Summary
הפרוטוקול כאן מתאר את השיטות להערכת דפוסי ההתיישבות המיקוריזאלית הארבוסקולרית והאסטרטגיה בשורשים לשני מינים: Zea mays ו-Festuca rubra. השימוש בשיטת MycoPatt מאפשר חישוב פרמטרים, המרה של מבנים מיקוריזאליים לנתונים דיגיטליים ומיפוי מיקומם האמיתי בשורשים.
Abstract
פטריות מיקוריזאליות ארבוסקולריות הן סימביונטים בשורשי הצמחים. תפקידם הוא לשמר את התפתחות המארחים ולשמור על שיווי המשקל התזונתי במערכות האקולוגיות. תהליך ההתיישבות תלוי במספר גורמים כמו אקולוגיה של הקרקע, המגוון הגנטי של הפטריות והפונדקאי, ופרקטיקות אגרונומיות. פעולתם המסונכרנת מובילה להתפתחות רשת היפאלית מורכבת ומובילה להתפתחות משנית של שלפוחיות וארבוסקולות בתאי השורש. מטרת מחקר זה הייתה לנתח את היעילות של שיטת תבניות המיקוריזה (MycoPatt) למיקום מבנים פטרייתיים בשורשים של Festuca rubra ו - Zea mays. מטרה נוספת הייתה לחקור את אסטרטגיית ההתיישבות הפטרייתית כפי שהיא מתגלה במפות מיקוריזאליות של כל מין. הרכישה וההרכבה של תמונות מיקרוסקופיות מרובות מאפשרות הערכת התיישבות מיקוריזאלית הן בצמחי תירס והן בצמחי צואה אדומה כדי לספק מידע על המיקום המציאותי של המבנים המפותחים. דפוסי המיקוריזה שנצפו מדגישים את היעילות המשתנה של כל צמח במונחים של פיתוח קשרים עם פטריות סימביוטיות בקרקע, הנגרמות על ידי טיפולים יישומיים ושלב הצמיחה. מפות מפורטות של מיקוריזאל המתקבלות בשיטת MycoPatt שימושיות לגילוי מוקדם של יעילות הצמח ברכישה סימביוטית מהקרקע.
Introduction
פטריות מיקוריזה ארבוסקולריות (AM) הן קטגוריה של אנדופיטים הנישאים בקרקע ומהווים כל הזמן תחום עניין עבור חוקרים. נוכחותם בשורשים של רוב הצמחים ומעורבותם במחזורי חומרי מזון הופכת אותם למרכיבים חיוניים ביציבות של כל מערכת אקולוגית שבה נמצאים צמחים עשבוניים 1,2. באמצעות התפטיר החוץ-רדיקולרי שלהם, AM משמש כהרחבה פטרייתית לשורשי צמחים, במיוחד באזורים שקשה להגיע אליהם3. הפעילות העיקרית היא בשורשי צמחים מארחים, שם AM מפתחת רשתות גדולות של מקף ומבנים תוך-תאיים ספציפיים הנקראים ארבוסקולים. חוסר הספציפיות של המארח מאפשר לסימביונט ליישב מספר מינים בו זמנית. יכולת זו מספקת ל-AM את התפקיד של הקצאת משאבים וויסות חומרים מזינים במערכת האקולוגית; הפטרייה גם מספקת תמיכה בהישרדות הצמחים ומסייעת בביצועי הצמח 4,5,6,7. התגובה של מיני AM לשורשים מארחים נראית בהרחבה ובמיקום של התפטיר התוך-רדיקולרי והנוכחות והצורה של הארבוסקולים התפתחו תוך תאיים. הארבוסקולים התוך-תאיים משמשים כנקודת החלפה בין שני הסימביונטים ומייצגים אזורים המאופיינים בתהליכי העברה מהירים. המבנים שה-AM מייצרים הם תלויי מינים, ובנוסף לארבוסקולים, בשורשים, הם מפתחים גם שלפוחיות, נבגים ותאי עזר.
ישנם אתגרים רבים בהערכת סימביונטים של AM בשורשי צמחים 8,9. הראשון הוא ההתפתחות המתמדת שלהם במהלך כל תקופת הצמחייה של המארחים, מה שמוביל לשינויים מרובים במבנה הארבוסקולרי ההיפלי. השלבים השונים של הצמיחה הארבוסקולרית, עד לקריסתם, נמצאים בבירור בשורשים, אך מבני AM הסנסנטיים מתעכלים לפעמים, מה שהופך אותם לנראים רק באופן חלקי10. האתגר השני מיוצג על ידי שיטת הצביעה והפרוטוקול, המגוון הגדול של מערכות השורשים, ממד התאים שלהן וההבדלים בעובי, המקשים על הצעת שיטה אחידה. האתגר האחרון מיוצג על ידי הערכה וניקוד של קולוניזציה AM. ישנן שיטות רבות המבקיעות AM בדרגות שונות של אובייקטיביות, ורובן עדיין מוגבלות לטכניקות מיקרוסקופיה. הפשוטים מבוססים על נוכחות/היעדר מבנים בקליפת השורש, ואילו המורכבים יותר מבוססים על ניקוד חזותי ושימוש במחלקות קולוניזציה, תוך אינטגרציה של התדירות והעוצמה של תופעת הקולוניזציה. הרבה נתונים הופקו בעשורים האחרונים על מצב המיקוריזה של מינים מרובים, אך רוב השיטות מוגבלות לערך הנצפה של קולוניזציה מבלי להצביע על המיקום האמיתי של כל מבנה בקליפת השורש. כתגובה לצורך בתוצאות מדויקות יותר על התיישבות AM, פותחה שיטה המבוססת על ניתוח מיקרוסקופי של תבניות מיקוריזאליות (MycoPatt) בשורשים כדי להרכיב, בצורה דיגיטלית, את מפות המיקוריזאל המפורטות11. כמו כן, השיטה מאפשרת חישוב אובייקטיבי של פרמטרי קולוניזציה וקביעת המיקום בפועל של כל מבנה בשורש.
המיקום של מבנים פטרייתיים AM יכול להיות חשוב לענות על שתי השאלות הבאות. הראשון קשור לניתוח הקולוניזציה ברגע מסוים אחד ממחזור הצמחייה של הצמח. בהקשר זה, כדאי מאוד להתבונן בשפע הארבוסקולרי/שלפוחית, לדווח כיצד הם ממוקמים בשורש, ולספק תמונת קולוניזציה ופרמטרים ברורים מאוד. השני קשור לזיהוי אסטרטגיה פטרייתית והאוריינטציה שלה ואפילו לתחזית התפתחותה העתידית. יישום אחד של MycoPatt יכול להיות עבור צמחים מנותחים מדי יום, כל 2-3 ימים, מדי שבוע, או במהלך שלבי צמיחה שונים. בהקשר זה, מיקום הבועיות/ארבוסקולות חשוב כדי להבין טוב יותר את המנגנון הביולוגי של התיישבות AM. פרמטרים ותצפיות אלה שימושיים מאוד כדי להשלים את הפרמטרים המתמטיים.
