Summary
ここでのプロトコルでは、アーバスキュラー菌根のコロニー形成パターンの評価方法と、 Zea mays と Festuca rubraの2つの種の根の戦略について説明しています。MycoPatt法を使用すると、パラメータの計算、菌根構造のデジタルデータへの変換、および根におけるそれらの実際の位置のマッピングが可能になります。
Abstract
アーバスキュラー菌根菌は植物の根に共生しています。それらの役割は、宿主の発達を維持し、生態系の栄養平衡を維持することです。植民地化プロセスは、土壌生態学、真菌と宿主の遺伝的多様性、農学的慣行などのいくつかの要因に依存しています。それらの同期作用は、複雑な菌糸網の発達をもたらし、そして根細胞における小胞およびアーバスキュールの二次発達をもたらす。本研究の目的は,菌根パターン(MycoPatt)法によるフェ ストゥカ・ルブラ と ゼア・メイスの根における真菌構造の位置決め効率を解析することであった。もう一つの目的は、各種菌根マップによって明らかにされた真菌コロニー形成戦略を探求することでした。複数の顕微鏡画像の取得と組み立てにより、トウモロコシとレッドフェスクの両方の植物における菌根コロニー形成評価が可能になり、開発された構造の現実的な位置に関する情報が提供されます。観察された菌根パターンは、適用された処理と成長段階によって引き起こされる土壌共生菌とのつながりを発達させるという点で、各植物のさまざまな効率を強調しています。MycoPatt法で得られた菌根詳細マップは、土壌からの共生獲得における植物の効率の早期発見に有用である。
Introduction
アーバスキュラー菌根(AM)菌は、研究者にとって常に関心のある分野である土壌媒介性内生植物のカテゴリーです。ほとんどの植物の根に存在し、栄養循環に関与しているため、草本植物が存在するすべての生態系の安定性に不可欠な要素になっています1,2。AMは、その根外菌糸体を介して、特に手の届きにくい地域で、植物の根の真菌延長として機能します3。主な活動は宿主植物の根であり、AMは大きな菌糸ネットワークとアーバスキュールと呼ばれる特定の細胞内構造を発達させます。宿主特異性の欠如は、共生生物が同時に複数の種にコロニーを形成することを可能にする。この能力は、生態系における資源配分と栄養素調節の役割をAMに提供します。真菌はまた、植物の生存をサポートし、植物のパフォーマンスを助けます4,5,6,7。宿主の根に対するAM種の反応は、根内菌糸体の伸長と位置、および細胞内に発達したアーバスキュールの存在と形状に見られます。細胞内のアーバスキュールは、2つの共生生物間の交換点として機能し、高速移動プロセスを特徴とする領域を表します。AMが生成する構造は種に依存し、アーバスキュールに加えて、根には小胞、胞子、および補助細胞も発達します。
植物の根におけるAM共生生物の評価には多くの課題があります8,9。第一のものは、宿主の全植生期間を通してそれらの絶え間ない発達であり、それは菌糸アーバスキュラー構造における複数の変化をもたらす。崩壊までのアーバスキュラー成長のさまざまな段階は根にはっきりと存在しますが、老化したAM構造は時々消化されるため、部分的にしか見えません10。2番目の課題は、染色方法とプロトコル、根系の多様性、細胞の寸法、および厚さの違いによって表され、統一された方法を提案することは困難です。最後の課題は、AM植民地化の評価と採点によって表されます。さまざまな客観性でAMをスコアリングする方法は数多くありますが、それらのほとんどは依然として顕微鏡技術に限定されています。単純なものは根皮質の構造の有無に基づいていますが、より複雑なものは視覚的なスコアリングとコロニー形成クラスの使用に基づいており、コロニー形成現象の頻度と強度を統合しています。過去数十年間に複数の種の菌根の状態に関する多くのデータが作成されてきましたが、ほとんどの方法は、根皮質の各構造の実際の位置を指すことなく、コロニー形成の観察値に制限されています。AMコロニー形成に関するより正確な結果の必要性への対応として、根の菌根パターンの顕微鏡分析(MycoPatt)に基づく方法が開発され、詳細な菌根マップをデジタル形式で組み立てました11。また、この方法は、コロニー形成パラメータの客観的な計算および根における各構造の実際の位置の決定を可能にする。
AM真菌構造の位置は、次の2つの質問に答える上で重要です。1つ目は、植物の植生サイクルからの特定の瞬間におけるコロニー形成の分析に関連しています。これに関連して、アーバスキュラー/ベシクルの存在量を観察し、それらが根にどのように配置されているかを報告し、非常に明確なコロニー形成の画像とパラメーターを提供することは非常に有用です。2つ目は、真菌戦略とその方向性の検出、さらにはその将来の発展の予測に関連しています。MycoPattの1つの用途は、毎日、2〜3日ごと、毎週、またはさまざまな成長段階で分析される植物に使用できます。これに関連して、小胞/アーバスキュールの位置は、AMコロニー形成の生物学的メカニズムをよりよく理解するために重要です。これらのパラメータとオブザベーションは、数学的パラメータを補完するのに非常に役立ちます。
この記事の目的は、MycoPattシステムがネイティブAM菌のコロニー形成の可能性と戦略を調査する能力を実証することです さまざまな開発段階のZea mays(トウモロコシ)根とさまざまな長期施肥条件下でのFestuca rubra(レッドフェスク)根。この目的を達成するために、2つの実験からの2つの大規模なデータベースが分析されました。トウモロコシの実験はコジョクナ(北緯46度44分56秒、長さ23度50分0秒)で確立されました。E)、農業科学獣医学大学の実験的教訓農場で、ローム質の質感の土壌12のフェオジオムに。レッドフェスク実験は、2001年にアプセニ山脈のゲシャリ(北緯46度49分064秒、長さ22°81'418'')に設立されたより大きな実験サイトの一部です。E)、プレルボソル(テラロッサ)土壌タイプ13,14。トウモロコシは、5つの異なる成長表現期12で集められた:B1 = 2〜4葉(菌根コロニー形成の開始のための対照点として)。B2 = 6葉;B3 = 8-10葉;B4 =穂軸形成;B5 =生理学的成熟度。2〜4葉の段階(A0)から開始して、有機処理が適用され、その結果、2つの目盛り因子(A1 =対照およびA2 =処理)が得られました。赤いフェスクの根は、5つの長期受精13,14の実験から開花時に収集されました:V1 =対照、非受精;V2 = 10トン·ha-1肥料;V3 = 10 t·ha-1肥料+ N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1;V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1;V5 = 10トン·ha-1肥料+ N 100 kg·ha-1、P 2 O5 50 kg·ha-1、K2O 50 kg·ha-1。各受精変異体から各開発段階で5つの植物を採取した。染色プロトコルと、サンプル処理時間と染色品質に関するそれらの性能を分析しました。AM菌糸の発達と根におけるその構造の存在との関係は、種ごとに別々に分析され、コロニー形成に最も寛容な根の特定を続けました。各根系の特定のコロニー形成パターンは、コロニー形成マップとAMパラメータの値に基づいて分析されました。
トウモロコシは一年生植物であり、それは根の継続的な成長を意味し、それが成長段階でMycoPattを適用する主な理由でした。レッドフェスクは、さまざまな肥料で長期間処理された草原からの多年生植物です。その根の発達は1年と短く、植物が栄養から生殖に代謝を変えるときの植生点と見なされます。これらの激しい活動期間中にこれらの植物を捕まえるために、上記の時点が選択されました。植生期のサンプリングは、自然の草原で育てられた場合、この種にとって困難です。
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Protocol
1.生物学的材料の選択、根のサンプリング、および保管
- 植物の根全体をシャベルで集め(図1A)、バリアントごとに別々に複製します。根から大きな土の骨材を手でやさしく取り除きます。根系全体を洗浄し、1 cm x 1 cmの細胞を含むスケールで測定します(図1B)。植物ごとに根を別々に切り、ビニール袋に入れます。
- 各植物からすべてのきれいな根をビニール袋に集め、1つの大きな袋に1つの亜種からすべてのサンプルを収集します。各バッグにステージ/バリアント名とサンプリング日を記入してください。根は、処理されるまで-4°Cから-20°Cの間の温度で冷蔵庫または冷凍庫に保管してください。
2.顕微鏡検査のための根の処理、透明化、染色
注意: プロトコルのこのステップでは、手袋、マスク、および微生物学的/化学的フードを使用してください。
- 根の解凍プロセスが室温でゆっくりと行われることを確認してください。処理のすべてのステップで、必要な薬剤の量を減らすために小さな瓶(30-50 mL)を使用してください。
- 緩慢透明化および染色手順15の以下の4つのステップを実行する。すべての手順を室温で実行します。この方法は、沸騰のための水浴を使用せずに同時に多数のサンプルを処理することを可能にする。
- 根のクリア:1つの植物からのすべての根を瓶に入れます。水道水で10%NaOH溶液を調製し、根を完全に覆うまで各瓶に注ぎます。ジャーを1分または2分間激しく振って、根に透明溶液の均一な分散を生成します。24時間後にこの手順を繰り返し、根を少なくとも48時間透明溶液に入れたままにします。
注:きれいな根は淡黄色(最大白)の側面を持ち、粘稠度は柔らかいです(ピンセットで押すことで簡単に押しつぶすことができます)。 - 根のすすぎ:一度に1つの瓶の中身をふるいに通します。清算液をリサイクルします。透明溶液が完全に除去されるまで、根を水道水で数回すすいでください。
注意: 透明溶液が完全に除去されない場合、染色手順の品質に影響します。 - 根の染色:すすいだ根をきれいな瓶に入れます。水道水(5 mLの青インク+ 5 mLの9%酢酸+ 90 mLの水道水)で5%:5%のインク酢溶液を調製します。それが根を完全に覆うまで各瓶に溶液を注ぎます。ジャーを1分または2分間激しく振って、根に染色液の均一な分散を生成します。24時間後にこの手順を繰り返し、根をこの溶液に48時間放置します。
注:染色された根は濃い青色をしています。 - 根の部分的な脱色:汚れた根を水道水で1〜2分間すすぎます。ジャーを激しく振って、余分な染色液を取り除きます。染色が強すぎて明確な顕微鏡評価ができない場合は、この手順を繰り返します。
注:染色された根は、染色品質を変えることなく、室温で最大1週間水道水に保持できます(図2)。長期間、根は5%市販のリンゴ酢溶液(5%酢酸)で最大2〜3か月間維持できます。
- 根のクリア:1つの植物からのすべての根を瓶に入れます。水道水で10%NaOH溶液を調製し、根を完全に覆うまで各瓶に注ぎます。ジャーを1分または2分間激しく振って、根に透明溶液の均一な分散を生成します。24時間後にこの手順を繰り返し、根を少なくとも48時間透明溶液に入れたままにします。
3. 顕微鏡のための根の加工
- 根のセグメンテーション:各サンプルの染色した根をスケーリングされたまな板に置きます(図3A)。根を1 cmのセグメントに切ります(図3B)。バリエーションごとに 15 個のセグメントを選択します。
- セグメント調製のための穏やかな粉砕方法:スライドの上に根を広げます。根を覆うためにラミネートポーチを使用し、端から始めてそれらをそっと押しつぶします(図3C、D)。ピンセット、メスの柄、ペン、消しゴム付きの鉛筆などの柔らかいプラスチック製のツールを使用して、スライドに根をゆっくりと表示します。ラミネートポーチを慎重に取り外し、サンプルをカバーガラスで覆います(図3E)。
注:根は管状であるため、それらを二次元平面で分離する必要があります。このアクションは、中間点での根の分離を前提としており、内径の2つの部分が表示されます。穏やかな破砕手順でラミネートパウチを使用すると、円筒形の根を左側と右側の2つのピースで中央に向かって表示できます。このようにして、根全体が詳細に分析され、コロニー形成度は体積コロニー形成を示すパラメータである(MycoPatt11に関する元の研究に記載されている)。基本的に、円柱を半分に切り、その後、数学的に再構築します。 - ピペットでスライドの角に水を加え、水をスライドにゆっくりと広げます(図3F)。ペーパータオルで余分な水を取り除きます。
4.根のサンプルの顕微鏡分析
- 高解像度のカメラを備えた顕微鏡を使用してください。
- 四肢からスライドを分析します。各微視的なフィールドをキャプチャします。キャプチャされた各画像の名前を、ルートパーツの実際のポストアセンブラージュを許可するコードに変更します。太い根の場合は10倍または40倍の倍率を使用し、細い根の場合は40倍の倍率を使用します。種からの根のセット全体に同じ対物レンズと倍率を使用します。
5. 顕微鏡後の画像集合
- プレゼンテーションソフトウェアを使用して、画像アセンブリの製図板を設計します。幅を画像の幅より2〜3cm広く設定します。1つのセグメントからキャプチャされたすべての画像をキャプチャ順に追加し、ルートセグメントの全長を再構築します(図4A)。
- 簡単に言うと、1cmのセグメントごとに合計15枚の写真を収集し、プレゼンテーションソフトウェアで1〜15から垂直に整理して、セグメントを再構築します。
