Summary
В этой рукописи субконъюнктивальная инъекция демонстрируется как действительный векторный метод доставки для глазных тканей у мышей с использованием системы инъекций, состоящей из инфузионно-выводного шприцевого насоса и газонепроницаемого съемного шприца в сочетании с микроинъекционными иглами. Эта система инъекций также адаптируется для других внутриглазных путей введения.
Abstract
Глазные заболевания включают в себя широкий спектр наследственных генетических и приобретенных расстройств, которые являются привлекательными целями для местной доставки лекарств из-за их относительной легкости доступа через несколько способов введения. Субконъюнктивальные (SCJ) инъекции предлагают преимущества по сравнению с другими путями внутриглазного введения, поскольку они просты, безопасны и обычно выполняются в амбулаторных условиях. Инъекции SCJ мелким животным обычно требуют помощи операционного микроскопа из-за размера глаза. Предыдущая работа показала, что инъекция SCJ специфических серотипов аденоассоциированного вируса (AAV) является действительной стратегией доставки генов для целенаправленной трансдукции глазной поверхности, глазной мышцы, роговицы и зрительного нерва, обеспечивая потенциальный подход к лечению многих глазных заболеваний.
В настоящем документе представлен подробный протокол для инъекций SCJ в мышиной модели с использованием системы впрыска, состоящей из программируемого инфузионно-выводного шприцевого насоса (который обеспечивает постоянную и точную скорость и давление впрыска) и газонепроницаемого съемного шприца в сочетании с микроинъекционными иглами. Система инъекций также адаптируется для других внутриглазных путей введения, таких как интрастромальные, внутрикамерные, интравитреальные и субретинальные инъекции у мелких животных. Хотя описана доставка аденоассоциированных вирусных векторов для исследований глазной генной терапии, протокол в настоящем описании также может быть адаптирован для различных офтальмологических растворов на моделях мелких животных. Будут подробно рассмотрены ключевые практические шаги в пути введения, настройка для инъекционной платформы, подготовка инъекции и советы из непосредственного опыта. Кроме того, будут кратко обсуждены общие методы валидации для подтверждения доставки AAV в желаемые ткани.
Introduction
Глазные заболевания охватывают широкий спектр как генетических, так и приобретенных расстройств. По оценкам, в 2015 году 36 миллионов человек во всем мире были юридически слепыми, и более 1 миллиарда человек страдают, по крайней мере, от некоторого уровня нарушений зрения, что подчеркивает необходимость наращивания усилий по смягчению последствий на всех уровнях1. Основные методы доставки глазных препаратов включают как местное, так и местное введение, такое как глазные капли или субконъюнктивальные (SCJ), внутрикамерные, интравитреальные и субретинальные инъекции. Хотя неинвазивная местная терапия является наиболее распространенным методом доставки офтальмологических препаратов и широко используется для многих заболеваний переднего сегмента, наличие анатомических барьеров роговицы представляет собой проблему для биодоступности, биораспределения и эффективности местно вводимых веществ, предполагая, что это может быть не лучшим кандидатом на лечение многих заболеваний внутреннего глаза. Местная инъекция в специфический глазной компартмент, пораженный заболеванием, вероятно, будет более эффективным и целенаправленным подходом к доставке лекарств2. Однако побочные эффекты, возникающие в результате повторных инъекций, могут усложнить стратегии введения. В идеале терапия должна поддерживать долгосрочную терапевтическую эффективность после однократного введения. Таким образом, генная терапия является перспективным вариантом минимизации количества необходимых инъекций и обеспечения устойчивой трансгенной экспрессии для лечения глазного заболевания 3,4.
Многочисленные вирусные и невирусные векторы доступны для генной терапии; однако векторы AAV представляют большой интерес из-за их превосходного профиля безопасности. AAV представляет собой небольшой, одноцепочечный, необолоченный ДНК-вирус, который был первоначально обнаружен как загрязнитель аденовирусного препарата в 1965 году Атчисоном и др.5,6 AAV был впоследствии спроектирован как эффективный вирусный вектор для доставки генов в 1980-х годах и стал вектором генной терапии выбора для многих заболеваний, включая глазные расстройства, за последние несколько десятилетий. Наиболее заметным из них является первый коммерчески доступный препарат генной терапии, voretigene neparvovec, который был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения врожденного амавроза Лебера, редкого заболевания заднего глаза. Хотя voretigene neparvovec успешно преодолел барьеры на пути клинической разработки, остаются проблемы для коммерциализации дополнительной глазной генной терапии. Например, воретиген непарвовец вводят пациентам, которые сохраняют жизнеспособные клетки сетчатки с помощью субретинальной инъекции. Таким образом, пациенты с более продвинутыми формами заболевания, у которых отсутствуют жизнеспособные клетки сетчатки, не имеют права на лечение, поскольку оно не принесет никакой клинической пользы. Кроме того, наблюдались известные осложнения, связанные с процедурой субретинальной инъекции, включая воспаление глаз, катаракту, слезотечение сетчатки, макулопатию и боль 7,8. Другие проблемы, связанные с этой процедурой, включают возможность кровоизлияния, отслоения сетчатки, эндофтальмита и отзыва иммунного привилегированного статуса глаза через разрушение тканей глаза 9,10,11,12. Таким образом, усилия по изучению менее инвазивных путей доставки генов, таких как инъекция SCJ, становятся все болееважными 13,14,15,16,17.
Конъюнктива представляет собой тонкую мембрану, содержащую 3-5 слоев клеток и соединяющую передний глаз с внутренним веком. Инъекции SCJ клинически используются для доставки офтальмологических препаратов как в передний, так и/или задний сегменты глаза для лечения глазных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация, глаукома, ретинит и задний увеит 18,19. Они относительно просты в выполнении, регулярно используются для доставки офтальмологических препаратов в амбулаторных условиях20, несколько безболезненны, не ставят под угрозу иммунную привилегию глаза и позволяют вводимым препаратам распространяться через большую периорбитальную область, которая охватывает зрительный нерв. Следовательно, инъекции SCJ являются привлекательным способом введения для применения генной терапии AAV. Естественные серотипы AAV, вводимые с помощью инъекций SCJ у мышей, ранее были охарактеризованы по безопасности, эффективности трансдукции, иммуногенности сыворотки, биораспределению и специфичности тканей 13,16,21. Эти данные показали, что доставка генов в отдельные глазные ткани через введение SCJ является формальной возможностью.
В этом документе описывается простой и адаптируемый протокол для внедрения SCJ для доставки векторов AAV в модель мыши. Для обеспечения воспроизводимости этого подхода описана система впрыска, состоящая из стереомикроскопа, программируемого инфузионно-выводного шприцевого насоса (который обеспечивает постоянную и точную скорость и давление впрыска) и газонепроницаемого съемного шприца в сочетании с микроинъекционными иглами. Эта система адаптируется для других внутриглазных путей введения, таких как интрастромальные, интракамерные, интравитреальные и субретинальные инъекции у мелких животных. Кроме того, для визуализации места инъекции AAV часто используется флуоресцеиновый краситель. Будут подробно рассмотрены ключевые практические шаги в пути введения, настройка для инъекционной платформы, подготовка инъекции и советы из непосредственного опыта. Наконец, будут кратко рассмотрены общие методы валидации для подтверждения доставки AAV в желаемые ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с правилами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл. Использование переносчиков AAV представляет собой риск биологической опасности уровня биобезопасности 1. Носите надлежащие средства индивидуальной защиты, включая лабораторное пальто, перчатки и очки при обращении с AAV. Для эксперимента, описанного в настоящем описании, использовали рекомбинантный вектор AAV, упакованный с капсидом серотипа 8 и кодирующий общий вездесущий промотор цитомегаловируса (ЦМВ), контролирующий экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP).
1. Обработка и хранение векторов AAV
- Храните вирус в морозильной камере -80 °C в 100 мкл аликвотах в силиконизированных или низкоудерживающих микроцентрифужных пробирках.
- Перед использованием разморозьте все векторные растворы на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Красители, такие как раствор флуоресцеина натрия (в конечной концентрации 0,1-2%), часто смешивают с векторами AAV для визуализации вводимого раствора. Кроме того, визуализация инжекционных растворов помогает обнаруживать пузырьки воздуха и контролировать распределение И/или утечку AAV после инъекции.
2. Субконъюнктивальный (SCJ) раствор для инъекций
- Соберите систему впрыска.
- Чтобы собрать систему впрыска, поместите стереомикроскоп и шприцевой насос в шкаф биобезопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инфузионный насос необходим для выполнения инъекций с высокой точностью. В данном случае используется стандартный программируемый шприцевой насос infuse/withdraw (см. Таблицу материалов), который включает в себя плотный захват и надежный шприц-зажим для шприцев объемом от 0,5 мкл до 60 мл. Этот насос также обеспечивает улучшенную производительность потока с высокой точностью и плавной скоростью потока от 1,28 пл / мин до 88,28 мл / мин. - Нарежьте полиэтиленовую трубку на длину примерно 50 см (см. Таблицу материалов).
- Вставьте стержневой конец иглы весом 36 г в один из концов трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сдвиньте конец ступицы иглы в трубку на ~3 мм, чтобы убедиться, что утечка не происходит. Игла 36 G используется для последующей инъекции SCJ. Иглы в диапазоне от 32 г до 36 г являются наиболее часто используемыми размерами для инъекций SCJ. Использование гемостата для оказания помощи этому шагу настоятельно рекомендуется, чтобы избежать потенциального риска острой травмы. - Наполните одноразовый шприц объемом 3 мл стерильной водой; вставьте этот одноразовый шприц в сторону трубки напротив иглы и промойте воду по всей трубке/игле. Повторите этот шаг с 70% алкоголем.
- Повторите шаг 2.1.4 еще три раза, чередуя промывки стерильной водой и 70% спиртом, чтобы продезинфицировать трубку и убедиться, что во всей трубке не наблюдается утечек, засоров или повреждений.
- Используйте одноразовый шприц объемом 3 мл, чтобы заполнить трубку стерильной водой и оставить трубку прикрепленной к одноразовому шприцу.
- Поместите кусочек парапленки на поверхность скамейки и добавьте в него бассейн со стерильной водой (~1 мл). Погрузите часть трубки, подключенную к игле, в бассейн со стерильной водой. Вытащите одноразовый шприц из отверстия трубки на противоположном конце, чтобы предотвратить попадание воздуха в систему трубки/иглы после извлечения шприца. Оставьте часть трубки, подключенную к игле, погруженной в бассейн с водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуры 2.1.4-2.1.7 в ламинарной вытяжке. - Наполните 10-мкл шприц Гамильтона / иглу стерильной водой и избегайте воздуха в шприце. Соедините шприц/иглу Гамильтона с оставшимся открытым концом трубки, погружая трубку и кончик иглы шприца Гамильтона в бассейн со стерильной водой на парапленке.
- Нажмите быструю кнопку заднего хода на экране насоса, чтобы переместить блок толкателя на приблизительную длину шприца. Открутите зажимные ручки кронштейна, чтобы ослабить стопорные кронштейны на толкателе и блоках держателя шприца. Загрузите шприц Hamilton на блок держателя шприца и закрепите шприц в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для закрепления шприца зажим ствола шприца должен быть плотно прижат к стволу шприца; Однако не стоит перетягивать, особенно при использовании стеклянных шприцев. Плунжер шприца должен быть закреплен удерживающим кронштейном толкающего блока. - Отрегулируйте параметры на экране настроек насоса.
- Нажмите кнопку Force и установите уровень силы на уровне 30%. Примите изменения, чтобы вернуться на экран настроек .
- Нажмите кнопку быстрого запуска и выберите Метод | Вливать/выводить.
- Для шприца выберите Hamilton 1700, стекло, 10 мкл. Выберите скорость инфузии и вывода , а также объем инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень усилия устанавливается в зависимости от типа/материала/емкости/изготовителя шприца; см. инструкции заводского производителя для рекомендуемого усилия для каждого шприца. Скорость впрыска, используемая в этом эксперименте, составляла 200 нл/с. Инъекции SCJ относительно безопасны, и меньше внимания уделяется индукции повышенного внутриглазного давления (ВГД) в результате инъекции. Более медленная скорость инъекции часто желательна для определенных применений, чтобы избежать рефлюкса в иглу и поддерживать консистенцию в инъекциях среди животных.
- Выбросьте воду из шприца Гамильтона, но оставьте трубку и инъекционную иглу полной воды. Слегка оттяните шприц Гамильтона, нажав кнопку Reverse , чтобы ввести небольшой пузырь воздуха в трубку/иглу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушный пузырь будет служить барьером между водой в трубке и лечебным препаратом (в данном случае ААВ), обеспечивая точность вводимой дозы. - Вывести вирус, поместив инъекционную иглу в аликвоту запаса вируса. Убедитесь, что между вирусом и водой в трубке остается видимый пузырь воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Векторы AAV могут связываться с пластиковой трубкой и металлической иглой, что приводит к потере вируса и/или неточным режимам дозирования. Таким образом, для обеспечения строгости, воспроизводимости и точной дозы AAV рекомендуется предварительное покрытие поверхностей, которые впоследствии вступают в контакт с AAV. Чтобы покрыть систему трубки/иглы вирусом, втяните раствор вирусного вектора в трубку/иглу и инкубируйте его при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы обеспечить насыщение вирусом, связывающегося со стенкой иглы и/или трубки. Отбросьте вирус.
- Чтобы собрать систему впрыска, поместите стереомикроскоп и шприцевой насос в шкаф биобезопасности.
- Инъекция вируса
- Обезболить мышь ингаляционной анестезией (изофлуран) или внутрибрюшинной инъекцией кетамина/ксилазина/ацепромазина. Подтвердите хирургическую плоскость анестезии отсутствием реакции на твердые щипки пальцев ног.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте самок и/или самцов мышей C57BL/6J или BALB/c, которым не менее 6 недель. Дозы кетамина/ксилазина/ацепромазина следующие: кетамин - 70 мг/кг, ксилазин - 7 мг/кг и ацепромазин - 1,5 мг/кг. - Нанесите местную анестезию на глаз, который получит инъекцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 0,1% пропаракаина гидрохлорида и/или тетракаина гидрохлорида офтальмологического раствора (0,5%) для местной анестезии. - Нанесите мазь местного применения на другой глаз, который не получит инъекцию, чтобы предотвратить сухость и травму.
- Поместите мышь на микроскопическую ступень и обнажите глаз мыши под стереомикроскопом.
- Поместите два пальца на веко и слегка оттяните его от глаза мыши, чтобы обнажить конъюнктиву, которая является внутренней мембраной, соединяющей веко со склерой.
- Захватите конъюнктиву щипцами.
- Отпустите веко и держите иглу со скосом, обращенным вверх, используя доминирующую руку.
- Вставьте иглу в конъюнктиву. Вставьте иглу до тех пор, пока скос не будет полностью покрыт мембраной конъюнктивы. Положите иглу на земной шар.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку конъюнктива представляет собой прозрачную мембрану, кончик иглы / скос легко виден. - Запустите инъекцию, нажав кнопку Пуск с помощью ножного переключателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Движение воздуха и плунжер Гамильтона синхронизированы; любая задержка указывает на избыток воздуха в системе впрыска или, возможно, на слабое соединение между компонентами трубки, иглы и/или шприца. - После того, как инъекция закончена, удерживайте иглу на месте в течение 10 с, прежде чем вынимать иглу из конъюнктивы, чтобы уменьшить вероятность обратного потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часто блеб появляется в месте инъекции SCJ. Такие пузырьки обычно полностью рассасываются в течение нескольких часов после инъекции. - Нанесите каплю местного смазочного геля на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость / травму глаза, а затем поместите мышь на грелку, чтобы восстановиться.
- Выполняйте глазные исследования, такие как производство слез, ВГД и исследование щелевой лампой в сочетании с окрашиванием флуоресцеином роговицы для оценки глазных аномалий после инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Производство слез измеряется с помощью теста фенольной красной нити, и тонометр часто используется для изучения ВГД глаза мыши. Сообщается, что некоторые внутриглазные инъекции, такие как интравитреальные инъекции, могут привести к значительному увеличению ВГД; однако изменения ВГД после инъекции SCJ не очевидны 13,22,23,24.
- Обезболить мышь ингаляционной анестезией (изофлуран) или внутрибрюшинной инъекцией кетамина/ксилазина/ацепромазина. Подтвердите хирургическую плоскость анестезии отсутствием реакции на твердые щипки пальцев ног.
- Исследование эффективности биораспределения и трансдукции AAV после субконъюнктивальной инъекции
- Чтобы исследовать биораспределение вирусного генома и/ или профиль трансдукции векторов AAV, доставляемых через SCJ, усыпляют мышей методом, одобренным AVMA.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте мышей приносили в жертву через 8 недель после инъекции. - Для биораспределения и экспрессии трансгенов в целевых глазных компартментах рассекните соответствующую ткань, представляющую интерес, такую как веки, роговица, конъюнктива, глазная мышца, сетчатка и зрительный нерв. Мгновенно заморозьте все ткани и храните при -80 °C. Чтобы исследовать биораспределение AAV всего тела, соберите органы, такие как подчелюстные лимфатические узлы и печень, и мгновенно заморозьте и храните их при -80 ° C.
- Используя набор для экстракции ДНК /РНК, соберите гДНК и РНК из одного образца для изучения экспрессии трансгенов и биораспределения AAV соответственно. Если требуется только векторное биораспределение, используйте набор для экстракции ДНК для извлечения гДНК.
- Выполнение стандартных qPCR и RT-qPCR для определения биораспределения вектора AAV и плотности кДНК с использованием векторных трансген-специфических праймеров/зондов13,25.
- Для гистологического анализа зафиксируйте глаза, встройте их в парафин, и разделите их толщиной 5 мкм. Выполняют стандартное иммунофлуоресцентное окрашивание для выявления экспрессии трансгенов26.
- Чтобы исследовать биораспределение вирусного генома и/ или профиль трансдукции векторов AAV, доставляемых через SCJ, усыпляют мышей методом, одобренным AVMA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Раствор, вводимый в субконъюнктивальное пространство, представляет собой блеб в зависимости от объема инъекции.
В этом эксперименте 7 мкл AAV (7 × 109 вирусных геномов (vg)/глаз), смешанных с флуоресцеином в конечной концентрации 0,1%, вводили иглой 36 G под стереомикроскопом, а скорость/давление инъекции поддерживали постоянной с помощью программируемого шприцевого насоса со скоростью 1 мкл/с. Блеб может появиться при инъекции (стрелка). Микроскопическое представление введения вектора AAV в отсек SCJ мышей показано на рисунке 1.
Вещества, вводимые в субконъюнктивальное пространство, диффундируют по всему земному шару глаза и распределяются по периокулярным тканям.
Чтобы определить распределение AAV, вводимого через инъекцию SCJ, 7 мкл разбавленных индийских чернил вводили в субконъюнктивальное пространство 10-месячной мыши после анестезии. Во время или после инъекции SCJ не было обнаружено кровотечения, утечки или обратного потока. Через тридцать минут после инъекции глазные и окружающие ткани были собраны и впоследствии окрашены гематоксилином и эозином (H & E), чтобы визуализировать распределение индийских чернил. Репрезентативные сагиттальные участки, изображенные на рисунке 2 , демонстрируют, что рассеивание индийских чернил происходило в основном рядом с экстраокулярными мышцами, на внешней поверхности склеры и периокулярными рыхлыми соединительными тканями (рисунок 2).
Самокомплементарный AAV8 успешно трансдуцирует роговицу и периокулярные мышцы после SCJ.
Чтобы определить профиль трансдукции самокомплементарного AAV8 через восемь недель после инъекции, обилие GFP во всех поперечных сечениях земного шара исследовали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антитела против GFP в разведении 1:500. Снимки были сделаны под флуоресцентным микроскопом (рисунок 3). Эти результаты показали, что векторы AAV, вводимые с помощью инъекции SCJ, эффективно трансдукируют периокулярные мышцы сзади глаза и роговицы.
Обильный векторный геном и трансгенная экспрессия в отдельных глазных компартментах после инъекции SCJ
Чтобы количественно проанализировать векторное биораспределение и трансгенную экспрессию, номера копий векторного генома в различных глазных компартментах и органах, таких как печень и сердце, были исследованы с помощью qPCR (рисунок 4A), в то время как экспрессия трансгена была проверена с помощью qRT-PCR (рисунок 4B). Эти результаты свидетельствуют о том, что инъекция SCJ AAV8 приводит к трансгенной экспрессии в веке, конъюнктиве, роговице и зрительном нерве.
Рисунок 1: Микроскопический вид введения вектора AAV в мышиное пространство SCJ. Чтобы обеспечить визуализацию образования блеба во время процедуры, 1% флуоресцеина непосредственно добавляли к векторному препарату AAV. Снимки были сделаны с помощью цифровой камеры, прикрепленной к стереомикроскопу. (A) Репрезентативное изображение неинъекционного глаза; (B) репрезентативное изображение введенного глаза. Стрелка указывает на введенный раствор AAV, содержащий флуоресцеин в пространстве SCJ. Сокращения: AAV = аденоассоциированный вирус; SCJ = субконъюнктивальный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Окрашивание H&E распределения индийских чернил (стрелка) после инъекции SCJ в глаз мыши. Представлены сагиттальные участки глаза, вводимые индийскими чернилами; 7 мкл индийских чернил вводили в указанное место. *, Место инъекции. Шкала бара = 500 мкм. Сокращения: SCJ = субконъюнктивальный; H&E = гематоксилин и эозин; С = роговица; I = радужная оболочка; L = линза; R = сетчатка; E = веко; H = Хардерова железа; M = мышца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные гистологические изображения GFP самокомплементарных AAV8 после инъекции SCJ. Трансдукция роговицы (А) и глазных мышц (В) после инъекции SCJ. Экспрессия GFP (зеленый) визуализировалась с помощью иммуноокрашивания в парафиновых срезах тканей антителом против GFP. Ядра были окрашены DAPI (синий). Шкала бар = 100 мкм (глазная мышца), 20 мкм (роговица). Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; AAV = аденоассоциированный вирус; SCJ = субконъюнктивальная; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Количественный анализ векторного биораспределения и трансгенной экспрессии. (A) Векторное биораспределение в глазных компартментах (веко, конъюнктива, роговица, зрительный нерв и сетчатка) и других органах (печень и сердце) после SCJ представлено в виде числа копий векторного генома / мкг ДНК генома хозяина. (B) Обилие GFP, определяемое qRT-PCR, представлено в виде векторного номера копии кДНК/транскрипта хозяина. Эта цифра изменена с 13. Сокращения: SCJ = субконъюнктивальный; qRT-PCR = количественная почитаемо-транскрипционная ПЦР; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AAV-опосредованная генная терапия обладает большим потенциалом для лечения глазных заболеваний. Современная глазная генная терапия опирается на два основных пути местного введения: интравитреальные и субретинальные инъекции. К сожалению, оба пути являются инвазивными и могут вызвать серьезные осложнения, включая отслоение сетчатки, образование катаракты и эндофтальмит. Таким образом, большой интерес представляет исследование относительно менее инвазивных путей, таких как инъекция SCJ.
Хотя этот метод является относительно простым и значительно менее инвазивным, есть несколько важных аспектов доставки AAV, которые необходимо выделить. Рекомендуется хранить вектор AAV при -80 °C в аликвотах желаемого объема (здесь 100 мкл) в силиконизированных или низкоудержающих микроцентрифужных трубках, чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания и предотвратить снижение титра вируса. Вектор, использованный в этом эксперименте, хранился при -80 °C в течение ~6 лет без значительной потери титра. Кроме того, состав транспортного средства может влиять на устойчивость вектора. В этом эксперименте вирусным носителем был PBS с 350 мМ NaCl + 5% D-сорбита. Титр вируса, использованного в этом исследовании, составлял 5,1 × 109 вг/мкл (определяемых qPCR), и в общей сложности вводили 7 × 109 вг/глаз. Тем не менее, диапазон 1 × 108-1 × 1010 vg / глаз является подходящим, в зависимости от целевой ткани и трансгена.
Инъекции SCJ относительно менее ограничительны в отношении вводимого объема (1-100 мкл для мыши). Тем не менее, считается, что различия в объеме играют роль в биораспределении и трансдукции AAV, и, как сообщается, большие объемы инъекций были использованы для создания модели27 конъюнктивального рубцевания. Одним из важных аспектов является сосудистая природа конъюнктивы, которая может привести к существенному системному клиренсу вектора AAV, что приводит к генерации нейтрализующих антител к вектору AAV. Текущие исследования активно изучают потенциальные стратегии снижения системного клиренса терапевтических векторов AAV.
Кроме того, распределение in vivo после инъекции SCJ является критическим соображением для потенциального применения этого пути впрыска. В текущем протоколе распределение исследуется с помощью красителя (индийских чернил) в один момент времени, а не в несколько временных точек или в режиме реального времени. Хотя эти данные дают некоторое представление о том, как раствор вектора AAV распространяется сразу после инъекции, распределение и кинетические свойства вектора AAV и других веществ могут значительно изменяться с течением времени. Хотя биораспределение вектора AAV было обнаружено в различных глазных компартментах с помощью qPCR, как упоминалось в предыдущем разделе методов в экспериментальной конечной точке, в идеале будет использоваться метод, который мог бы контролировать трафик терапевтических реагентов по всему глазу в режиме реального времени; однако на практике это часто является сложной задачей. Наконец, профиль трансдукции AAV, наблюдаемый у мышей после инъекции SCJ, может отличаться в глазах человека из-за очевидных размеров, анатомических и физиологических различий между глазом мыши и человеческим глазом.
Заболевания сетчатки также являются основной мишенью генной терапии28; таким образом, определение того, может ли AAV, вводимый с помощью инъекции SCJ, достичь тканей сетчатки, заслуживает дальнейшего изучения 13,17,29. Предыдущие исследования показали, что наночастицы, вводимые с помощью инъекций SCJ, могут достигать внутренней сетчатки. Однако конкретные пути торговли людьми неясны. Данные о распределении индийских чернил (рисунок 2) показывают, что большая часть раствора распространяется в периокулярные соединительные ткани, что указывает на то, что AAV может достигать внутренней сетчатки через периокулярное проникновение, проникая в склеру, сосудистую оболочку и пигментированный эпителий сетчатки.
Данные о трансдукции роговицы, представленные на рисунке 3A , свидетельствуют о том, что AAV, введенный в пространство SCJ, может проникать в склеру и роговицу. Это также говорит о том, что введение AAV через инъекцию SCJ может достигать передней камеры или даже задней и стекловидной камер, хотя для достижения желаемых эффектов в сетчатке30 может потребоваться значительно более высокая доза. Тем не менее, инъекция SCJ является одним из самых простых способов введения в глаза и имеет большие перспективы для доставки AAV для лечения множественных глазных заболеваний, включая, но не ограничиваясь, заболеваниями глазной поверхности, такими как дефицит лимбальных стволовых клеток, болезнь сухого глаза и / или заболевания глазных мышц, такие как мышечная дистрофия глазной железы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы благодарят Vector Core в Университете Северной Каролины за предоставление векторов scAAV8-GFP, используемых в этом исследовании, CGIBD Histology Core и лаборатории доктора Брайана С. Гилгера за их помощь в аспектах клинической оценки этого исследования. Это исследование было поддержано Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship и премией за развитие карьеры от Американского общества генной и клеточной терапии и Фонда муковисцидоза. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Американского общества генной и клеточной терапии или Фонда муковисцидоза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K.
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S.
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
