Summary
这里的协议描述了评估丛枝菌根定植模式的方法和两个物种的根策略： Zea mays 和 Festuca rubra。MycoPatt方法的使用允许计算参数，将菌根结构转换为数字数据，以及绘制它们在根中的真实位置。
Abstract
丛枝菌根真菌是植物根部的共生体。它们的作用是维持宿主发育和维持生态系统中的营养平衡。定植过程取决于几个因素，如土壤生态、真菌和宿主的遗传多样性以及农艺实践。它们的同步作用导致复杂的菌丝网络的发展，并导致根细胞中囊泡和丛枝的二次发育。本研究的目的是分析菌根模式（MycoPatt）方法在 红费斯图卡 和 玉米根部定位真菌结构的效率。另一个目标是探索每个物种的菌根图所揭示的真菌定植策略。多个显微图像的采集和组合允许玉米和红羊茅植物的菌根定植评估，以提供有关发达结构的实际位置的信息。观察到的菌根模式突出了每种植物在与土壤共生真菌建立联系方面的不同效率，这是由应用处理和生长阶段引起的。通过MycoPatt方法获得的菌根详细图谱可用于早期检测从土壤中共生获取的植物效率。
Introduction
丛枝菌根（AM）真菌是一类土壤传播的内生菌，一直是研究人员感兴趣的领域。它们存在于大多数植物的根部并参与营养循环，使它们成为存在草本植物的每个生态系统稳定性的重要组成部分1，2。通过其神经根外菌丝体，AM可作为植物根系的真菌延伸，特别是在难以到达的地区3。主要活动是在寄主植物根部，AM在其中发展出大型菌丝网络和称为丛枝的特定细胞内结构。宿主特异性的缺乏使共生体能够同时定植多个物种。这种能力为AM提供了生态系统中资源分配和养分调节的作用;真菌还为植物生存提供支持，并有助于植物性能4，5，6，7。AM物种对宿主根的反应在神经根内菌丝体的延伸和位置以及细胞内发育的丛枝的存在和形状中可见。细胞内丛枝作为两个共生体之间的交换点，代表以快速转移过程为特征的区域。AM产生的结构是物种依赖性的，除了丛枝外，在根部，它们还发育囊泡，孢子和辅助细胞。
植物根系AM共生体的评估存在许多挑战8，9。首先是它们在整个寄主植被时期的不断发展，导致菌丝丛枝结构发生多重变化。丛枝生长的不同阶段，直到它们的崩溃，明显存在于根部，但衰老的AM结构有时会被消化，这使得它们只能部分可见10。第二个挑战是染色方法和方案，根系的多样性，细胞的尺寸以及厚度的差异，这使得很难提出统一的方法。最后一个挑战是AM定植的评估和评分。有许多方法可以对AM进行不同程度的客观性评分，其中大多数仍然仅限于显微镜技术。简单的是基于根皮层中结构的存在/不存在，而更复杂的是基于视觉评分和定植类的使用，并整合了定植现象的频率和强度。在过去的几十年里，已经产生了大量关于多个物种菌根状态的数据，但大多数方法仅限于定植的观察值，而没有指出根皮层中每个结构的真实位置。为了应对更准确的AM定植结果的必要性，开发了一种基于根系菌根模式显微镜分析（MycoPatt）的方法，以数字形式组装详细的菌根图谱11。此外，该方法允许客观计算定植参数并确定根中每个结构的实际位置。
AM真菌结构的位置对于回答以下两个问题很重要。第一个与植物植被周期中某一特定时刻的定植分析有关。在这种情况下，观察丛枝/囊泡丰度，报告它们在根中的位置，并提供非常清晰的定植图像和参数非常有用。第二个与真菌策略的检测及其取向甚至对其未来发展的预测有关。MycoPatt 的一种应用可以用于每天、每 2-3 天、每周或在不同生长阶段分析的植物。在这种情况下，囊泡/丛枝的位置对于更好地了解AM定植的生物学机制非常重要。这些参数和观察结果对于补充数学参数非常有用。
本文的目的是展示MycoPatt系统在不同发育阶段的玉米根和不同长期受精条件下的红羊茅根中探索天然AM真菌定植潜力和策略的能力。为了实现这个目标，分析了来自两个实验的两个大型数据库。玉米实验在Cojocna（北纬46°44′56“，长23°50′0”）建立。E），在农业科学和兽医大学克卢日的实验教学农场中，在具有壤质土壤的 phaeoziom 上12.红羊茅实验是2001年在阿普塞尼山脉Gheśari（北纬46°49'064“，长22°81'418”）建立的大型实验场的一部分。E），在前卢沃索尔（土地罗萨）土壤类型13，14上。以5种不同的生长形态12收集玉米：B1 = 2-4叶（作为菌根定植开始的控制点）;B2 = 6 片叶子;B3 = 8-10 叶;B4 = 玉米芯形成;B5 = 生理成熟度。从2-4叶阶段（A0）开始，应用有机处理，产生两个分级因子（A1 =对照和A2 =处理）。在开花时从五次长期施肥实验中收集红羊茅的根13，14：V1 =对照，未受精;V2 = 10 t·ha-1 粪肥;V3 = 10 t·ha-1 粪肥 + N 50 kg·ha-1， P 2 O5 25 kg·ha-1， K2O 25 kg·ha-1;V4 = N 100 kg·ha-1， P 2 O5 50 kg·ha-1， K2O 50 kg·ha-1;V5 = 10 t·ha-1 粪肥 + N 100 kg·ha-1， P 2 O5 50 kg·ha-1， K2O 50 kg·ha-1.在每个发育阶段从每个施肥变体中收集五株植物。分析了染色方案及其在样品处理时间和染色质量方面的性能。分别分析了每个物种的AM菌丝发育与其根部结构存在之间的关系，并继续确定最宽松的根进行定植。基于定植图谱和AM参数值分析各根系的具体定植模式。
玉米是一年生植物，这意味着根系的持续生长，这是在生长阶段使用MycoPatt的主要原因。红羊茅是一种来自草原的多年生植物，经过长时间的不同肥料处理。它的根部发育较短，为1年，当植物的新陈代谢从营养转变为生成时，开花被认为是植被点。为了在这些激烈的活动期间捕捉这些植物，选择了上述时间点。在天然草原上生长时，该物种很难在植被期取样。
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Protocol
1.生物材料的选择、根系取样和储存
- 用铲子（图1A）分别收集每个变体的植物的整个根并复制。用手轻轻地从根部清除大块土壤聚集体。清洗整个根系，并在带有1cm x 1cm细胞的刻度上测量（图1B）。为每株植物分别切根，然后将它们放入塑料袋中。
- 将每株植物的所有干净根收集在一个塑料袋中，并将一个变体的所有样品收集在一个更大的袋子中。在每个袋子上写上阶段/变体名称和采样日期。将根存放在冰箱或冰柜中，温度在-4°C至-20°C之间，直到加工。
2. 用于显微镜的根部处理、清除和染色
注意：在协议的这一步中使用手套，口罩和微生物/化学头罩。
- 确保根解冻过程在室温下缓慢完成。对于所有处理步骤，请使用小罐（30-50 mL）以减少所需试剂的量。
- 执行以下四个步骤的缓慢清除和染色程序15。在室温下完成所有步骤。该方法允许同时处理大量样品，而无需使用水浴进行沸腾。
- 根清除：将一株植物的所有根放入罐子中。用自来水准备10%的NaOH溶液，然后将其倒入每个罐子中，直到完全覆盖根部。剧烈摇动罐子1分钟或2分钟，以在根部产生均匀的透明溶液分散。24小时后重复此过程，并将根部留在澄清溶液中至少48小时。
注意：干净的根具有淡黄色（直至白色）的外观，并且稠度柔软（可以用镊子轻松压碎）。 - 根部冲洗：一次将一个罐子的内容物通过筛子。回收清除溶液。用自来水冲洗根部几次，直到完全去除清除溶液。
注意：如果清除溶液未完全去除，则会影响染色程序的质量。 - 根染色：将冲洗过的根放入干净的罐子中。用自来水（5 mL 蓝色墨水 + 5 mL 9% 乙酸 + 90 mL 自来水）制备 5%：5% 墨水醋溶液。将溶液倒入每个罐子中，直到完全覆盖根部。剧烈摇动罐子1分钟或2分钟，以在根部产生均匀的染色溶液分散。24小时后重复此过程，并将根留在该溶液中48小时。
注意：染色的根具有强烈的蓝色。 - 根部分脱色：用自来水冲洗染色的根1-2分钟。用力摇晃罐子以去除多余的染色溶液。如果染色太强烈并且不允许进行清晰的显微镜评估，请重复该过程。
注意：染色的根可以在室温下在自来水中保存长达1周，而不会改变染色质量（图2）。在较长时间内，根可以在5%的商业苹果醋溶液（5%乙酸）中维持长达2-3个月。
- 根清除：将一株植物的所有根放入罐子中。用自来水准备10%的NaOH溶液，然后将其倒入每个罐子中，直到完全覆盖根部。剧烈摇动罐子1分钟或2分钟，以在根部产生均匀的透明溶液分散。24小时后重复此过程，并将根部留在澄清溶液中至少48小时。
3. 显微镜的根处理
- 根分割：将每个样品的染色根放在缩放的砧板上（图3A）。将根切成1厘米的段（图3B）。为每个款式/规格选择 15 个细分。
- 用于分段制备的温和破碎方法：将根部铺在载玻片上。使用层压袋覆盖根部，并从边缘开始轻轻压碎它们（图 3C，D）。使用软塑料工具，例如镊子、手术刀柄、钢笔或带橡皮擦的铅笔，在幻灯片上慢慢显示根部。小心地取出层压袋并用盖玻片盖住样品（图3E）。
注意：根具有管状形式，因此有必要将它们分开在二维平面中。这个动作假定根在中点分离，导致显示内径的两个部分。在温和的破碎过程中使用层压袋允许将具有圆柱形的根部分成两部分（一块在左边，一块在右边）朝向它们的中间点展示。通过这种方式，对整个根进行了深入分析，定植程度是显示体积定植的参数（在MycoPatt11的原始工作中进行了描述）。基本上，我们将一个圆柱体切成两半，然后用数学方式重建它。 - 用移液管将水添加到载玻片的一角，让水慢慢扩散到载玻片上（图3F）。用纸巾擦去多余的水。
4. 根样品的显微分析
- 使用配备良好分辨率相机的显微镜。
- 从四肢开始分析幻灯片。捕获每个微观场。使用代码重命名捕获的每个图像，该代码将允许根部分的真正后组装。对于粗根，请使用 10 倍或 40 倍放大倍率，对于细根，请使用 40 倍放大倍率。对一个物种的整组根使用相同的物镜和放大倍率。
5. 显微镜后图像组合
- 使用演示软件设计用于图像组合的绘图板。将宽度设置为比图像宽度宽 2-3 厘米。按照捕获顺序从一个段添加所有捕获的图像，并重建根段的整个长度（图4A）。
- 简而言之，为每个 1 厘米的片段收集总共 15 张图片，并在演示软件中从 1 到 15 开始垂直组织它们以重建片段。
- 将图像对齐到中心。使用垂直对齐方式确保每个图像都遵循前一个图像。在所有图片上，放置一个由 10 个单元格 x 150 个单元格组成的网格以覆盖整个根段。
- 此外，在每张单独的图片上放置一个 10 x 10 的网格，如果 AM 结构可见，则在此网格的每个单元格中插入一个从 1 到 6 的数字，如果不存在 AM 结构，则留空。通过这种方式，过程的准确性是最大的，而观察到的AM结构的位置没有错误。
- 为宽度为 10 个单元格、长度为 150 个单元格的网格添加一个表格（15 个正方形，共 10 个单元格 x 10 个单元格）。将表格宽度尺寸更改为图像的宽度。更改表格的长度以包含所有图像（图 4B）。
6. 菌根定植的评分
- 使用唯一编号对每种类型的结构进行评分，如菌根模式方法11：1中所述的菌丝;2 用于丛枝;3 用于囊泡;4个为孢子;5个用于辅助细胞;6 个用于入口点（图 4C）。对先前应用的网格的每个细胞的每个观察到的菌根结构进行评分（图4D）。
7. 原始数据分析和结果提取
- 将所有获得的分数插入MycoPatt电子表格11中。使用复制/粘贴功能将所有分数从演示文稿传输到名为 rawdata 的第一张纸中（图 5）。
- 结果的初步分析：使用 MycoPatt 电子表格工具中名为参数的第三张工作表，以三种形式分别以百分比 （%） 的形式可视化结果（图 6A-C）。使用A到K列分析殖民的水平图像;列M至W分析殖民的垂直图像;和 Y 到 AI 列，以分析 15 个 10 x 10 正方形（第 2-17 行）中每个方块的横向（平均）定植和最终平均定植（第 19-20 行）。
注意：横向平均定植用于计算与水平和垂直分析相关的实际定植参数。这样，与仅使用水平或垂直分析相比，不会出错（在原著11中有详细描述）。此外，这组参数是针对微观场的整个表面计算的。- 使用特定于每个参数的定义和公式来分析结果11.使用以下定植参数：定植频率（%），定植强度（%），丛枝（%）和囊泡（%），孢子（%）和辅助细胞（%），入口点（%），非菌根区域的百分比（%），总定植程度（%）以及菌根/非菌根区域的报告。
注意：如果分析的样品中缺少丛枝、囊泡、孢子、辅助细胞和入口点，MycoPatt 电子表格会将它们评分为零 （0）。
- 使用特定于每个参数的定义和公式来分析结果11.使用以下定植参数：定植频率（%），定植强度（%），丛枝（%）和囊泡（%），孢子（%）和辅助细胞（%），入口点（%），非菌根区域的百分比（%），总定植程度（%）以及菌根/非菌根区域的报告。
- 菌根图的制作和提取：可视化从菌根结构代码转换为颜色中获得的图像，在MycoPatt命名图的第二张纸（图7A）。 将图表表中的结果图像导出为图像（图 7B）。使用图例中的颜色代码分析菌根模式。
- 菌根图谱分析：确定菌根图谱上最重要的结构及其组合。描述在分析的根中观察到的菌根定植模式。描述基于观察到的根结构发育、分支模式和丛枝/囊泡发育的菌根定植策略。
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Representative Results
染色程序后正确使用根部的温和破碎方法提供了菌根结构的良好细节，无论是Zea mays（图8A-C）还是红费斯图卡（图9A-E），菌根结构和根细胞之间的良好对比度，以及由于蓝色而确认石碑。如果清除和染色程序不成功，根样品很难粉碎，并且不能清楚地显示菌根结构（图10A-E）。在这种情况下，重复整个清除染色过程。
菌根模式法和MycoPatt工具的使用允许对定植机制进行全面探索。该方法提供了对每个物种的定植模式和策略的深入，小规模探索（图11和图12），并增加了定植参数的视觉表达（表1和表2）。对Zea mays进行的两项研究，由Pop-Moldovan等人广泛描述12，以及Festuca rubra，由Corcoz等人详细介绍。13，14，提供了一个大型的观测数据库，菌根图谱和定植参数。两个数据库都对定植频率（%）、定植强度（%）、丛枝（%）和囊泡（%）、非菌根区域的百分比（%）、总体定植程度（%）以及菌根/非菌根区域作为定植参数的报告进行了评分。对于Zea mays来说，该数据库由电子表格数据库中的5，850行条目组成，这些条目汇编在390张殖民地图中。Zea mays实验提出了菌根/非菌根区域的报告，作为描述根系定植区域之间交替和破坏的参数。这种方法允许深入分析殖民机制及其沿根源的发展。Festuca rubra在电子表格中提供了一个包含4，500条线条目的数据库，该数据库由300张地图汇编而成。提出了一个新的指数，即丛枝/囊泡报告，该报告进一步被用作殖民战略的指标。对定植策略的总体评估提出了菌根发育的四种不同情景：1）繁殖策略，2）转移策略，3）储存策略和4）植物抗性策略。为了提取最具代表性的菌根图谱，根据定植频率和强度的转换平均值探索了两个数据库，从而为分析的每个变体提取了三个不同的图谱（表1和表2）。这三张地图表示具有最接近以下值的根段的 AM 殖民化：每个变体的平均值 （Av），它是根据变体的所有可用数据计算的;Av−，表示由平均值和平均值/2之差（Av−Av/2）计算的值，并显示较低的正常定植潜力;和 Av+，它代表由平均值和平均值/2 （Av+Av/2） 之和计算的值，并显示出更高的正常定植潜力。使用此提取公式允许用户避免定植的极端（最高或最低）。该方法允许提取最可能的菌根定植情况。
玉米具有 高度波动的定植潜力，这取决于植物的发育阶段（表1， 图11）。定植频率值在3.67%-69.60%之间变化很大，定植强度为50%。造成这种现象的主要原因是根系在整个植被时期不断发育。丛枝在6叶（B2）发育阶段呈现最大值，在随后的生长阶段呈下降趋势。囊泡零星出现，值低于1%。对菌根模式的探索表明，菌丝在根的不同区域发育，延伸有限。观察到定植区域之间存在很大的不连续性，在定植中心点周围菌丝不规则地发育。定植策略在植物抗增殖和转移策略的区间上表现出较大的差异。6叶期（B2）和玉米棒形成期（B4）表现出定植转移策略，菌丝化/非菌丝化面积报告低于0.14。唯一具有明显高转移策略的病例记录在B2期，当时大面积的根呈现丛枝。它们的整体定位表明，丛枝发育区域与丛枝处于新兴阶段的区域之间有明显的分离。在B5发育阶段观察到最均匀的平均定植模式，定植区域之间具有恒定的非定植区域。对这种视觉现象的总体评估对应于最终的植被时期，丛枝值很小，这表明这些结构的回归。
红花是山地草原的优势物种，具有多年生根系。由于这种适应，大多数定植过程发生在根内，菌丝网络的发育与根的低发育速度相关（表2，图12）。由于施用肥料，定植参数在变种之间表现出很大的差异。定植频率的差异为65%，记录的强度差异为36%。每个变异表现出不同的定植模式，与治疗的长期应用相关，并伴有菌根化/非菌化区域报告中0.09-0.96的变化和丛枝/囊泡报告中0-9.43的变化。对照变体（V1）显示出一种平均的面向存储的策略，有限的区域限制了Av+殖民图的丛枝的发展。定植（Av−）的简化图像显示菌丝的线性和横向发育，其完全面向两个上部模型（Av−和Av+）的不规则定植。有机处理（V2）的应用诱导了根系的双重，线性和不规则菌丝发育。为有机处理确定的定植策略显示出一种储存策略的方向，这与粪便在土壤中的缓慢释放及其从一个季节到下一个季节的持久性有关。Av+模型表现出最高的定植潜力，具有强烈的囊泡存在。菌化/非菌化区域报告呈现了同质定植，定植区域之间罕见的不连续性。与此相反，施用矿物肥料（V4）诱导了菌根定植的消退。殖民区域呈现出不规则的模式，它们之间有很大的未殖民不连续性。观察到的策略通常面向植物抗性策略，在小区域可以看到准时储存或转移策略。低矿物质有机（V3）和高矿物质有机（V5）处理之间的比较分析表明，在两个相反的处理（V2和V4）之间拟合，定植和定植策略的转变不断回归。所有殖民地区都围绕一个中心点不规则地发展，非殖民地区均匀存在。定植策略面向增殖转移策略，在有限的区域存在囊泡。在具有较高量矿物肥料（V5）的变体中发现了最大的非定植不连续性。
图1：根系采样程序 。 （A）用土壤提取样品以保护根系的完整性。（B）第一次清除程序后根系的测量。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：染色的根部在装有自来水的罐子中保持，直到加工。根在室温下可保持其颜色长达 1 周。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：根处理 。 （A）将一个样品的所有根保存在培养皿中的水中。（B）将根切成1厘米长的段。（中四）轻轻按压层压袋以压碎根部并将它们慢慢显示在幻灯片上。（E-F）用盖玻片盖住根段，并在一角加入一滴自来水。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：图像处理。 （A） 添加演示文稿中从一个样本捕获的所有图像。对齐所有图像以重建每个根的微观视图。（B）添加一个表格来准备网格，每个图像的宽度为10个单元格x 10个单元格长度。将内部边框设置为无。内部边界仍然可见，但它们的透明度不会干扰菌根分析。（中四）使用 MycoPatt 的图例对图像上可见的每个结构进行评分。请点击此处查看此图的大图。
图 5：在 MycoPatt 中插入数据。 将包含演示文稿中的观察结果的整个数据库复制到 MycoPatt。将其粘贴为数字。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：原始数据提取和主要数据分析。 （A）一行所有10个水平细胞的定植评估。（B）对MycoPatt的10个细胞中每个细胞中每个细胞（垂直）的一列（垂直）的所有10个细胞进行定植评估。（C）横向定植评估和平均定植参数的计算。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：菌根模式图的提取。 （A）对于整个数据集，MycoPatt的图表表中提供了10个单元格x 150个单元格的大图。（B） 将殖民地图提取为图像。请点击此处查看此图的大图。
图8： 玉米加工根中AMF结构的显微图像。 （A）菌丝网络细胞间和丛枝的细胞内发育。（B）密集的菌丝网络，细胞内发育着许多丛枝。（C）不同尺寸的囊泡系列。缩写：H = 菌丝;A = 丛枝;V = 囊泡。 请点击此处查看此图的大图。
图9： 红费斯图卡加工根部AMF结构的显微图像 。 （A）多个菌丝网络，在不同区域发育有囊泡和丛枝。（B）盘绕菌丝网络的细节。（C）一个入口点和两个盘绕菌丝的细节。（D）盘绕菌丝末端囊泡的细节。（E）细胞内丛枝的细节，盘绕的菌丝的细节，以及菌丝末端囊泡的存在。缩写：H = 菌丝;A = 丛枝;V = 囊泡;ep = 入场点。 请点击此处查看此图的大图。
图10：不完全清除和染色根中红费斯图卡（A-C）和Zea mays（D-E）根部AMF结构的不清晰微观图像。 （A）染色根部不明确，可见菌丝数量少，根部原生色可见。（B）菌丝呈蓝色和强烈的蓝色渐变，根细胞和菌丝之间的区别不明确。（C）图像上部的染色菌丝网络和图像下部的不完整染色菌丝网络。（D）根和菌丝严重染色，这使得AM结构的识别变得不可能。（E）细胞中存在伪影的强烈染色根的细节，这使得AM结构的识别变得不可能。缩写：H = 菌丝。请点击此处查看此图的大图。
图 11：经过处理的 Zea 可能根中的菌根定植模式（Av、Av− 和 Av+）。 缩写：A0 = 治疗应用时刻;A1 = 对照变异（无治疗）/A2 = 治疗变异;B1 = 2-4叶（作为菌根定植开始的控制点）;B2 = 6 片叶子;B3 = 8-10 叶;B4 = 玉米芯形成;B5 = 生理成熟度。变体组合为 A0-B1;A1-B2/A2-B2;A1-B3/A2-B3;A1-B4/A2-B4;和 A1B5/A2-B5。治疗的完整描述可以在Pop-Moldovan等人12中找到。 请点击此处查看此图的大图。
图 12：长期处理的红费斯图卡根中的菌根定植模式（Av、Av− 和 Av+）。 缩写：V1 = 对照，无施肥;V2 = 10 t·ha−1 粪便;V3 = 10 t·ha−1 粪肥 + N 50 kg·ha-1， P 2 O5 25 kg·ha−1， K2O 25 kg·ha−1;V4 = N 100 kg·ha−1， P 2 O5 50 kg·ha−1， K2O 50 kg·ha−1;V5 = 10 t·ha−1 粪肥 + N 100 kg·ha-1， P 2 O5 50 kg·ha−1， K2O 50 kg·ha−1.治疗的完整描述可以在以前的工作13，14中找到。请点击此处查看此图的大图。
表1：基于发育阶段的 Zea mays 根中菌根定植参数值。 图例：A0 = 治疗应用时刻;A1 = 对照变异（无治疗）/A2 = 治疗变异;B1 = 2-4叶（作为菌根定植开始的控制点）;B2 = 6 片叶子;B3 = 8-10 叶;B4 = 玉米芯形成;B5 = 生理成熟度。变体组合为 A0-B1;A1-B2/A2-B2;A1-B3/A2-B3;A1-B4/A2-B4;和 A1B5/A2-B5。治疗的完整描述可以在Pop-Moldovan等人12中找到。 请按此下载此表格。
表2：基于施肥的红费斯图卡根系菌根定植参数值。图例：V1 = 对照，无受精;V2 = 10 t·ha−1 粪便;V3 = 10 t·ha−1 粪肥 + N 50 kg·ha-1， P 2 O5 25 kg·ha−1， K2O 25 kg·ha−1;V4 = N 100 kg·ha−1， P 2 O5 50 kg·ha−1 K2O 50 kg·ha−1;V5 = 10 t·ha−1 粪肥 + N 100 kg·ha-1， P 2 O5 50 kg·ha−1 K2O 50 kg·ha−1.治疗的完整描述可以在以前的工作13，14中找到。请按此下载此表格。
表3：从根的现场采样到原始数据分析和菌根图谱提取的详细协议步骤。请按此下载此表格。
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Discussion
菌根定植研究对于农艺领域的新战略制定至关重要。多种栽培植物与丛枝菌根形成共生联系的潜力使它们成为农业生态系统可持续发展和维持其健康的重要组成部分16，17，18，19，20。因此，有必要更好地了解定植机制和真菌策略，这提供了关于植物如何与土壤营养网络、产量和生存潜力联系起来的基本数据。因此，在智能农业背景下，这是本世纪的必备品，对定植进行深入评估至关重要，研究需要提供真菌在根部位置的真实图像。
根菌根模式方法提供了对根的深度扫描，但它既有局限性又有优点11。提出的局限性是首次分析植物时需要评分的大量样品，图像处理的必要性以及根系中菌根结构的手动分配，但所有这些都可以通过多种长期益处来克服。应用这种方法以及显微镜与MycoPatt工具的集成所产生的大型数据库提供了稳定性，结果的统计保证以及结果比较方面的持久性。一种特定植物根的菌根模式鉴定将有助于后续的比较研究。此外，它改进了对新模式的识别，这可以提供有关定植机制和真菌策略演变的信息。与视觉估计方法（如网格交集、根段估计和放大交集9，11）相比，基于水平和垂直发展的平均定植参数计算允许获取更真实和更复杂的值。总体而言，菌根模式方法可以评估根部真菌的进步和分支，并确定外部定植的新点和菌丝沿根的延伸。它允许丛枝和囊泡的定位，并在整个模式中为它们分配一个现实的位置和维度。
MycoPatt方法的正确应用取决于协议每个步骤的成功完成（表3）。为了提高效率，该方法的整个流程设计为由具有不同培训水平的一个或多个人进行。通过这种方式，可以从每个步骤中提取多个结果，并且可以连续分析。对于生物材料的选择，根采样和储存步骤，无论其生长阶段如何，都必须由训练有素的人员正确识别物种。一旦确定了物种，任何人都可以进行根系采样，只需进行最少的培训即可温和去除土壤颗粒。第二步，用于显微镜的根部处理、清除和染色，需要训练有素的人员;该过程具有多个验证步骤，每个步骤对于程序的成功都是必需的。在前两个步骤中可以同时处理多个样品。显微镜的根部处理（步骤3）和根样品的显微分析（步骤4）非常重要，因为将片段切成1厘米的碎片需要高度注意，并且需要轻轻粉碎用于载玻片制备。显微镜需要注意光的校准和软件以获得高质量的图像。这两个步骤都需要训练有素的人员或在专家的监督下接受中等培训的人员。显微镜后图像组合需要训练有素的人员来正确重叠图像和图像顺序以重建片段。菌根定植的评分是一个步骤，需要AM真菌专家识别其结构和定植性能，并在网格化图像上为每个结构分配分数。最后一步，原始数据分析和结果提取需要训练有素的数据分析师编译数据库并管理数据过滤和提取最相关地图背后的统计数据。此步骤可以与菌根专家的工作相结合，以实现过程的最大效率。总体而言，整个流程允许多个专家参与跨学科研究，从而产生高质量的结果。
像任何新方法一样，菌根模式方法需要发展和改进。将来有一些修改将使此方法更易于使用并提供多个结果。如果通过慢速清除和染色技术完成，则该方法允许一次操作多个样品，以便在程序的每个步骤后暂停/重新开始分析并获得多个数字数据库。一个重要的改进将是使用高性能扫描仪进行更快的图像采集，并且在开发合适和有效的菌根结构识别工具后，该过程的自动化。在技术进化的背景下，菌根模式的快速获取将维持该领域的未来研究。
使用自动软件有几个困难。1）由于根细胞外的AM结构（菌丝和囊泡）和根细胞内的丛枝位置不同，因此很难校准和训练软件在同一张图片中识别它们。2）对于一个片段的图片组合，软件不会总是对齐图片以重新创建片段，并且可能会随机放置它们，这将改变过程。3）另一个问题是，软件无法区分两张图片的某些部分是否相同，或者在显微镜程序中，某些字段是否重叠。因此，该过程需要由训练有素的专家手动执行。
总体而言，分析了来自多个植物的每个变体的60厘米根。目前的手稿旨在介绍使用MycoPatt系统和工具的概念，结果展示了该方法的功能。与该方法相比，网格交叉法由于染色根的随机放置具有更高的主观性。我们认为，未来有必要为每个增材制造工厂确定要使用的段数。这是菌根领域所有研究人员都需要完成的研究。其中一篇比较多种方法的文章 9提出了相似的定植率，即50至200根节/株。他们的结论指出，需要一种更客观的方法来分析每个细分市场。根据我们的研究，MycoPatt将主观性降低到0。每个部分都经过深入扫描和分析。此外，可以使用此方法开发所有分析片段结果的图像数据库。如果需要，这也可用于重新分析数据。
整个方法提供了多个研究和商业领域所需的结果。植物育种者不断尝试创造适应特定土壤条件的更具抗性的品种和杂交种。在这种情况下，植物育种过程将从初始选择阶段开始从土壤到菌根网络的植物连接方面受益。菌根模式分析将显示杂交种在从土壤中收获菌根和适应场地条件方面的差异。育种领域的研究人员可以使用这种方法来检测，甚至从选择过程的早期阶段，新品种/杂交种对土壤菌根条件的适用性。这样，将有易于适应大量条件和技术的品种/杂交种，但也会有接受度较低、对狭窄条件具有高特异性的品种/杂交种。对于草原生态系统，菌根模式方法将非常适合多种应用：更好地了解与真菌支持相关的不同植被组合中的植物生存;分析特有和濒危物种的具体定殖模式;外源物种的入侵潜力;以及由于应用各种投入而导致的优势-优势波动21.接种物生产者可以进一步使用这些模式，他们需要根据活性繁殖体和进入点计算潜在剂量。此外，可以开发高度特异性的生物肥料，其中包含适合共享相同生殖器的植物的接种物。在研究中，菌根模式代表了高度比较的研究，无论是从视觉还是数字的角度来看。有多个数据库22，23，24提供了菌根物种及其在测试植物根部可以发育的结构，但迄今为止，它们都没有提供完整的定植图像。所有这些要求以及对更现实和应用性研究的需求都支持将菌根模式方法整合到土壤-微生物-植物相互作用研究中。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
本文使用了由Victoria Pop-Moldovan进行的“农艺投入驱动的玉米菌根模式”专题领域的两项博士研究得出的数据，以及由Larisa Corcoz在Roxana Vidican教授博士的协调下进行的“山地草原优势物种的菌根现状和定植发展”。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
References
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