מטרת מאמר זה היא להדגים את יכולתה של מערכת MycoPatt לחקור את הפוטנציאל והאסטרטגיה של התיישבות פטריות AM בשורשי Zea mays (תירס) בשלבי התפתחות שונים ובשורשי Festuca rubra (צואה אדומה) בתנאי הפריה ארוכי טווח שונים. כדי להגשים את המטרה נותחו שני מאגרי מידע גדולים משני ניסויים. ניסוי התירס נערך בקוג'וצ'נה (46°44′56" lat. N ו-23°50′0" אורך). E), בחווה הדידקטית הניסויית של האוניברסיטה למדעי החקלאות והרפואה הווטרינרית קלוז' על פאוזיום עם אדמה מרקם שמנמן12. ניסוי הצואה האדומה הוא חלק מאתר ניסוי גדול יותר שהוקם בשנת 2001 בגהשארי, הרי אפוסני (46°49'064" lat. N ו-22°81'418''' אורך). E), על אדמת פרלובוסול (טרה רוסה) סוג13,14. התירס נאסף בחמישה פנופאזות גדילה שונות12: B1 = 2-4 עלים (כנקודת בקרה לתחילת ההתיישבות המיקוריזאלית); B2 = 6 עלים; B3 = 8-10 עלים; B4 = היווצרות cob; B5 = בגרות פיזיולוגית. החל משלב 2-4 העלים (A0), הוחל טיפול אורגני, שהביא לגורם שני סיום (A1 = בקרה ו- A2 = מטופל). שורשים של צואה אדומה נאספו בפריחה מניסוי עם חמש הפריות ארוכות טווח13,14: V1 = בקרה, לא מופרית; V2 = 10 t·ha-1 זבל; V3 = 10 t·ha-1 זבל + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 זבל + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. בכל שלב נאספו חמישה צמחים מכל גרסת הפריה. פרוטוקולי הצביעה וביצועיהם מבחינת זמן עיבוד הדגימה ואיכות הכתמים נותחו. הקשר בין התפתחות AM hyphae לבין נוכחות המבנים שלו בשורשים נותח בנפרד עבור כל מין והמשיך בזיהוי השורשים המתירניים ביותר להתיישבות. דפוסי הקולוניזציה הספציפיים של כל מערכת שורשים נותחו על סמך מפות קולוניזציה והערך של פרמטרי AM.
תירס הוא צמח שנתי, אשר מרמז על צמיחה מתמשכת של השורשים, וזה היה הסיבה העיקרית ליישם את MycoPatt בשלבי הגידול. צואה אדומה היא צמח רב שנתי ממרעה שטופלה במשך זמן רב בדשנים שונים. לשורשיו יש התפתחות קצרה יותר של שנה, והאנתזה נחשבת לנקודת הצמחייה כאשר הצמח משנה את חילוף החומרים שלו מווגטטיבי לגנרטיבי. כדי לתפוס צמחים אלה במהלך תקופות פעילות אינטנסיביות אלה, נבחרו נקודות הזמן הנ"ל. דיגום בתקופת הצמחייה קשה למין זה כאשר הוא גדל בערבות טבעיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בחירת חומר ביולוגי, דגימת שורשים ואחסון
- אספו את כל שורש הצמחים עם חפירה (איור 1A) בנפרד עבור כל וריאנט ושכפלו. מוציאים בעדינות, ביד, את אגרגטי הקרקע הגדולים מהשורשים. שטפו את כל מערכת השורשים ומדדו אותה בקנה מידה עם תאים בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ (איור 1B). חותכים את השורשים בנפרד עבור כל צמח, ומניחים אותם לתוך שקית ניילון.
- אספו את כל השורשים הנקיים מכל צמח בשקית ניילון, ואספו את כל הדגימות מגרסה אחת בשקית אחת גדולה יותר. כתוב על כל שקית את שם הבמה / הגרסה ואת תאריך הדגימה. אחסנו את השורשים במקרר או במקפיא בטמפרטורה שבין −4°C ל-−20°C עד לעיבוד.
2. עיבוד שורשים, ניקוי והכתמה למיקרוסקופיה
הערה: השתמש בכפפות, מסכה ומכסה מנוע מיקרוביולוגי/כימי לשלב זה של הפרוטוקול.
- ודאו שתהליך הפשרת השורשים נעשה באיטיות בטמפרטורת החדר. עבור כל השלבים של עיבוד, להשתמש צנצנות קטנות (30-50 מ"ל) כדי להפחית את כמות החומרים הדרושים.
- בצע את ארבעת השלבים הבאים של הליך הניקוי וההכתמה האיטי15. בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר. שיטה זו מאפשרת עיבוד של מספר רב של דגימות בו זמנית ללא שימוש באמבט מים לרתיחה.
- ניקוי שורשים: מניחים את כל השורשים מצמח אחד בצנצנת. מכינים תמיסת NaOH 10% עם מי ברז ויוצקים אותה לכל צנצנת עד שהיא מכסה לחלוטין את השורשים. לנער את הצנצנות במרץ במשך 1 דקה או 2 דקות כדי לייצר פיזור הומוגני של תמיסת ניקוי בשורשים. חזור על הליך זה לאחר 24 שעות ולהשאיר את השורשים בתמיסת הניקוי לפחות 48 שעות.
הערה: לשורשים נקיים יש היבט צהוב חיוור (עד לבן), והמרקם רך (ניתן לרסק אותם בקלות על ידי לחיצה עם פינצטה). - שטיפת שורשים: מעבירים את התוכן של צנצנת אחת בכל פעם דרך מסננת. מחזר את פתרון הסליקה. יש לשטוף את השורשים מספר פעמים במי ברז עד להסרתם המלאה של תמיסת הסליקה.
הערה: אם תמיסת הניקוי לא תוסר לחלוטין, הדבר ישפיע על איכות הליך ההכתמה. - מכתים שורשים: מניחים את השורשים השטופים בצנצנת נקייה. הכינו תמיסת חומץ דיו 5%:5% עם מי ברז (5 מ"ל דיו כחול + 5 מ"ל של 9% חומצה אצטית + 90 מ"ל של מי ברז). יוצקים את התמיסה לכל צנצנת עד שהיא מכסה לחלוטין את השורשים. נערו את הצנצנות במרץ במשך דקה או 2 דקות כדי לייצר פיזור הומוגני של תמיסת צביעה בשורשים. חזור על הליך זה לאחר 24 שעות ולהשאיר את השורשים בפתרון זה במשך 48 שעות.
הערה: לשורשים מוכתמים יש צבע כחול עז. - ניקוי חלקי של השורשים: שטפו את השורשים המוכתמים במי ברז למשך 1-2 דקות. נערו את הצנצנות במרץ כדי להסיר את תמיסת הכתמים הנוספת. חזור על ההליך אם הכתם עז מדי ואינו מאפשר הערכה מיקרוסקופית ברורה.
הערה: ניתן לשמור שורשים מוכתמים במי ברז עד שבוע בטמפרטורת החדר מבלי לשנות את איכות הכתמים (איור 2). לתקופות ארוכות יותר, ניתן לשמור על שורשים עד 2-3 חודשים בתמיסת חומץ תפוחים מסחרית של 5% (5% חומצה אצטית).
- ניקוי שורשים: מניחים את כל השורשים מצמח אחד בצנצנת. מכינים תמיסת NaOH 10% עם מי ברז ויוצקים אותה לכל צנצנת עד שהיא מכסה לחלוטין את השורשים. לנער את הצנצנות במרץ במשך 1 דקה או 2 דקות כדי לייצר פיזור הומוגני של תמיסת ניקוי בשורשים. חזור על הליך זה לאחר 24 שעות ולהשאיר את השורשים בתמיסת הניקוי לפחות 48 שעות.
3. עיבוד שורש למיקרוסקופיה
- פילוח שורשים: הניחו את השורשים המוכתמים מכל דגימה על קרש חיתוך מוקטן (איור 3A). חותכים את השורשים למקטעים של 1 ס"מ (איור 3B). בחר 15 מקטעים עבור כל גרסה.
- שיטת ריסוק עדינה להכנת הקטע: מורחים את השורשים על שקופית. השתמשו בשקית למינציה לכיסוי השורשים ומעכו אותם בעדינות החל מהקצה (איור 3C,D). השתמש בכלי פלסטיק רך, כגון פינצטה, ידית אזמל, עט או עיפרון עם מחק, כדי להציג באיטיות את השורשים בשקופית. הסירו בזהירות את שקית הלמינציה וכסו את הדגימה בכיסוי (איור 3E).
הערה: לשורשים יש צורה צינורית, ולכן יש צורך להפריד ביניהם במישור דו-ממדי. פעולה זו מניחה את הפרדת השורשים בנקודה האמצעית, מה שמוביל לתצוגה של שני חלקי הקוטר הפנימי. השימוש בשקיות למינציה בהליך הריסוק העדין מאפשר להציג את השורשים, בעלי צורת גליל, בשני חלקים - אחד משמאל ואחד מימין - לכיוון נקודת האמצע שלהם. בדרך זו, השורש כולו מנותח לעומק, ודרגת הקולוניזציה היא הפרמטר המציג את הקולוניזציה הנפחית (המתוארת בעבודה המקורית על MycoPatt11). בעיקרון, אנחנו חותכים גליל לשניים, ואחרי זה, אנחנו בונים אותו מחדש מתמטית. - הוסיפו מים לפינה של המגלשה עם פיפטה ותנו למים להתפשט באיטיות על המגלשה (איור 3F). מוציאים את המים הנוספים בעזרת מגבת נייר.
4. ניתוח מיקרוסקופי של דגימות השורש
- השתמש במיקרוסקופ המצויד במצלמה ברזולוציה טובה.
- נתח את השקופיות החל מקיצוניות. צלם כל שדה מיקרוסקופי. שנה את השם של כל תמונה שצולמה עם קוד שיאפשר את ההרכבה האמיתית שלאחר ההרכבה של חלקי השורש. עבור שורשים עבים, השתמש בהגדלה של 10x או 40x, ועבור שורשים דקים, השתמש בהגדלה של 40x. השתמש באותה מטרה והגדלה עבור כל קבוצת השורשים ממין מסוים.
5. אסמבלאז' תמונה לאחר מיקרוסקופיה
- השתמש בתוכנת מצגות כדי לעצב לוח שרטוט להרכבת תמונות. הגדר את הרוחב 2-3 ס"מ רחב יותר מרוחב התמונה. הוסיפו את כל התמונות שצולמו מקטע אחד לפי סדר לכידתן ושחזרו את כל אורך מקטע השורש (איור 4A).
- בקצרה, אסוף סך של 15 תמונות עבור כל קטע של 1 ס"מ וארגן אותן אנכית, החל מ- 1 עד 15, בתוכנת המצגת כדי לשחזר את המקטע.
- יישרו את התמונות במרכז. השתמש ביישור האנכי כדי לוודא שכל תמונה עוקבת אחר התמונה הקודמת. בכל התמונות, מקם רשת של 10 תאים x 150 תאים כדי לכסות את כל מקטע השורש.
- בנוסף, בכל תמונה בנפרד, מקם רשת בגודל 10 x 10, ובכל תא ברשת זו, הוסף מספר מאחד עד שישה אם מבנה AM גלוי או השאר ריק אם אין מבנה AM. בדרך זו, הדיוק של התהליך הוא מקסימלי ללא שגיאות במיקום של מבני AM להיות שנצפו.
- הוסף טבלה עבור רשת של 10 תאים ברוחב ו- 150 תאים באורך (15 ריבועים של 10 תאים x 10 תאים). שנה את מידות רוחב הטבלה לרוחב התמונות. שנה את אורך הטבלה כך שתכלול את כל התמונות (איור 4B).
6. ניקוד של התיישבות מיקוריזאלית
- השתמש במספר הייחודי כדי לדרג כל סוג של מבנה כמתואר בשיטת תבניות מיקוריזאליות11: 1 עבור hyphae; 2 עבור ארבוסקולים; 3 עבור שלפוחית; 4 לנבגים; 5 עבור תאי עזר; ו-6 עבור נקודות כניסה (איור 4C). ניקוד כל אחד מהם צפה במבנה מיקוריזאלי מכל תא ברשתות שהוחלו קודם לכן (איור 4D).
7. ניתוח נתונים גולמיים וחילוץ תוצאות
- הוסף את כל הציונים שהתקבלו בגיליון האלקטרוניMycoPatt 11. השתמש בפונקציית העתקה/הדבקה כדי להעביר את כל התוצאות מהמצגת לגיליון הראשון שנקרא rawdata (איור 5).
- ניתוח ראשוני של תוצאות: השתמש בפרמטרים בעלי שם הגיליון השלישי בכלי הגיליון האלקטרוני MycoPatt כדי להציג את התוצאות באופן חזותי כאחוזים (%) בנפרד בשלוש צורות (איור 6A-C). השתמש בעמודות A עד K כדי לנתח את התמונה האופקית של הקולוניזציה; עמודות M עד W כדי לנתח את התמונה האנכית של הקולוניזציה; ועמודות Y עד AI כדי לנתח את הקולוניזציה הרוחבית (הממוצעת) עבור כל אחד מ-15 ריבועי 10 x 10 (קווים 2-17) והקולוניזציה הממוצעת הסופית (קווים 19-20).
הערה: הקולוניזציה הממוצעת הרוחבית משמשת לחישוב פרמטרי הקולוניזציה האמיתיים, הקשורים לניתוח אופקי ואנכי כאחד. בדרך זו, לא ניתן לבצע שגיאות בהשוואה אם רק ניתוח אופקי או אנכי משמש (המתואר בפירוט בעבודה המקורית11). כמו כן, קבוצה זו של פרמטרים מחושב עבור כל פני השטח של השדה המיקרוסקופי.- השתמש בהגדרות ובנוסחאות, הספציפיות לכל פרמטר, כדי לנתח את התוצאות11. השתמש בפרמטרים הבאים של התיישבות: תדירות הקולוניזציה (%), עוצמת הקולוניזציה (%), ארבוסקולים (%) ובועיות (%), נבגים (%) ותאי עזר (%), נקודות כניסה (%), אחוז האזורים שאינם מיקוריזאליים (%), מידת הקולוניזציה הכוללת (%), ודיווח על אזורים מיקוריזאליים/לא מיקוריזאליים.
הערה: אם חסרים ארבוסקולים, שלפוחיות, נבגים, תאי עזר ונקודות כניסה בדגימות שנותחו, הגיליון האלקטרוני של MycoPatt ייתן להם ציון אפס (0).
- השתמש בהגדרות ובנוסחאות, הספציפיות לכל פרמטר, כדי לנתח את התוצאות11. השתמש בפרמטרים הבאים של התיישבות: תדירות הקולוניזציה (%), עוצמת הקולוניזציה (%), ארבוסקולים (%) ובועיות (%), נבגים (%) ותאי עזר (%), נקודות כניסה (%), אחוז האזורים שאינם מיקוריזאליים (%), מידת הקולוניזציה הכוללת (%), ודיווח על אזורים מיקוריזאליים/לא מיקוריזאליים.
- הפקה והפקה של מפות מיקוריזאליות: דמיינו את התמונה המתקבלת מהמרה של מבנים מיקוריזאליים מקודדים לצבעים בגיליון השני של הגרפים בעלי השם MycoPatt (איור 7A). ייצא את תמונת התוצאה בגיליון הגרפים כתמונה (איור 7B). השתמש בקוד הצבע במקרא לניתוח תבניות מיקוריזאליות.
- ניתוח מפת מיקוריזאל: זהה את המבנים החשובים ביותר ואת ההרכבה שלהם במפות מיקוריזאליות. תאר את דפוס ההתיישבות המיקורייזאלי שנצפה בשורשים המנותחים. תאר את אסטרטגיית ההתיישבות המיקוריזאלית המבוססת על התפתחות מבנית נצפית בשורש, תבנית ההסתעפות והתפתחות ארבוסקולה/שלפוחית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השימוש הנכון בשיטת הריסוק העדינה של השורשים לאחר הליכי הצביעה מספק פרטים טובים על מבנים מיקוריזאליים, הן עבור Zea mays (איור 8A-C) והן עבור Festuca rubra (איור 9A-E), ניגודיות טובה בין מבנים מיקוריזאליים לתאי שורש, ואישור של המצבה בשל הצבע הכחול. אם הליכי הניקוי וההכתמה לא מצליחים, קשה לרסק דגימות שורשים והן לא מראות בבירור מבנים מיקוריזאליים (איור 10A-E). במקרה זה, חזור על כל הליך הניקוי-צביעה.
השימוש בשיטת תבנית המיקוריזה ובכלי MycoPatt אפשרו חקירה מלאה של מנגנון הקולוניזציה. השיטה מספקת חקירה מעמיקה בקנה מידה קטן של דפוסי קולוניזציה ואסטרטגיות עבור כל מין (איור 11 ואיור 12) עם ביטוי חזותי נוסף של פרמטרי קולוניזציה (טבלה 1 וטבלה 2). שני המחקרים שנערכו על Zea mays, שתוארו בהרחבה על ידי Pop-Moldovan et al.12, ו- Festuca rubra, שפורטו על ידי Corcoz et al. 13,14, סיפקו מסד נתונים גדול של תצפיות, מפות מיקוריזאליות ופרמטרים של התיישבות. שני מסדי הנתונים דירגו את תדירות הקולוניזציה (%), עוצמת הקולוניזציה (%), ארבוסקולס (%) ושלפוחית (%), אחוז האזורים שאינם מיקוריזאליים (%), מידת הקולוניזציה הכוללת (%), והדיווח על אזורים מיקוריזאליים/לא מיקוריזאליים כפרמטרים להתיישבות. עבור Zea mays, מסד הנתונים כלל 5,850 ערכי שורה במסד הנתונים של הגיליון האלקטרוני, שנאספו ב-390 מפות קולוניזציה. ניסוי Zea mays הציע את הדיווח על אזורים מיקוריזאליים/לא מיקוריזאליים כפרמטר לתיאור החלפה ושיבוש בין אזורים מיושבים בשורשים. הגישה מאפשרת ניתוח מעמיק של מנגנון ההתיישבות והתפתחותו לאורך השורשים. Festuca rubra סיפקה מסד נתונים של 4,500 ערכי שורה בגיליון האלקטרוני, שנאספו ב-300 מפות. מדד חדש אחד הוצע, דו"ח arbuscules/vesicles, ששימש גם כאינדיקטור לאסטרטגיית הקולוניזציה. ההערכה הכוללת של אסטרטגיית ההתיישבות הציעה ארבעה תרחישים שונים של התפתחות מיקוריזאלית: 1) אסטרטגיית התפשטות, 2) אסטרטגיית העברה, 3) אסטרטגיית אחסון, ו-4) אסטרטגיית עמידות צמחים. לצורך הפקת המפות המיקוריזאליות המייצגות ביותר, שני מסדי הנתונים נחקרו על סמך ערכים ממוצעים מותמרים של תדירות ועוצמת הקולוניזציה, וכתוצאה מכך נוצרו שלוש מפות שונות עבור כל וריאנט שנותח (טבלה 1 וטבלה 2). שלוש המפות מייצגות את קולוניזציה AM ממקטעי השורש בעלי הערכים הקרובים ביותר לערכים הבאים: הממוצע (Av) של כל וריאנט, המחושב על סמך כל הנתונים הזמינים עבור משתנה; Av−, המייצג ערך המחושב על ידי ההפרש בין ממוצע לממוצע/2 (Av−Av/2) ומראה פוטנציאל התיישבות נורמלי נמוך יותר; וה-Av+, המייצג ערך המחושב על ידי הסכום שבין ממוצע לממוצע/2 (Av+Av/2) ומראה פוטנציאל התיישבות נורמלי גבוה יותר. השימוש בנוסחת מיצוי זו מאפשר למשתמש להימנע מהקיצוניות (הגבוהה ביותר או הנמוכה ביותר) של הקולוניזציה. השיטה מאפשרת מיצוי של המקרים האפשריים ביותר של התיישבות mycorrhizal.
Zea mays הציג פוטנציאל התיישבות תנודתי מאוד, שהיה תלוי בשלב ההתפתחות של הצמח (טבלה 1, איור 11). ערכי תדירות הקולוניזציה נעו מאוד בין 3.67%-69.60%, בתמיכת ערכים של 50% לעוצמת הקולוניזציה. הסיבה העיקרית לתופעה זו היא שמערכת השורשים מתפתחת ברציפות לאורך כל תקופת הצמחייה. ארבוסקולס הציג ערכים מקסימליים בשלב ההתפתחות של 6 עלים (B2), עם ירידה בשלבי הצמיחה הבאים. בועיות הופיעו באופן ספורדי, עם ערכים נמוכים מ -1%. חקר דפוסי המיקוריזה גילה כי ההיפ פותח באזורים שונים של השורשים, עם הרחבה מוגבלת. נצפו הפסקות גדולות בין אזורים מיושבים, עם התפתחות לא סדירה של hyphae סביב הנקודה המרכזית של הקולוניזציה. אסטרטגיית ההתיישבות הראתה הבדלים גדולים במרווח הזמן של עמידות הצמח לאסטרטגיות ההתפשטות וההעברה. השלב של 6 עלים (B2), ואחריו שלב היווצרות הקוביות (B4), הציגו אסטרטגיית העברה של קולוניזציה, שנמשכה על ידי דיווחי האזור המיקורי/לא מיקורי שהיו נמוכים מ-0.14. המקרה היחיד עם אסטרטגיית העברה גבוהה נראית לעין נרשם בשלב B2 כאשר שטחים גדולים של שורשים הציגו ארבוסקולים. המיקום הכללי שלהם הראה הפרדה ברורה בין האזור שבו פותחו ארבוסקולים לבין האזור שבו ארבוסקולים היו בשלב מתפתח. דפוס הקולוניזציה הממוצע ההומוגני ביותר נצפה בשלב הפיתוח B5, עם אזורים קבועים שאינם מיושבים בין אלה המתיישבים. ההערכה הכוללת של תופעה חזותית זו התאימה לתקופת הצמחייה הסופית, עם ערכים קטנים של arbuscules, אשר הצביעו על רגרסיה של מבנים אלה.
פסטוקה רוברה (שם מדעי: Festuca rubra ) הוא מין דומיננטי בערבות הרים עם מערכת שורשים רב-שנתית. בשל הסתגלות זו, רוב תהליכי ההתיישבות מתרחשים בתוך השורשים, והתפתחות רשתות היפאל מתואמת עם מהירות התפתחות נמוכה של השורשים (טבלה 2, איור 12). בשל היישום של דשנים, הפרמטרים קולוניזציה הציגו הבדלים גבוהים בין וריאנטים. ההבדלים בתדירות ההתיישבות היו 65%, שנמשכו על ידי הבדל של 36% בעוצמות שתועדו. כל וריאנט הראה דפוס התיישבות שונה, בקורלציה עם היישום ארוך הטווח של הטיפולים, ומלווה בשונות בין 0.09-0.96 בדו"ח האזורים המיוקורטיביים/לא מיקוריים ו-0-9.43 בדו"ח ארבוסקולס/שלפוחית. גרסת הבקרה (V1) הראתה אסטרטגיה מוכוננת אחסון ממוצעת, עם שטח מוגבל שהגביל את הפיתוח של ארבוסקולים למפת ההתיישבות Av+. התמונה הפשוטה של הקולוניזציה (Av−) הראתה התפתחות ליניארית ורוחבית של ה-hyphae, שהייתה מכוונת לחלוטין להתיישבות לא סדירה עבור שני המודלים העליונים (Av− ו-Av+). היישום של טיפולים אורגניים (V2) גרם להתפתחות היפאלית כפולה, ליניארית ולא סדירה בשורשים. אסטרטגיית ההתיישבות שזוהתה לטיפול האורגני הראתה אוריינטציה לכיוון אסטרטגיית אגירה, הקשורה לשחרור איטי של זבל בקרקע והתמדתו מעונה לעונה. מודל Av+ הציג את פוטנציאל ההתיישבות הגבוה ביותר, עם נוכחות אינטנסיבית של שלפוחיות. דו"ח האזורים המיקוריוזים/לא מיקוריים הציג קולוניזציה הומוגנית, עם אי-רציפות נדירה בין אזורים מיושבים. בניגוד לכך, היישום של דשנים מינרליים (V4) גרם לרגרסיה של התיישבות mycorrhizal. האזורים המתיישבים הציגו דפוס לא סדיר, עם אי-רציפות גדולה ובלתי מיושבת ביניהם. האסטרטגיה שנצפתה הייתה מכוונת בדרך כלל לכיוון של עמידות צמחים, עם אזורים קטנים שבהם נראתה אסטרטגיית אחסון או העברה דייקנית. הניתוח ההשוואתי בין טיפולים אורגניים דלי מינרלים (V3) ואורגניים עתירי מינרלים (V5) הראה רגרסיה מתמשכת של התיישבות ושינויים באסטרטגיית הקולוניזציה, שהותואמו בין שני הטיפולים המנוגדים (V2 ו-V4). כל האזורים שהתיישבו התפתחו באופן לא סדיר סביב נקודה מרכזית, עם נוכחות הומוגנית של אזורים לא מיושבים. אסטרטגיית הקולוניזציה הייתה מכוונת להעברה שגשוגית, עם נוכחות של שלפוחיות באזורים מוגבלים. הרציפות הגדולה ביותר שאינה מיושבת זוהתה בווריאנט עם כמות גבוהה יותר של דשן מינרלי (V5).
איור 1: הליכי דגימת שורשים . (A) הפקת דגימות בקרקע כדי להגן על שלמות השורשים. (B) מדידות של מערכת השורשים לאחר הליך הניקוי הראשון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שורשים מוכתמים שנשמרים בצנצנת עם מי ברז עד לעיבוד. השורשים שומרים על צבעם עד שבוע בטמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: עיבוד שורשים . (A) שמור את כל השורשים מדגימה אחת במים בצלחת פטרי. (B) חותכים את השורשים למקטעים באורך 1 ס"מ. (ג-ד) לחץ בעדינות על שקית הלמינציה כדי למחוץ את השורשים ולהציג אותם באיטיות על שקופית. (E-F) מכסים את מקטעי השורש בכיסוי ומוסיפים טיפה אחת של מי ברז בפינה אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: עיבוד תמונה. (A) הוסף את כל התמונות שצולמו מדגם אחד במצגת. יישרו את כל התמונות כדי לשחזר את התצוגה המיקרוסקופית של כל שורש. (B) הוסף טבלה להכנת הרשת, ברוחב של 10 תאים x 10 תאים באורך של כל תמונה. הגדר את הגבולות הפנימיים ל'ללא'. הגבול הפנימי עדיין יהיה גלוי, אך שקיפותם לא תפריע לניתוח המיקוריזה. (ג-ד) השתמש במקרא של MycoPatt כדי להבקיע כל מבנה הנראה בתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הכנסת נתונים ב-MycoPatt. העתק את מסד הנתונים כולו עם תצפיות מהמצגת ל- MycoPatt. הדבק אותו כמספרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: חילוץ נתונים גולמיים וניתוח נתונים ראשוניים. (A) הערכת התיישבות עבור כל 10 התאים האופקיים משורה אחת. (B) הערכת קולוניזציה עבור כל 10 התאים מעמודה אחת (אנכית) בכל אחד מ-10 התאים x 10 התאים המרובעים של MycoPatt. (C) הערכת קולוניזציה רוחבית וחישוב פרמטרי קולוניזציה ממוצעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: מיצוי מפות של תבניות מיקוריזאליות . (A) עבור כל מערך הנתונים, מפה גדולה של 10 תאים x 150 תאים זמינה בגיליון הגרפים של MycoPatt. (B) חלץ את מפת ההתיישבות כתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: תמונות מיקרוסקופיות של מבני AMF בשורשים מעובדים של Zea mays. (A) התפתחות בין-תאית ותוך-תאית של רשת Hyphal. (B) רשת היפל צפופה עם ארבוסקולים רבים המתפתחים תוך תאיים. (C) סדרה של שלפוחיות בממדים שונים. קיצורים: H = hyphae; A = ארבוסקולים; V = שלפוחיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: תמונות מיקרוסקופיות של מבני AMF בשורשים מעובדים של Festuca rubra. (A) רשתות היפליות מרובות עם שלפוחיות וארבוסקולות שפותחו באזורים נפרדים. (B) פירוט של רשת hyphal מפותלת. (C) פירוט של נקודת כניסה ושני מקפים מפותלים. (D) פרט של שלפוחית בקצה של מקף מפותל. (E) פירוט של ארבוסקולה תוך-תאית, פירוט של hypha מפותל, ונוכחות של שלפוחית בסוף hypha. קיצורים: H = hyphae; A = ארבוסקולים; V = שלפוחיות; Ep = נקודות כניסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 10: תמונות מיקרוסקופיות לא ברורות של מבני AMF בשורשים של Festuca rubra (A-C) ו-Zea mays (D-E ) בשורשים לא שלמים שהושלמו והוכתמו. (A) שורש מוכתם לא ברור עם מספר נמוך של מקף גלוי וצבע מקורי של שורשים גלוי. (B) שיפוע צבע כחול וכחול עז עם הבחנה לא ברורה בין תאי השורש לבין המקף. (C) רשת מקף מוכתמת ברורה בחלק העליון של התמונה ומקף מוכתם לא שלם בחלק התחתון של התמונה. (D) שורש מוכתם עז ומקף, מה שהופך את זיהוי מבני AM לבלתי אפשרי. (E) פירוט של שורש מוכתם עז עם ממצאים הנמצאים בתאים, מה שהופך את זיהוי מבני AM לבלתי אפשרי. קיצורים: H = hyphae. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 11: דפוסי התיישבות מיקוריזאליים (Av, Av− ו-Av+) בשורשים של Zea mays שטופלו. קיצורים: A0 = רגע של יישום הטיפול; A1 = וריאנט בקרה (ללא טיפול)/A2 = גרסה מטופלת; B1 = 2-4 עלים (כנקודת בקרה לתחילת ההתיישבות המיקוריזאלית); B2 = 6 עלים; B3 = 8-10 עלים; B4 = היווצרות cob; B5 = בגרות פיזיולוגית. שילובי גרסאות הם A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; ו-A1B5/A2-B5. את התיאור המלא של הטיפולים ניתן למצוא ב-Pop-Moldovan et al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 12: דפוסי התיישבות מיקוריזאליים (Av, Av− ו-Av+) בשורשים של פסטה רוברה שטופלה לטווח ארוך. קיצורים: V1 = שליטה, לא מופרית; V2 = 10 t·ha−1 זבל; V3 = 10 t·ha−1 זבל + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha−1, K2O 25 kg·ha−1; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O5 50 kg·ha−1, K2O 50 kg·ha−1; V5 = 10 t·ha−1 זבל + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha−1, K2O 50 kg·ha−1. את התיאור המלא של הטיפולים ניתן למצוא בעבודה קודמת13,14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: ערכים של פרמטרי התיישבות מיקוריזאליים בשורשים של Zea mays בהתבסס על שלב ההתפתחות. מקרא: A0 = רגע של יישום הטיפול; A1 = וריאנט בקרה (ללא טיפול)/A2 = גרסה מטופלת; B1 = 2-4 עלים (כנקודת בקרה לתחילת ההתיישבות המיקוריזאלית); B2 = 6 עלים; B3 = 8-10 עלים; B4 = היווצרות cob; B5 = בגרות פיזיולוגית. שילובי גרסאות הם A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; ו-A1B5/A2-B5. את התיאור המלא של הטיפולים ניתן למצוא ב-Pop-Moldovan et al.12. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: ערכים של פרמטרי התיישבות מיקוריזאליים בשורשים של Festuca rubra המבוססים על הפריה יישומית. מקרא: V1 = שליטה, לא מופרית; V2 = 10 t·ha−1 זבל; V3 = 10 t·ha−1 זבל + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha−1, K2O 25 kg·ha−1; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O5 50 kg·ha−1 K2O 50 kg·ha−1; V5 = 10 t·ha−1 זבל + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha−1 K2O 50 kg·ha−1. את התיאור המלא של הטיפולים ניתן למצוא בעבודה קודמת13,14. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: שלבי פרוטוקול מפורטים מדגימת שדה של שורשים ועד ניתוח נתונים גולמיים וחילוץ מפת מיקוריזל. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים על התיישבות מיקוריזאלית חיוניים לפיתוח אסטרטגיה חדשה בתחום האגרונומי. הפוטנציאל של צמחים מעובדים מרובים ליצור קשר סימביוטי עם מיקוריזות ארבוסקולריות הפך אותם למרכיב חשוב בפיתוח בר-קיימא של המערכת החקלאית ובשמירה על בריאותה 16,17,18,19,20. לפיכך, יש צורך בהבנה טובה יותר של מנגנון הקולוניזציה ואסטרטגיות פטרייתיות, המספקות נתונים חיוניים על האופן שבו צמח יכול להתחבר לרשתות תזונתיות מהאדמה, מהיבול שלו ומפוטנציאל ההישרדות שלו. לכן, בהקשר של חקלאות חכמה, זהו פריט חובה של המאה הנוכחית, חיוני לבצע הערכה מעמיקה של הקולוניזציה, והמחקרים צריכים לספק תמונה מציאותית של מיקום הפטרייה בשורשים.
שיטת תבניות מיקוריזאל השורש מספקת סריקה כה עמוקה של השורשים, אך היא מגיעה עם מגבלות ויתרונותכאחד 11. המגבלות המוצגות הן המספר הרב של דגימות שיש להבקיע כאשר מנתחים צמח בפעם הראשונה, הצורך במניפולציה של תמונה, והקצאה ידנית של מבנים מיקוריזאליים בשורשים, אך ניתן להתגבר על כל אלה על ידי יתרונות רבים לטווח ארוך. מסד הנתונים הגדול הנובע מיישום שיטה זו ושילוב המיקרוסקופיה עם כלי MycoPatt מספק יציבות, הבטחה סטטיסטית של התוצאות, ורב שנתיות במונחים של השוואת תוצאות. זיהוי תבנית מיקוריזאלית לשורשים של צמח ספציפי אחד יקל על מחקרים מאוחרים יותר במונחים של השוואה. כמו כן, זה משפר את הזיהוי של דפוסים חדשים, אשר יכול לספק מידע על האבולוציה של מנגנוני קולוניזציה ואסטרטגיה פטרייתית. חישוב פרמטרי ההתיישבות הממוצעים המבוססים על פיתוח אופקי ואנכי מאפשר רכישת ערכים מציאותיים ומורכבים יותר בהשוואה לשיטות האומדן החזותי, כגון צומת רשת, אומדן מקטע שורש וצומת מוגדל 9,11. באופן כללי, שיטת התבנית המיקוריזאלית מאפשרת להעריך את ההתקדמות וההסתעפות הפטרייתית בשורשים וזיהוי נקודות חדשות של התיישבות חיצונית והרחבת הקורים לאורך השורשים. היא מאפשרת מיקום של ארבוסקולים ושלפוחיות ומקצה להם מיקום וממד מציאותיים בתבנית הגלובלית.
היישום הנכון של שיטת MycoPatt מסתמך על ההשלמה המוצלחת של כל שלב בפרוטוקול (טבלה 3). ליעילות גבוהה יותר, כל הזרימה של השיטה מתוכננת להתבצע על ידי אדם אחד או יותר עם רמות אימון שונות. בדרך זו, תוצאות מרובות מופקות מכל שלב וניתוח מתמשך אפשרי. לבחירת חומר ביולוגי, דגימת שורשים ושלב האחסון, יש צורך שאדם מאומן מאוד יזהה נכונה את המין, ללא קשר לשלב הצמיחה שלו. לאחר זיהוי המין, דגימת השורש יכולה להיעשות על ידי כל אדם, עם הכשרה מינימלית להסרת חלקיקי קרקע עדינה. השלב השני, עיבוד שורשים, ניקוי והכתמה למיקרוסקופיה, דורש אנשים מיומנים; התהליך כולל מספר שלבי אימות, וכל שלב נחוץ להצלחת ההליך. ניתן לעבד מספר דוגמאות בו זמנית בשני השלבים הראשונים. עיבוד שורשים למיקרוסקופיה (שלב 3) וניתוח מיקרוסקופי של דגימות שורש (שלב 4) חשובים מאוד בשל תשומת הלב הרבה הנדרשת לחיתוך המקטעים לחתיכות של 1 ס"מ בשילוב עם ריסוקם העדין להכנת שקופיות. מיקרוסקופיה זקוקה לתשומת לב לכיול האור ולתוכנה לקבלת תמונות באיכות גבוהה. שני השלבים דורשים אנשים מיומנים מאוד או בעלי הכשרה בינונית תחת פיקוחו של מומחה. מכלול תמונות לאחר מיקרוסקופיה דורש כוח אדם מיומן ביותר לחפיפה נכונה וסדר התמונות כדי לשחזר את המקטע. ניקוד של התיישבות מיקוריזאלית הוא צעד הדורש מומחה בפטריות AM כדי לזהות את המבנים שלהן ואת ביצועי הקולוניזציה, כמו גם להקצות ציונים עבור כל מבנה על תמונות מרושתות. השלב האחרון, ניתוח נתונים גולמיים וחילוץ תוצאות דורשים מנתח נתונים מיומן ביותר אשר אוסף את מסדי הנתונים ומנהל את הנתונים הסטטיסטיים שמאחורי סינון הנתונים וחילוץ המפות הרלוונטיות ביותר. שלב זה יכול להיות משולב עם העבודה של מומחה mycorrhizal ליעילות מקסימלית של התהליך. בסך הכל, הזרימה כולה מאפשרת מעורבות של מומחים מרובים בתוך מחקר בין-תחומי, מה שמוביל לתוצאות באיכות גבוהה.
כמו כל שיטה חדשה, שיטת תבנית המיקוריזה צריכה להתפתח ולהשתפר. ישנם כמה שינויים שבעתיד יהפכו את השיטה לקלה יותר לשימוש ויספקו תוצאות מרובות. אם זה נעשה על ידי טכניקת ניקוי וצביעה איטית, שיטה זו מאפשרת מניפולציה של דגימות מרובות בכל פעם כדי להשהות / להפעיל מחדש את הניתוח לאחר כל שלב של ההליך ולקבל מסדי נתונים דיגיטליים מרובים. שיפור חשוב יהיה השימוש בסורקים ביצועיים לרכישת תמונה מהירה יותר, ולאחר פיתוח כלים מתאימים ויעילים לזיהוי מבנה מיקוריזאלי, אוטומציה של תהליך זה. בהקשר של אבולוציה של טכניקה, רכישה מהירה של תבניות מיקוריזאליות תקיים מחקרים עתידיים בתחום.
ישנם מספר קשיים בשימוש בתוכנה אוטומטית. 1) בשל המיקומים השונים של מבני AM - hyphae ו-vesicles - מחוץ לתאי השורש וה-arbuscules בתוך תאי השורש, קשה לכייל ולאמן את התוכנה לזהות אותם באותה תמונה. 2) עבור הרכבת התמונות מקטע אחד, התוכנה לא תמיד תיישר את התמונות כדי ליצור מחדש את הקטע, וייתכן שהיא תמקם אותן באופן אקראי, מה שישנה את התהליך. 3) בעיה נוספת היא שתוכנה אינה יכולה להפלות אם חלקים מסוימים של שתי תמונות זהים או אם, בהליכי המיקרוסקופיה, שדות מסוימים היו חופפים. לפיכך, התהליך דורש להתבצע באופן ידני על ידי מומחים מיומנים.
בסך הכל, 60 ס"מ של שורש מכל גרסה נותחו מצמחים מרובים. כתב היד הנוכחי נועד להציג את הרעיון של שימוש במערכת ובכלי MycoPatt, והתוצאות מציגות את הפונקציונליות של שיטה זו. בהשוואה לשיטה זו, לשיטת צומת הרשת יש סובייקטיביות גבוהה יותר בשל המיקום האקראי של שורשים מוכתמים. אנו מאמינים כי יהיה צורך בעתיד לקבוע עבור כל מפעל AM את מספר המקטעים לשימוש. זהו מחקר שצריך להיעשות על ידי כל החוקרים בתחום המיקוריזה. אחד המאמרים שהשוו בין מספר שיטות9 הציג שיעור התיישבות דומה של 50 עד 200 מקטעי שורש/צמח. מסקנותיהם קבעו כי יש צורך בשיטה אובייקטיבית יותר כדי לנתח כל קטע. בהתבסס על המחקר שלנו, MycoPatt מפחית את הסובייקטיביות ל-0. כל מקטע נסרק ומנותח לעומק. כמו כן, ניתן לפתח מסד נתונים של תמונות עבור כל תוצאות המקטעים המנותחים בשיטה זו. זה יכול לשמש גם לניתוח מחדש של הנתונים במידת הצורך.
השיטה כולה מספקת תוצאות הנחוצות למספר תחומי מחקר ומסחר. מגדלי צמחים מנסים כל הזמן ליצור זנים עמידים יותר ובני כלאיים שמסתגלים לתנאי קרקע ספציפיים. בהקשר זה, תהליכי גידול הצמחים ירוויחו מבחינת קישוריות הצמח לרשתות מיקוריזאליות מהקרקע החל משלבי הברירה הראשוניים. ניתוח דפוסי מיקוריזאל יראה את ההבדלים בין בני כלאיים במונחים של קצירת מיקוריזאל מהקרקע והתאקלמות לתנאי האתר. חוקרים בתחום הרבייה יכולים להשתמש בשיטה זו כדי לזהות, אפילו מהשלבים המוקדמים של תהליכי הבחירה, את התאמתם של זנים/בני כלאיים חדשים לתנאי מיקוריזל הקרקע. בדרך זו, יהיו זנים / היברידים שמסתגלים בקלות למספר רב של תנאים וטכנולוגיות אך גם זנים / היברידים עם קבלה נמוכה יותר וספציפיות גבוהה לתנאים צרים. עבור מערכות אקולוגיות של ערבות, שיטת תבנית המיקוריזה תתאים באופן מושלם ליישומים מרובים: הבנה טובה יותר של הישרדות הצמחים במכלולי צמחייה מגוונים הקשורים לתמיכה פטרייתית; ניתוח דפוסי התיישבות ספציפיים במינים אנדמיים ובסכנת הכחדה; הפוטנציאל הפולש של מינים אקסוגניים; ותנודות הדומיננטיות-קודומיננטיות עקב יישום תשומות שונות21. התבניות יכולות לשמש עוד יותר את יצרני האינוקולום שצריכים לחשב את המינונים הפוטנציאליים על סמך התפשטות פעילה ונקודות כניסה. כמו כן, ניתן לפתח ביו-פרטיליזטורים ספציפיים מאוד שיכילו אינוקולום מתאים לצמחים החולקים את אותם גנים. במחקר, תבניות מיקוריזאליות מייצגות מחקר השוואתי ביותר, הן מבחינה חזותית והן מבחינה מספרית. ישנם מסדי נתונים מרובים22,23,24 המציגים מינים מיקוריזאליים ואת המבנים שהם יכולים לפתח בשורשים של צמחי בוחן, אך אף אחד מהם, עד כה, לא מציג את תמונת ההתיישבות המלאה. כל הדרישות הללו והצורך במחקרים מציאותיים ויישומיים יותר תומכים בשילוב שיטת דפוסי המיקוריזה במחקרי אינטראקציה בין קרקע למיקרוב-צמחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
מאמר זה משתמש בנתונים הנובעים משני מחקרי דוקטורט בתחום התמטי של "תבניות מיקוריזאליות של תירס המונעות על ידי תשומות אגרונומיות", שנערכו על ידי ויקטוריה פופ-מולדובה, ו"מעמד מיקוריזאלי ופיתוח התיישבות במינים דומיננטיים בערבה הררית", שנערכו על ידי לריסה קורקוז, בתיאום של פרופ' רוקסנה וידיקן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
References
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).
- Jeffries, P., Barea, J. M. 4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems. The Mycota. IX Fungal Associations. Hock, B. , SpringerVerlag. Berlin, Germany. 51-75 (2012).
- Parniske, M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature Reviews Microbiology. 6 (10), 763-775 (2008).
- Gianinazzi, S., et al. Agroecology: The key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Lee, E. -H., Eo, J. -K., Ka, K. -H., Eom, A. -H. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and their roles in ecosystems. Mycobiology. 41 (3), 121-125 (2013).
- Zhang, Y., Zeng, M., Xiong, B., Yang, X. Ecological significance of arbuscular mycorrhiza biotechnology in modern agricultural system. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao = The Journal of Applied Ecology. 14 (4), 613-617 (2003).
- Shah, A. A., et al. Effect of endophytic Bacillus megaterium colonization on structure strengthening, microbial community, chemical composition and stabilization properties of Hybrid Pennisetum. Journal of the Science of Food and Agriculture. 100 (3), 1164-1173 (2020).
- Souza, T. Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , Springer. New York City, NY. (2015).
- Sun, X. -G., Tang, M. Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. Botany. 90 (11), 1073-1083 (2012).
- Smith, S., Read, D. Colonization of Roots and Anatomy of Arbuscular Mycorrhiza. Mycorrhizal Symbiosis. Smith, S. E., Read, D. J. , Academic Press. London, UK. 42-90 (2008).
- Stoian, V., et al. Sensitive approach and future perspectives in microscopic patterns of mycorrhizal roots. Scientific Reports. 9 (1), 10233 (2019).
- Pop-Moldovan, V., et al. Divergence in corn mycorrhizal colonization patterns due to organic treatment. Plants. 10 (12), 2760 (2021).
- Corcoz, L., et al. Mycorrhizal patterns in the roots of dominant Festuca rubra in a high-natural-value grassland. Plants. 11 (1), 112 (2021).
- Corcoz, L., et al. Deciphering the colonization strategies in roots of long-term fertilized Festuca rubra. Agronomy. 12 (3), 650 (2022).
- Stoian, V., Florian, V. Mycorrhiza - Benefits, influence, diagnostic method. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).
- Prates Júnior, P., et al. Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity. PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture. Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).
- Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S. Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem. Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. Gehlot, P., Singh, J. , Springer. New York City, NY. 205-220 (2018).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
- Vaida, I., Păcurar, F., Rotar, I., Tomoș, L., Stoian, V. Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland. Plants. 10 (4), 739 (2021).
- Taxonomy of Arbuscular Fungi. , Available from: http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html (2022).
- The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , Available from: https://invam.wvu.edu/collection (2022).
- The International Bank for the Glomeromycota. , Available from: https://www.i-beg.eu/ (2022).
