Summary
이 기사에서는 화염 대신 마이크로 소각로를 사용하여 웜 픽, 주걱 및 메스를 살균하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) 는 주로 학부 기관의 연구 및 교육을위한 최적의 모델 유기체입니다. 학부생은 C. elegans 문화를 유지하는 데 필요한 멸균 기술을 신속하게 배울 수 있습니다. 한 접시에서 다른 접시로 웜을 옮기는 데 사용되는 백금 픽의 살균은 전통적으로 Bunsen 버너 또는 에탄올 랜턴의 화염에 픽을 고정하여 수행됩니다. 그러나 Bunsen 버너에는 가스 공급원이 필요하며 두 장비 모두 화염과 관련된 우발적 인 화재의 위험이 있습니다. 여기서 입증 된 기술은 적외선 박테리아 루프 마이크로 소각로를 사용하여 웜 픽, 주걱 및 메스를 살균하는 기술입니다. 이 장비는 전기 콘센트 만 있으면 잠재적 인 화재 위험을 최소화합니다. 위험 및 가스 요구 사항을 낮춤으로써이 기술은 학부 환경에서 연구 및 교육에 매우 적합합니다.
Introduction
모델 유기체 C. elegans는 저렴한 비용, 유지 보수의 용이성 및 응용 프로그램 범위 1,2,3,4로 인해 주로 학부 기관 (PUI)의 연구 및 교육 모두에 매우 적합합니다. 웜을 처리하기 위해 - 예를 들어, 한 플레이트에서 다른 플레이트로 웜을 이동하기 위해 실험자는 웜 픽을 사용할 수 있습니다. C. elegans와 함께 사용하기 위해 다양한 픽을 만들거나 구입할 수 있습니다. 픽은 가장 일반적으로 백금 또는 백금 / 이리듐 팁을 사용하여 만들어지며 유리, 금속 또는 나무 손잡이에 장착됩니다. 유리 손잡이는 와이어가 안전 할 때까지 백금 와이어 주위에 파스퇴르 피펫을 녹여 사내에서 만들 수 있습니다. 웜과 그 먹이 공급원을 키우 고 유지하는 방법을 포함하여 C. elegans 축산에 대한 추가 정보는 WormBook5 및 기타 출처 6,7,8에서 찾을 수 있습니다.
C. elegans와 함께 작업 할 때, 무균 기술은 일반적으로 미생물 및 곰팡이로 인한 오염을 방지하기 위해 사용됩니다. 무균 기술의 예로는 기기의 멸균, 시약의 오토클레이빙, 멸균 분야에서의 작업 수행 등이 있습니다. 웜 픽은 전형적으로 화염9를 사용하여 멸균된다. 또한, 웜 픽의 살균은 웜을 소각하여 여러 웜 균주로 작업 할 때 우발적 인 변형 혼합을 방지합니다. 웜 픽을 살균하는 일반적인 방법은 Bunsen 버너, 에탄올 랜턴 또는 표준 라이터의 화염을 포함합니다 (표 1). 우리는 학부생이 에탄올 랜턴을 채우는 동안 무의식적으로 에탄올을 쏟아 부었고 랜턴을 점화 할 때 우연히 작은 화재를 시작했을 때 실험실의 기존 방법에 대한보다 안전한 대안을 모색하기 위해 동기를 부여 받았습니다. 불행히도, 에탄올 랜턴10,11,12를 사용하는 많은 사고가보고되었습니다. 다행스럽게도 대체 살균 방법은 미생물학에서 사용하기 위해 검증되었으며,이 기사의 목적은이 장비를 사용하여 C. elegans와 함께 사용하기 위해 도구를 살균하는 방법을 시연하는 것입니다.
미생물학 실험실에서는 무균 기술도 중요합니다. 백금으로 만들어진 혈청학적 루프 및 와이어는 화염(13) 또는 마이크로 소각로(14,15,16)를 사용하여 멸균된다. 마이크로 소각로의 다른 이름으로는 마이크로 살균기 또는 박토 소각로가 있습니다. 전통적인 화염 방법에 비해 마이크로 소각로의 장점은 화재 위험 감소, 소각 재료의 스패터링 제거 및 층류 후드 / 생물 안전 캐비닛16,17,18에서 작업 할 수있는 능력을 포함합니다. 사실, 미국 미생물학 협회와 세계 보건기구 (WHO)는 모두 화염 17,19,20의 사용보다 마이크로 소각로를 사용할 것을 권장합니다. Bunsen 버너와 비교할 때, 마이크로 소각로는 일부 실험실이 가지고 있지 않거나 학생들이 사용할 수있는 각 벤치에 위치하지 않았을 수도있는 가스 라인이 필요하지 않습니다. 이러한 장점에서 영감을 얻은 프로토콜은 C. elegans 실험실에서 픽, 주걱 및 메스와 같이 일반적으로 사용되는 장비의 살균을 위해 화염의 사용을 마이크로 소각로로 대체하기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 C. elegans와 함께 작업 할 때 안전 및 / 또는 유연성을 향상시키려는 강사 및 연구원에게 적합 할 수 있습니다.
Protocol
1. 마이크로 소각로 준비
- 루프 홀더 액세서리 가이드를 마이크로 소각로에 부착하여 외부 배럴에 클리핑합니다.
- 마이크로 소각로를 표준 120V 또는 230V 전원 콘센트에 적절하게 꽂습니다.
참고: 이것은 벤치탑 또는 층류 후드에서 수행할 수 있습니다. - 마이크로 소각로를 높은 설정으로 돌리고 제조업체의 지침에 따라 10-20 분 동안 예열하여 800-825 oC의 최적 온도에 도달하십시오.
참고: 소각로를 3시간 이상 켜 두면 낮은 온도 설정(500o C)을 대기 설정으로 사용할 수 있습니다. 제조업체의 사용 설명서에 따르면 장비의 사용 수명이 연장됩니다.
2. 픽, 주걱 또는 메스를 살균하십시오.
- 가이드(21)를 따라 슬라이딩하여 측면을 만지지 않고 원통형 살균 영역에 기기를 삽입한다.
참고: 메스를 살균하는 경우 세라믹 벽을 블레이드로 만지지 않는 것이 중요합니다. 세라믹 벽을 긁으면 가열 장치의 무결성이 손상 될 수 있습니다. - 살균 구역에서 장비를 5-7 초 동안 유지하십시오.
- 가이드를 따라 뒤로 밀어 측면을 만지지 않고 계측기를 분리합니다.
- 픽의 경우, 웜을 만지기 전에 악기를 3-5 초 동안 식혀서 태우지 않도록하십시오.
참고 : 식히지 않는 메스 또는 주걱은 한천을 노래합니다. - 웜을 따낸 후, 픽을 챔버에 5-7초 동안 다시 삽입하여 픽의 웜을 소각합니다.
3. 비교방법 - 분젠버너를 이용한 기기의 살균
- 고무 튜브를 사용하여 Bunsen 버너를 가스 라인에 연결하십시오. 튜브를 단단히 고정하고 버너를 오버 헤드 물체로부터 멀리 떨어 뜨려야합니다.
- 가스 라인의 손잡이를 돌려 가스를 켭니다.
- 스트라이커 또는 라이터를 사용하여 버너에 불을 붙입니다.
- 파란색 원뿔이 보일 때까지 가스 손잡이와 공기 흡입구를 사용하여 화염을 조정하십시오.
- 픽, 주걱 또는 메스가 빨간색으로 빛날 때까지 불꽃 속에서 잡으십시오.
- 픽의 경우 웜을 만지기 전에 악기를 3-5 초 동안 식혀 태우지 않도록하십시오.
참고 : 식히지 않는 메스 또는 주걱은 한천을 노래합니다. - 웜을 따낸 후, 픽을 화염에 다시 삽입하여 픽의 웜을 소각합니다.
4. 실험
- OP50 에스케리치아 콜리(E. coli) 박테리아를 루리아 브로스22에서 37oC 진탕기에서 하룻밤 동안 배양하였다.
- 밤새 배양한 후, 배양물을 멸균수에 1:100의 비율로 희석한다.
참고: 이 희석 계수는 도금 후 콜로니의 분리를 보장하기 위해 선택되었습니다. - 박테리아 용액에 Bunsen 버너를 사용하여 멸균 된 웜 픽을 담그고 Bunsen 버너로 다시 살균 한 다음 멸균수 100 mL에 소용돌이 치십시오.
- 100 μL의 물을 10 cm LB 한천22,23 페트리 접시에 플레이트하고, 멸균 세포 스프레더를 사용하여 물을 확산시키고, 뚜껑을 씌운 채 실온에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
- 마이크로 소각로를 이용하여 멸균된 웜픽을 이용하여 단계 4.3-4.4를 수행한다.
- 양성 대조군으로서 재멸균 없이 4.3-4.4단계를 수행하십시오.
- 음성 대조군으로서, 박테리아 용액 대신에 멸균수를 사용하여 단계 4.3-4.4를 수행한다.
- 잠복기 후에 콜로니를 수동으로 계산하십시오.
Representative Results
마이크로 소각로 대 화염을 이용한 상대적 오염률을 입증하기 위해 간단한 실험(섹션 4)이 고안되었다(그림 1, 표 2). 이러한 결과는 여러 방법에 걸쳐 오염 속도를 나타내지만, 마이크로 소각로 기술을 사용하기 위해이 방법을 반복 할 필요는 없습니다. 실험은 삼중으로 실행되었다. 음성 대조군은 박테리아가 없는 멸균수였다. 양성 대조군은 멸균 기술을 사용하지 않았다: 픽을 희석된 OP50 배양물에 침지시킨 다음, 멸균수로 직접 옮겼다. 모든 반복실험 및 조건은 같은 날에 병렬로 실행되었다. 세 개의 음성 대조군 플레이트 모두에서, 제로 콜로니가 계수되었다. 4.7 (± 0.3 SEM) 콜로니의 평균 카운트는 Bunsen 버너가 픽을 살균하기 위해 사용될 때 얻어졌다. 3.3 (±1.2 SEM) 콜로니의 평균 카운트가 마이크로소각로 조건에서 관찰되었다. 그러나, 298.3 (±17.9 SEM) 콜로니의 평균 카운트가 양성 대조군 조건에서 수득되었다. Bunsen 버너와 마이크로 소각로를 비교한 동일한 분산을 가정한 2-꼬리 t-검정은 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았으며, p = 0.35였다. 따라서, 마이크로 소각로는 Bunsen 버너에 동등하게 효과적인 멸균 결과를 달성하였다.
그림 1: 살균 방법에 걸쳐 박테리아 계수. 픽을 멸균수에 1:100 OP50 배양물에 담근 다음, 분젠 버너 또는 마이크로 소각로를 사용하여 멸균하였다. 이어서, 픽을 멸균수에 담그고, LB 한천 22,23 상에 플레이팅하고, 실온에서24시간 동안 인큐베이션하고, 콜로니를 수동으로 계수하였다. 양성 대조군은 살균이 없었고 음성 대조군은 박테리아가없는 멸균수를 사용했습니다. n = 조건당 3회 반복실험. 참고: y축은 그래프의 관련 부분에서 데이터 포인트를 분리할 수 있도록 끊어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 살균 방법 | 비용 | 실험실 요구 사항 | 장점 | 단점 | |||
| 마이크로 소각로 | $365–530 | 120V 또는 230V 콘센트 | • 휴대용 • 화염 또는 노출 된 발열체 없음 • 층류 후드 및 생물학적 안전 캐비닛에서 사용 가능 |
• 워밍업 시간 • 더 높은 비용 |
|||
| 분젠 버너 | $24–169 | 가스 라인 | • 빠른 설정 • 저렴한 비용 |
• 화염 • 층류 후드 또는 생물학적 안전 캐비닛에는 사용하지 않는 것이 좋습니다. |
|||
| 에탄올 램프 | 11달러 | 없음 | • 빠른 설정 • 저렴한 비용 • 리필 가능 |
• 화염 • 리필 시 안전 위험 • 층류 후드 또는 생물학적 안전 캐비닛에는 사용하지 않는 것이 좋습니다. • 특정 기관에서는 허용되지 않습니다. |
|||
| 라이터 | $5–8 | 없음 | • 저렴한 비용 • 접근 가능 • 일회용 • 리필 가능 |
• 화염 • 손 작동 • 층류 후드 또는 생물학적 안전 캐비닛에는 사용하지 않는 것이 좋습니다. |
|||
표 1 : 살균 장비 방법 비교. 장비를 살균하는 네 가지 방법을 장점, 단점, 비용 및 실험실 요구 사항을 기준으로 비교했습니다.
| 복제 | 조건 | |||
| 마이크로 소각로 | 분젠 버너 | 음성 대조군 | 포지티브 컨트롤 | |
| 1 | 1 | 5 | 0 | 278 |
| 2 | 4 | 4 | 0 | 334 |
| 3 | 5 | 5 | 0 | 283 |
| 의미하다 | 3.3 | 4.7 | 0.0 | 298.3 |
| 증권 시세 표시기 | 1.2 | 0.3 | 0.0 | 17.9 |
표 2: 멸균 방법에 걸친 박테리아 수의 원시 데이터. 픽을 멸균수에 1:100 OP50 배양물에 담근 다음, 분젠 버너 또는 마이크로 소각로를 사용하여 멸균하였다. 이어서, 픽을 멸균수에 담그고, LB 한천 22,23 상에 플레이팅하고, 실온에서24시간 동안 인큐베이션하고, 콜로니를 수동으로 계수하였다. 양성 대조군은 살균이 없었고 음성 대조군은 박테리아가없는 멸균수를 사용했습니다. n = 조건당 3회 반복실험. 평균 및 SEM은 개별 카운트 아래에보고되었습니다.
Discussion
C. elegans 는 학부 교육 실험실에서의 연습에 적합한 모델 유기체입니다. 화염 대신 마이크로 소각로를 사용하면 연구 실험실과 교실 실험실 모두에서 이점을 얻을 수 있습니다. 사실, 학부 실험실 과정은 새로 훈련 된 과학자의 수를 감안할 때 우발적 인 화재의 위험이 더 높을 수 있습니다. 또한, 에탄올 증기가 점화 될 수 있기 때문에 에탄올이 화염원 근처의 도구를 살균하는 데 사용될 때 화재의 위험이 증가합니다. 휴대성은 또한 각 벤치에 가스 라인이 설치되지 않은 교실에 이점을 제공합니다. 이 방법은 우리 기관의 교육 및 연구 실험실에서 사용되어 2016 년 설립 이후 오염이 증가하지 않고 실험실 안전 사고가 발생하지 않았습니다.
마이크로 소각로와의 호환성을 보장하기 위해 다양한 장착, 와이어 구성 및 와이어 게이지가있는 다양한 픽을 테스트했습니다. 와이어 조성에는 100 % 백금뿐만 아니라 와이어 두께가 30-32 G인 90 % 백금 / 10 % 이리듐이 포함되어있어 두께와 조성에 관계없이 가열 방법은 와이어 무결성을 손상시키지 않았습니다. 마운팅에는 상업적으로 이용 가능한 두 가지 유형의 픽 핸들과 파스퇴르 피펫의 사내 유리 마운팅이 포함되었습니다. 픽은 화염에서처럼 빨갛게 뜨겁게 빛나지 않습니다. 그러나 살균기가 적절한 온도에 도달하는 한 충분한 살균이 여전히 이루어집니다. 따라서 제조업체의 지침에 표시된 대로 마이크로 소각로를 10분 또는 20분 동안 예열하는 것이 중요합니다. 살균을 달성하기 위해 적어도 5 초 동안 챔버에 장비를 유지하는 것도 중요합니다. 챔버에 계측기를 7초보다 오래 두면 계측기에 해를 끼치 지 않지만 불필요합니다. 이것은 최소한의 단계로 비교적 간단한 절차이며 문제 해결이 필요하지 않을 수도 있지만 측면을 만지지 않고 배럴에서 악기를 안정시키는 법을 배우는 데 약간의 연습이 필요할 수 있습니다.
화염을 대체하기 위해서는 멸균 방법이 실험실에서 사용되는 모든 응용 분야를 포괄해야합니다. 살균 장비 외에도 C. elegans 실험실은 Bunsen 버너를 사용하여 플레이트를 붓거나 배양물을 접종하는 것과 같은 다른 작업을 수행하기 위해 멸균 필드를 만들 수 있습니다13. 그러나 이것이 멸균 된 필드를 만들거나 여전히 실행 가능한 오염 물질을 끌어 들일지 여부는 논란의 여지가있는14 가지 논란의 여지가있다. 모든 기관에서 선택 사항은 아니지만 생물 안전 캐비닛 또는 층류 후드를 이러한 목적으로 사용할 수 있으므로 실험실이 화염을 사용하지 않고도 작동 할 수 있습니다. 대부분의 마이크로 소각로에 대한 사용 설명서는 내벽을 긁으면 살균기가 손상되기 때문에 메스 블레이드의 살균에 사용하지 말 것을 권장합니다. 그러나 가이드를 조심스럽게 사용하면 내벽에 닿지 않고 메스 블레이드 나 주걱을 살균 할 수 있습니다. 이것은 화염을 사용하지 않고 청크를 허용하기 위해이 기술의 사용을 확장하고 C. elegans 실험실이 다른 물체를 살균하는 기술을 전환하지 않고도 기능을 수행 할 수있게합니다.
표 1에 설명된 바와 같이, 마이크로 소각로는 향상된 안전성, 층류 후드와의 호환성 증가, 화염 기반 방법에 비해 향상된 휴대성을 제공하지만 한계가 있습니다. 그들은 다른 방법보다 비용이 많이 들고 살균 온도가 달성되기 전에 예열 시간이 필요합니다. 결론적으로, 많은 미생물학 실험실에서 일상적으로 사용되는이 방법은 불임성을 손상시키지 않고 실험실 안전을 개선하고자하는 일부 C. elegans 연구 및 교육 실험실에 적용 할 수 있습니다.
Disclosures
이해 상충은 공개되지 않았습니다.
Acknowledgments
저자들은 수잔 하워드와 저스틴 핀을 인정하고 싶다. 이 연구는 Wellesley College Neuroscience Department에서 자금을 지원했습니다. N2 웜은 NIH Office of Research Infrastructure Program (P40 OD010440)이 자금을 지원하는 CGC에 의해 제공되었습니다. 이 기사의 출판 비용은 Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund에서 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
- Attix, H., et al. Wild caught nematode identification and early embryo development: An accessible undergraduate research experience. microPublication Biology. 2021, (2021).
- Rose, J. K. Demonstrating connections between neuron signaling and behavior using C. elegans learning assays and optogenetics in a laboratory class. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 16 (3), 223-231 (2018).
- Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education: JUNE: A Publication of FUN, Faculty for Undergraduate Neuroscience. 15 (1), 44-55 (2016).
- Raley-Susman, K. M., Gray, J. M. Exploration of gerontogenes in the nervous system: a multi-level neurogenomics laboratory module for an intermediate neuroscience and behavior course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 8 (2), 108-115 (2010).
- Stiernagle, T.
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
- JoVE. Biology I: yeast, Drosophilia, and C. Elegant. C. Elegans Maintenace. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Hope, I. A. C. elegans: A Practical Approach. , IRL. Oxford University Press. Oxford. (1999).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with Worms: Caenorhabditis elegans as a Model Organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
- Waechter-Brulla, D. Improving safety in the microbiology laboratory through active learning and investigation. American Society for Microbiology. , (2000).
- Young, J. A. It says in the books that ethanol burns with a cool flame. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1488 (2000).
- Mojtabai, F., Kaufman, J. A. Learning by accident. V. 2. , Laboratory Safety Institute. Natick, MA. (2005).
- JoVE. General Laboratory Techniques. Introduction to the Bunsen Burner. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Katz, D. S. The streak plate protocol. American Society for Microbiology Laboratory Protocols. , (2008).
- Public Health Agency of Canada. Agency of Canada Canadian Biosafety Handbook. Government of Canada. , Ottawa, ON. (2016).
- Emmert, E. A. B. ASM Task Committee on Laboratory Biosafety Biosafety guidelines for handling microorganisms in the teaching laboratory: development and rationale. Journal of Microbiology & Biology Education. 14 (1), 78-83 (2013).
- Collins, C. H. Health Hazards in Microbiology. Handbook of Laboratory Health and Safety Measures. Pal, S. B. , Springer. Dordrecht. (1990).
- Laboratory Biosafety Manual. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/I/item/9789240011311 (2020).
- Fleming, D. O. Laboratory Safety Principles and Practices. American Society for Microbiology. , ASM Press. Washington, D.C. (1995).
- Gordon, R. C., Davenport, C. V. Simple modification to improve usefulness of the Bacti-Cinerator. Applied Microbiology. 26 (3), 423 (1973).
- Cold Spring Harbor.
- Cold Spring Harbor. Media containing agar or agarose. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
