Summary
Denna artikel beskriver en metod för sterilisering av maskplockningar, spatlar och skalpeller med hjälp av en mikroförbränningsanläggning i stället för en öppen låga.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) är en optimal modellorganism för forskning och utbildning vid främst grundutbildningsinstitutioner. Studenter kan snabbt lära sig den sterila tekniken som krävs för att upprätthålla C. elegans kulturer . Sterilisering av platinaplockningar som används för att överföra maskar från en tallrik till en annan görs traditionellt genom att hålla plogen i en flamma från en Bunsen-brännare eller etanollykta. Bunsen-brännare kräver dock en gaskälla, och båda utrustningarna utgör risken för oavsiktlig brand i samband med öppen låga. Demonstreras här är en teknik för sterilisering av maskplockningar, spatlar och skalpeller med hjälp av en infraröd bakteriologisk slinga mikroförbränningsugn. Denna utrustning kräver endast ett eluttag och minimerar potentiella brandrisker. Genom att sänka risk- och gaskraven är denna teknik väl lämpad för forskning och undervisning i en grundutbildning.
Introduction
Modellorganismen C. elegans är väl lämpad för både forskning och utbildning vid främst grundutbildningsinstitutioner (PUI) på grund av den låga kostnaden, enkel underhåll och användningsområde 1,2,3,4. För att hantera maskar - till exempel för att flytta en mask från en platta till en annan, kan experimenter använda en maskplockning. En mängd olika val kan göras eller köpas för användning med C. elegans. Picks görs oftast med en platina eller platina / iridium spets, monterad i ett glas, metall eller trähandtag. Glashandtag kan tillverkas internt genom att smälta en Pasteur-pipett runt en platinatråd tills tråden är säker. Ytterligare information om C. elegans djurhållning, inklusive hur man odlar och underhåller maskar och deras matkällor, finns i WormBook5 och andra källor 6,7,8.
När man arbetar med C. elegans används aseptiska tekniker vanligtvis för att förhindra kontaminering med mikrober och svampar. Exempel på aseptiska tekniker inkluderar sterilisering av instrument, autoklavering av reagenser och utförande av arbete i sterila fält. Maskplockningar steriliseras vanligtvis med öppen eld9. Dessutom förbränner sterilisering av maskplockningen maskar, vilket förhindrar oavsiktliga blandningar av stammar när man arbetar med flera maskstammar. Typiska metoder för sterilisering av maskplockningar involverar en öppen låga från antingen en Bunsen-brännare, etanollykta eller standardtändare (tabell 1). Vi var motiverade att söka säkrare alternativ till befintliga metoder i laboratoriet när en grundstudent omedvetet spillde etanol medan han fyllde en etanollykta och av misstag startade en liten eld när han tände lyktan. Tyvärr har många olyckor rapporterats med etanollyktor 10,11,12. Lyckligtvis har alternativa steriliseringsmetoder validerats för användning i mikrobiologi, och syftet med denna artikel är att visa hur man använder denna utrustning för att sterilisera instrument för användning med C. elegans.
I mikrobiologiska laboratorier är den aseptiska tekniken också kritisk. Serologiska slingor och trådar av platina steriliseras antingen med öppen eld13 eller en mikroförbränningsanläggning 14,15,16. Andra namn för mikroförbränningsanläggningar inkluderar mikrosterilisatorer eller bactoförbränningsanläggningar. Fördelar med mikroförbränningsanläggningen jämfört med traditionella flammetoder inkluderar minskad brandrisk, eliminering av stänk av förbrända material och förmåga att arbeta i en laminär flödeshuv / biosäkerhetsskåp 16,17,18. Faktum är att både American Society of Microbiology och Världshälsoorganisationen rekommenderar att man använder mikroförbränningsanläggningar över användningen av en öppen låga 17,19,20. I jämförelse med Bunsen-brännare kräver mikroförbränningsanläggningar inte heller en gasledning, som vissa laboratorier kanske inte har, eller kanske inte har placerat vid varje bänk för studenter att använda. Inspirerad av dessa fördelar utvecklades ett protokoll för att ersätta användningen av flamma med mikroförbränningsanläggningar för sterilisering av vanliga instrument som plockar, spatlar och skalpeller i C. elegans-laboratoriet. Denna metod kan vara lämplig för instruktörer och forskare som vill förbättra säkerheten och / eller flexibiliteten när de arbetar med C. elegans.
