Festuca rubra ve Zea mays'ın Köklerinde Kolonizasyon Kalıplarını ve Mantar Stratejilerini Keşfetmek İçin Bir Araç Olarak Mikorizal Haritalar

Summary

Buradaki protokol, arbusküler mikorizal kolonizasyon paternlerinin değerlendirilmesi için yöntemleri ve iki türün köklerindeki stratejiyi açıklamaktadır: Zea mays ve Festuca rubra. MycoPatt yönteminin kullanılması, parametrelerin hesaplanmasına, mikorizal yapıların dijital verilere dönüştürülmesine ve köklerdeki gerçek konumlarının haritalandırılmasına izin verir.

Abstract

Arbusküler mikorizal mantarlar bitki köklerindeki simbiyontlardır. Rolleri, konakçı gelişimini sürdürmek ve ekosistemlerdeki beslenme dengesini korumaktır. Kolonizasyon süreci toprak ekolojisi, mantarların ve konakçıların genetik çeşitliliği ve agronomik uygulamalar gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Senkronize etkileri, karmaşık bir hifal ağının gelişmesine yol açar ve kök hücrelerde veziküllerin ve arbusküllerin ikincil gelişimine yol açar. Bu araştırmanın amacı, mantar yapılarının Festuca rubra ve Zea mays köklerinde konumlandırılmasında mikorizal paternler (MycoPatt) yönteminin etkinliğini analiz etmektir. Diğer bir amaç, her türün mikorizal haritalarının ortaya koyduğu mantar kolonizasyon stratejisini araştırmaktı. Birden fazla mikroskobik görüntünün elde edilmesi ve bir araya getirilmesi, hem mısır hem de kırmızı fescue bitkilerinde mikorizal kolonizasyon değerlendirmesinin, gelişmiş yapıların gerçekçi konumu hakkında bilgi sağlamasına izin verir. Gözlemlenen mikorizal desenler, uygulanan tedavilerin ve büyüme aşamasının neden olduğu toprak simbiyotik mantarları ile bağlantılar geliştirmek açısından her bitkinin değişken verimliliğini vurgulamaktadır. MycoPatt yöntemi ile elde edilen mikorizal detaylı haritalar, topraktan simbiyotik edinimde bitki etkinliğinin erken tespiti için yararlıdır.

Introduction

Arbusküler mikoriza () mantarları, araştırmacılar için sürekli ilgi alanı olan toprak kaynaklı endofitlerin bir kategorisidir. Çoğu bitkinin köklerindeki varlıkları ve besin döngülerine katılımları, onları otsu bitkilerin bulunduğu her ekosistemin stabilitesinde hayati bileşenler haline getirir ^1,2. Ekstra-radiküler miselyumları sayesinde, özellikle ulaşılması zor bölgelerde, bitki kökleri için mantar uzantısı görevi görür³. Ana aktivite,'nin büyük hifa ağları ve arbuskül adı verilen spesifik hücre içi yapılar geliştirdiği konakçı bitki köklerindedir. Konakçı özgüllüğünün olmaması, simbiyontun aynı anda birden fazla türü kolonileştirmesine izin verir. Bu yetenek,'ye ekosistemde kaynak tahsisi ve besin düzenlemesinin rolünü sağlar; mantar ayrıca bitki hayatta kalmasında destek sağlar ve bitki performansına yardımcı olur ^4,5,6,7. türlerinin konakçı köklere reaksiyonu, intraradiküler miselyumun uzaması ve konumunda ve hücre içinde gelişen arbusküllerin varlığında ve şeklinde görülebilir. Hücre içi arbusküller, iki simbiyont arasında bir değişim noktası görevi görür ve hızlı transfer süreçleri ile karakterize edilen alanları temsil eder. 'nin ürettiği yapılar türe bağımlıdır ve arbusküllere ek olarak, köklerde veziküller, sporlar ve yardımcı hücreler de gelişir.

Bitki köklerinde simbiyontlarının değerlendirilmesinde birçok zorluk vardır ^8,9. Birincisi, konakçıların tüm bitki örtüsü döneminde sürekli gelişimleridir ve bu da hifal arbusküler yapısında çoklu değişikliklere yol açar. Arbusküler büyümenin farklı aşamaları, çöküşlerine kadar, köklerde açıkça bulunur, ancak yaşlanan yapıları bazen sindirilir, bu da onları sadece kısmen görünür kılar¹⁰. İkinci zorluk, boyama yöntemi ve protokolü, kök sistemlerinin büyük çeşitliliği, hücrelerinin boyutu ve birleşik bir yöntem önermeyi zorlaştıran kalınlık farklılıkları ile temsil edilir. Son zorluk, kolonizasyonunun değerlendirilmesi ve puanlanması ile temsil edilir. 'yi farklı derecelerde nesnellikle puanlayan çok sayıda yöntem vardır ve bunların çoğu hala mikroskopi teknikleriyle sınırlıdır. Basit olanlar kök korteksteki yapıların varlığına / yokluğuna dayanırken, daha karmaşık olanlar görsel skorlamaya ve kolonizasyon sınıflarının kullanımına, kolonizasyon fenomeninin sıklığının ve yoğunluğunun entegrasyonuna dayanmaktadır. Son on yıllarda birden fazla türün mikorizal durumu hakkında birçok veri üretilmiştir, ancak yöntemlerin çoğu, kök korteksteki her bir yapının gerçek konumuna işaret etmeden kolonizasyonun gözlemlenen değeri ile sınırlıdır. kolonizasyonunda daha doğru sonuçların gerekliliğine yanıt olarak, ayrıntılı mikorizal haritaları dijital bir biçimde birleştirmek için köklerdeki mikorizal paternlerin (MycoPatt) mikroskobik analizine dayanan bir yöntem geliştirilmiştir¹¹. Ayrıca, yöntem kolonizasyon parametrelerinin objektif olarak hesaplanmasına ve kökteki her yapının gerçek konumunun belirlenmesine izin verir.

mantar yapılarının konumu aşağıdaki iki soruyu cevaplamada önemli olabilir. Birincisi, bir bitkinin bitki örtüsü döngüsünden belirli bir anda kolonizasyonun analizi ile ilgilidir. Bu bağlamda arbusküler/vezikül bolluğunu gözlemlemek, kökte nasıl yerleştiklerini raporlamak, çok net bir kolonizasyon görüntüsü ve parametreleri sağlamak çok yararlıdır. İkincisi, mantar stratejisinin tespiti ve yönelimi ve hatta gelecekteki gelişiminin tahmini ile ilgilidir. MycoPatt'ın bir uygulaması, günlük, her 2-3 günde bir, haftada bir veya çeşitli büyüme aşamalarında analiz edilen bitkiler için olabilir. Bu bağlamda, veziküllerin / arbusküllerin yeri, kolonizasyonunun biyolojik mekanizmasını daha iyi anlamak için önemlidir. Bu parametreler ve gözlemler matematiksel parametreleri tamamlamak için çok yararlıdır.

Bu makalenin amacı, MycoPatt sisteminin farklı gelişim aşamalarında Zea mays (mısır) köklerinde ve farklı uzun süreli döllenme koşulları altında Festuca rubra (kırmızı fescue) köklerinde doğal mantar kolonizasyon potansiyelini ve stratejisini keşfetme yeteneğini göstermektir. Amacı gerçekleştirmek için, iki deneyden iki büyük veritabanı analiz edildi. Mısır deneyi Cojocna'da (46°44′56" enlem N ve 23°50′0" uzunluğunda) kurulmuştur. E), Cluj Tarım Bilimleri ve Veterinerlik Üniversitesi Deneysel Didaktik Çiftliğinde, tınlı dokulu bir toprağa sahip bir phaeoziom üzerinde¹². Kırmızı fescue deneyi, 2001 yılında Ghețari, Apuseni Dağları'nda (46 ° 49'064 " enlem N ve 22 ° 81'418 '' uzunluğunda) kurulan daha büyük bir deney alanının bir parçasıdır. E), prelüvosol (terra rossa) toprak tipi^13,14. Mısır beş farklı büyüme fenofazında toplandı¹²: B1 = 2-4 yaprak (mikorizal kolonizasyonun başlangıcı için bir kontrol noktası olarak); B2 = 6 yaprak; B3 = 8-10 yaprak; B4 = koçan oluşumu; B5 = fizyolojik olgunluk. 2-4 yaprak aşamasından (A0) başlayarak, organik bir tedavi uygulandı ve bu da iki mezuniyet faktörü ile sonuçlandı (A1 = kontrol ve A2 = tedavi edildi). Kırmızı fescue'nin kökleri çiçeklenme sırasında beş uzun süreli döllenme ile yapılan bir deneyden toplandı^13,14: V1 = kontrol^, döllenmemiş; V2 = 10 t·^ha-1 gübre; V3 = 10 t·ha-1 gübre + N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 gübre + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Her gelişme aşamasında, her gübreleme varyantından beş bitki toplandı. Boyama protokolleri ve numune işleme süresi ve boyama kalitesi açısından performansları analiz edildi. hifye gelişimi ile yapılarının köklerdeki varlığı arasındaki ilişki, her tür için ayrı ayrı analiz edilmiş ve kolonizasyon için en izin verilen köklerin belirlenmesiyle devam etmiştir. Her kök sisteminin spesifik kolonizasyon kalıpları, kolonizasyon haritalarına ve parametrelerinin değerine göre analiz edildi.

Mısır, köklerin sürekli büyümesini ima eden yıllık bir bitkidir ve bu, MycoPatt'ı büyüme aşamalarında uygulamanın ana nedeniydi. Kırmızı fescue, farklı gübrelerle uzun süre tedavi edilmiş bir otlaktan çok yıllık bir bitkidir. Kökleri 1 yıl daha kısa bir gelişime sahiptir ve antez, bitki metabolizmasını vejetatiften üretkene değiştirdiğinde bitki örtüsü noktası olarak kabul edilir. Bu yoğun aktivite dönemlerinde bu bitkileri yakalamak için yukarıda belirtilen zaman noktaları seçilmiştir. Bitki örtüsü döneminde örnekleme, doğal otlaklarda yetiştirildiğinde bu tür için zordur.

Protocol

1. Biyolojik materyal seçimi, kök örneklemesi ve depolama

1. Bitkilerin tüm kökünü bir kürekle (Şekil 1A) her varyant için ayrı ayrı toplayın ve çoğaltın. Büyük toprak topaklarını köklerden nazikçe çıkarın, elle çıkarın. Tüm kök sistemini yıkayın ve 1 cm x 1 cm hücreli bir ölçekte ölçün (Şekil 1B). Kökleri her bitki için ayrı ayrı kesin ve plastik bir torbaya koyun.
2. Her bitkinin tüm temiz köklerini plastik bir torbada toplayın ve bir varyanttan tüm örnekleri daha büyük bir torbada toplayın. Her torbaya aşama/varyant adını ve örnekleme tarihini yazın. Kökleri bir buzdolabında veya dondurucuda işleme kadar -4 °C ile -20 °C arasındaki bir sıcaklıkta saklayın.

2. Mikroskopi için kök işleme, temizleme ve boyama

NOT: Protokolün bu adımı için eldiven, maske ve mikrobiyolojik/kimyasal başlık kullanın.

1. Kök çözme işleminin oda sıcaklığında yavaşça yapıldığından emin olun. Tüm işleme adımları için, gerekli ajanların miktarını azaltmak için küçük kavanozlar (30-50 mL) kullanın.
2. Yavaş temizleme ve boyama prosedürünün aşağıdaki dört adımını uygulayın¹⁵. Tüm adımları oda sıcaklığında yapın. Bu yöntem, kaynatma için bir su banyosu kullanılmadan aynı anda çok sayıda numunenin işlenmesine izin verir.
   1. Kök temizleme: Bir bitkinin tüm köklerini bir kavanoza yerleştirin. Musluk suyuyla% 10'luk bir NaOH çözeltisi hazırlayın ve kökleri tamamen kaplayana kadar her kavanoza dökün. Köklerde temizleme çözeltisinin homojen bir dağılımını sağlamak için kavanozları 1 dakika veya 2 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. Bu prosedürü 24 saat sonra tekrarlayın ve kökleri temizleme çözeltisinde en az 48 saat bekletin.
      NOT: Temiz köklerin soluk sarı (beyaza kadar) bir yönü vardır ve tutarlılık yumuşaktır (bir cımbızla bastırılarak kolayca ezilebilirler).
   2. Kök durulama: Bir seferde bir kavanozun içeriğini bir elek içinden geçirin. Takas çözümünü geri dönüştürün. Temizleme çözeltisi tamamen çıkarılana kadar kökleri musluk suyunda birkaç kez durulayın.
      NOT: Temizleme çözeltisi tamamen çıkarılmazsa, boyama prosedürünün kalitesini etkileyecektir.
   3. Kök boyama: Durulanmış kökleri temiz bir kavanoza yerleştirin. Musluk suyuyla% 5:% 5'lik bir mürekkep-sirke çözeltisi hazırlayın (5 mL mavi mürekkep + 5 mL% 9 asetik asit + 90 mL musluk suyu). Çözeltiyi, kökleri tamamen kaplayana kadar her kavanoza dökün. Köklerde boyama çözeltisinin homojen bir şekilde dağılmasını sağlamak için kavanozları 1 dakika veya 2 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. Bu prosedürü 24 saat sonra tekrarlayın ve kökleri bu çözeltide 48 saat bekletin.
      NOT: Lekeli kökler yoğun mavi bir renge sahiptir.
   4. Kök kısmi destaining: Lekeli kökleri musluk suyunda 1-2 dakika durulayın. Ekstra boyama solüsyonunu çıkarmak için kavanozları kuvvetlice çalkalayın. Boyama çok yoğunsa ve net bir mikroskobik değerlendirmeye izin vermiyorsa prosedürü tekrarlayın.
      NOT: Lekeli kökler, lekelenme kalitesini değiştirmeden oda sıcaklığında 1 haftaya kadar musluk suyunda tutulabilir (Şekil 2). Daha uzun süreler boyunca, kökler% 5'lik bir ticari elma sirkesi çözeltisinde (% 5 asetik asit) 2-3 aya kadar muhafaza edilebilir.

3. Mikroskopi için kök işleme

1. Kök segmentasyonu: Her numuneden lekelenmiş kökleri ölçekli bir kesme tahtasına yerleştirin (Şekil 3A). Kökleri 1 cm'lik segmentler halinde kesin (Şekil 3B). Her varyasyon için 15 segment seçin.
2. Segment hazırlama için nazik kırma yöntemi: Kökleri bir slayta yayın. Kökleri örtmek için bir laminasyon torbası kullanın ve bir kenardan başlayarak yavaşça ezin (Şekil 3C, D). Slayttaki kökleri yavaşça görüntülemek için cımbız, neşter sapı, kalem veya sindirimli bir kalem gibi yumuşak plastik bir alet kullanın. Laminasyon torbasını dikkatlice çıkarın ve numuneyi bir kapak kayması ile örtün (Şekil 3E).
   NOT: Kökler boru şeklinde bir forma sahiptir, bu nedenle onları iki boyutlu bir düzlemde ayırmak gerekir. Bu eylem, köklerin orta noktada ayrıldığını varsayar ve iç çapın iki parçasının görüntülenmesine yol açar. Laminasyon torbalarının nazik kırma prosedüründe kullanılması, silindir formuna sahip köklerin, biri solda, diğeri sağda olmak üzere iki parça halinde orta noktalarına doğru görüntülenmesini sağlar. Bu şekilde, tüm kök derinlemesine analiz edilir ve kolonizasyon derecesi, hacimsel kolonizasyonu gösteren parametredir (MycoPatt¹¹ üzerindeki orijinal çalışmada açıklanmıştır). Temel olarak, bir silindiri ikiye böleriz ve ondan sonra matematiksel olarak yeniden inşa ederiz.
3. Slaytın bir köşesine pipetle su ekleyin ve suyun yavaşça slayta yayılmasına izin verin (Şekil 3F). Ekstra suyu bir kağıt havluyla çıkarın.

4. Kök örneklerinin mikroskobik analizi

1. İyi bir çözünürlüklü kamera ile donatılmış bir mikroskop kullanın.
2. Bir ekstremiteden başlayarak slaytları analiz edin. Her mikroskobik alanı yakalayın. Kök parçaların gerçek birleşme sonrasına izin verecek bir kodla yakalanan her görüntüyü yeniden adlandırın. Kalın kökler için 10x veya 40x büyütmeyi kullanın ve ince kökler için 40x büyütmeyi kullanın. Bir türden tüm kök kümesi için aynı hedefi ve büyütmeyi kullanın.

5. Mikroskopi sonrası görüntü montajı

1. Görüntü montajı için bir çizim tahtası tasarlamak üzere sunum yazılımını kullanın. Genişliği görüntü genişliğinden 2-3 cm daha geniş olarak ayarlayın. Bir segmentten yakalanan tüm görüntüleri yakalama sırasına göre ekleyin ve kök segmentin tüm uzunluğunu yeniden yapılandırın (Şekil 4A).
   1. Kısacası, her 1 cm'lik segment için toplam 15 resim toplayın ve segmenti yeniden oluşturmak için sunum yazılımında 1'den 15'e kadar dikey olarak düzenleyin.
2. Ortadaki görüntüleri hizalayın. Her görüntünün bir öncekini takip ettiğinden emin olmak için dikey hizalamayı kullanın. Tüm resimlerde, tüm kök segmenti kapsayacak şekilde 10 hücre x 150 hücreden oluşan bir ızgara yerleştirin.
   1. Ek olarak, her bir resme 10 x 10 ızgara yerleştirin ve bu ızgaranın her hücresine, bir yapısı görünüyorsa bir ila altı arasında bir sayı ekleyin veya yapısı yoksa boş bırakın. Bu şekilde, işlemin doğruluğu, yapılarının konumunda hiçbir hata gözlenmeden maksimumdur.
3. Genişliği 10 hücreli ve uzunluğu 150 hücreli (10 hücreli 15 kare x 10 hücreli) bir kılavuz için tablo ekleyin. Tablo genişliği boyutlarını görüntülerin genişliğine değiştirin. Tablonun uzunluğunu tüm görüntüleri içerecek şekilde değiştirin (Şekil 4B).

6. Mikorizal kolonizasyonun puanlanması

1. Hifa için mikorizal desenler yöntemi^{11: 1'de} açıklandığı gibi her bir yapı tipini puanlamak için benzersiz sayıyı kullanın; Arbusküller için 2; Veziküller için 3; Sporlar için 4; Yardımcı hücreler için 5; ve giriş noktaları için 6 (Şekil 4C). Daha önce uygulanan ızgaraların her hücresinden gözlemlenen her mikorizal yapıyı puanlayın (Şekil 4D).

7. Ham veri analizi ve sonuç çıkarma

1. Elde edilen tüm puanları MycoPatt elektronik tablosu^11'e ekleyin. Sunumdaki tüm puanları rawdata olarak adlandırılan ilk sayfaya aktarmak için kopyala/yapıştır işlevini kullanın (Şekil 5).
2. Sonuçların birincil analizi: Sonuçları üç biçimde ayrı ayrı yüzde (%) olarak görselleştirmek için MycoPatt elektronik tablo aracındaki parametreler adlı üçüncü sayfayı kullanın (Şekil 6A-C). Kolonizasyonun yatay görüntüsünü analiz etmek için A'dan K'ya sütunları kullanın; kolonizasyonun dikey görüntüsünü analiz etmek için M'den W'ye sütunlar; ve 15 10 x 10 karenin (satır 2-17) her biri için enine (ortalama) kolonizasyonu ve son ortalama kolonizasyonu (satır 19-20) analiz etmek için Y'den AI'ya sütunlar.
   NOT: Enine ortalama kolonizasyon, hem yatay hem de dikey analizle ilgili gerçek kolonizasyon parametrelerinin hesaplanmasında kullanılır. Bu şekilde, yalnızca yatay veya dikey analizin kullanılması ile karşılaştırıldığında hiçbir hata yapılamaz (orijinal çalışma^11'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Ayrıca, bu parametre kümesi mikroskobik alanın tüm yüzeyi için hesaplanır.
   1. Sonuçları analiz etmek için her parametreye özgü tanımları ve formülleri kullanın¹¹. Aşağıdaki kolonizasyon parametrelerini kullanın: kolonizasyon sıklığı (%), kolonizasyon yoğunluğu (%), arbusküller (%) ve veziküller (%), sporlar (%) ve yardımcı hücreler (%), giriş noktaları (%), mikorizal olmayan alanların yüzdesi (%), genel kolonizasyon derecesi (%) ve mikorizal/mikorizal olmayan alanların raporu.
      NOT: Analiz edilen numunelerde arbusküller, veziküller, sporlar, yardımcı hücreler ve giriş noktaları eksikse, MycoPatt elektronik tablosu bunları sıfır (0) olarak puanlayacaktır.
3. Mikorizal haritaların üretimi ve ekstraksiyonu: Mikorizal yapı kodunun renklere dönüştürülmesinden elde edilen görüntüyü MycoPatt adlı grafiklerin ikinci sayfasında görselleştirin (Şekil 7A). Elde edilen görüntüyü grafik sayfasında görüntü olarak dışa aktarın (Şekil 7B). Mikorizal desenlerin analizi için göstergedeki renk kodunu kullanın.
4. Mikorizal harita analizi: Mikorizal haritalarda en önemli yapıları ve bunların montajını tanımlayın. Analiz edilen köklerde gözlenen mikorizal kolonizasyon paternini tanımlayın. Mikorizal kolonizasyon stratejisini kökte gözlenen yapısal gelişime, dallanma paternine ve arbuskül / vezikül gelişimine dayanarak tanımlayın.

Representative Results

Boyama işlemlerinden sonra köklerin nazik kırma yönteminin doğru kullanımı, hem Zea mays (Şekil 8A-C) hem de Festuca rubra (Şekil 9A-E) için mikorizal yapıların iyi ayrıntılarını, mikorizal yapılar ve kök hücreleri arasında iyi bir kontrast ve mavi renk nedeniyle stelin doğrulanmasını sağlar. Temizleme ve boyama prosedürleri başarılı olamazsa, kök örneklerinin ezilmesi zordur ve mikorizal yapıları açıkça göstermez (Şekil 10A-E). Bu durumda, tüm temizleme-boyama prosedürünü tekrarlayın.

Mikorizal patern yönteminin ve MycoPatt aracının kullanılması, kolonizasyon mekanizmasının tam olarak araştırılmasına izin verdi. Yöntem, kolonizasyon parametrelerinin ek bir görsel ifadesi (Tablo 1 ve Tablo 2) ile her tür için kolonizasyon modellerinin ve stratejilerinin derin, küçük ölçekli bir araştırmasını sağlar (Şekil 11 ve Şekil 12). Pop-Moldovan ve ^ark.12 tarafından kapsamlı bir şekilde tanımlanan Zea mays üzerinde yapılan iki çalışma ve Corcoz ve ark. tarafından detaylandırılan Festuca rubra üzerinde yapılmıştır. ^13,14, gözlemler, mikorizal haritalar ve kolonizasyon parametrelerinden oluşan geniş bir veritabanı sağladı. Her iki veri tabanında da kolonizasyon sıklığı (%), kolonizasyon yoğunluğu (%), arbusküller (%) ve veziküller (%), mikorizal olmayan alanların yüzdesi (%), genel kolonizasyon derecesi (%) ve mikorizal/mikorizal olmayan alanların kolonizasyon parametreleri olarak bildirilmesi puanlandı. Zea Mays için veritabanı, elektronik tablo veritabanında 390 kolonizasyon haritasında derlenen 5.850 satır girişinden oluşuyordu. Zea mays deneyi, mikorizal / mikorizal olmayan alanların raporunu, köklerdeki kolonize alanlar arasındaki değişim ve bozulmanın tanımlanması için bir parametre olarak önerdi. Yaklaşım, kolonizasyon mekanizmasının derinlemesine analizine ve kökler boyunca gelişmesine izin verir. Festuca rubra, elektronik tabloda 300 haritada derlenen 4.500 satır girişinden oluşan bir veritabanı sağladı. Yeni bir indeks önerildi, arbusküller / veziküller raporu, kolonizasyon stratejisinin bir göstergesi olarak daha da kullanıldı. Kolonizasyon stratejisinin genel değerlendirmesi, mikorizal kalkınmanın dört farklı senaryosunu önerdi: 1) yayılma stratejisi, 2) transfer stratejisi, 3) depolama stratejisi ve 4) bitki direnci stratejisi. En temsili mikorizal haritaların çıkarılması için, her iki veritabanı da kolonizasyonun frekans ve yoğunluğunun dönüştürülmüş ortalama değerlerine dayanarak araştırıldı ve analiz edilen her varyant için üç farklı haritanın çıkarılmasıyla sonuçlandı (Tablo 1 ve Tablo 2). Üç harita, aşağıdakilere en yakın değerlere sahip kök segmentlerden kolonizasyonunu temsil eder: bir varyasyon için mevcut tüm verilere dayanarak hesaplanan her bir varyasyonun ortalaması (Av); ortalama ve ortalama/2 (Av−Av/2) arasındaki farkla hesaplanan bir değeri temsil eden ve daha düşük bir normal kolonizasyon potansiyeli gösteren Av−; ve Av+, ortalama ile ortalama/2 (Av+Av/2) arasındaki toplamla hesaplanan bir değeri temsil eder ve daha yüksek bir normal kolonizasyon potansiyeli gösterir. Bu ekstraksiyon formülünün kullanılması, kullanıcının kolonizasyonun aşırı uçlarından (en yüksek veya en düşük) kaçınmasına izin verir. Yöntem, en olası mikorizal kolonizasyon vakalarının çıkarılmasına izin verir.

Zea mays , bitkinin gelişim aşamasına bağlı olarak oldukça dalgalanan kolonizasyon potansiyeli sunmuştur (Tablo 1, Şekil 11). Kolonizasyon sıklığı değerleri% 3.67-% 69.60 arasında büyük ölçüde değişmekte olup, kolonizasyonun yoğunluğu için% 50'lik değerlerle desteklenmiştir. Bu fenomenin ana nedeni, kök sisteminin tüm bitki örtüsü döneminde sürekli olarak gelişmesidir. Arbuscules, 6 yaprak (B2) gelişim aşamasında maksimum değerler sundu ve sonraki büyüme aşamalarında bir azalma oldu. Veziküller sporadik olarak ortaya çıktı, değerler% 1'den düşüktü. Mikorizal paternlerin araştırılması, hifaların köklerin farklı bölgelerinde, sınırlı bir uzantı ile geliştiğini ortaya koymuştur. Kolonize edilmiş alanlar arasında büyük süreksizlikler gözlendi ve kolonizasyonun merkezi noktası etrafında düzensiz bir hifa gelişimi gözlendi. Kolonizasyon stratejisi, üreme ve transfer stratejilerine karşı bitki direnci aralığında büyük farklılıklar göstermiştir. 6 yaprağın (B2) evresi, ardından koçan oluşumu aşaması (B4), mikorize/mikorize olmayan alan raporlarının 0.14'ten düşük olmasıyla sürdürülen kolonizasyon transfer stratejisi sergilemiştir. Görünür bir yüksek transfer stratejisine sahip tek vaka, geniş kök alanlarının arbusküllerin ortaya çıktığı B2 aşamasında kaydedildi. Genel konumları, arbusküllerin geliştirildiği alan ile arbusküllerin ortaya çıkma aşamasında olduğu alan arasında net bir ayrım gösterdi. En homojen ortalama kolonizasyon paterni B5 gelişim aşamasında, kolonize edilenler arasında sürekli kolonize edilmemiş alanlar ile gözlenmiştir. Bu görsel fenomenin genel değerlendirmesi, bu yapıların gerilemesini gösteren küçük arbuskül değerleriyle son bitki örtüsü dönemine karşılık geldi.

Festuca rubra , çok yıllık kök sistemine sahip dağ otlaklarında baskın bir türdür. Bu adaptasyon nedeniyle, kolonizasyon işlemlerinin çoğu köklerin içinde gerçekleşir ve hifal ağlarının gelişimi, köklerin düşük gelişme hızı ile ilişkilidir (Tablo 2, Şekil 12). Gübrelerin uygulanması nedeniyle, kolonizasyon parametreleri varyantlar arasında yüksek farklılıklar göstermiştir. Kolonizasyon sıklığındaki farklılıklar% 65 idi ve kaydedilen yoğunluklarda% 36'lık bir farkla sürdürüldü. Her varyant farklı bir kolonizasyon paterni gösterdi, tedavilerin uzun süreli uygulanması ile korelasyon gösterdi ve mikorize/mikorize olmayan alanlar raporunda 0.09-0.96 ve arbusküller/veziküller raporunda 0-9.43 arasında bir avariasyon eşlik etti. Kontrol varyantı (V1), Av + kolonizasyon haritası için arbusküllerin gelişimini kısıtlayan sınırlı bir alanla ortalama depolama odaklı bir strateji gösterdi. Kolonizasyonun basitleştirilmiş görüntüsü (Av−), iki üst model (Av− ve Av+) için tamamen düzensiz kolonizasyona yönelik olan hifaların doğrusal ve yanal gelişimini gösterdi. Organik tedavilerin (V2) uygulanması, köklerde ikili, doğrusal ve düzensiz hifal gelişimine neden olmuştur. Organik arıtma için belirlenen kolonizasyon stratejisi, topraktaki gübrenin yavaş salınması ve bir mevsimden diğerine kalıcılığı ile ilişkili bir depolama stratejisine doğru bir yönelim göstermiştir. Av + modeli, yoğun bir vezikül varlığı ile en yüksek kolonizasyon potansiyelini sundu. Mikorize edilmiş/mikorize edilmemiş alanlar raporu, kolonize edilmiş alanlar arasında nadir süreksizliklerle homojen kolonizasyon sunmuştur. Bunun aksine, mineral gübrelerin (V4) uygulanması, mikorizal kolonizasyonun gerilemesine neden olmuştur. Kolonize edilmiş alanlar, aralarında büyük kolonize edilmemiş süreksizlikler bulunan düzensiz bir model sundu. Gözlemlenen strateji genellikle zamanında depolama veya transfer stratejisinin görünür olduğu küçük alanlarla bitki direncine yönelikti. Düşük mineralli organik (V3) ve yüksek mineralli organik (V5) tedaviler arasındaki karşılaştırmalı analiz, kolonizasyonun sürekli bir gerilemesini ve iki zıt tedavi (V2 ve V4) arasına yerleştirilen kolonizasyon stratejisindeki kaymaları göstermiştir. Kolonize edilen tüm alanlar, merkezi bir nokta etrafında düzensiz bir şekilde gelişti ve kolonize edilmemiş alanların homojen bir varlığı vardı. Kolonizasyon stratejisi, sınırlı alanlarda veziküllerin varlığı ile çoğalan bir transfer stratejisine yönelikti. En büyük kolonize edilmemiş süreksizlikler, daha yüksek miktarda mineral gübre (V5) içeren varyantta tanımlanmıştır.

Şekil 1: Kök örnekleme prosedürleri . (A) Köklerin bütünlüğünü korumak için numunelerin toprakla çıkarılması. (B) İlk temizleme prosedüründen sonra kök sisteminin ölçümleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İşlemeye kadar musluk suyu ile bir kavanozda tutulan lekeli kökler. Kökler renklerini oda sıcaklığında 1 haftaya kadar korurlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kök işleme . (A) Bir numunedeki tüm kökleri bir Petri kabındaki suda saklayın. (B) Kökleri 1 cm uzunluğundaki bölümler halinde kesin. (C-D) Kökleri ezmek için laminasyon torbasına hafifçe bastırın ve yavaşça bir slaytta görüntüleyin. (E-F) Kök segmentlerini bir kapak kayması ile örtün ve bir köşeye bir damla musluk suyu ekleyin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Görüntü işleme. (A) Bir örnekten yakalanan tüm görüntüleri bir sunuya ekleyin. Her kökün mikroskobik görünümünü yeniden oluşturmak için tüm görüntüleri hizalayın. (B) Kılavuzu hazırlamak için, her görüntü için 10 hücre x 10 hücre uzunluğunda bir tablo ekleyin. İç sınırları hiçbiri olarak ayarlayın. İç sınır hala görünür olacak, ancak şeffaflıkları mikorizal analize müdahale etmeyecektir. (C-D) Görüntüde görünen her yapıyı puanlamak için MycoPatt göstergesini kullanın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: MycoPatt'a veri eklenmesi. Sunumdan gözlemlerle birlikte tüm veritabanını MycoPatt'a kopyalayın. Sayı olarak yapıştırın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Ham veri ayıklama ve birincil veri analizi. (A) Bir satırdan 10 yatay hücrenin tümü için kolonizasyon değerlendirmesi. (B) MycoPatt'tan 10 hücre x 10 hücre karesinin her birinde bir sütundan (dikey) 10 hücrenin tümü için kolonizasyon değerlendirmesi. (C) Enine kolonizasyon değerlendirmesi ve ortalama kolonizasyon parametrelerinin hesaplanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Mikorizal desen haritalarının çıkarılması . (A) Tüm veri kümesi için, MycoPatt'ın grafik sayfasında 10 hücre x 150 hücreden oluşan büyük bir harita mevcuttur. (B) Kolonizasyon haritasını görüntü olarak ayıklayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Zea Mays'in işlenmiş köklerinde AMF yapılarının mikroskobik görüntüleri . (A) Hifal ağı hücreler arası ve hücre içi arbuskül gelişimi. (B) Hücre içinde gelişen çok sayıda arbuskül ile yoğun hifal ağı. (C) Farklı boyutlarda vezikül serisi. Kısaltmalar: H = hyphae; A = arbusküller; V = veziküller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Festuca rubrasının işlenmiş köklerindeki AMF yapılarının mikroskobik görüntüleri . (A) Ayrı alanlarda gelişen veziküller ve arbusküllerle çoklu hifal ağları. (B) Sarmal bir hifal ağının detayı. (C) Bir giriş noktasının ve iki sarmal hiflerin detayı. (D) Sarmal bir hifanın sonundaki vezikülün detayı. (E) Hücre içi arbuskülün detayı, sarmal bir hifanın detayı ve bir hifanın sonunda bir vezikülün varlığı. Kısaltmalar: H = hyphae; A = arbusküller; V = veziküller; Ep = giriş noktaları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Festuca rubra (A-C) ve Zea mays (D-E) köklerindeki AMF yapılarının belirsiz mikroskobik görüntüleri, eksik temizlenmiş ve lekelenmiş köklerde. (A) Düşük sayıda hifaj görülebilen ve köklerin doğal rengi görülebilen belirsiz lekeli kök. (B) Kök hücreler ve hifler arasında belirsiz bir ayrım olan mavi ve yoğun mavi renk gradyanının hifleri. (C) Görüntünün üst kısmında lekeli hifal ağı ve alt kısmında eksik lekeli hifler. (D) yapılarının tanımlanmasını imkansız kılan yoğun lekeli kök ve hifler. (E) Hücrelerde bulunan eserlerle yoğun lekeli bir kökün detayı, bu da yapılarının tanımlanmasını imkansız kılar. Kısaltmalar: H = hyphae. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Tedavi edilen Zea mays'ın köklerinde mikorizal kolonizasyon paternleri (Av, Av− ve Av+). Kısaltmalar: A0 = tedavi uygulama anı; A1 = kontrol varyantı (tedavi edilmez)/A2 = tedavi edilen varyant; B1 = 2-4 yaprak (mikorizal kolonizasyonun başlangıcı için bir kontrol noktası olarak); B2 = 6 yaprak; B3 = 8-10 yaprak; B4 = koçan oluşumu; B5 = fizyolojik olgunluk. Varyant kombinasyonları A0-B1'dir; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; ve A1B5/A2-B5. Tedavilerin tam açıklaması Pop-Moldovan et ^al.12 bulunabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12: Uzun süreli tedavi edilen Festuca rubrasının köklerinde mikorizal kolonizasyon paternleri (Av, Av− ve Av+). Kısaltmalar: V1 = kontrol, döllenmemiş; V2 = 10 t·ha⁻¹ gübre; V3 = 10 t·ha−1 gübre + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 gübre + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹. Tedavilerin tam tanımı önceki çalışma^13,14'te bulunabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Zea mays köklerinde mikorizal kolonizasyon parametrelerinin gelişim aşamasına göre değerleri. Açıklama: A0 = tedavi uygulama anı; A1 = kontrol varyantı (tedavi edilmez)/A2 = tedavi edilen varyant; B1 = 2-4 yaprak (mikorizal kolonizasyonun başlangıcı için bir kontrol noktası olarak); B2 = 6 yaprak; B3 = 8-10 yaprak; B4 = koçan oluşumu; B5 = fizyolojik olgunluk. Varyant kombinasyonları A0-B1'dir; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; ve A1B5/A2-B5. Tedavilerin tam açıklaması Pop-Moldovan et ^al.12 bulunabilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Uygulanan döllenmeye dayalı olarak Festuca rubra köklerinde mikorizal kolonizasyon parametrelerinin değerleri. Açıklama: V1 = kontrol, döllenmemiş; V2 = 10 t·ha⁻¹ gübre; V3 = 10 t·ha−1 gübre + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 gübre + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹. Tedavilerin tam tanımı önceki çalışma^13,14'te bulunabilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: Köklerin saha örneklemesinden ham veri analizine ve mikorizal harita ekstraksiyonuna kadar ayrıntılı protokol adımları. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Mikorizal kolonizasyon üzerine yapılan çalışmalar, agronomik alanda yeni strateji geliştirme için hayati öneme sahiptir. Birden fazla ekili bitkinin arbusküler mikorizalarla simbiyotik bir ilişki kurma potansiyeli, onları agroekosistemin sürdürülebilir gelişiminin ve sağlığının korunmasının önemli bir bileşeni haline getirmiştir 16,17,18,19,20. Bu nedenle, bir bitkinin topraktan beslenme ağları, verimi ve hayatta kalma potansiyeli ile nasıl bağlantı kurabileceği hakkında temel veriler sağlayan kolonizasyon mekanizmasının ve mantar stratejilerinin daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç vardır. Bu nedenle, akıllı tarım bağlamında, bu yüzyılın olmazsa olmazlarından biridir, kolonizasyonun derinlemesine bir değerlendirmesini yapmak hayati önem taşımaktadır ve çalışmaların köklerdeki mantar pozisyonunun gerçekçi bir görüntüsünü sağlaması gerekmektedir.

Kök mikorizal desenleri yöntemi, köklerin bu kadar derin bir taramasını sağlar, ancak hem sınırlamalar hem de avantajlarla birlikte gelir¹¹. Sunulan sınırlamalar, bir bitki ilk kez analiz edildiğinde puanlanması gereken çok sayıda numune, görüntü manipülasyonunun gerekliliği ve mikorizal yapıların köklerde manuel olarak tahsis edilmesidir, ancak bunların hepsi birden fazla uzun vadeli fayda ile aşılabilir. Bu yöntemin uygulanmasından ve mikroskopinin MycoPatt aracıyla entegrasyonundan kaynaklanan geniş veri tabanı, sonuçların karşılaştırılması açısından stabilite, sonuçların istatistiksel güvencesi ve çok yıllılık sağlar. Belirli bir bitkinin kökleri için mikorizal desen tanımlama, karşılaştırma açısından sonraki çalışmaları kolaylaştıracaktır. Ayrıca, kolonizasyon mekanizmalarının evrimi ve mantar stratejisi hakkında bilgi sağlayabilecek yeni kalıpların tanımlanmasını geliştirir. Ortalama kolonizasyon parametrelerinin yatay ve dikey gelişime dayalı olarak hesaplanması, ızgara kesişimi, kök segment tahmini ve büyütülmüş kesişim ^9,11 gibi görsel tahmin yöntemlerine kıyasla daha gerçekçi ve karmaşık değerlerin elde edilmesini sağlar. Genel olarak, mikorizal desen yöntemi, köklerde mantar ilerlemesinin ve dallanmanın değerlendirilmesine ve yeni dış kolonizasyon noktalarının belirlenmesine ve kökler boyunca hiflerin uzatılmasına izin verir. Arbusküllerin ve veziküllerin konumlandırılmasına izin verir ve onlara küresel modelde gerçekçi bir konum ve boyut tahsis eder.

MycoPatt yönteminin doğru uygulanması, protokolün her adımının başarıyla tamamlanmasına bağlıdır (Tablo 3). Daha yüksek verimlilik için, yöntemin tüm akışı, farklı eğitim seviyelerine sahip bir veya daha fazla kişi tarafından yürütülecek şekilde tasarlanmıştır. Bu şekilde, her adımdan birden fazla sonuç çıkarılır ve sürekli analiz mümkündür. Biyolojik materyal seçimi, kök örneklemesi ve depolama adımı için, yüksek eğitimli bir kişinin, büyüme aşamasından bağımsız olarak türleri doğru bir şekilde tanımlaması gerekir. Türler tanımlandıktan sonra, kök örneklemesi herhangi bir kişi tarafından, yumuşak toprak parçacığı giderimi için minimum eğitimle yapılabilir. İkinci adım, mikroskopi için kök işleme, temizleme ve boyama, eğitimli kişiler gerektirir; işlemin birden fazla doğrulama adımı vardır ve her adım prosedürün başarısı için gereklidir. İlk iki adımda aynı anda birden fazla numune işlenebilir. Mikroskopi için kök işleme (adım 3) ve kök örneklerinin mikroskobik analizi (adım 4), segmentlerin slayt hazırlığı için nazik ezilmeleri ile birlikte 1 cm'lik parçalara kesilmesi için gereken yüksek dikkat nedeniyle çok önemlidir. Mikroskopi, ışığın kalibrasyonu ve yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yazılıma dikkat edilmesi gerekir. Her iki adım da bir uzman gözetiminde yüksek eğitimli kişiler veya orta eğitimli kişiler gerektirir. Mikroskopi sonrası görüntü montajı, segmenti yeniden yapılandırmak için görüntülerin doğru örtüşmesi ve sırası için yüksek eğitimli personel gerektirir. Mikorizal kolonizasyonun puanlanması, mantarlarında bir uzmanın yapılarını ve kolonizasyon performanslarını tanımlamasını ve ızgaralı görüntülerde her yapı için puanlar tahsis etmesini gerektiren bir adımdır. Son adım, ham veri analizi ve sonuç ayıklama, veritabanlarını derleyen ve veri filtrelemenin ve en alakalı haritaların çıkarılmasının arkasındaki istatistikleri yöneten yüksek eğitimli bir veri analisti gerektirir. Bu adım, işlemin maksimum verimliliği için mikorizal uzmanın çalışmaları ile birleştirilebilir. Genel olarak, tüm akış, disiplinlerarası bir çalışmaya birden fazla uzmanın katılımına izin verir ve bu da yüksek kaliteli sonuçlara yol açar.

