Summary
We presenteren een protocol voor de isolatie en bevriezing van extracellulaire blaasjes (EV's) afkomstig van kankerachtige urotheelcellen. De freeze-fracture-techniek onthulde de diameter en vorm van de EV's en - als een uniek kenmerk - de interne organisatie van de EV-membranen. Deze zijn van immens belang om te begrijpen hoe EV's interageren met de membranen van de ontvanger.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraanbeperkte structuren die uit de cellen in de extracellulaire ruimte vrijkomen en zijn betrokken bij intercellulaire communicatie. EV's bestaan uit drie populaties blaasjes, namelijk microvesicles (MV's), exosomen en apoptotische lichamen. Het beperkende membraan van EV's is cruciaal betrokken bij de interacties met de ontvangende cellen, wat kan leiden tot de overdracht van biologisch actieve moleculen naar de ontvangende cellen en bijgevolg hun gedrag kan beïnvloeden. De freeze-fracture elektronenmicroscopietechniek wordt gebruikt om de interne organisatie van biologische membranen te bestuderen. Hier presenteren we een protocol voor MV-isolatie van gekweekte kankerachtige urotheelcellen en de vriesfractuur van MV's in de stappen van snel bevriezen, breken, het maken en reinigen van de replica's en het analyseren ervan met transmissie-elektronenmicroscopie. De resultaten tonen aan dat het isolatieprotocol een homogene populatie ev's oplevert, die overeenkomen met de vorm en grootte van MV's. Intramembraandeeltjes worden voornamelijk aangetroffen in het protoplasmatische oppervlak van het limiterende membraan. Daarom is freeze-fracture de techniek bij uitstek om de diameter, vorm en distributie van membraaneiwitten van de MV's te karakteriseren. Het gepresenteerde protocol is van toepassing op andere populaties ev's.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraanbeperkte blaasjes die uit cellen vrijkomen in de extracellulaire ruimte. De drie belangrijkste populaties van EV's zijn exosomen, microvesicles (MV's) en apoptotische lichamen, die verschillen in hun oorsprong, grootte en moleculaire samenstelling 1,2,3. De samenstelling van EV's weerspiegelt het moleculaire profiel van de donorcel en zijn fysiologische status (d.w.z. gezond of ziek)4,5. Dit geeft EV's een enorm potentieel in de diagnose, prognose en therapie van menselijke ziekten, en ze hebben veelbelovende medische toepassingen voor het gebruik in gepersonaliseerde geneeskunde 6,7,8.
EV's zijn bemiddelaars van intercellulaire communicatie. Ze bevatten biologisch actieve eiwitten, lipiden en RNA's, die interfereren met biologische processen in de ontvangende cel en het gedrag ervan kunnen veranderen 9,10. De samenstelling van het EV-beperkende membraan is echter cruciaal voor de interactie met het ontvangende celmembraan.
De bronnen van EV's zijn lichaamsvloeistoffen en geconditioneerde kweekmedia. Om een EV-populatie te isoleren, moet een geschikte isolatietechniek worden gebruikt. Centrifugatie bij 10.000 × g levert bijvoorbeeld een fractie op die verrijkt is in MV's, terwijl centrifugale krachten van ≥ 100.000 × g een fractie opleveren die verrijkt is met exosomen11,12. De geïsoleerde fractie van EV's moet worden gevalideerd in termen van zuiverheid, grootte en vorm. Daartoe heeft de International Society for Extracellular Vesicles 2018 drie klassen van beeldvormingstechnieken met hoge resolutie aanbevolen: elektronenmicroscopie, atoomkrachtmicroscopie en op lichtmicroscopie gebaseerde superresolutiemicroscopie13. Geen van deze technieken kan informatie geven over het EV-membraaninterieur.
Freeze-fracture elektronenmicroscopie is een techniek om bevroren monsters te breken om hun interne structuren te onthullen, met name door een beeld te geven van het binnenste van het membraan. De stappen van monstervoorbereiding zijn (1) snel invriezen, (2) breken, (3) het maken van de replica en (4) het schoonmaken van de replica14. In stap 1 wordt het monster (optioneel) chemisch gefixeerd, gecryoprotecteerd met glycerol en ingevroren in vloeibaar freon. In stap 2 wordt het bevroren monster gebroken in een vriesbreukeenheid, die het binnenste van de membraanbilaag blootlegt. In stap 3 worden de blootgestelde gebroken gezichten overschaduwd met platina (Pt) en koolstof (C) om replica's te produceren. In stap 4 wordt het organisch materiaal verwijderd. De replica wordt geanalyseerd in de transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Voor een nauwkeurige interpretatie van de microfoto's moet men richtlijnen volgen voor hun juiste oriëntatie14,15. In het kort is de richting van schaduwen in de micrograaf een verwijzing om de micrograaf te oriënteren (d.w.z. om de richting van Pt-schaduwen te bepalen) en bijgevolg om bolle en concave vormen te bepalen (figuur 1). Twee inwendige weergaven die gebroken vlakken van de membraanbilaag worden genoemd, kunnen worden gezien als een gevolg van het splitsen van het membraan door bevriezingsfracturering: het protoplasmatische gezicht (P-gezicht) en het exoplasmatische gezicht (E-face). Het P-vlak vertegenwoordigt de membraanfolder naast het celprotoplasma, terwijl de E-face de membraanfolder naast de extracellulaire ruimte vertegenwoordigt. Integrale membraaneiwitten en hun associaties worden gezien als uitstekende intramembraandeeltjes14,15.
Hier is het doel om de freeze-fracture-techniek toe te passen om MV's te karakteriseren in termen van grootte, vorm en de structuur van hun beperkende membraan. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie en bevriezing van MV's afkomstig van menselijke invasieve blaaskanker urotheelcellen.
Protocol
1. Kweken van kankerachtige urotheelcellen en isolatie van EV's
OPMERKING: Een protocol voor het verkrijgen van EV's van een humane invasieve blaaskanker urotheliale (T24) cellijn wordt gepresenteerd. De kweekomstandigheden moeten echter worden geoptimaliseerd om andere celtypen te gebruiken.
- Plaat T24 cellen met een dichtheid van 3 × 104 cellen/cm2 in drie kolven (groeioppervlak van 75 cm2) en begin met het kweken van de cellen in een CO2 incubator gedurende 3 dagen bij 37 °C en een 5% CO2 (figuur 2A).
- Gebruik een kweekmedium voor T24-cellen in een 1:1 (v/v) mengsel van A-DMEM en F12 aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 4 mM Glutamax, 100 mg/ml streptomycine en 100 U/ml penicilline.
OPMERKING: De volgende isolatie levert EV's op die zijn verrijkt met MV's. Voordat u met de isolatie begint, inspecteert u de cellen met een lichtmicroscoop om de levensvatbaarheid en samenvloeiing te bevestigen (figuur 2B). Begin met het verzamelen van de EV's uit de geconditioneerde kweekmedia wanneer de T24-cellen zich op 70% confluentie bevinden.
- Gebruik een kweekmedium voor T24-cellen in een 1:1 (v/v) mengsel van A-DMEM en F12 aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 4 mM Glutamax, 100 mg/ml streptomycine en 100 U/ml penicilline.
- Verzamel het kweekmedium met MV's met een pipet uit kolven (T75) in conische centrifugebuizen (figuur 2C). Centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C (figuur 2D).
- Verzamel het supernatant voorzichtig in een nieuwe centrifugebuis met de pipet (figuur 2E).
- Centrifugeer het supernatant bij 2.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Verzamel het supernatant voorzichtig met de pipet in een nieuwe centrifugebuis.
- Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 40 minuten bij 4 °C. Zoek naar de aanwezigheid van een witachtige pellet aan de onderkant van de buis.
OPMERKING: Vervang indien nodig de rotor van de centrifuge om de vereiste g-kracht te bereiken. De EV-pellet wordt gezien als een witte pellet op de bodem van de centrifugebuis (figuur 2F); markeer de locatie om te voorkomen dat de pellet verloren gaat tijdens het pipetteren (figuur 2G). - Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet. Voeg aan de pellet 1,5 ml PBS toe en resuspendeer de pellet met MV's. Plaats de suspensie in een nieuwe centrifugebuis.
- Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 40 minuten bij 4 °C en zoek naar de aanwezigheid van een witte pellet aan de onderkant van de buis.
OPMERKING: De EV-pellet wordt gezien als een witte vlek aan de onderkant van de centrifugebuis; markeer de locatie om te voorkomen dat de pellet verloren gaat tijdens het pipetteren. - Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet. Voeg voorzichtig het fixeermiddel 2,5% glutaaraldehyde toe in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,2). Laat 20 minuten staan bij 4 °C (figuur 2H).
LET OP: Glutaaraldehyde en natriumcacrodronisatie zijn giftig. Werk in een zuurkast, draag beschermende handschoenen en gooi ze op de juiste manier weg. - Verwijder het fixeermiddel voorzichtig met een pipet. Voeg de wasbuffer (0,1 M natriumcacrodaatbuffer) toe aan de pellet. Laat 10 minuten bij 4 °C staan zonder de pellet te resuspenderen.
2. Bevriezing van EV's
OPMERKING: Voor het invriezen, eerst cryoprotect de monsters met glycerol.
- Bereid 0,1 M natriumcacodylaatbuffer voor. Verwijder de wasbuffer en voeg 50 μL 30% glycerol toe aan 0,1 M cacodylaatbuffer. Resuspendeer de EV's voorzichtig om de oplossing homogeen te maken. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Reinig de koperen dragers met een centrale put in het ultrasone bad met chloroform gedurende 5 minuten (figuur 3A). Droog ze aan de lucht en markeer ze met kleuren als je meerdere monsters gebruikt (figuur 3B). Bewaar de dragers tot gebruik op een droge, schone plaats (bijvoorbeeld op lenspapier in een petrischaaltje). Raak de dragers niet met blote handen aan.
- Pipetten, oplossingen, filterpapier, pincet, een stereomicroscoop, een Dewar-kolf met freon en vloeibare stikstof (LN2), een metalen staaf en cryovialen. Koel het af met LN2.
LET OP: Draag beschermende uitrusting en werk dienovereenkomstig bij het hanteren van LN2 en gekoeld freon.
- Pipetten, oplossingen, filterpapier, pincet, een stereomicroscoop, een Dewar-kolf met freon en vloeibare stikstof (LN2), een metalen staaf en cryovialen. Koel het af met LN2.
- Resuspend de EV's opnieuw voordat ze bevriezen. Vermijd de vorming van luchtbellen.
OPMERKING: Voer stappen 2.4-2.7 snel uit. - Werk onder een stereomicroscoop (figuur 3C). Breng 1,5-1,7 μL van het monster over in de centrale put van de koperdrager om een bolle druppel te maken die hoger reikt dan de koperen dragerrand zonder het monster over de rand te morsen (figuur 3D). Gebruik in geval van overspill filterpapier om de buitenste ring van de drager te drogen.
- Meng gestold freon met een metalen staaf om het opnieuw vloeibaar te maken (figuur 3E).
- Pak de buitenste ring van de koperen drager vast met een pincet en dompel deze onder in gekoeld freon met een zacht schudden van een pincet gedurende 8 s (figuur 3F). Na 8 s zet u de drager snel over in een andere Dewar-kolf gevuld met LN2.
- Ga onmiddellijk verder met het breken of opslaan van de monsters in LN2. Markeer in het laatste geval een cryoviaal en koel de injectieflacon en pincetpunten af door ze onder te dompelen in LN2 (figuur 3G). Verzamel onder LN2 bevroren koperen dragers in de injectieflacon, sluit deze en bewaar ze in de LN2-container (figuur 3H) totdat u de breuk invriest.
3. Fracking van EV's en het maken van de replica's
OPMERKING: Bereid de vriesbreekeenheid voor volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. (Figuur 4A). Reinig de kamer van het apparaat. Plaats platina (Pt/C) en carbon (C) kanonnen onder een hoek van respectievelijk 45° en 90° (figuur 4B).
- Start het unitvacuümsysteem. Wanneer een druk van 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) is bereikt, koelt u de unitkamer af tot −150 °C.
- Breng de koperen dragers met bevroren monsters over in een vriesbreekeenheid met behulp van een droog pincet (figuur 4C). Gebruik cryotransfer of werk snel om te voorkomen dat het monster en de afzetting van de ijskristallen ontdooien. Bevestig de dragers op de monstertafel.
- Wacht tot het vacuüm weer 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) bereikt en stel vervolgens de mestemperatuur in op −100 °C (figuur 4D).
- Wacht tot het vacuüm 1,0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr) bereikt.
- Observeer het monster met een verrekijker en benader het mes zorgvuldig (figuur 4E).
- Begin met het doorsnijden van het monster door de gemotoriseerde beweging van het mes in te schakelen (figuur 4F) en sectie totdat het oppervlak van het monster glad is (figuur 4G).
- Schakel voor het breken de gemotoriseerde beweging van het mes uit en ga verder met langzame handmatige bediening van het mes, waardoor het monster wordt gebroken (figuur 4H). Om het gebroken oppervlak te beschermen tegen het vormen van ijskristallen en puin totdat het schaduwt, beweegt u het mes boven het gebroken monster.
- Ga verder met de Pt-schaduw op 45° (figuur 4I, J).
- Bereid een stopwatch voor en/of zet de kwartskristalmonitor op de vriesbreekeenheid aan, zodat toezicht kan worden gehouden op de dikte van de Pt op het monster. De aanbevolen dikte van de Pt-laag zoals gemeten op de kwartskristalmonitor is 2,5 nm, wat overeenkomt met 4 s schaduwvorming bij een bepaalde hoge spanning en stroom (d.w.z. de snelheid van Pt-schaduw is 0,63 nm / s).
- Voordat u met schaduwen begint, verplaatst u het mes uit de buurt van het monster. Breng hoge spanning aan op het Pt/C-pistool (1.600 V) en verhoog de stroom tot 60 mA. Vonken van Pt moeten verschijnen en moeten het monster beginnen te schaduwen. Start op dit punt het aftellen van 4 s en /of observeer en lokaliseer de positie van Pt op de kwartskristalmonitor.
OPMERKING: De aanbevolen dikte van de C-laag is 2,5 nm, wat overeenkomt met 10 s schaduw bij een bepaalde hoge spanning en stroom. - Schakel de stroom en hoge spanning uit wanneer de gewenste dikte van Pt is verkregen.
- Ga verder met de C-schaduw op 90 ° (d.w.z. de snelheid van C-schaduwen is 0,25 nm / s).
- Breng hoge spanning aan op het C-pistool (1.900 V), verhoog de stroom tot 90 mA en vonken van C moeten verschijnen en het monster beginnen te schaduwen; begin op dat moment met het aftellen van 10 s. Schakel de stroom en hoge spanning uit wanneer de gewenste dikte van C is verkregen.
4. Het reinigen van de replica's en replica-analyse
- Gebruik de koperen dragers uit de monstertafel en breng ze met een pincet over op gedestilleerd water bij kamertemperatuur in een porseleinen 12-well plaat (figuur 4K). De replica's drijven op het wateroppervlak, terwijl de dragers zinken (figuur 4L).
- Breng de replica's met een draadlus van gedestilleerd water over in een put met natriumhypochloriet. Dek af en laat een nacht op kamertemperatuur in een zuurkast.
LET OP: Natriumhypochloriet is giftig. Werk in een zuurkast, draag beschermende handschoenen en gooi ze op de juiste manier weg. - Breng de replica's over naar ddH2O en was gedurende 30 minuten. Herhaal dit 3 keer.
- Breng de replica's met een draadlus over naar een gaas koperEN TEM-rooster (bijv. Vierkant of honingraat 100+ gaas). Droog de roosters 2 uur aan de lucht en bewaar ze vervolgens in een roosteropslagdoos tot microscopie.
OPMERKING: Over het algemeen kunnen roosters maandenlang worden opgeslagen in donkere, droge omstandigheden bij kamertemperatuur. - Gebruik een TEM-microscoop om de replica's in beeld te brengen en microfoto's te verkrijgen.
- Om dit te doen, plaatst u een TEM-raster met een replica en start u de TEM-beeldvorming volgens de bedieningshandleidingen van de fabrikant. Werk bij 80 kV of 100 kV.
- Inspecteer het monster en verkrijg microfoto's bij lagere en hogere vergrotingen met een camera op TEM.
- Analyseer de microfoto's van de MV's. Gebruik voor metingen van de MV-diameters Fiji/ImageJ-software16. De diameter van MV's is 4/π maal de meting op de microfoto's volgens Hallett et al.17.
Representative Results
MV's werden geïsoleerd uit het geconditioneerde medium van kankerurotheliale T24-cellen na differentiële centrifugaties. Volgens het protocol werd de EV-fractie voor het eerst gedetecteerd na centrifugatie bij 10.000 × g toen het werd gezien als een witte pellet (figuur 2G).
Vervolgens werden de EV's verwerkt volgens het bovenstaande protocol en onderzocht onder TEM. Pt/C shadowing produceerde (figuur 4L) relatief grote replica's die tijdens de reinigingsstap vaak in kleinere fragmenten uiteenvielen. Grote replica's en hun kleinere fragmenten werden op het TEM-raster geplukt en onder de microscoop vergeleken. De resultaten toonden geen verschillen in de kwaliteit van de replica-oppervlakken, ongeacht hun grootte, en ze kunnen daarom allemaal worden gebruikt. Lage vergrotingsonderzoeken toonden gebieden van de replica met i) een homogeen oppervlak (achtergrond), ii) concave en convexe bolvormige profielen (blaasjes) en iii) gebieden van beschadigd oppervlak (artefacten; Figuur 5A). Typische artefacten werden gezien als breuken, plooien en onregelmatige dimmerschaduwen (d.w.z. replica's van ijskristalafzettingen op het specimen). Het is ook belangrijk op te merken dat er geen celresten of cellulaire organellen werden gezien, wat de zuiverheid van het monster bevestigt (figuur 5B).
De geïsoleerde blaasjes werden gewoonlijk verzameld in clusters van drie of meer of werden individueel verdeeld (figuur 5B). De blaasjes waren bolvormig, wat wijst op een goed behoud van de ultrastructuur tijdens isolatie, fixatie en bevriezing (figuur 5C). "Platte bal" en langwerpige blaasjes (figuur 5C), die af en toe werden gezien, waren vermoedelijk artefacten van voorbereiding en werden niet opgenomen in de daaropvolgende metingen van de diameter van blaasjes. De diameter van de zichtbare profielen was 238,5 nm (±8,0 nm, n = 190), wat, rekening houdend met de door Hallett et al.17 voorgestelde correctiefactor, overeenkomt met de gemiddelde blaasjesdiameter van 304 nm (±10 nm; Figuur 5D). De grootte correleert met een diameterbereik van MV's tussen 100 nm en 1000 nm en bewijst de effectiviteit van het gebruikte isolatieprotocol. De beelden van de blaasjes samen met de diameterbepaling bevestigden ondubbelzinnig dat de EV's in het isolaat verrijkt waren met MV's.
De analyse van de replica's onthulde de organisatie van P-face en E-face van de MV-beperkende membranen. MV's werden waargenomen als concave en bolle ronde vormen (figuur 5C, E, F), die het breukvlak weerspiegelen. De bolle vormen vertegenwoordigen E-gezichten (d.w.z. gebroken exoplasmatische folder van de membranen; Figuur 5E). De exoplasmatische gezichten van de EV's hadden een glad, uniform uiterlijk. De concave vormen komen overeen met P-vlakken (figuur 5F). In de P-vlakken werden enkele uitstekende intramembraandeeltjes gezien in gladde membranen (figuur 5C,F). Dit impliceert dat MV's geïsoleerd uit kankerurotheliale T24-cellen slechts een lage hoeveelheid membraaneiwitten bevatten.
Figuur 1: Schematische presentatie van membraanbepaling na bevriezingsfracturering. (A) Microvesicles knopen van het plasmamembraan naar de extracellulaire ruimte. (B) Microvesicle is beperkt met P- en E-membraanfolder tot vriesfractionering, die de folders splitst en de binneninaanzichten van folders blootlegt, gebroken gezichten genoemd. (C) Na Pt/C-schaduw zijn twee gebroken vlakken waarneembaar: het protoplasmatisch vlak (P-vlak) met een bolle vorm tegenover het cytoplasma (protoplasma) en een exoplasmatisch vlak (E-face) met een concave vorm tegenover de extracellulaire ruimte. Figuur 1 is gemaakt met behulp van Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Isolatie van EV's. (A) T24-cellen gekweekt in een CO2-incubator worden onderzocht met (B) een lichtmicroscoop om hun levensvatbaarheid en samenvloeiing vóór MV-isolatie te bevestigen. (C) Het celkweekmedium wordt verzameld en (D) achtereenvolgens gecentrifugeerd bij 300 × g en bij 2.000 × g (E) telkens wanneer het supernatant wordt verzameld. (F,G) Na de centrifugatie bij 10.000 × g is een witte vlek die een pellet aangeeft zichtbaar en gemarkeerd. Het supernatant wordt verwijderd en (H) fixatief wordt voorzichtig aan de pellet toegevoegd zonder het te resuspenderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Invriezen van EV's. (A) Aan de lucht gedroogde schone koperen dragers met een centrale put worden (B) vóór verwerking gemarkeerd. Microvesicles worden geresuspendeerd in glycerol om een homogeen monster te krijgen en (C) toegevoegd aan een centrale put van een cooper carrier onder een stereomicroscoop. (D) Men moet een volume van het monster toevoegen dat het een bolle druppel in de centrale put vormt. (E) Meng vlak voor het invriezen LN2-gekoeld freon met een metalen staaf om het freon vloeibaar te maken. (F) Vries het monster in door het onder te dompelen in freon en breng het vervolgens (G) over in LN2. (H) Dragers met het ingevroren monster kunnen worden verzameld in cryovialen en worden opgeslagen in een LN2 Dewar-container. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Freeze-fracturing en het maken van een replica. (A) Freeze-fracturing unit. In de eenheidskamer (B) bevindt zich een platina (Pt) en koolstof (C) elektronenkanon, een mes en de monstertabel. (C) Om met het breken te beginnen, worden dragers met het monster overgebracht naar de monstertabel, (D) de vriesbreekeenheid wordt gekoeld en er wordt een vacuüm ingesteld. (E) Secties worden gedaan door gemotoriseerde (F) beweging van het mes, maar het breken gebeurt bij voorkeur handmatig. (G) Monster vóór het snijden en (H) na het breken. (I) Onmiddellijk na het breken wordt de replica gemaakt. (J) Tijdens dit proces wordt Pt op het monster geschaduwd. Platina schaduwen wordt gezien als een helder licht (vonken) in de kamer. (K) Monsterdragers worden verzameld in een porseleinen put gevuld met water. (L) Replica (pijl) die tijdens de reinigingsstap in de natriumhypochlorietoplossing drijft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Elektronenmicrografieën van freeze-fractured en Pt/C shadowed MV's. (A) Een overzicht van de freeze-fractured en shadowed EV pellet (i) bij lagere vergroting. Het homogene oppervlak is achtergrond (ii), heldere gebieden zijn breuken in de replica's (iii), donkere gebieden zijn plooien van replica's (asterisk) en onregelmatige dimmer schaduwen zijn te wijten aan ijskristallen (twee sterretjes). (B) Cluster van ronde EV's met concave en bolle oppervlakken. (C) Hoge vergroting van EV's. In convexe fracturen, die P-gezicht van de EV-membranen vertonen, worden intramembraandeeltjes (pijlen) en vlekken van een glad oppervlak (pijlpunten) gezien. Extracellulaire blaasjes met langwerpige (ster) en platte bolvormen (twee sterren) worden gevonden. (D) De gemiddelde diameter van geïsoleerde urotheliale MV's is 304 nm ± 10 nm volgens de groottemetingen zoals voorgesteld door Hallett et al.17. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. (E,F) E-face en P-face van MV's. Legenda: pijlen = intramembraandeeltjes in P-vlak, omcirkelde pijlen = de richting van Pt/C-schaduw. Schaalstaven: A = 10 μm, B-F = 400 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De karakterisering van MV's, of een andere populatie van geïsoleerde EV's, is van het grootste belang om mee te beginnen voordat downstream-analyses zoals "omics" -studies of functionele studies worden gestart11,18. Hierin werden EV's van humane invasieve blaaskanker urotheliale T24-cellen geïsoleerd door centrifugatie, en volgens het meegeleverde protocol voor analyse door vriesfractuurelektronenmicroscopie, toonden we aan dat de geïsoleerde fractie was verrijkt in MVs11,13. Het isolaat van MV's was verstoken van celresten of organellen, wat een succesvol isolatie- en zuiveringsprotocol bevestigt.
De combinatie van chemische fixatie en bevriezing, die kritieke stappen van het protocol zijn, behield de bolvorm van de EV's12. Er zijn echter voorzorgsmaatregelen nodig bij het beoordelen van de EV-diameter door bevriezingsfracturering17. Omdat de breuk willekeurig door het monster gaat, worden MV-membranen gesplitst in hun equatoriale en niet-equatoriale vlakken. Om een rigoureuze methode te bieden voor het analyseren van de beelden van bevroren en beschaduwde exemplaren, toonden Hallett et al. aan dat de gemiddelde blaasjesdiameter 4/π keer de werkelijke grootte van de vesiculaire diameter op de afbeelding is17. Daarmee rekening houdend, werden EV's van T24-cellen berekend met een diameter van 304 nm, wat past in het theoretische grootteverdelingsbereik van de MV van 100-1000 nm19.
Freeze-fracturing kan negatieve kleuring aanvullen, de meest gebruikte TEM-techniek om EV's te visualiseren. Door negatieve kleuring wordt het monster gewoonlijk chemisch gefixeerd, gedroogd en bevestigd aan een TEM-rooster en gecontrasteerd met uranyloplossing. Zonder ondersteunende media hebben EV's de neiging om in te storten, waardoor ze een bekervormig uiterlijk krijgen. Door freeze-fracturing laten we zien dat MV's bollen zijn, die hun vorm weerspiegelen in extracellulaire ruimtes en lichaamsvloeistoffen12. Daarmee komen onze resultaten ook overeen met waarnemingen van EV's in cryo-ultradunne secties20.
Een cruciaal voordeel van de freeze-fracture-techniek is de kracht om de interne organisatie van het beperkende membraan op te lossen, wat een belangrijke factor is bij het begrijpen hoe EV's worden gericht op en interageren met ontvangende membranen. Hier analyseerden we de membranen van MV's, maar freeze-fracturing zou de membraanorganisatie van elke andere populatie EV's kunnen onthullen. MV's worden gevormd door plasmamembraan ontluiken; daarom wordt verwacht dat plasmamembraaneiwitten en eiwitclusters in het MV-membraan zullen worden aangetroffen. Onze resultaten ondersteunden dat de MV's van T24-cellen intramembraandeeltjes bevatten, die integrale membraaneiwitten presenteren. Op basis van de deeltjesverdeling tussen de E-face en P-face is het redelijk om te verwachten dat de deeltjes die in MV's worden waargenomen transmembraaneiwitten uroplakinen zijn, die urotheelcelspecifiekzijn 21,24. De waargenomen deeltjes waren schaars, wat in overeenstemming is met eerdere studies die een vermindering van uroplakinen tijdens urotheliale carcinogenese 21,22,23 rapporteerden. Om de eiwitsamenstelling van MV-membranen verder te onderzoeken, wordt echter het gebruik van de freeze-fracture replica immune-labeling (FRIL) -techniek aanbevolen. FRIL is een upgrade van de gepresenteerde freeze-fracture techniek en is gewijd aan het onthullen van de identiteit van eiwitten in replica's door antilichaamherkenning24,25. Kortom, de freeze-fracture-techniek is een elektronenmicroscopietechniek die geschikt is voor de karakterisering van het EV-beperkende membraan, evenals de vorm, grootte en zuiverheid van de geïsoleerde EV-fracties. Het gepresenteerde protocol kan ook worden gebruikt voor de beoordeling van andere populaties van geïsoleerde EV's; daarom verdient de freeze-fracturing-techniek opname in de richtlijnen van de International Society for Extracellular Vesicles voor studies die de organisatie van EV-beperkende membranen onderzoeken.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Sloveense onderzoeksbureau (research core funding no. P3-0108 en project J7-2594) en het MRIC UL IP-0510 Infrastructuur programma. Dit werk draagt bij aan de COST-actie CA17116 International Network for Translating Research on Perinatal Derivatives into Therapeutic Approaches (SPRINT), ondersteund door COST (European Cooperation in Science and Technology). De auteurs willen Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič en Sabina Železnik bedanken voor technische hulp bij het kweken van cellen en het voorbereiden van de monsters en Marko Vogrinc, Ota Širca Roš en Nejc Debevec voor technische hulp bij het voorbereiden van de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-DMEM | ThermoFisher Scientific, USA | 12491015 | |
| Balzers freeze-fracture device | Balzers AG, Liechtenstein | Balzers BAF 200 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | model 5810R | |
| CO2 incubator HeraCell | Heraues, Germany | ||
| Copper carriers | Balzers | BB 113 142-2 | 100+ mesh |
| Copper grids | SPI, United States | 2010C | |
| Culture flask T75 | TPP, Switzerland | growing surface 75 cm2 | |
| F12 (HAM) | Sigma-Aldrich, Germany | 21765029 | |
| FBS | Gibco, Life Technologies, USA | 10500064 | |
| Glazed Porcelain Plate 6 Well | Fischer Sientific, United States | 50-949-072 | |
| Glycerol | Kemika, Croatia | 711901 | final concentration 30 % (v/v) |
| Glutaradehyde | Serva, Germany | 23114.01 | final concentration 2.5 % (v/v) |
| GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 35050-079 | final concentration 4 mM |
| Penicillin | Gibco, Life Technologies | 15140163 | final concentration 100 U/ml |
| Phase-contast inverted microscope | Nikon, Japan | model Eclipse | |
| Rotor | Eppendorf, Germany | A 4-44 | |
| Rotor | Eppendorf, Germany | F-34-6-38 | |
| Serological pipetts | TPP, Switzerland | 50mL volume | |
| Sodium hypochloride solution in water | Carlo Erba, Italy | 481181 | |
| Stereomicroscope | Leica, Germany | ||
| Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 35050038 | final concentration 100 mg/mL |
| Transmission electron microscope | Philips, The Netherlands | model CM100 | working at 80 kV |
| Tweezers | SPI, United States |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Willms, E., Cabanas, C., Mager, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Cocucci, E., Racchetti, G., Meldolesi, J. Shedding microvesicles: Artefacts no more. Trends in Cell Biology. 19 (2), 43-51 (2009).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 29-39 (2020).
- Tricarico, C., Clancy, J., D'Souza-Schorey, C. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
- Georgantzoglou, N., Pergaris, A., Masaoutis, C., Theocharis, S. Extracellular vesicles as biomarkers carriers in bladder cancer: Diagnosis, surveillance, and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2744 (2021).
- Słomka, A., Urban, S. K., Lukacs-Kornek, V., Żekanowska, E., Kornek, M. Large extracellular vesicles: Have we found the holy grail of inflammation. Frontiers in Immunology. 9, 2723 (2018).
- Han, L., Lam, E. W. F., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: Old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., Clancy, J. W., Sedgwick, A., D'Souza-Schorey, C. Microvesicles: Mediators of extracellular communication during cancer progression. Journal of Cell Science. 123, 1603-1611 (2010).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Severs, N. J.
- Severs, N. J., Robenek, H.
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Hallett, F. R., Nickel, B., Samuels, C., Krygsman, P. H. Determination of vesicle size distributions by freeze-fracture electron microscopy. Journal of Electron Microscopy Technique. 17 (4), 459-466 (1991).
- Nigro, A., et al. Selective loss of microvesicles is a major issue of the differential centrifugation isolation protocols. Scientific Reports. 11, 3589 (2021).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1153 (2017).
- Iliev, D., et al. Stimulation of exosome release by extracellular DNA is conserved across multiple cell types. The FEBS Journal. 285 (16), 3114-3133 (2018).
- Zupančič, D., Zakrajšek, M., Zhou, G., Romih, R. Expression and localization of four uroplakins in urothelial preneoplastic lesions. Histochemistry and Cell Biology. 136 (4), 491-500 (2011).
- Wu, X. R., Manabe, M., Yu, J., Sun, T. T. Large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins I, II, and III. Molecular markers of urothelial differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 19170-19179 (1990).
- Kreft, M. E., Hudoklin, S., Jezernik, K., Romih, R. Formation and maintenance of blood-urine barrier in urothelium. Protoplasma. 246 (1-4), 3-14 (2010).
- Kreft, M. E., Robenek, H. Freeze-fracture replica immunolabelling reveals urothelial plaques in cultured urothelial cells. PLoS One. 7 (6), 38509 (2012).
- Robenek, H., et al. Topography of lipid droplet-associated proteins: Insights from freeze-fracture replica immunogold labeling. Journal of Lipids. 2011, 409371 (2011).