Protocol
1. Förbered mikroförbränningsanläggningen
- Fäst en tillbehörsguide för öglahållaren på mikroförbränningsanläggningen genom att fästa den på ytterpipan.
- Anslut mikroförbränningsapparaten till ett vanligt 120 V eller 230 V eluttag efter behov.
OBS: Detta kan göras på en bänkskiva eller i en laminär flödeshuva. - Vrid mikroförbränningsanläggningen till den höga inställningen och låt den värmas upp i 10-20 minuter beroende på tillverkarens instruktioner för att nå en optimal temperatur på 800-825 oC.
OBS: Om förbränningsanläggningen hålls på längre än 3 timmar kan den lägre temperaturinställningen (500 oC) användas som standby-inställning. Enligt tillverkarens användarmanualer förlänger detta utrustningens användbara livslängd.
2. Sterilisera plockningen, spateln eller skalpellen
- Sätt in instrumentet i det cylindriska steriliseringsområdet utan att vidröra sidorna genom att glida längs styrningen21.
OBS: Om du steriliserar en skalpell är det viktigt att undvika att röra den keramiska väggen med bladet. Skrapning av keramikväggen kan äventyra värmeenhetens integritet. - Håll instrumentet i steriliseringsområdet i 5-7 s.
- Ta bort instrumentet utan att vidröra sidorna genom att glida bakåt längs styrningen.
- För plockningar, låt instrumentet svalna i 3-5 s innan du rör vid en mask för att undvika att bränna den.
OBS: Skalpeller eller spatlar som inte får svalna kommer att sjunga agaren. - Efter att ha plockat maskar, sätt in plockningen i kammaren i 5-7 s för att förbränna eventuella maskar på plockningen.
3. Jämförande metod - sterilisering av instrument med hjälp av en Bunsen-brännare
- Anslut Bunsen-brännaren till gasledningen med gummislangar. Se till att fästa slangen ordentligt och placera brännaren borta från överliggande föremål.
- Slå på gas genom att vrida på ratten på gasledningen.
- Tänd brännaren med en anfallare eller tändare.
- Justera lågan med gasvredet och luftintaget tills en blå kon är synlig.
- Håll plollen, spateln eller skalpellen i lågan tills den lyser rött.
- För plockningar, låt instrumentet svalna i 3-5 sekunder innan du rör vid en mask för att undvika att bränna den.
OBS: Skalpeller eller spatlar som inte får svalna kommer att sjunga agaren. - Efter att ha plockat maskar, sätt in plockningen i lågan igen för att förbränna eventuella maskar på plockningen.
4. Experimentera
- Kultur OP50 Escherichia coli (E. coli) bakterier i Luria Broth22 över natten på en 37 oC shaker.
- Efter över natten kultur, späd kulturen i sterilt vatten i ett förhållande av 1:100.
OBS: Denna utspädningsfaktor valdes för att säkerställa separation av kolonier efter plätering. - Doppa en maskplockning steriliserad med en Bunsen-brännare i bakterielösningen, sterilisera igen med Bunsen-brännaren och virvla den i 100 ml sterilt vatten.
- Platta 100 μL vatten på en 10 cm LB agar22,23 petriskål, sprid vattnet med en steril cellspridare och inkubera vid rumstemperatur i 24 timmar med locket på.
- Utför steg 4.3-4.4 med en maskplockning steriliserad med hjälp av en mikroförbränningsanläggning.
- Som en positiv kontroll, utför steg 4.3-4.4 utan omsterilisering.
- Som en negativ kontroll, utför steg 4.3-4.4 med sterilt vatten i stället för bakterielösningen.
- Räkna kolonierna manuellt efter inkubationsperioden.
Representative Results
Ett enkelt experiment (avsnitt 4) utformades för att visa de relativa föroreningshastigheterna med hjälp av en mikroförbränningsanläggning kontra en flamma (figur 1, tabell 2). Även om dessa resultat representerar föroreningshastigheter över metoder, skulle det inte vara nödvändigt att upprepa denna metod för att använda mikroförbränningstekniken. Experimentet kördes i tre exemplar. Negativ kontroll var sterilt vatten utan bakterier. Den positiva kontrollen använde ingen steriliseringsteknik: plockningen doppades i den utspädda OP50-kulturen och överfördes sedan direkt till det sterila vattnet. Alla repliker och villkor kördes parallellt samma dag. I alla tre negativa kontrollplattor räknades noll kolonier. Ett genomsnittligt antal 4,7 (± 0,3 SEM) kolonier erhölls när Bunsen-brännaren användes för att sterilisera plockar. Ett genomsnittligt antal kolonier på 3,3 (±1,2 SEM) observerades i mikroförbränningstillståndet. Ett genomsnittligt antal kolonier på 298,3 (±17,9 SEM) erhölls emellertid i det positiva kontrolltillståndet. Ett 2-tailed t-test som antog lika stor varians som jämförde Bunsen-brännaren med mikroförbränningsanläggningen gav ingen statistiskt signifikant skillnad, p = 0,35. Således uppnådde mikroförbränningsanläggningen sterilitetsresultat lika effektiva som Bunsen-brännaren.
Figur 1: Bakteriella räkningar över steriliseringsmetoder. Picks doppades i 1: 100 OP50-kultur i sterilt vatten och steriliserades sedan med en Bunsen-brännare eller mikroförbränningsanläggning. Picks doppades sedan i sterilt vatten, pläterades på LB agar 22,23 och inkuberades i 24 timmar vid rumstemperatur, och kolonier räknades manuellt. Positiv kontroll hade ingen sterilisering, och negativ kontroll använde sterilt vatten utan bakterier. n = 3 repliker per villkor. Anm.: y-axeln är bruten för att möjliggöra separation av datapunkter i relevanta delar av diagrammet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Steriliseringsmetod | Kostnad | Krav för labb | Fördelar | Nackdelar | |||
| Mikroförbränningsanläggning | $ 365–530 | 120 V eller 230 V utlopp | • Bärbar • Ingen öppen låga eller exponerat värmeelement • Kan användas i laminära flödeshuvar och biologiska säkerhetsskåp |
• Uppvärmningstid • Högre kostnad |
|||
| Bunsen brännare | $ 24–169 | Gasledning | • Snabb uppsättning • Låg kostnad |
• Öppen låga • Rekommenderas inte för användning i laminär flödeshuv eller biologiskt säkerhetsskåp |
|||
| Etanollampa | 110 kr | Ingen | • Snabb uppsättning • Låg kostnad • Påfyllningsbar |
• Öppen låga • Säkerhetsrisk vid påfyllning • Rekommenderas inte för användning i laminär flödeshuv eller biologiskt säkerhetsskåp • Ej tillåtet vid vissa institutioner |
|||
| Tändare | $ 5–8 | Ingen | • Låg kostnad • Tillgänglig • Engångsbruk • Påfyllningsbar |
• Öppen låga • Handmanövrerad • Rekommenderas inte för användning i laminär flödeshuv eller biologiskt säkerhetsskåp |
|||
Tabell 1: Jämförelse av metoder för sterilisering av instrument. Fyra metoder för sterilisering av instrument jämfördes baserat på fördelar, nackdelar, kostnader och laboratoriekrav.
| Replikera | Tillstånd | |||
| Mikroförbränningsanläggning | Bunsen brännare | Negativ kontroll | Positve-kontroll | |
| 1 | 1 | 5 | 0 | 278 |
| 2 | 4 | 4 | 0 | 334 |
| 3 | 5 | 5 | 0 | 283 |
| Betyda | 3.3 | 4.7 | 0.0 | 298.3 |
| SEM | 1.2 | 0.3 | 0.0 | 17.9 |
Tabell 2: Rådata för bakterieantal över steriliseringsmetoder. Picks doppades i 1: 100 OP50-kultur i sterilt vatten och steriliserades sedan med en Bunsen-brännare eller mikroförbränningsanläggning. Picks doppades sedan i sterilt vatten, pläterades på LB agar 22,23 och inkuberades i 24 timmar vid rumstemperatur, och kolonier räknades manuellt. Positiv kontroll hade ingen sterilisering, och negativ kontroll använde sterilt vatten utan bakterier. n = 3 repliker per villkor. Medelvärde och SEM rapporteras under enskilda räkningar.
Discussion
C. elegans är en modellorganism som är väl lämpad för övningar i grundutbildningslaboratorier. Användningen av mikroförbränningsanläggningar i stället för öppna lågor ger fördelar i både forskningslaboratorier och klassrumslaboratorier. Faktum är att grundutbildningskurser kan utgöra en högre risk för oavsiktliga bränder med tanke på antalet nyutbildade forskare i rummet. Dessutom ökar risken för brand när etanol används för att sterilisera instrument nära flamkällan eftersom etanolångor antänds. Portabiliteten ger också en fördel för klassrum där gasledningar inte installeras vid varje bänk. Denna metod har använts i undervisnings- och forskningslaboratorier vid vår institution, vilket resulterar i inga ökningar av föroreningar och noll laboratoriesäkerhetsolyckor sedan den införlivades 2016.
För att säkerställa kompatibilitet med mikroförbränningsanläggningar testades en rad plockningar med olika fästen, trådkompositioner och trådmätare. Trådkompositionen inkluderade 100% platina samt 90% platina / 10% iridium med en trådtjocklek på 30-32 G, och oavsett tjocklek och sammansättning äventyrade uppvärmningsmetoden inte trådintegriteten. Monteringarna inkluderade två olika typer av kommersiellt tillgängliga plockhandtag och egentillverkade glasfästen från Pasteur-pipetter. Observera att plock inte lyser glödande hett som de gör i lågan. Emellertid uppnås tillräcklig sterilisering fortfarande så länge sterilisatorn har nått rätt temperatur. Således är det viktigt att låta mikroförbränningsanläggningen värmas upp i 10 eller 20 minuter, vilket anges i tillverkarens instruktioner. Att hålla instrumentet i kammaren i minst 5 s för att uppnå sterilisering är också kritiskt. Att lämna instrumentet i kammaren längre än 7 s kommer inte att skada instrumentet men är onödigt. Även om detta är ett relativt enkelt förfarande med minimala steg och sannolikt inte behöver felsökas, kan det ta lite övning att lära sig att stabilisera instrumentet i pipan utan att röra vid sidorna.
För att ersätta en öppen låga måste en steriliseringsmetod täcka alla applikationer som används i ett laboratorium. Förutom steriliseringsinstrument kan C. elegans-laboratorier också använda Bunsen-brännare för att skapa ett sterilt fält för att utföra andra uppgifter som att hälla plattor eller inokulera kulturer13. Huruvida detta skapar ett sterilt fält eller drar in fortfarande livskraftiga föroreningar är dock fortfarande kontroversiellt14. Även om det inte är ett alternativ på alla institutioner, kan ett biosäkerhetsskåp eller laminär flödeshuv användas för dessa ändamål, vilket gör att ett laboratorium kan fungera utan användning av öppna lågor. Bruksanvisningar för de flesta mikroförbränningsanläggningar rekommenderar att man inte använder för sterilisering av skalpellblad eftersom skrapning av innerväggarna skadar sterilisatorn. Men om man försiktigt använder en guide kan man sterilisera ett skalpellblad eller spatel utan att röra vid innerväggarna. Detta utökar användningen av tekniken för att möjliggöra chunking utan att använda en flamma och gör det möjligt för ett C. elegans-laboratorium att fungera utan att växla tekniker mellan sterilisering av olika föremål.
Som beskrivs i tabell 1 erbjuder mikroförbränningsanläggningar ökad säkerhet, ökad kompatibilitet med laminära flödeshuvar och ökad bärbarhet jämfört med flambaserade metoder men har begränsningar. De är dyrare än de andra metoderna och kräver uppvärmningstid innan steriliseringstemperaturer uppnås. Sammanfattningsvis kan denna metod som rutinmässigt används i många mikrobiologiska laboratorier vara tillämplig i vissa C. elegans forsknings- och undervisningslaboratorier som försöker förbättra laboratoriesäkerheten utan att kompromissa med steriliteten.
Disclosures
Inga intressekonflikter avslöjades.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma Suzanne Howard och Justin Finne. Detta arbete finansierades av Wellesley College Neuroscience Department. N2-maskar tillhandahölls av CGC som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Publiceringsavgifterna för denna artikel stöddes av Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
- Attix, H., et al. Wild caught nematode identification and early embryo development: An accessible undergraduate research experience. microPublication Biology. 2021, (2021).
- Rose, J. K. Demonstrating connections between neuron signaling and behavior using C. elegans learning assays and optogenetics in a laboratory class. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 16 (3), 223-231 (2018).
- Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education: JUNE: A Publication of FUN, Faculty for Undergraduate Neuroscience. 15 (1), 44-55 (2016).
- Raley-Susman, K. M., Gray, J. M. Exploration of gerontogenes in the nervous system: a multi-level neurogenomics laboratory module for an intermediate neuroscience and behavior course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 8 (2), 108-115 (2010).
- Stiernagle, T.
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
- JoVE. Biology I: yeast, Drosophilia, and C. Elegant. C. Elegans Maintenace. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Hope, I. A. C. elegans: A Practical Approach. , IRL. Oxford University Press. Oxford. (1999).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with Worms: Caenorhabditis elegans as a Model Organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
- Waechter-Brulla, D. Improving safety in the microbiology laboratory through active learning and investigation. American Society for Microbiology. , (2000).
- Young, J. A. It says in the books that ethanol burns with a cool flame. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1488 (2000).
- Mojtabai, F., Kaufman, J. A. Learning by accident. V. 2. , Laboratory Safety Institute. Natick, MA. (2005).
- JoVE. General Laboratory Techniques. Introduction to the Bunsen Burner. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Katz, D. S. The streak plate protocol. American Society for Microbiology Laboratory Protocols. , (2008).
- Public Health Agency of Canada. Agency of Canada Canadian Biosafety Handbook. Government of Canada. , Ottawa, ON. (2016).
- Emmert, E. A. B. ASM Task Committee on Laboratory Biosafety Biosafety guidelines for handling microorganisms in the teaching laboratory: development and rationale. Journal of Microbiology & Biology Education. 14 (1), 78-83 (2013).
- Collins, C. H. Health Hazards in Microbiology. Handbook of Laboratory Health and Safety Measures. Pal, S. B. , Springer. Dordrecht. (1990).
- Laboratory Biosafety Manual. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/I/item/9789240011311 (2020).
- Fleming, D. O. Laboratory Safety Principles and Practices. American Society for Microbiology. , ASM Press. Washington, D.C. (1995).
- Gordon, R. C., Davenport, C. V. Simple modification to improve usefulness of the Bacti-Cinerator. Applied Microbiology. 26 (3), 423 (1973).
- Cold Spring Harbor.
- Cold Spring Harbor. Media containing agar or agarose. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
