לפיכך, הקביעה אם AAV הניתן באמצעות הזרקת SCJ יכול להגיע לרקמות הרשתית שווה בדיקה נוספת13,17,29. מחקרים קודמים הראו כי ננו-חלקיקים הניתנים באמצעות זריקות SCJ יכולים להגיע לרשתית הפנימית. עם זאת, מסלולי הסחר הספציפיים אינם ברורים. נתוני התפוצה של דיו הודו (איור 2) מראים שרוב התמיסה מתפשטת לרקמות החיבור הפריוקולריות, מה שמצביע על כך ש-AAV עשוי להגיע לרשתית הפנימית דרך חדירה פריוקולרית על ידי חדירה לסקלרה, לכורואיד ולאפיתל פיגמנטי רשתית.
נתוני התמרת הקרנית המוצגים באיור 3A מצביעים על כך ש-AAV המוזרק לחלל SCJ יכול לחדור את הסקלרה והקרנית. זה עוד מצביע על כך שמתן AAV באמצעות הזרקת SCJ עשוי להגיע לתא הקדמי או אפילו לתאים האחוריים והזגוגיים, אם כי ייתכן שיידרש מינון גבוה משמעותית כדי להשיג השפעות רצויות ברשתית30. עם זאת, הזרקת SCJ היא אחד ממסלולי ניהול העיניים הפשוטים ביותר וטומנת בחובה הבטחה גדולה לאספקת AAV לטיפול במחלות עיניים מרובות, כולל אך לא מוגבל למחלות פני השטח של העיניים כגון מחסור בתאי גזע לימבליים, מחלות עיניים יבשות ו / או מחלות של שרירי העין, כגון ניוון שרירים oculopharyngeal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לליבה הווקטורית באוניברסיטת צפון קרוליינה על שסיפקה את וקטורי scAAV8-GFP ששימשו במחקר זה, את ליבת ההיסטולוגיה CGIBD ואת המעבדה של ד"ר בריאן סי גילגר על עזרתם בהיבטי ההערכה הקלינית של מחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי מלגת הפוסט-דוקטורט המכובדת של פייזר-NC Biotech ופרס פיתוח קריירה מטעם האגודה האמריקאית לריפוי גנים ותאים וקרן סיסטיק פיברוזיס. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של האגודה האמריקאית לריפוי גנטי ותאי או של קרן סיסטיק פיברוזיס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K.
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S.
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