Herhangi bir yeni yöntem gibi, mikorizal desen yönteminin de gelişmesi ve gelişmesi gerekir. Gelecekte, bu yöntemin kullanımını kolaylaştıracak ve birden fazla sonuç sağlayacak bazı değişiklikler vardır. Yavaş temizleme ve boyama tekniği ile yapılırsa, bu yöntem, prosedürün her adımından sonra analizi duraklatmak / yeniden başlatmak ve birden fazla dijital veritabanı elde etmek için aynı anda birden fazla numunenin manipüle edilmesine izin verir. Önemli bir gelişme, daha hızlı görüntü elde etmek için performanslı tarayıcıların kullanılması ve mikorizal yapı tanıma için uygun ve verimli araçların geliştirilmesinden sonra bu sürecin otomatikleştirilmesi olacaktır. Teknik evrim bağlamında, mikorizal paternlerin hızlı bir şekilde elde edilmesi, alandaki gelecekteki çalışmaları sürdürecektir.

Otomatik yazılım kullanımında çeşitli zorluklar vardır. 1) yapılarının farklı konumları nedeniyle - hifalar ve veziküller - kök hücrelerin dışındaki ve kök hücrelerin içindeki arbusküller, yazılımı aynı resimde tanımak için kalibre etmek ve eğitmek zordur. 2) Resimlerin bir segmentten birleştirilmesi için, yazılım segmenti yeniden oluşturmak için resimleri her zaman hizalamaz ve bunları rastgele yerleştirebilir, bu da işlemi değiştirir. 3) Diğer bir sorun, yazılımın iki resmin bazı bölümlerinin aynı olması veya mikroskopi prosedürlerinde bazı alanların üst üste binmesi durumunda ayrımcılık yapamamasıdır. Bu nedenle, sürecin eğitimli uzmanlar tarafından manuel olarak gerçekleştirilmesi gerekir.

Genel olarak, her varyanttan 60 cm kök birden fazla bitkiden analiz edildi. Bu makale, MycoPatt sistemini ve aracını kullanma kavramını sunmak için tasarlanmıştır ve sonuçlar bu yöntemin işlevselliğini sunmaktadır. Bu yöntemle karşılaştırıldığında, ızgara kesişim yöntemi, lekeli köklerin rastgele yerleştirilmesi nedeniyle daha yüksek öznelliğe sahiptir. Gelecekte her tesisi için kullanılacak segment sayısının belirlenmesinin gerekli olacağına inanıyoruz. Bu, mikorizalar alanındaki tüm araştırmacılar tarafından yapılması gereken bir araştırmadır. Birden fazla yöntemi karşılaştıran makalelerden biri⁹ , 50'den 200 kök segmentine / bitkiye kadar benzer bir kolonizasyon oranı sunmuştur. Sonuçları, her segmenti analiz etmek için daha objektif bir yönteme ihtiyaç duyulduğunu belirtti. Araştırmamıza dayanarak, MycoPatt öznelliği 0'a düşürüyor. Her segment derinlemesine taranır ve analiz edilir. Ayrıca, analiz edilen tüm segment sonuçları için bir görüntü veritabanı bu yöntem kullanılarak geliştirilebilir. Bu, gerekirse verileri yeniden analiz etmek için de kullanılabilir.

Tüm yöntem, birden fazla araştırma ve ticari alan için gerekli olan sonuçları sağlar. Bitki yetiştiricileri, belirli toprak koşullarına uyum sağlayan daha dayanıklı çeşitler ve melezler yaratmaya çalışırlar. Bu bağlamda, bitki ıslah süreçleri, ilk seçim aşamalarından itibaren topraktan mikorizal ağlara bitki bağlantısı açısından fayda sağlayacaktır. Mikorizal desen analizi, topraktan mikorizal hasat ve saha koşullarına alışma açısından melezler arasındaki farkları gösterecektir. Üreme alanındaki araştırmacılar, seçim süreçlerinin erken aşamalarından bile, yeni çeşitlerin / melezlerin toprak mikorizal koşullarına uygunluğunu tespit etmek için bu yöntemi kullanabilirler. Bu şekilde, çok sayıda koşul ve teknolojiye kolayca uyum sağlayan çeşitler / hibritler, aynı zamanda dar koşullar için daha düşük kabul ve yüksek özgüllüğe sahip çeşitler / hibritler de olacaktır. Otlak ekosistemleri için, mikorizal desen yöntemi birden fazla uygulama için mükemmel bir şekilde uyacaktır: mantar desteği ile ilgili çeşitli bitki örtüsü topluluklarında bitki sağkalımının daha iyi anlaşılması; endemik ve nesli tükenmekte olan türlerde spesifik kolonizasyon modellerinin analizi; eksojen türlerin istilacı potansiyeli; ve çeşitli girdilerin uygulanmasına bağlı baskınlık-eş baskınlık dalgalanmaları²¹. Desenler, aktif propagüllere ve giriş noktalarına dayanarak potansiyel dozları hesaplaması gereken inokülum üreticileri tarafından daha da kullanılabilir. Ayrıca, aynı genitorları paylaşan bitkiler için uygun inokülum içerecek oldukça spesifik biyogübreler geliştirilebilir. Araştırmada, mikorizal desenler hem görsel hem de sayısal açıdan oldukça karşılaştırmalı bir çalışmayı temsil etmektedir. Mikorizal türleri ve test edici bitkilerin köklerinde geliştirebilecekleri yapıları sunan ^22,23,24 numaralı birden fazla veritabanı vardır^, ancak bunların hiçbiri bugüne kadar tam kolonizasyon görüntüsünü sunmamaktadır. Tüm bu gereksinimler ve daha gerçekçi ve aplikatif çalışmalara duyulan ihtiyaç, toprak-mikrop-bitki etkileşimi çalışmalarında mikorizal desenler yönteminin entegrasyonunu desteklemektedir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb