Mapas micorrízicos como ferramenta para explorar padrões de colonização e estratégias fúngicas nas raízes de Festuca rubra e zea mays

Summary

O protocolo aqui descreve os métodos para a avaliação dos padrões de colonização micorrízica arbuscular e a estratégia em raízes para duas espécies: Zea mays e Festuca rubra. O uso do método MycoPatt permite o cálculo de parâmetros, a conversão de estruturas micorrízicas em dados digitais e o mapeamento de sua posição real nas raízes.

Abstract

Os fungos micorrízicos arbusculares são simbiontes nas raízes das plantas. Seu papel é sustentar o desenvolvimento do hospedeiro e manter o equilíbrio nutricional nos ecossistemas. O processo de colonização é dependente de vários fatores, como a ecologia do solo, a diversidade genética dos fungos e hospedeiros e práticas agronômicas. Sua ação sincronizada leva ao desenvolvimento de uma complexa rede hifal e leva ao desenvolvimento secundário de vesículas e arbúsculos nas células radiculares. O objetivo deste trabalho foi analisar a eficiência do método de padrões micorrízicos (MycoPatt) para o posicionamento de estruturas fúngicas nas raízes de Festuca rubra e Zea mays. Outro objetivo foi explorar a estratégia de colonização fúngica revelada pelos mapas micorrízicos de cada espécie. A aquisição e a montagem de múltiplas imagens microscópicas permitem a avaliação da colonização micorrízica em plantas de milho e fescue vermelha para fornecer informações sobre a posição realista das estruturas desenvolvidas. Os padrões micorrízicos observados destacam a eficiência variável de cada planta em termos de desenvolvimento de conexões com fungos simbióticos do solo, causadas por tratamentos aplicados e estágio de crescimento. Mapas detalhados micorrízicos obtidos pelo método MycoPatt são úteis para a detecção precoce da eficiência das plantas na aquisição simbiótica do solo.

Introduction

Os fungos micorrizas arbusculares (MA) são uma categoria de endófitos transmitidos pelo solo que são constantemente uma área de interesse para os pesquisadores. Sua presença nas raízes da maioria das plantas e seu envolvimento nos ciclos de nutrientes as tornam componentes vitais na estabilidade de todos os ecossistemas onde as plantas herbáceas estão presentes ^1,2. Através de seu micélio extra-radicular, o AM atua como uma extensão fúngica para as raízes das plantas, especialmente em áreas de difícil acesso³. A principal atividade é nas raízes das plantas hospedeiras, onde a MA desenvolve grandes redes de hifas e estruturas intracelulares específicas chamadas arbúsculos. A falta de especificidade do hospedeiro permite que o simbionte colonize várias espécies ao mesmo tempo. Essa habilidade fornece à AM o papel da alocação de recursos e da regulação de nutrientes no ecossistema; o fungo também fornece suporte na sobrevivência das plantas e auxilia no desempenho das plantas 4,5,6,7. A reação de espécies de micorrizas arbustivas às raízes hospedeiras é visível na extensão e localização do micélio intra-radicular e na presença e forma dos arbúsculos desenvolvidos intracelularmente. Os arbúsculos intracelulares atuam como um ponto de intercâmbio entre os dois simbiontes e representam áreas caracterizadas por processos de transferência rápida. As estruturas que o AM produz são dependentes da espécie e, além dos arbúsculos, nas raízes, eles também desenvolvem vesículas, esporos e células auxiliares.

Há muitos desafios na avaliação de simbiontes de micorrizas arbusculares em raízes de plantas ^8,9. O primeiro deles é o seu constante desenvolvimento durante todo o período de vegetação dos hospedeiros, o que leva a múltiplas mudanças na estrutura arbuscular hifal. Os diferentes estágios do crescimento arbuscular, até o seu colapso, estão claramente presentes nas raízes, mas as estruturas arbusculares senescentes às vezes são digeridas, o que as torna apenas parcialmente visíveis¹⁰. O segundo desafio é representado pelo método e protocolo de coloração, pela grande diversidade de sistemas radiculares, pela dimensão de suas células e pelas diferenças de espessura, que dificultam a proposição de um método unificado. O último desafio é representado pela avaliação e pontuação da colonização da MA. Existem inúmeros métodos que pontuam a MA com diferentes graus de objetividade, e a maioria deles ainda está restrita às técnicas de microscopia. As simples baseiam-se na presença/ausência de estruturas no córtex radicular, enquanto as mais complexas baseiam-se no escore visual e no uso de classes de colonização, com a integração da frequência e intensidade do fenômeno de colonização. Muitos dados foram produzidos nas últimas décadas sobre o status micorrízico de múltiplas espécies, mas a maioria dos métodos se restringe ao valor observado da colonização sem apontar para a posição real de cada estrutura no córtex radicular. Como resposta à necessidade de resultados mais precisos sobre a colonização por MA, foi desenvolvido um método baseado na análise microscópica de padrões micorrízicos (MycoPatt) em raízes para montar, em formato digital, os mapas micorrízicos detalhados¹¹. Além disso, o método permite o cálculo objetivo dos parâmetros de colonização e a determinação da posição real de cada estrutura na raiz.

A posição das estruturas fúngicas da micorrizas do miocárdio pode ser importante para responder às duas perguntas a seguir. A primeira está relacionada à análise da colonização em um momento específico do ciclo vegetacional de uma planta. Nesse contexto, é muito útil observar a abundância de arbusculares/vesículas, relatar como elas estão localizadas na raiz e fornecer uma imagem e parâmetros de colonização muito claros. A segunda está relacionada à detecção da estratégia fúngica e sua orientação e até mesmo à previsão de seu desenvolvimento futuro. Uma aplicação do MycoPatt pode ser para plantas analisadas diariamente, a cada 2-3 dias, semanalmente ou durante vários estágios de crescimento. Nesse contexto, a localização das vesículas/arbúsculos é importante para melhor compreensão do mecanismo biológico da colonização por MA. Estes parâmetros e observações são muito úteis para complementar os parâmetros matemáticos.

O objetivo deste artigo é demonstrar a capacidade do sistema MycoPatt de explorar o potencial e a estratégia de colonização de fungos de micorrizas arbusculares nativos em raízes de Zea mays (milho) durante diferentes estágios de desenvolvimento e em raízes de Festuca rubra (fescue vermelha) sob diferentes condições de fertilização a longo prazo. Para cumprir o objetivo, foram analisadas duas grandes bases de dados de dois experimentos. O experimento com milho foi estabelecido em Cojocna (46°44′56" lat. N e 23°50′0" de comprimento. E), na Fazenda Didática Experimental da Universidade de Ciências Agrárias e Medicina Veterinária de Cluj sobre um feozoima com textura argilosa do solo¹². O experimento de fescue vermelha é uma parte de um local experimental maior estabelecido em 2001 em Ghețari, Montanhas Apuseni (46°49'064" lat. N e 22°81'418'' de comprimento. E), em um solo preluvosol (terra rossa) tipo^13,14. O milho foi coletado em cinco diferentes fenófases de crescimento¹²: B1 = 2-4 folhas (como ponto de controle para o início da colonização micorrízica); B2 = 6 folhas; B3 = 8-10 folhas; B4 = formação de espiga ; B5 = maturidade fisiológica. A partir do estágio de 2-4 folhas (A0), aplicou-se um tratamento orgânico, que resultou em um fator de duas graduações (A1 = controle e A2 = tratado). Raízes de fescue vermelha foram coletadas na floração de um experimento com cinco adubações de longa duração^13,14: V1 = controle^, não adubado; V2 = 10 t·^ha-1 de estrume; V3 = 10 t·ha-1 de estrume + N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 de estrume + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Cinco plantas foram coletadas em cada estágio de desenvolvimento de cada variante de fertilização. Foram analisados os protocolos de coloração e seu desempenho em termos de tempo de processamento da amostra e qualidade da coloração. A relação entre o desenvolvimento das hifas de micorrizas arbustivas e a presença de suas estruturas nas raízes foi analisada separadamente para cada espécie e continuou com a identificação das raízes mais permissivas para colonização. Os padrões específicos de colonização de cada sistema radicular foram analisados com base em mapas de colonização e no valor dos parâmetros de MA.

O milho é uma planta anual, o que implica o crescimento contínuo das raízes, e essa foi a principal razão para aplicar o MycoPatt nos estágios de crescimento. A fescue vermelha é uma planta perene de uma pastagem tratada por um longo tempo com diferentes fertilizantes. Suas raízes têm um desenvolvimento mais curto de 1 ano, e a antese é considerada como o ponto de vegetação quando a planta muda seu metabolismo de vegetativo para generativo. Para a captura dessas plantas durante esses períodos de intensa atividade, foram escolhidos os pontos de tempo acima mencionados. A amostragem durante o período de vegetação é difícil para esta espécie quando cultivada em pastagens naturais.

Protocol

1. Seleção de material biológico, amostragem radicular e armazenamento

1. Coletar toda a raiz das plantas com uma pá (Figura 1A) separadamente para cada variante e replicar. Retire suavemente, à mão, os grandes agregados de solo das raízes. Lavar todo o sistema radicular e medi-lo em uma escala com células de 1 cm x 1 cm (Figura 1B). Corte as raízes separadamente para cada planta e coloque-as em um saco plástico.
2. Colete todas as raízes limpas de cada planta em um saco plástico e colete todas as amostras de uma variante em um saco maior. Escreva em cada saco o nome do estágio/variante e a data de amostragem. Conservar as raízes num frigorífico ou congelador a uma temperatura entre -4 °C e -20 °C até ao processamento.

2. Processamento de raiz, limpeza e coloração para microscopia

NOTA: Use luvas, uma máscara e um exaustor microbiológico/químico para esta etapa do protocolo.

1. Certifique-se de que o processo de descongelamento da raiz seja feito lentamente à temperatura ambiente. Para todas as etapas do processamento, use frascos pequenos (30-50 mL) para reduzir a quantidade de agentes necessários.
2. Execute as quatro etapas a seguir do procedimento lento de limpeza e coloração¹⁵. Faça todos os passos à temperatura ambiente. Este método permite o processamento de um grande número de amostras ao mesmo tempo sem o uso de um banho de água para ferver.
   1. Limpeza de raízes: Coloque todas as raízes de uma planta em um frasco. Prepare uma solução de NaOH a 10% com água da torneira e despeje-a em cada frasco até cobrir completamente as raízes. Agite vigorosamente os frascos durante 1 min ou 2 min para produzir uma dispersão homogénea da solução de limpeza nas raízes. Repita este procedimento após 24 h e deixe as raízes na solução de limpeza por pelo menos 48 h.
      NOTA: As raízes limpas têm um aspecto amarelo pálido (até branco) e a consistência é macia (elas podem ser facilmente esmagadas pressionando com um tweezer).
   2. Enxágue radicular: Passe o conteúdo de um frasco de cada vez através de uma peneira. Recicle a solução de limpeza. Lave as raízes várias vezes em água da torneira até que a solução de limpeza seja completamente removida.
      NOTA: Se a solução de limpeza não for completamente removida, isso afetará a qualidade do procedimento de coloração.
   3. Coloração da raiz: Coloque as raízes enxaguadas em um frasco limpo. Prepare uma solução de tinta-vinagre a 5%:5% com água da torneira (5 ml de tinta azul + 5 ml de ácido acético a 9% + 90 ml de água da torneira). Despeje a solução em cada frasco até cobrir completamente as raízes. Agitar vigorosamente os frascos durante 1 min ou 2 min para produzir uma dispersão homogénea da solução de coloração nas raízes. Repita este procedimento após 24 h e deixe as raízes nesta solução por 48 h.
      NOTA: As raízes manchadas têm uma cor azul intensa.
   4. Coloração parcial da raiz: Lave as raízes coradas em água da torneira por 1-2 min. Agite os frascos vigorosamente para remover a solução de coloração extra. Repita o procedimento se a coloração for muito intensa e não permitir uma avaliação microscópica clara.
      NOTA: As raízes coradas podem ser mantidas em água da torneira por até 1 semana à temperatura ambiente sem alterar a qualidade da coloração (Figura 2). Por períodos mais longos, as raízes podem ser mantidas por até 2-3 meses em uma solução comercial de vinagre de maçã a 5% (ácido acético a 5%).

3. Processamento de raiz para microscopia

1. Segmentação radicular: Colocar as raízes coradas de cada amostra em uma tábua de corte em escala (Figura 3A). Corte as raízes em segmentos de 1 cm (Figura 3B). Escolha 15 segmentos para cada variante.
2. Método de esmagamento suave para preparação do segmento: Espalhe as raízes em uma lâmina. Use uma bolsa de laminação para cobrir as raízes e esmagá-las suavemente a partir de uma borda (Figura 3C,D). Use uma ferramenta de plástico macio, por exemplo, pinça, alça de bisturi, caneta ou um lápis com borracha, para exibir lentamente as raízes na lâmina. Retirar cuidadosamente a bolsa de laminação e cobrir a amostra com uma folha de cobertura (Figura 3E).
   NOTA: As raízes têm uma forma tubular, por isso é necessário separá-las em um plano bidimensional. Esta ação pressupõe a separação das raízes no ponto médio, levando à exibição das duas partes do diâmetro interno. O uso de bolsas de laminação no procedimento de esmagamento suave permite a exibição das raízes, que têm uma forma de cilindro, em duas peças - uma à esquerda e outra à direita - em direção ao seu ponto médio. Dessa forma, toda a raiz é analisada em profundidade, sendo o grau de colonização o parâmetro que mostra a colonização volumétrica (descrita no trabalho original sobre o MycoPatt¹¹). Basicamente, cortamos um cilindro ao meio e, depois disso, o reconstruímos matematicamente.
3. Adicione água a um canto da lâmina com uma pipeta e deixe a água se espalhar lentamente na lâmina (Figura 3F). Retire a água extra com uma toalha de papel.

4. Análise microscópica das amostras de raiz

1. Use um microscópio equipado com uma câmera de boa resolução.
2. Analise os slides a partir de uma extremidade. Capture cada campo microscópico. Renomeie cada imagem capturada com um código que permitirá a pós-montagem real de peças raiz. Para raízes grossas, use a ampliação de 10x ou 40x e, para raízes finas, use a ampliação de 40x. Use o mesmo objetivo e ampliação para todo o conjunto de raízes de uma espécie.

5. Montagem de imagens pós-microscopia

1. Use o software de apresentação para projetar uma prancheta de desenho para montagem de imagens. Defina a largura 2-3 cm mais larga do que a largura da imagem. Adicione todas as imagens capturadas de um segmento na ordem de captura e reconstrua todo o comprimento do segmento raiz (Figura 4A).
   1. Em resumo, coletar um total de 15 figuras para cada segmento de 1 cm e organizá-las verticalmente, começando com 1 a 15, no software de apresentação para reconstruir o segmento.
2. Alinhe as imagens no centro. Use o alinhamento vertical para garantir que cada imagem esteja seguindo a anterior. Em todas as imagens, coloque uma grade de 10 células x 150 células para cobrir todo o segmento raiz.
   1. Além disso, em cada imagem individual, coloque uma grade de 10 x 10 e, em cada célula dessa grade, insira um número de um a seis se uma estrutura AM estiver visível ou deixe em branco se nenhuma estrutura AM estiver presente. Desta forma, a precisão do processo é máxima, sem que se observem erros na localização das estruturas de MA.
3. Adicione uma tabela para uma grade de 10 células de largura e 150 células de comprimento (15 quadrados de 10 células x 10 células). Altere as dimensões da largura da tabela para a largura das imagens. Altere o comprimento da tabela para incluir todas as imagens (Figura 4B).

6. Pontuação da colonização micorrízica

1. Use o número único para pontuar cada tipo de estrutura, conforme descrito no método de padrões micorrízicos¹¹: 1 para hifas; 2 para arbúsculos; 3 para vesículas; 4 para esporos; 5 para células auxiliares; e 6 para pontos de entrada (Figura 4C). Escore cada estrutura micorrízica observada de cada célula das grades previamente aplicadas (Figura 4D).

7. Análise de dados brutos e extração de resultados

1. Insira todos os escores obtidos na planilha MycoPatt¹¹. Use a função copiar/colar para transferir todas as pontuações da apresentação para a primeira planilha denominada como rawdata (Figura 5).
2. Análise primária dos resultados: Use a terceira folha denominada parâmetros na ferramenta de planilha MycoPatt para visualizar os resultados como porcentagens (%) separadamente em três formas (Figura 6A-C). Use as colunas A a K para analisar a imagem horizontal da colonização; colunas M a W para analisar a imagem vertical da colonização; e colunas Y a AI para analisar a colonização transversal (média) para cada um dos 15 10 x 10 quadrados (linhas 2-17) e a colonização média final (linhas 19-20).
   NOTA: A colonização média transversal é utilizada para o cálculo dos parâmetros reais de colonização, relacionados à análise horizontal e vertical. Desta forma, nenhum erro pode ser cometido em comparação com se apenas a análise horizontal ou vertical for usada (descrita em detalhes no trabalho original¹¹). Além disso, esse conjunto de parâmetros é calculado para toda a superfície do campo microscópico.
   1. Utilizar as definições e fórmulas, específicas para cada parâmetro, para analisar os resultados¹¹. Use os seguintes parâmetros de colonização: frequência de colonização (%), intensidade da colonização (%), arbúsculos (%) e vesículas (%), esporos (%) e células auxiliares (%), pontos de entrada (%), porcentagem de áreas não micorrízicas (%), grau geral de colonização (%) e relato de áreas micorrízicas/não micorrízicas.
      NOTA: Se arbúsculos, vesículas, esporos, células auxiliares e pontos de entrada estiverem ausentes das amostras analisadas, a planilha do MycoPatt os pontuará como zero (0).
3. Produção e extração de mapas micorrízicos: Visualize a imagem obtida a partir da conversão do código de estruturas micorrízicas em cores na segunda folha dos gráficos nomeados pelo MycoPatt (Figura 7A). Exporte a imagem resultante na folha de gráficos como uma imagem (Figura 7B). Use o código de cores na legenda para a análise de padrões micorrízicos.
4. Análise de mapas micorrízicos: Identificar as estruturas mais importantes e sua assembleia em mapas micorrízicos. Descrever o padrão de colonização micorrízica observado nas raízes analisadas. Descrever a estratégia de colonização micorrízica com base no desenvolvimento estrutural observado na raiz, no padrão de ramificação e no desenvolvimento de arbúsculo/vesícula.

Representative Results

O uso correto do método de esmagamento suave das raízes após os procedimentos de coloração fornece bons detalhes das estruturas micorrízicas, tanto para Zea mays (Figura 8A-C) quanto para Festuca rubra (Figura 9A-E), bom contraste entre estruturas micorrízicas e células radiculares e confirmação da estela devido à cor azul. Se os procedimentos de limpeza e coloração não forem bem-sucedidos, as amostras de raízes são difíceis de esmagar e não mostram claramente estruturas micorrízicas (Figura 10A-E). Neste caso, repita todo o procedimento de limpeza-coloração.

O uso do método do padrão micorrízico e da ferramenta MycoPatt permitiu uma exploração completa do mecanismo de colonização. O método fornece uma exploração profunda e em pequena escala dos padrões e estratégias de colonização para cada espécie (Figura 11 e Figura 12) com uma expressão visual adicional dos parâmetros de colonização (Tabela 1 e Tabela 2). Os dois estudos realizados sobre Zea mays, descritos extensivamente por Pop-Moldovan et ^al.12, e Festuca rubra, detalhados por Corcoz et al. ^13,14, forneceu um grande banco de dados de observações, mapas micorrízicos e parâmetros de colonização. Ambas as bases de dados pontuaram a frequência de colonização (%), intensidade de colonização (%), arbúsculos (%) e vesículas (%), a porcentagem de áreas não micorrízicas (%), o grau geral de colonização (%) e o relato de áreas micorrízicas/não micorrízicas como parâmetros de colonização. Para Zea Mays, o banco de dados consistiu em 5.850 entradas de linha no banco de dados da planilha, compiladas em 390 mapas de colonização. O experimento de Zea mays propôs o relato de áreas micorrízicas/não micorrízicas como parâmetro para a descrição da alternância e ruptura entre áreas colonizadas nas raízes. A abordagem permite a análise aprofundada do mecanismo de colonização e seu desenvolvimento ao longo das raízes. A Festuca rubra forneceu um banco de dados de 4.500 entradas de linhas na planilha, compiladas em 300 mapas. Um novo índice foi proposto, o relatório de arbúsculos/vesículas, que foi posteriormente utilizado como indicador da estratégia de colonização. A avaliação global da estratégia de colonização propôs quatro cenários diferentes de desenvolvimento micorrízico: 1) estratégia propagativa, 2) estratégia de transferência, 3) estratégia de armazenamento e 4) estratégia de resistência às plantas. Para a extração dos mapas micorrízicos mais representativos, ambas as bases de dados foram exploradas com base em valores médios transformados de frequência e intensidade de colonização, resultando na extração de três mapas diferentes para cada variante analisada (Tabela 1 e Tabela 2). Os três mapas representam a colonização AM a partir dos segmentos raiz que têm os valores mais próximos do seguinte: a média (Av) de cada variante, que é calculada com base em todos os dados disponíveis para uma variante; o Av−, que representa um valor calculado pela diferença entre média e média/2 (Av−Av/2) e apresenta um menor potencial de colonização normal; e a Av+, que representa um valor calculado pela soma entre média e média/2 (Av+Av/2) e apresenta maior potencial de colonização normal. O uso desta fórmula de extração permite ao usuário evitar os extremos (mais altos ou mais baixos) da colonização. O método permite a extração do maior número possível de casos de colonização micorrízica.

Zea mays apresentou potencial de colonização altamente flutuante, que dependeu do estágio de desenvolvimento da planta (Tabela 1, Figura 11). Os valores de frequência de colonização variaram muito entre 3,67%-69,60%, apoiados por valores de 50% para a intensidade da colonização. A principal razão para este fenômeno é que o sistema radicular se desenvolve continuamente durante todo o período da vegetação. Os arbúsculos apresentaram valores máximos no estádio de desenvolvimento das 6 folhas (B2), com diminuição nos estádios de crescimento seguintes. As vesículas apareceram esporadicamente, com valores inferiores a 1%. A exploração de padrões micorrízicos revelou que as hifas foram desenvolvidas em diferentes áreas das raízes, com extensão limitada. Grandes descontinuidades entre as áreas colonizadas foram observadas, com um desenvolvimento irregular de hifas em torno do ponto central de colonização. A estratégia de colonização mostrou grandes variações no intervalo de resistência das plantas às estratégias proliferativa e de transferência. O estágio de 6 folhas (B2), seguido do estágio de formação de espiga (B4), apresentou uma estratégia de transferência de colonização, sustentada pelos relatos de área micorrizizada/não micorrizada sendo inferiores a 0,14. O único caso com estratégia de alta transferência visível foi registrado no estádio B2, quando grandes áreas de raízes apresentaram arbúsculos. Seu posicionamento geral mostrou uma clara separação entre a área onde os arbúsculos foram desenvolvidos e a área onde os arbúsculos estavam em um estágio emergente. O padrão médio de colonização mais homogêneo foi observado no estágio de desenvolvimento B5, com constantes áreas não colonizadas entre as colonizadas. A avaliação global desse fenômeno visual correspondeu ao período final de vegetação, com pequenos valores de arbúsculos, o que indicou a regressão dessas estruturas.

Festuca rubra é uma espécie dominante em pastagens de montanha com um sistema radicular perene. Devido a essa adaptação, a maioria dos processos de colonização ocorre no interior das raízes, e o desenvolvimento das redes hifais está correlacionado com uma baixa velocidade de desenvolvimento das raízes (Tabela 2, Figura 12). Devido à aplicação de fertilizantes, os parâmetros de colonização apresentaram altas diferenças entre as variantes. As diferenças na frequência de colonização foram de 65%, sustentadas por uma diferença de 36% nas intensidades registradas. Cada variante apresentou um padrão de colonização diferente, correlacionado com a aplicação a longo prazo de tratamentos, e acompanhado de uma variação entre 0,09-0,96 no relato de áreas micorrizizadas/não micorrizadas e 0-9,43 no relato de arbúsculos/vesículas. A variante controle (V1) apresentou uma estratégia média orientada para o armazenamento, com uma área limitada restringindo o desenvolvimento de arbúsculos para o mapa de colonização Av+. A imagem simplificada da colonização (Av−) mostrou desenvolvimento linear e lateral das hifas, que foi completamente orientado para a colonização irregular para os dois modelos superiores (Av− e Av+). A aplicação de tratamentos orgânicos (V2) induziu o desenvolvimento de hifas duais, lineares e irregulares nas raízes. A estratégia de colonização identificada para o tratamento orgânico mostrou uma orientação para uma estratégia de armazenamento, associada à lenta liberação de esterco no solo e sua persistência de uma estação para a outra. O modelo Av+ apresentou o maior potencial de colonização, com intensa presença de vesículas. O relato de áreas micorrizizadas/não micorrizadas apresentou colonização homogênea, com raras descontinuidades entre as áreas colonizadas. Ao contrário disso, a aplicação de fertilizantes minerais (V4) induziu a regressão da colonização micorrízica. As áreas colonizadas apresentaram um padrão irregular, com grandes descontinuidades não colonizadas entre si. A estratégia observada foi geralmente orientada para uma estratégia de resistência às plantas, com pequenas áreas onde uma estratégia pontual de armazenamento ou transferência era visível. A análise comparativa entre os tratamentos orgânico de baixo mineral (V3) e orgânico de alto mineral (V5) mostrou regressão contínua da colonização e mudanças na estratégia de colonização, ajustadas entre os dois tratamentos opostos (V2 e V4). Todas as áreas colonizadas se desenvolveram irregularmente em torno de um ponto central, com presença homogênea de áreas não colonizadas. A estratégia de colonização foi orientada para uma estratégia de transferência proliferativa, com a presença de vesículas em áreas limitadas. As maiores descontinuidades não colonizadas foram identificadas na variante com maior quantidade de adubo mineral (V5).

Figura 1: Procedimentos de amostragem de raízes. (A) Extração de amostras com solo para proteger a integridade das raízes. (B) Medições do sistema radicular após o primeiro procedimento de limpeza. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Raízes coradas mantidas em frasco com água da torneira até o processamento. As raízes mantêm sua cor por até 1 semana à temperatura ambiente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Processamento de raízes . (A) Mantenha todas as raízes de uma amostra em água em uma placa de Petri. (B) Corte as raízes em segmentos de 1 cm de comprimento. (C-D) Pressione suavemente a bolsa de laminação para esmagar as raízes e exiba-as lentamente em uma lâmina. (E-F) Cubra os segmentos radiculares com uma tampa e adicione uma gota de água da torneira em um canto. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Processamento de imagens. (A) Adicione todas as imagens capturadas de uma amostra em uma apresentação. Alinhe todas as imagens para reconstruir a visão microscópica de cada raiz. (B) Adicione uma tabela para preparar a grade, com uma largura de 10 células x 10 células de comprimento para cada imagem. Defina as fronteiras internas como nenhumas. A fronteira interna ainda será visível, mas sua transparência não interferirá na análise micorrízica. (C-D) Use a legenda do MycoPatt para pontuar cada estrutura visível na imagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Inserção de dados no MycoPatt. Copie todo o banco de dados com observações da apresentação ao MycoPatt. Cole-o como números. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Extração de dados brutos e análise de dados primários. (A) Avaliação da colonização para todas as 10 células horizontais de uma linha. (B) Avaliação da colonização para todas as 10 células de uma coluna (vertical) em cada uma das 10 células x 10 células quadradas do MycoPatt. (C) Avaliação transversal da colonização e cálculo dos parâmetros médios de colonização. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Extração de mapas de padrões micorrízicos . (A) Para todo o conjunto de dados, um grande mapa de 10 células x 150 células está disponível na folha de gráficos do MycoPatt. (B) Extraia o mapa de colonização como uma imagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Imagens microscópicas de estruturas de FMA em raízes processadas de Zea mays. (A) Desenvolvimento intercelular e intracelular de arbúsculos. (B) Rede hifal densa com numerosos arbúsculos desenvolvendo-se intracelularmente. (C) Série de vesículas de diferentes dimensões. Abreviaturas: H = hifas; A = arbúsculos; V = vesículas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Imagens microscópicas de estruturas de FMA em raízes processadas de Festuca rubra. (A) Múltiplas redes hifais com vesículas e arbúsculos desenvolvidas em áreas separadas. (B) Detalhe de uma rede hifal enrolada. (C) Detalhe de um ponto de entrada e duas hifas enroladas. (D) Detalhe de uma vesícula no final de uma hifa enrolada. (E) Detalhe de um arbúsculo intracelular, detalhe de uma hifa enrolada e a presença de uma vesícula no final de uma hifa. Abreviaturas: H = hifas; A = arbúsculos; V = vesículas; Ep = pontos de entrada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Imagens microscópicas pouco claras de estruturas de FMA em raízes de Festuca rubra (A-C) e Zea mays (D-E) em raízes limpas e coradas incompletas. (A) Raiz manchada pouco clara com um baixo número de hifas visíveis e a cor nativa das raízes visível. (B) Hifas de gradiente de cor azul intenso e azul intenso com distinção pouco clara entre as células radiculares e hifas. (C) Rede hifal clara e corada na parte superior da imagem e hifas coradas incompletas na parte inferior da imagem. (D) Raiz e hifas coradas intensas, o que impossibilita a identificação de estruturas de MA. (E) Detalhe de uma raiz corada intensa com artefatos presentes nas células, o que impossibilita a identificação de estruturas de MA. Abreviaturas: H = hifas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Padrões de colonização micorrízica (Av, Av− e Av+) em raízes de Zea mays tratadas. Abreviaturas: A0 = momento da aplicação do tratamento; A1 = variante de controlo (sem tratamento)/A2 = variante tratada; B1 = 2-4 folhas (como ponto de controle para o início da colonização micorrízica); B2 = 6 folhas; B3 = 8-10 folhas; B4 = formação de espiga ; B5 = maturidade fisiológica. As combinações variantes são A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; e A1B5/A2-B5. A descrição completa dos tratamentos pode ser encontrada em Pop-Moldovan et ^al.12. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Padrões de colonização micorrízica (Av, Av− e Av+) em raízes de Festuca rubra tratada a longo prazo. Abreviaturas: V1 = controle, não fertilizado; V2 = 10 t·ha⁻¹ estrume; V3 = 10 t·ha−1 estrume + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 estrume + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹. A descrição completa dos tratamentos pode ser encontrada em trabalhos anteriores^13,14. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Valores dos parâmetros de colonização micorrízica em raízes de Zea mays com base no estágio de desenvolvimento. Legenda: A0 = momento da aplicação do tratamento; A1 = variante de controlo (sem tratamento)/A2 = variante tratada; B1 = 2-4 folhas (como ponto de controle para o início da colonização micorrízica); B2 = 6 folhas; B3 = 8-10 folhas; B4 = formação de espiga ; B5 = maturidade fisiológica. As combinações variantes são A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; e A1B5/A2-B5. A descrição completa dos tratamentos pode ser encontrada em Pop-Moldovan et ^al.12. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Valores dos parâmetros de colonização micorrízica em raízes de Festuca rubra com base na adubação aplicada. Legenda: V1 = controle, não fertilizado; V2 = 10 t·ha⁻¹ estrume; V3 = 10 t·ha−1 estrume + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 estrume + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹. A descrição completa dos tratamentos pode ser encontrada em trabalhos anteriores^13,14. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Etapas detalhadas do protocolo, desde a amostragem de campo das raízes até a análise de dados brutos e extração do mapa micorrízico. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussion

Estudos sobre colonização micorrízica são vitais para o desenvolvimento de novas estratégias no campo agronômico. O potencial de múltiplas plantas cultivadas para formar uma associação simbiótica com micorrizas arbusculares tornou-as um importante componente do desenvolvimento sustentável do agroecossistema e da manutenção de sua saúde 16,17,18,19,20. Assim, há a necessidade de uma melhor compreensão do mecanismo de colonização e das estratégias fúngicas, que fornecem dados essenciais sobre como uma planta pode se conectar com as redes nutricionais do solo, seu rendimento e seu potencial de sobrevivência. Portanto, no contexto da agricultura inteligente, este é um must-have deste século, é vital realizar uma avaliação aprofundada da colonização, e os estudos precisam fornecer uma imagem realista da posição fúngica nas raízes.

O método de padrões micorrízicos radiculares fornece uma varredura tão profunda das raízes, mas vem com limitações e vantagens¹¹. As limitações apresentadas são o grande número de amostras que precisam ser pontuadas quando uma planta é analisada pela primeira vez, a necessidade de manipulação de imagens e a alocação manual de estruturas micorrízicas nas raízes, mas tudo isso pode ser superado por múltiplos benefícios a longo prazo. O grande banco de dados resultante da aplicação desse método e da integração da microscopia com a ferramenta MycoPatt proporciona estabilidade, garantia estatística dos resultados e perenidade em termos de comparação de resultados. A identificação do padrão micorrízico para as raízes de uma planta específica facilitará estudos subsequentes em termos de comparação. Além disso, melhora a identificação de novos padrões, o que pode fornecer informações sobre a evolução dos mecanismos de colonização e estratégia fúngica. O cálculo dos parâmetros médios de colonização com base no desenvolvimento horizontal e vertical permite a aquisição de valores mais realistas e complexos em comparação com os métodos de estimação visual, como interseção de grade, estimativa de segmento raiz e interseção ampliada ^9,11. De modo geral, o método do padrão micorrízico permite a avaliação do avanço fúngico e da ramificação nas raízes e a identificação de novos pontos de colonização externa e a extensão das hifas ao longo das raízes. Permite o posicionamento de arbúsculos e vesículas e aloca-lhes uma posição e dimensão realistas no padrão global.

A aplicação correta do método MycoPatt depende da conclusão bem-sucedida de cada etapa do protocolo (Tabela 3). Para maior eficiência, todo o fluxo do método é projetado para ser conduzido por uma ou várias pessoas com diferentes níveis de treinamento. Desta forma, múltiplos resultados são extraídos de cada etapa e a análise contínua é possível. Para a seleção do material biológico, a amostragem radicular e a etapa de armazenamento, é necessário que uma pessoa altamente treinada identifique corretamente a espécie, independentemente do seu estágio de crescimento. Uma vez que a espécie é identificada, a amostragem de raízes pode ser feita por qualquer pessoa, com treinamento mínimo para a remoção suave de partículas do solo. A segunda etapa, processamento radicular, limpeza e coloração para microscopia, requer pessoas treinadas; o processo tem várias etapas de verificação, e cada etapa é necessária para o sucesso do procedimento. Várias amostras podem ser processadas ao mesmo tempo nas duas primeiras etapas. O processamento radicular para microscopia (etapa 3) e a análise microscópica de amostras de raiz (etapa 4) são muito importantes devido à alta atenção necessária para cortar os segmentos em pedaços de 1 cm combinados com seu esmagamento suave para preparação de lâminas. A microscopia precisa de atenção para a calibração da luz e do software para obter imagens de alta qualidade. Ambas as etapas exigem pessoas altamente treinadas ou médias treinadas sob a supervisão de um especialista. A montagem de imagens pós-microscopia requer pessoal altamente treinado para a correta sobreposição e ordem das imagens para reconstruir o segmento. O escore da colonização micorrízica é uma etapa que requer um especialista em fungos de micorrizas arbusculares para identificar suas estruturas e desempenho de colonização, bem como alocar escores para cada estrutura em imagens quadriculadas. A última etapa, a análise de dados brutos e a extração de resultados exigem um analista de dados altamente treinado que compila os bancos de dados e gerencia as estatísticas por trás da filtragem de dados e da extração dos mapas mais relevantes. Esta etapa pode ser combinada com o trabalho do especialista em micorrízico para a máxima eficiência do processo. No geral, todo o fluxo permite o envolvimento de vários especialistas dentro de um estudo interdisciplinar, o que leva a resultados de alta qualidade.

Como qualquer novo método, o método do padrão micorrízico precisa evoluir e melhorar. Existem algumas modificações que, no futuro, tornarão esse método mais fácil de usar e fornecerão vários resultados. Se for feito pela técnica de limpeza lenta e coloração, este método permite a manipulação de várias amostras de cada vez para pausar/reiniciar a análise após cada etapa do procedimento e obter vários bancos de dados digitais. Uma melhoria importante será o uso de scanners performantes para aquisição mais rápida de imagens e, após o desenvolvimento de ferramentas adequadas e eficientes para o reconhecimento da estrutura micorrízica, a automatização desse processo. No contexto da evolução da técnica, a rápida aquisição de padrões micorrízicos sustentará futuros estudos na área.

Existem várias dificuldades no uso de software automático. 1) Devido às diferentes posições das estruturas de MA - hifas e vesículas - fora das células radiculares e arbúsculos dentro das células radiculares, é difícil calibrar e treinar software para reconhecê-las na mesma imagem. 2) Para a montagem das imagens de um segmento, o software nem sempre alinhará as imagens para recriar o segmento, e é possível que ele as coloque aleatoriamente, o que alterará o processo. 3) Outro problema é que o software não pode discriminar se algumas partes de duas imagens são idênticas ou se, nos procedimentos de microscopia, alguns campos foram sobrepostos. Assim, o processo requer ser realizado manualmente por especialistas treinados.

Ao todo, 60 cm de raiz de cada variante foram analisados a partir de várias plantas. O presente manuscrito foi desenhado para apresentar o conceito de utilização do sistema e ferramenta MycoPatt, e os resultados apresentam a funcionalidade deste método. Em comparação com este método, o método de intersecção de grade tem maior subjetividade devido à colocação aleatória de raízes coradas. Acreditamos que será necessário para o futuro estabelecer para cada planta de AM o número de segmentos a serem utilizados. Esta é uma pesquisa que precisa ser feita por todos os pesquisadores no campo das micorrizas. Um dos artigos que comparou múltiplos métodos⁹ apresentou uma taxa de colonização semelhante de 50 a 200 segmentos radiculares/planta. Suas conclusões afirmaram que é necessário um método mais objetivo para analisar cada segmento. Com base em nossa pesquisa, o MycoPatt reduz a subjetividade para 0. Cada segmento é escaneado e analisado em profundidade. Além disso, um banco de dados de imagens para todos os resultados de segmentos analisados pode ser desenvolvido usando esse método. Isso também pode ser usado para reanalisar os dados, se necessário.

Todo o método fornece resultados que são necessários para vários campos de pesquisa e comerciais. Os obtentores de plantas tentam constantemente criar variedades e híbridos mais resistentes que se adaptam a condições específicas do solo. Neste contexto, os processos de melhoramento de plantas beneficiarão em termos de conectividade das plantas com as redes micorrízicas do solo desde as fases iniciais de seleção. A análise do padrão micorrízico mostrará as diferenças entre os híbridos em termos de colheita micorrízica do solo e aclimatação às condições do local. Pesquisadores da área de melhoramento genético podem usar esse método para detectar, mesmo desde os estágios iniciais dos processos de seleção, a adequação de novas variedades/híbridos para condições micorrízicas do solo. Desta forma, haverá variedades/híbridos que se adaptam facilmente a um grande número de condições e tecnologias, mas também variedades/híbridos com menor aceitação e alta especificidade para condições estreitas. Para ecossistemas de pastagens, o método do padrão micorrízico se encaixará perfeitamente para múltiplas aplicações: uma melhor compreensão da sobrevivência das plantas em diversas assembleias de vegetação relacionadas ao suporte fúngico; a análise de padrões específicos de colonização em espécies endêmicas e ameaçadas de extinção; o potencial invasor das espécies exógenas; e as flutuações de dominância-codominância devido à aplicação de vários insumos²¹. Os padrões podem ainda ser usados por produtores de inóculo que precisam calcular as doses potenciais com base em propágulos ativos e pontos de entrada. Além disso, biofertilizantes altamente específicos podem ser desenvolvidos que conterão inóculo adequado para plantas que compartilham os mesmos genitores. Na pesquisa, os padrões micorrízicos representam um estudo altamente comparativo, tanto do ponto de vista visual quanto numérico. Existem múltiplas bases de dados^22,23,24 que apresentam espécies micorrízicas e as estruturas que elas podem desenvolver nas raízes de plantas testadoras, mas nenhuma delas, até o momento^, apresenta a imagem de colonização completa. Todos esses requisitos e a necessidade de estudos mais realistas e aplicativos apoiam a integração do método de padrões micorrízicos em estudos de interação solo-micróbio-planta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb