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Cancer Research

बाह्य पुटिका विश्लेषण के लिए फ्रीज-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/63550
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Medicine, Institute of Cell Biology, University of Ljubljana

Summary

हम कैंसर यूरोथेलियल कोशिकाओं से उत्पन्न बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) के अलगाव और फ्रीज-फ्रैक्चरिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक ने ईवी के व्यास और आकार का खुलासा किया और एक अनूठी विशेषता के रूप में- ईवी झिल्ली के आंतरिक संगठन। ये समझने में बहुत महत्वपूर्ण हैं कि ईवी प्राप्तकर्ता झिल्ली के साथ कैसे बातचीत करते हैं।

Abstract

बाह्य पुटिकाएं (ईवीएस) कोशिकाओं से बाह्य अंतरिक्ष में जारी झिल्ली-सीमित संरचनाएं हैं और अंतरकोशिकीय संचार में फंसी हुई हैं। ईवीएस में पुटिकाओं की तीन आबादी होती है, अर्थात् माइक्रोवेसिकल्स (एमवी), एक्सोसोम और एपोप्टोटिक निकाय। ईवीएस की सीमित झिल्ली महत्वपूर्ण रूप से प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के साथ बातचीत में शामिल होती है, जिससे प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में जैविक रूप से सक्रिय अणुओं का हस्तांतरण हो सकता है और परिणामस्वरूप, उनके व्यवहार को प्रभावित किया जा सकता है। फ्रीज-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग जैविक झिल्ली के आंतरिक संगठन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यहां, हम सुसंस्कृत कैंसर यूरोथेलियल कोशिकाओं से एमवी अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और तेजी से ठंड, फ्रैक्चरिंग, प्रतिकृतियां बनाने और साफ करने और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ उनका विश्लेषण करने के चरणों में एमवी के फ्रीज-फ्रैक्चर। परिणाम बताते हैं कि अलगाव के लिए प्रोटोकॉल ईवीएस की एक समरूप आबादी पैदा करता है, जो एमवी के आकार और आकार के अनुरूप होता है इंट्रामेम्ब्रेन कण मुख्य रूप से सीमित झिल्ली के प्रोटोप्लाज्मिक चेहरे में पाए जाते हैं। इसलिए, फ्रीज-फ्रैक्चर एमवी के व्यास, आकार और झिल्ली प्रोटीन के वितरण को चिह्नित करने के लिए पसंद की तकनीक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल ईवीएस की अन्य आबादी पर लागू होता है।

Introduction

बाह्य पुटिकाएं (ईवीएस) कोशिकाओं से बाह्य अंतरिक्ष में जारी झिल्ली-सीमित पुटिकाएं हैं। ईवीएस की तीन मुख्य आबादी एक्सोसोम, माइक्रोवेसिकल्स (एमवी), और एपोप्टोटिक निकाय हैं, जो उनकी उत्पत्ति, आकार और आणविक संरचना 1,2,3 में भिन्न हैं। ईवीएस की संरचना दाता कोशिका की आणविक प्रोफ़ाइल और इसकी शारीरिक स्थिति (यानी, स्वस्थ या रोगग्रस्त) 4,5 को दर्शाती है। यह मानव रोगों के निदान, रोग का निदान और चिकित्सा में ईवीएस को अपार क्षमता देता है, और उनके पास व्यक्तिगत चिकित्सा 6,7,8 में उपयोग के लिए आशाजनक चिकित्सा अनुप्रयोग हैं।

ईवीएस अंतरकोशिकीय संचार के मध्यस्थ हैं। उनमें जैविक रूप से सक्रिय प्रोटीन, लिपिड और आरएनए होते हैं, जो प्राप्तकर्ता कोशिका में जैविक प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप करते हैं और इसके व्यवहार 9,10 को बदल सकते हैं। हालांकि, प्राप्तकर्ता कोशिका झिल्ली के साथ बातचीत के लिए ईवी सीमित झिल्ली की संरचना महत्वपूर्ण है।

ईवीएस के स्रोत शरीर के तरल पदार्थ और वातानुकूलित संस्कृति मीडिया हैं। एक ईवी आबादी को अलग करने के लिए, एक उपयुक्त अलगाव तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन एमवी में समृद्ध एक अंश पैदा करता है, जबकि ≥100,000 × ग्राम के केन्द्रापसारक बल एक्सोसोम11,12 में समृद्ध एक अंश उत्पन्न करते हैं। ईवीएस के पृथक अंश को शुद्धता, आकार और आकार के संदर्भ में मान्य किया जाना चाहिए। उस उद्देश्य के लिए, इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स 2018 ने उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों के तीन वर्गों की सिफारिश की: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और प्रकाश माइक्रोस्कोपी-आधारित सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी13. इनमें से कोई भी तकनीक ईवी झिल्ली इंटीरियर के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकती है।

फ्रीज-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अपनी आंतरिक संरचनाओं को प्रकट करने के लिए जमे हुए नमूनों को तोड़ने की एक तकनीक है, विशेष रूप से झिल्ली इंटीरियर का दृश्य देना। नमूना तैयार करने के चरण (1) तेजी से ठंड, (2) फ्रैक्चरिंग, (3) प्रतिकृति बनाना, और (4) प्रतिकृति14 की सफाई करना है। चरण 1 में, नमूना (वैकल्पिक रूप से) रासायनिक रूप से तय किया जाता है, ग्लिसरॉल के साथ क्रायोप्रोटेक्टेड होता है, और तरल फ्रीऑन में जमे हुए होता है। चरण 2 में, जमे हुए नमूने को फ्रीज-फ्रैक्चर इकाई में फ्रैक्चर किया जाता है, जो झिल्ली बाइलेयर के इंटीरियर को उजागर करता है। चरण 3 में, उजागर खंडित चेहरों को प्रतिकृतियों का उत्पादन करने के लिए प्लैटिनम (पीटी) और कार्बन (सी) के साथ छाया हुआ है। चरण 4 में, कार्बनिक पदार्थ हटा दिया जाता है। प्रतिकृति का विश्लेषण ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) में किया जाता है। माइक्रोग्राफ की सटीक व्याख्या के लिए, किसी को अपने उचित अभिविन्यास14,15 के लिए दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए। संक्षेप में, माइक्रोग्राफ में छाया की दिशा माइक्रोग्राफ को उन्मुख करने के लिए एक संदर्भ है (यानी, पीटी शैडोइंग की दिशा निर्धारित करने के लिए) और परिणामस्वरूप, उत्तल और अवतल आकार (चित्रा 1) निर्धारित करने के लिए। झिल्ली बाइलेयर के खंडित चेहरे नामक दो आंतरिक दृश्यों को फ्रीज-फ्रैक्चरिंग द्वारा झिल्ली को विभाजित करने के परिणामस्वरूप देखा जा सकता है: प्रोटोप्लाज्मिक चेहरा (पी-फेस) और एक्सोप्लाज्मिक फेस (ई-फेस)। पी-फेस सेल प्रोटोप्लाज्म से सटे झिल्ली पत्रक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि ई-फेस बाह्य अंतरिक्ष से सटे झिल्ली पत्रक का प्रतिनिधित्व करता है। इंटीग्रल झिल्ली प्रोटीन और उनके संघों को इंट्रामेम्ब्रेनकणों 14,15 के रूप में देखा जाता है।

यहां, लक्ष्य आकार, आकार और उनकी सीमित झिल्ली की संरचना के संदर्भ में एमवी को चिह्नित करने के लिए फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक को लागू करना है। यहां, हम मानव आक्रामक मूत्राशय के कैंसर यूरोथेलियल कोशिकाओं से उत्पन्न एमवी के अलगाव और फ्रीज-फ्रैक्चरिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Protocol

1. कैंसर यूरोथेलियल कोशिकाओं और ईवीएस के अलगाव संवर्धन

नोट: एक मानव आक्रामक मूत्राशय कैंसर यूरोथेलियल (टी 24) सेल लाइन से ईवीएस प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। हालांकि, संवर्धन की स्थिति को अन्य सेल प्रकारों का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

  1. सेमी 2 के घनत्व के साथ प्लेट टी 24 कोशिकाएं तीन फ्लास्क (75 सेमी2 की बढ़तीसतह) में और ×37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (चित्रा2 ए) पर 3 दिनों के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संवर्धन के साथ शुरू करती हैं।
    1. 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 4 एमएम ग्लूटामैक्स, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक ए-डीएमईएम और एफ 12 के 1: 1 (वी / वी) मिश्रण में टी 24 कोशिकाओं के लिए एक संस्कृति माध्यम का उपयोग करें।
      नोट: निम्नलिखित अलगाव पैदावार एमवी में समृद्ध ईवीएस। अलगाव शुरू करने से पहले, व्यवहार्यता और संगम (चित्रा 2 बी) की पुष्टि करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं का निरीक्षण करें। वातानुकूलित संस्कृति मीडिया से ईवीएस एकत्र करना शुरू करें जब टी 24 कोशिकाएं 70% संगम पर हों।
  2. शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों (चित्रा 2 सी) में फ्लास्क (टी 75) से एक विंदुक के साथ एमवी के साथ संस्कृति माध्यम ले लीजिए। 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 डी) पर 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  3. ध्यान से पिपेट (चित्रा 2 ई) के साथ एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र।
  5. ध्यान से एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब में पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। ट्यूब के तल पर एक सफेद गोली की उपस्थिति की तलाश करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो आवश्यक जी-बल तक पहुंचने के लिए अपकेंद्रित्र रोटर बदलें। ईवी गोली अपकेंद्रित्र ट्यूब (चित्रा 2 एफ) के तल पर एक सफेद गोली के रूप में देखा जाता है; पाइपिंग (चित्रा 2 जी) के दौरान गोली खोने से बचने के लिए अपने स्थान को चिह्नित करें।
  7. ध्यान से एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें। गोली के लिए, पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें और एमवी युक्त गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और ट्यूब के तल पर एक सफेद गोली की उपस्थिति के लिए देखो।
    नोट: ईवी गोली अपकेंद्रित्र ट्यूब के तल पर एक सफेद पैच के रूप में देखा जाता है; पाइपिंग के दौरान गोली खोने से बचने के लिए इसके स्थान को चिह्नित करें।
  9. ध्यान से एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें। धीरे-धीरे 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर (पीएच 7.2) में फिक्सेटिव, 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 एच) पर 20 मिनट के लिए छोड़ दें।
    सावधानी: ग्लूटाराल्डिहाइड और सोडियम कैकोडाइलेट विषाक्त हैं। एक धूआं हुड में काम करें, सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें, और उन्हें उचित रूप से त्याग दें।
  10. ध्यान से एक विंदुक के साथ फिक्सेटिव को हटा दें। गोली में धोने के बफर (0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर) जोड़ें। गोली को फिर से निलंबित किए बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए छोड़ दें।

2. ईवीएस की फ्रीजिंग

नोट: ठंड से पहले, पहले ग्लिसरॉल के साथ नमूनों को क्रायोप्रोटेक्ट करें।

  1. 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर तैयार करें। धोने बफर निकालें और 0.1 एम कैकोडाइलेट बफर में 30% ग्लिसरॉल के 50 μL जोड़ें। समाधान को सजातीय बनाने के लिए ईवीएस को धीरे-धीरे फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. 5 मिनट (चित्रा 3 ए) के लिए क्लोरोफॉर्म के साथ अल्ट्रासोनिक स्नान में एक केंद्रीय गड्ढे के साथ तांबे के वाहक को साफ करें। हवा उन्हें सूखी और कई नमूने (चित्रा 3 बी) का उपयोग कर रहे हैं, तो रंगों के साथ उन्हें चिह्नित करें। उपयोग करने तक, वाहक को एक सूखी, साफ जगह पर रखें (उदाहरण के लिए, पेट्री डिश में लेंस पेपर पर)। वाहक को नंगे हाथों से न छुएं।
    1. पिपेट, समाधान, फिल्टर पेपर, चिमटी, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, फ्रीन और तरल नाइट्रोजन (एलएन2), एक धातु की छड़ और क्रायोवियल के साथ एक देवर फ्लास्क तैयार करें। इसे एलएन2 के साथ ठंडा करें।
      सावधानी: सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और एलएन2 और ठंडा फ्रीन को संभालते समय तदनुसार काम करें।
  3. ठंड से पहले ईवीएस को फिर से निलंबित करें। हवा के बुलबुले के गठन से बचें।
    नोट: चरण 2.4-2.7 तेजी से निष्पादित करें।
  4. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 3 सी) के तहत काम करें। तांबे के वाहक के केंद्रीय गड्ढे में नमूने के 1.5-1.7 μL स्थानांतरण एक उत्तल ड्रॉप तांबे वाहक किनारे से अधिक तक पहुँचने के लिए, जबकि किनारे पर नमूना फैल नहीं (चित्रा 3 डी)। ओवरस्पिल के मामले में, वाहक की बाहरी अंगूठी को सुखाने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें।
  5. इसे फिर से तरलीकृत करने के लिए एक धातु की छड़ के साथ जमने वाले फ्रीन को मिलाएं (चित्रा 3 ई)।
  6. चिमटी के साथ तांबे के वाहक की बाहरी अंगूठी को पकड़ो और इसे 8 एस (चित्रा 3 एफ) के लिए चिमटी के कोमल मिलाते हुए के साथ ठंडा फ्रीन में विसर्जित करें। 8 एस के बाद, जल्दी से वाहक को एलएन2 से भरे एक और देवर फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  7. एलएन2 में नमूनों को फ्रैक्चर या संग्रहीत करने के साथ तुरंत आगे बढ़ें। उत्तरार्द्ध मामले में, एक क्रायोवियल को चिह्नित करें और उन्हें एलएन2 (चित्रा 3 जी) में डुबोकर शीशी और चिमटी युक्तियों को ठंडा करें। एलएन2 के तहत, शीशी में जमे हुए तांबे के वाहक इकट्ठा करें, इसे बंद करें, और उन्हें फ्रीज फ्रैक्चरिंग तक एलएन2 कंटेनर (चित्रा 3 एच) में स्टोर करें।

3. ईवीएस का फ्रैक्चरिंग और प्रतिकृतियां बनाना

नोट: निर्माता के ऑपरेटिंग निर्देशों के अनुसार फ्रीज-फ्रैक्चरिंग इकाई तैयार करें। (चित्रा 4 ए)। इकाई के कक्ष को साफ करें। सी) और कार्बन (सी) बंदूकें क्रमशः 45 ° और 90 ° के कोण पर (चित्रा 4 बी)।

  1. यूनिट वैक्यूम सिस्टम शुरू करें। जब 6.6 × 10−2 पीए (5 × 10−4 टोर) का दबाव पहुंच जाए, तो इकाई कक्ष को -150 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  2. सूखी चिमटी (चित्रा 4 सी) का उपयोग कर एक फ्रीज फ्रैक्चरिंग इकाई में जमे हुए नमूनों के साथ तांबे के वाहक स्थानांतरण। बर्फ क्रिस्टल के नमूने और जमाव को पिघलने से बचने के लिए क्रायोट्रांसफर का उपयोग करें या तेजी से काम करें। नमूना तालिका पर वाहक सुरक्षित करें।
  3. वैक्यूम फिर से 6.6 × 10−2 पीए (5 × 10−4 टोर) तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें, और फिर चाकू के तापमान को -100 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4 डी) पर सेट करें।
  4. वैक्यूम 1.0 × 10−3 पीए (8 × 10−6 टोर) तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें।
  5. दूरबीन के साथ नमूना का निरीक्षण करें और ध्यान से चाकू (चित्रा 4 ई) दृष्टिकोण।
  6. नमूना की सतह चिकनी (चित्रा 4 जी) है जब तक चाकू (चित्रा 4 एफ) और अनुभाग के मोटर चालित आंदोलन पर मोड़ करके नमूना अनुभाग शुरू करें।
  7. फ्रैक्चरिंग के लिए, चाकू के मोटरचालित आंदोलन को बंद कर दें और चाकू के धीमी गति से मैनुअल नियंत्रण के साथ आगे बढ़ें, जिससे नमूना (चित्रा 4 एच) फ्रैक्चर हो जाए। खंडित सतह को छायांकन तक बर्फ के क्रिस्टल और मलबे बनाने से बचाने के लिए, चाकू को खंडित नमूने के ऊपर ले जाएं।
  8. 45 ° (चित्रा 4 आई, जे) पर पीटी छाया के साथ आगे बढ़ें।
    1. या फ्रीज-फ्रैक्चरिंग यूनिट पर क्वार्ट्ज क्रिस्टल मॉनिटर चालू करें, जो नमूने पर पीटी की मोटाई के पर्यवेक्षण की अनुमति देगा। क्वार्ट्ज क्रिस्टल मॉनिटर पर मापा गया पीटी परत की अनुशंसित मोटाई 2.5 एनएम है, जो किसी दिए गए उच्च तनाव और वर्तमान में 4 एस छायांकन से मेल खाती है (यानी, पीटी शैडोइंग की गति 0.63 एनएम /
    2. शैडोइंग शुरू करने से पहले, चाकू को नमूने से दूर ले जाएं। सी बंदूक (1,600 वी) पर उच्च तनाव लागू करें, और वर्तमान को 60 एमए तक बढ़ाएं। पीटी की चिंगारी दिखाई देनी चाहिए और नमूने को छाया देना शुरू करना चाहिए। इस बिंदु पर, 4 एस उलटी गिनती शुरू करें और / या क्वार्ट्ज क्रिस्टल मॉनिटर पर पीटी की स्थिति का निरीक्षण और पता लगाएं।
      नोट: सी परत की अनुशंसित मोटाई 2.5 एनएम है, जो किसी दिए गए उच्च तनाव और वर्तमान में छायांकन के 10 एस से मेल खाती है।
    3. पीटी की वांछित मोटाई प्राप्त होने पर वर्तमान और उच्च तनाव को बंद कर दें।
  9. 90 ° पर सी शैडोइंग के साथ आगे बढ़ें (यानी, सी शैडोइंग की गति 0.25 एनएम /
    1. सी बंदूक (1,900 वी) पर उच्च तनाव लागू करें, वर्तमान को 90 एमए तक बढ़ाएं, और सी की चिंगारी दिखाई देनी चाहिए और नमूने को छाया देना शुरू करना चाहिए; उस समय, 10 एस उलटी गिनती शुरू करें। सी की वांछित मोटाई प्राप्त होने पर वर्तमान और उच्च तनाव को बंद कर दें।

4. प्रतिकृतियों और प्रतिकृति विश्लेषण की सफाई

  1. नमूना तालिका से तांबे के वाहक का उपयोग करें और उन्हें चीनी मिट्टी के बरतन 12-अच्छी तरह से प्लेट (चित्रा 4 के) में कमरे के तापमान पर आसुत पानी में चिमटी के साथ स्थानांतरित करें। प्रतिकृतियां पानी की सतह पर तैर जाएंगी, जबकि वाहक डूब जाएंगे (चित्रा 4 एल)।
  2. आसुत जल से एक तार लूप के साथ प्रतिकृतियों को सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ एक कुएं में स्थानांतरित करें। एक धूआं हुड में कमरे के तापमान पर रात भर कवर करें और छोड़ दें।
    सावधानी: सोडियम हाइपोक्लोराइट विषाक्त है। एक धूआं हुड में काम करें, सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें, और उन्हें उचित रूप से त्याग दें।
  3. प्रतिकृतियों को डीडीएच2ओ में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए धो लें। इसे 3 बार दोहराएं।
  4. एक तार लूप के साथ प्रतिकृतियों को एक जाल तांबा टीईएम ग्रिड (जैसे, वर्ग या मधुकोश 100+ जाल) में स्थानांतरित करें। 2 घंटे के लिए ग्रिड को हवा में सुखाएं, और फिर उन्हें माइक्रोस्कोपी तक ग्रिड स्टोरेज बॉक्स में स्टोर करें।
    नोट: आम तौर पर, ग्रिड अंधेरे, शुष्क, कमरे के तापमान की स्थिति में महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. प्रतिकृतियों को चित्रित करने और माइक्रोग्राफ प्राप्त करने के लिए एक टीईएम माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    1. ऐसा करने के लिए, एक प्रतिकृति के साथ एक टीईएम ग्रिड डालें और निर्माता के ऑपरेटिंग मैनुअल के अनुसार टीईएम इमेजिंग शुरू करें। 80 केवी या 100 केवी पर काम करें।
  6. नमूने का निरीक्षण करें और टीईएम पर एक कैमरे के साथ कम और उच्च आवर्धन पर माइक्रोग्राफ प्राप्त करें।
  7. एमवी के माइक्रोग्राफ का विश्लेषण करें। एमवी व्यास के माप के लिए, फिजी / इमेजजे सॉफ्टवेयर16 का उपयोग करें। एमवी का व्यास हैलेट एट अल 17 के अनुसार माइक्रोग्राफ पर माप का 4/π गुना है।

Representative Results

एमवी को अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद कैंसर यूरोथेलियल टी 24 कोशिकाओं के वातानुकूलित माध्यम से अलग किया गया था। प्रोटोकॉल के बाद, ईवी अंश पहली बार 10,000 × जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पता चला था जब इसे एक सफेद गोली (चित्रा 2 जी) के रूप में देखा गया था।

अगला, ईवीएस को उपरोक्त प्रोटोकॉल के अनुसार संसाधित किया गया और टीईएम के तहत जांच की गई। सी छायांकन का उत्पादन (चित्रा 4 एल) अपेक्षाकृत बड़ी प्रतिकृतियां जो अक्सर सफाई चरण के दौरान छोटे टुकड़ों में टूट जाती हैं। बड़ी प्रतिकृतियां और उनके छोटे टुकड़े टीईएम ग्रिड पर उठाए गए थे और माइक्रोस्कोप के तहत तुलना की गई थी। परिणामों ने उनके आकार की परवाह किए बिना प्रतिकृति सतहों की गुणवत्ता में कोई अंतर नहीं दिखाया, और इसलिए, सभी का उपयोग किया जा सकता है। कम आवर्धन परीक्षाओं ने प्रतिकृति के क्षेत्रों को i) एक सजातीय सतह (पृष्ठभूमि), ii) अवतल और उत्तल गोलाकार प्रोफाइल (पुटिकाओं), और iii) क्षतिग्रस्त सतह (कलाकृतियों) के क्षेत्रों के साथ दिखाया; चित्रा 5 ए)। विशिष्ट कलाकृतियों को टूटने, सिलवटों और अनियमित मंद छाया (यानी, नमूने पर बर्फ-क्रिस्टल जमा की प्रतिकृतियां) के रूप में देखा गया था। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कोई सेल मलबे या सेलुलर ऑर्गेनेल नहीं देखा गया था, नमूना (चित्रा 5 बी) की शुद्धता की पुष्टि करता है।

पृथक पुटिकाओं को आमतौर पर तीन या अधिक के समूहों में इकट्ठा किया गया था या व्यक्तिगत रूप से वितरित किया गया था (चित्रा 5 बी)। पुटिकाएं गोलाकार थीं, जो अलगाव, निर्धारण और ठंड (चित्रा 5 सी) के दौरान अल्ट्रास्ट्रक्चर के अच्छे संरक्षण की ओर इशारा करती हैं। "फ्लैट-बॉल" और लम्बी पुटिकाएं (चित्रा 5 सी), जिन्हें कभी-कभी देखा जाता था, संभवतः तैयारी की कलाकृतियां थीं और पुटिका व्यास के बाद के माप में शामिल नहीं थीं। दृश्यप्रोफाइल का व्यास 238.5 एनएम (±8.0 एनएम, एन = 190) था, जो हैलेट एट अल .17 द्वारा प्रस्तावित सुधार कारक को ध्यान में रखते हुए, 304 एनएम (±10 एनएम) के औसत पुटिका व्यास से मेल खाती है; चित्रा 5 डी)। आकार 100 एनएम और 1000 एनएम के बीच एमवी की व्यास सीमा से संबंधित है और उपयोग किए गए अलगाव प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता साबित करता है। व्यास निर्धारण के साथ पुटिकाओं की छवियों ने स्पष्ट रूप से पुष्टि की कि पृथक में ईवीएस एमवी के साथ समृद्ध थे।

प्रतिकृतियों के विश्लेषण से एमवी सीमित झिल्ली के पी-फेस और ई-फेस के संगठन का पता चला। एमवी को अवतल और उत्तल गोल आकार (चित्रा 5 सी, ई, एफ) के रूप में देखा गया था, जो फ्रैक्चर विमान को दर्शाता है। उत्तल आकार ई-चेहरे का प्रतिनिधित्व करते हैं (यानी, झिल्ली के खंडित एक्सोप्लाज्मिक पत्रक; चित्रा 5 ई)। ईवीएस के एक्सोप्लाज्मिक चेहरों में एक चिकनी, समान उपस्थिति थी। अवतल आकार पी-चेहरे (चित्रा 5 एफ) के अनुरूप हैं। पी-चेहरे में, चिकनी झिल्ली (चित्रा 5 सी, एफ) के भीतर कुछ उभरे हुए इंट्रामेम्ब्रेन कणों को देखा गया था। इसका तात्पर्य यह है कि कैंसर यूरोथेलियल टी 24 कोशिकाओं से पृथक एमवी में केवल झिल्ली प्रोटीन की कम मात्रा होती है।

Figure 1
चित्रा 1: फ्रीज-फ्रैक्चरिंग के बाद झिल्ली निर्धारण की योजनाबद्ध प्रस्तुति( ए) प्लाज्मा झिल्ली से बाह्य अंतरिक्ष में माइक्रोवेसिकल्स कली। (बी) माइक्रोवेसिकल फ्रीज-फ्रैक्शनिंग तक पी- और ई-झिल्ली पत्रक के साथ सीमित है, जो पत्रक को विभाजित करता है और पत्रक के आंतरिक दृश्यों को उजागर करता है, जिसे खंडित चेहरे कहा जाता है। सी छायांकन के बाद, दो खंडित चेहरे स्पष्ट होते हैं: साइटोप्लाज्म (प्रोटोप्लाज्म) का सामना करने वाले उत्तल आकार के साथ प्रोटोप्लाज्मिक चेहरा (पी-फेस) और बाह्य अंतरिक्ष का सामना करने वाले अवतल आकार के साथ एक एक्सोप्लाज्मिक चेहरा (ई-फेस)। चित्रा 1 Biorender.com का उपयोग करके बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ईवी का अलगाव (ए) एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में उगाए गए टी24 कोशिकाओं की जांच (बी) एमवी अलगाव से पहले उनकी व्यवहार्यता और संगम की पुष्टि करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ की जाती है। (सी) सेल संस्कृति माध्यम एकत्र किया जाता है और (डी) लगातार 300 × ग्राम और 2,000 × जी (ई) पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है हर बार सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया जाता है। (एफ, जी) 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एक गोली का संकेत देने वाला एक सफेद पैच दिखाई देता है और चिह्नित होता है। सतह पर तैरनेवाला हटा दिया जाता है और (एच) फिक्सेटिव को सावधानीपूर्वक इसे फिर से निलंबित किए बिना गोली में जोड़ा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ईवीएस की ठंड (ए) केंद्रीय गड्ढे के साथ हवा में सूखे स्वच्छ तांबे के वाहक (बी) प्रसंस्करण से पहले चिह्नित हैं। माइक्रोवेसिकल्स को एक समरूप नमूना प्राप्त करने के लिए ग्लिसरॉल में फिर से निलंबित कर दिया जाता है और (सी) एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत कूपर वाहक के केंद्रीय गड्ढे में जोड़ा जाता है। (डी) किसी को नमूने की मात्रा को जोड़ना होगा जैसे कि यह केंद्रीय गड्ढे में उत्तल बूंद बनाता है। (ई) ठंड से तुरंत पहले, फ्रीन को तरलीकृत करने के लिए धातु की छड़ के साथ एलएन2-ठंडा फ्रीन मिलाएं। (एफ) नमूने को फ्रीन में डुबोकर फ्रीज करें, और फिर (जी) इसे एलएन2 में स्थानांतरित करें। (एच) जमे हुए नमूने के साथ वाहक क्रायोवियल्स में एकत्र किए जा सकते हैं और एलएन2 देवर कंटेनर में संग्रहीत किए जा सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: फ्रीज-फ्रैक्चरिंग और प्रतिकृति बनाना। (ए) फ्रीज-फ्रैक्चरिंग यूनिट। यूनिट चैंबर (बी) के अंदर एक प्लैटिनम (पीटी) और कार्बन (सी) इलेक्ट्रॉन बंदूक, एक चाकू और नमूना तालिका है। (सी) फ्रैक्चरिंग शुरू करने के लिए, नमूने के साथ वाहक नमूना तालिका में स्थानांतरित कर रहे हैं, (डी) फ्रीज फ्रैक्चरिंग इकाई ठंडा है, और एक वैक्यूम स्थापित किया जाता है। (ई) सेक्शनिंग चाकू के मोटर चालित (एफ) आंदोलन द्वारा किया जाता है, लेकिन फ्रैक्चरिंग अधिमानतः मैन्युअल रूप से किया जाता है। (जी) सेक्शनिंग से पहले नमूना और फ्रैक्चरिंग के बाद (एच)। (I) फ्रैक्चरिंग के तुरंत बाद, प्रतिकृति बनाई जाती है। (जे) इस प्रक्रिया के दौरान, पीटी नमूने पर छाया हुआ है। प्लेटिनम शैडोइंग को चैंबर में एक उज्ज्वल प्रकाश (स्पार्क्स) के रूप में देखा जाता है। (के) नमूना वाहक पानी से भरे चीनी मिट्टी के बरतन कुएं में एकत्र किए जाते हैं। (एल) सफाई चरण के दौरान सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान में तैरने वाली प्रतिकृति (तीर)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: फ्रीज-फ्रैक्चर और पीटी/सी छायादार एमवी के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (ए) कम आवर्धन पर फ्रीज-फ्रैक्चर और छायादार ईवी गोली (आई) का अवलोकन। सजातीय सतह पृष्ठभूमि (ii) है, उज्ज्वल क्षेत्र प्रतिकृतियों (iii) में टूट जाते हैं, गहरे क्षेत्र प्रतिकृतियों (तारांकन) के सिलवटों होते हैं, और अनियमित मंद छाया बर्फ के क्रिस्टल (दो तारांकन) के कारण होती है। (बी) अवतल और उत्तल सतहों के साथ गोल आकार के ईवीएस का क्लस्टर। (सी) ईवीएस का उच्च आवर्धन। उत्तल फ्रैक्चर में, जो ईवी झिल्ली के पी-फेस को प्रदर्शित करते हैं, इंट्रामेम्ब्रेन कण (तीर) और एक चिकनी सतह (एरोहेड्स) के पैच देखे जाते हैं। लम्बी (स्टार) और फ्लैट-बॉल आकृतियों (दो सितारों) के साथ बाह्य पुटिकाएं पाई जाती हैं। (डी) पृथक यूरोथेलियल एमवी का औसत व्यास 304 एनएम ± 10 एनएम हैलेट एट अल 17 द्वारा प्रस्तावित आकार माप के अनुसार। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (ई, एफ) ई-फेस और एमवी के पी-फेस लीजेंड: तीर = पी-फेस में इंट्रामेम्ब्रेन कण, घिरे हुए तीर = पीटी / स्केल बार: ए = 10 μm, बी-एफ = 400 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एमवी, या पृथक ईवीएस की किसी भी अन्य आबादी का लक्षण वर्णन, "ओमिक्स" अध्ययन या कार्यात्मक अध्ययन11,18 जैसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण शुरू करने से पहले शुरू करने के लिए प्रमुख महत्व का है। इसमें, मानव आक्रामक मूत्राशय के कैंसर यूरोथेलियल टी 24 कोशिकाओं से ईवीएस को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था, और फ्रीज-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हमने प्रदर्शित किया कि पृथक अंश एमवी11,13 में समृद्ध था। एमवी का अलगाव सेल मलबे या ऑर्गेनेल से रहित था, जो एक सफल अलगाव और शुद्धिकरण प्रोटोकॉल की पुष्टि करता था।

रासायनिक निर्धारण और ठंड का संयोजन, जो प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरण हैं, ने ईवीएस12 के गोलाकार आकार को बनाए रखा। हालांकि, फ्रीज-फ्रैक्चरिंग17 द्वारा ईवी व्यास का आकलन करते समय सावधानी बरतने की आवश्यकता होती है। चूंकि फ्रैक्चर बेतरतीब ढंग से नमूने से गुजरता है, इसलिए एमवी झिल्ली को उनके भूमध्यरेखीय और गैर-भूमध्यरेखीय विमानों में विभाजित किया जाता है। फ्रीज-फ्रैक्चर और छायादार नमूनों की छवियों का विश्लेषण करने के लिए एक कठोर विधि प्रदान करने के लिए, हैलेट एट अल ने दिखाया कि औसत पुटिका व्यास छवि17 पर पुटिका व्यास के वास्तविक आकार का 4/π गुना है। इसके लिए लेखांकन, टी 24 कोशिकाओं से ईवीएस की गणना 304 एनएम के व्यास के लिए की गई थी, जो एमवी के सैद्धांतिक आकार वितरण सीमा 100-1000 एनएम19 में फिट बैठती है।

फ्रीज-फ्रैक्चरिंग नकारात्मक धुंधला पूरक हो सकता है, ईवीएस की कल्पना करने के लिए सबसे बड़े पैमाने पर इस्तेमाल की जाने वाली टीईएम तकनीक। नकारात्मक धुंधला होने से, नमूना आमतौर पर रासायनिक रूप से तय, सूखा और टीईएम ग्रिड से जुड़ा होता है, और यूरेनियल समाधान के विपरीत होता है। मीडिया का समर्थन किए बिना, ईवीएस ढह जाते हैं, जो उन्हें कप के आकार की उपस्थिति देता है। फ्रीज-फ्रैक्चरिंग द्वारा, हम दिखाते हैं कि एमवी गोले हैं, जो बाह्य रिक्त स्थान और शरीर के तरल पदार्थ12 में उनके आकार को दर्शाता है। इसके द्वारा, हमारे परिणाम क्रायो-अल्ट्राथिन धारा20 में ईवीएस की टिप्पणियों के साथ समझौते में भी हैं।

फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक का एक महत्वपूर्ण लाभ सीमित झिल्ली के आंतरिक संगठन को हल करने की शक्ति है, जो यह समझने में एक महत्वपूर्ण कारक है कि ईवीएस को प्राप्तकर्ता झिल्ली के साथ कैसे लक्षित और बातचीत की जाती है। यहां, हमने एमवी की झिल्ली का विश्लेषण किया, फिर भी फ्रीज-फ्रैक्चरिंग ईवीएस की किसी भी अन्य आबादी के झिल्ली संगठन को प्रकट कर सकता है। एमवी प्लाज्मा झिल्ली नवोदित द्वारा बनते हैं; इसलिए, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन और प्रोटीन क्लस्टर एमवी झिल्ली में पाए जाने की उम्मीद है। हमारे परिणामों ने समर्थन किया कि टी 24 कोशिकाओं के एमवी में इंट्रामेम्ब्रेन कण होते हैं, जो अभिन्न झिल्ली प्रोटीन पेश करते हैं। ई-फेस और पी-फेस के बीच कण वितरण के आधार पर, यह उम्मीद करना उचित है कि एमवी में देखे गए कण ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन यूरोप्लाकिन्स हैं, जो यूरोथेलियल सेल विशिष्ट 21,24 हैं। मनाया कण विरल थे, जो पिछले अध्ययनों के अनुसार यूरोथेलियल कार्सिनोजेनेसिस21,22,23 के दौरान यूरोप्लाकिन्स में कमी की सूचना देता है। हालांकि, एमवी झिल्ली की प्रोटीन संरचना की आगे की जांच करने के लिए, फ्रीज-फ्रैक्चर प्रतिकृति प्रतिरक्षा-लेबलिंग (एफआरआईएल) तकनीक के उपयोग की सिफारिश की जाती है। एफआरआईएल प्रस्तुत फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक का एक उन्नयन है और एंटीबॉडी मान्यता24,25 द्वारा प्रतिकृतियों में प्रोटीन की पहचान का खुलासा करने के लिए समर्पित है। संक्षेप में, फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक है जो ईवी सीमित झिल्ली के लक्षण वर्णन के साथ-साथ पृथक ईवी अंशों के आकार, आकार और शुद्धता के लिए उपयुक्त है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग पृथक ईवी की अन्य आबादी के मूल्यांकन के लिए भी किया जा सकता है; इसलिए, फ्रीज-फ्रैक्चरिंग तकनीक ईवी सीमित झिल्ली के संगठन की खोज करने वाले अध्ययनों के लिए इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स दिशानिर्देशों में शामिल होने के योग्य है।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी द्वारा वित्त पोषित किया गया था (अनुसंधान कोर फंडिंग सं। पी 3-0108 और परियोजना जे 7-2594) और एमआरआईसी उल आईपी -0510 इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम। यह काम कॉस्ट एक्शन सीए 17116 इंटरनेशनल नेटवर्क फॉर ट्रांसलेटिंग रिसर्च ऑन पेरिनेटल डेरिवेटिव्स को चिकित्सीय दृष्टिकोण (स्प्रिंट) में अनुवाद करने के लिए योगदान देता है, जो लागत (विज्ञान और प्रौद्योगिकी में यूरोपीय सहयोग) द्वारा समर्थित है। लेखक लिंडा स्ट्रस, संजा अबराजा, नाडा पावलिका डुबारिक और सबीना जेलेज़निक को सेल संवर्धन और नमूने तैयार करने में तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं और मार्को वोग्रिंक, ओटा सिर्का रोस और नेजक डेबेवेक वीडियो तैयार करने में तकनीकी सहायता के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A-DMEM ThermoFisher Scientific, USA 12491015
Balzers freeze-fracture device Balzers AG, Liechtenstein Balzers BAF 200
Centrifuge Eppendorf, Germany model 5810R
CO2 incubator HeraCell  Heraues, Germany
Copper carriers Balzers BB 113 142-2 100+ mesh
Copper grids SPI, United States 2010C
Culture flask T75 TPP, Switzerland growing surface 75 cm2
F12 (HAM) Sigma-Aldrich, Germany 21765029
FBS Gibco, Life Technologies, USA 10500064
Glazed Porcelain Plate 6 Well Fischer Sientific, United States 50-949-072
Glycerol Kemika, Croatia 711901 final concentration 30 % (v/v)
Glutaradehyde  Serva, Germany 23114.01 final concentration 2.5 % (v/v)
GlutaMAX Gibco, Life Technologies 35050-079 final concentration 4 mM
Penicillin Gibco, Life Technologies 15140163 final concentration 100 U/ml
Phase-contast inverted microscope Nikon, Japan model Eclipse
Rotor Eppendorf, Germany A 4-44
Rotor  Eppendorf, Germany F-34-6-38
Serological pipetts TPP, Switzerland 50mL volume
Sodium hypochloride solution in water Carlo Erba, Italy 481181
Stereomicroscope Leica, Germany
Streptomycin Gibco, Life Technologies 35050038 final concentration 100 mg/mL
Transmission electron microscope Philips, The Netherlands model CM100 working at 80 kV
Tweezers SPI, United States

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 187
बाह्य पुटिका विश्लेषण के लिए फ्रीज-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
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Resnik, N., Romih, R., Kreft, M. E., … More

Resnik, N., Romih, R., Kreft, M. E., Hudoklin, S. Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis. J. Vis. Exp. (187), e63550, doi:10.3791/63550 (2022).

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