- 画像を中央に揃えます。垂直方向の配置を使用して、各画像が前の画像に従っていることを確認します。すべての画像に、ルートセグメント全体をカバーするように10セルx150セルのグリッドを配置します。
- さらに、個々の画像に 10 x 10 のグリッドを配置し、このグリッドのすべてのセルに、AM 構造が表示されている場合は 1 から 6 までの数値を挿入し、AM 構造が存在しない場合は空白のままにします。このようにして、プロセスの精度は最大であり、観察されるAM構造の位置の誤差はありません。
- 幅 10 セル、長さ 150 セルのグリッドの表を追加します (10 セルの正方形 15 x 10 セル)。テーブルの幅のサイズを画像の幅に変更します。すべての画像で構成されるようにテーブルの長さを変更します(図4B)。
6.菌根コロニー形成のスコアリング
- 菌糸の菌根パターン法11:1で説明されているように、各タイプの構造をスコアリングするために一意の番号を使用します。アーバスキュールの場合は2。小胞の場合は3。胞子の場合は4。補助セルの場合は5。エントリポイントの場合は6です(図4C)。以前に適用されたグリッドの各細胞から観察された各菌根構造をスコアリングする(図4D)。
7.生データの分析と結果の抽出
- 取得したすべてのスコアをMycoPattスプレッドシート11に挿入します。コピー/貼り付け機能を使用して、プレゼンテーションのすべてのスコアを rawdata という名前の最初のシートに転送します (図 5)。
- 結果の一次分析:MycoPattスプレッドシートツールのパラメーターという名前の3番目のシートを使用して、結果を3つの形式で個別にパーセンテージ(%)として視覚化します(図6A-C)。列AからKを使用して、植民地化の水平画像を分析します。植民地化の垂直画像を分析するための列MからW。列YからAIは、15個の10 x 10の正方形(2〜17行目)のそれぞれの横方向(平均)コロニー形成と最終的な平均コロニー形成(19〜20行目)を分析します。
注:横平均コロニー形成は、水平分析と垂直解析の両方に関連する実際のコロニー形成パラメータの計算に使用されます。このように、水平分析または垂直分析のみを使用する場合と比較してエラーを犯すことはできません(元の作業11で詳細に説明されています)。また、このパラメータセットは、微視的場の表面全体について計算されます。- 各パラメータに固有の定義と式を使用して、結果を分析します11。次のコロニー形成パラメータを使用します:コロニー形成の頻度(%)、コロニー形成の強度(%)、アーバスキュール(%)および小胞(%)、胞子(%)および補助細胞(%)、エントリポイント(%)、非菌根領域の割合(%)、全体的なコロニー形成度(%)、および菌根/非菌根領域のレポート。
注:アーバスキュール、小胞、胞子、補助細胞、およびエントリポイントが分析されたサンプルから欠落している場合、MycoPattスプレッドシートはそれらをゼロ(0)としてスコア付けします。
- 各パラメータに固有の定義と式を使用して、結果を分析します11。次のコロニー形成パラメータを使用します:コロニー形成の頻度(%)、コロニー形成の強度(%)、アーバスキュール(%)および小胞(%)、胞子(%)および補助細胞(%)、エントリポイント(%)、非菌根領域の割合(%)、全体的なコロニー形成度(%)、および菌根/非菌根領域のレポート。
- 菌根マップの作成と抽出:MycoPattという名前のグラフの2枚目のシートで、菌根構造コードを色に変換して得られた画像を視覚化 します (図7A)。グラフシート内の結果の画像を画像としてエクスポートします(図7B)。菌根パターンの分析には、凡例のカラーコードを使用します。
- 菌根マップ分析:菌根マップ上で最も重要な構造とその集合体を特定します。分析された根で観察された菌根コロニー形成パターンを説明してください。根の観察された構造発達、分岐パターン、およびアーバスキュール/小胞の発達に基づく菌根コロニー形成戦略を説明してください。
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Representative Results
染色手順後の根の穏やかな破砕方法を正しく使用すると、Zea mays(図8A-C)とFestuca rubra(図9A-E)の両方の菌根構造の良好な詳細、菌根構造と根細胞の良好なコントラスト、および青色による石碑の確認が得られます。透明化および染色手順が成功しない場合、根のサンプルは粉砕するのが難しく、菌根構造を明確に示しません(図10A-E)。この場合、クリア染色手順全体を繰り返します。
菌根パターン法とMycoPattツールを使用することで、コロニー形成メカニズムの完全な調査が可能になりました。この方法は、各種のコロニー形成パターンと戦略の深く小規模な調査を提供し(図11および図12)、コロニー形成パラメーターの追加の視覚的表現(表1および表2)を提供します。Pop-Moldovan et al.12によって広範囲に記述されているZea maysとCorcozらによって詳述されたFestuca rubraについて実施された2つの研究。13,14は、観察、菌根マップ、およびコロニー形成パラメータの大規模なデータベースを提供しました。両方のデータベースは、コロニー形成の頻度(%)、コロニー形成の強度(%)、アーバスキュル(%)および小胞(%)、非菌根領域の割合(%)、全体的なコロニー形成度(%)、およびコロニー形成パラメータとしての菌根/非菌根領域の報告をスコアリングしました。Zea maysの場合、データベースはスプレッドシートデータベース内の5,850行エントリで構成され、390の植民地化マップにまとめられました。Zea mays実験は、根のコロニー形成領域間の交代と破壊を記述するためのパラメーターとして、菌根/非菌根領域の報告を提案しました。このアプローチにより、コロニー形成メカニズムとその根に沿った発達の詳細な分析が可能になります。Festuca rubraは、スプレッドシート内の4,500行エントリのデータベースを提供し、300のマップにまとめました。1つの新しい指標であるアーバスキュール/小胞レポートが提案され、植民地化戦略の指標としてさらに使用されました。コロニー形成戦略の全体的な評価は、菌根発生の4つの異なるシナリオを提案しました:1)繁殖戦略、2)移動戦略、3)貯蔵戦略、および4)植物抵抗性戦略。最も代表的な菌根マップの抽出のために、コロニー形成の頻度および強度の変換された平均値に基づいて両方のデータベースを探索し、分析された各変異体について3つの異なるマップを抽出した(表1および表2)。3 つのマップは、バリアントで使用可能なすべてのデータに基づいて計算される各バリアントの平均 (Av) に最も近い値を持つルートセグメントからの AM コロニー化を表します。Av−は、平均と平均/ 2(Av−Av / 2)の差によって計算された値を表し、より低い通常のコロニー形成の可能性を示します。Av+は、平均と平均/ 2(Av + Av / 2)の合計によって計算された値を表し、より高い通常のコロニー形成の可能性を示します。この抽出式を使用すると、ユーザーは植民地化の極端(最高または最低)を回避できます。この方法は、菌根コロニー形成の最も可能な症例の抽出を可能にする。
Zea maysは 、植物の発達段階に依存する、非常に変動するコロニー形成の可能性を示しました(表1、 図11)。コロニー形成頻度の値は3.67%〜69.60%の間で大きく異なり、コロニー形成の強度の50%の値に支えられています。この現象の主な理由は、根系が植生期間全体を通して継続的に発達することです。イタバは6葉(B2)の発達段階で最大値を示し、次の成長段階で減少しました。小胞は散発的に現れ、値は1%未満でした。菌根パターンの探索により、菌糸は根のさまざまな領域で発達し、伸びが制限されていることが明らかになりました。コロニー形成地域間に大きな不連続性が観察され、コロニー形成の中心点付近に菌糸が不規則に発達した。コロニー形成戦略は、増殖戦略と移動戦略に対する植物抵抗性の間隔に大きなばらつきを示しました。6葉の段階(B2)、続いて穂軸形成の段階(B4)は、0.14未満の菌化/非菌化領域の報告に支えられて、コロニー形成の移行戦略を示しました。目に見える高移動戦略を持つ唯一のケースは、根の広い領域がアーバスキュールを示したB2段階で記録されました。それらの全体的な位置付けは、アーバスキュールが発達した領域とアーバスキュールが出現段階にある領域との間に明確な分離を示しました。最も均質な平均コロニー形成パターンはB5開発段階で観察され、コロニー化された領域の間に一定の非コロニー化領域がありました。この視覚現象の全体的な評価は、最終植生期間に対応し、アーバスキュールの値は小さく、これらの構造の回帰を示しました。
フェストゥカルブラは、多年生の根系を持つ山の草原で優占的な種です。この適応により、コロニー形成プロセスのほとんどは根の内部で行われ、菌糸網の発達は根の発達速度の低さと相関しています(表2、図12)。肥料の施用により、コロニー形成パラメータは変種間で高い違いを示しました。植民地化頻度の違いは65%であり、記録された強度の36%の差によって維持されました。各バリアントは、治療の長期適用と相関する異なるコロニー形成パターンを示し、菌化/非菌化領域レポートでは0.09〜0.96、アーバスキュル/小胞レポートでは0〜9.43の変動を伴いました。対照バリアント(V1)は、平均的なストレージ指向の戦略を示し、限られた領域がAv+コロニー形成マップのアーバスキュールの開発を制限しました。コロニー形成の単純化された画像(Av−)は、2つの上部モデル(Av−およびAv+)の不規則なコロニー形成に完全に向けられた菌糸の線形および横方向の発達を示した。有機処理(V2)の適用は、根の二重、線形、および不規則な菌糸の発達を誘発しました。有機処理のために特定されたコロニー形成戦略は、土壌中の肥料のゆっくりとした放出と、ある季節から次の季節へのその持続性に関連する貯蔵戦略への方向性を示しました。Av+モデルは、小胞の強い存在を伴う、最も高いコロニー形成の可能性を示した。菌化/非菌化地域レポートは、コロニー化された地域間にまれな不連続性を伴う均質なコロニー形成を示しました。これとは対照的に、ミネラル肥料(V4)の施用は菌根コロニー形成の退行を誘発した。植民地化された地域は不規則なパターンを示し、それらの間に植民地化されていない大きな不連続性がありました。観察された戦略は、一般的に植物抵抗性の戦略に向けられており、時間厳守の保管または移動戦略のいずれかが見える小さな領域がありました。低ミネラル有機(V3)処理と高鉱物有機(V5)処理の比較分析では、2つの反対の処理(V2とV4)の間に適合して、コロニー形成の継続的な回帰とコロニー形成戦略のシフトが示されました。植民地化されたすべての地域は、中心点の周りに不規則に発達し、植民地化されていない地域が均質に存在していました。植民地化戦略は、限られた地域に小胞が存在する増殖移動戦略に向けられていました。最大の非植民地化不連続性は、ミネラル肥料(V5)の量が多いバリアントで確認されました。
図1:ルートサンプリング手順 。 (A)根の完全性を保護するための土壌によるサンプルの抽出。(B)最初の清算手順後の根系の測定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:染色された根は、処理されるまで水道水を入れた瓶に保持されています。根は室温で最大1週間色を維持します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ルート処理 。 (A)1つのサンプルのすべての根をペトリ皿の水に入れます。(B)根を1cmの長さのセグメントに切ります。(C-D)ラミネートポーチをそっと押して根をつぶし、ゆっくりとスライドに表示します。(E-F)根の部分をカバーガラスで覆い、片隅に水道水を1滴加えます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:画像処理。 (A)1つのサンプルからキャプチャしたすべての画像をプレゼンテーションに追加します。各根の顕微鏡ビューを再構築するために、すべての画像を整列させます。(B)各画像の幅が10セル×10セルの長さのグリッドを準備するためのテーブルを追加します。内部境界線を [なし] に設定します。内側の境界線は引き続き表示されますが、それらの透明度は菌根分析を妨げません。(C-D)MycoPattの凡例を使用して、画像に表示されている各構造をスコアリングします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マイコパットへのデータの挿入。 プレゼンテーションから観察を含むデータベース全体をMycoPattにコピーします。数字として貼り付けます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:生データの抽出と一次データ分析。 (A)1行からの10個の水平セルすべてのコロニー形成評価。(B)MycoPatからの10セル×10セルの正方形のそれぞれにおける1列(垂直)からの10セルすべてのコロニー形成評価。(C)横断的植民地化評価と平均植民地化パラメータの計算。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:菌根パターンマップの抽出 。 (A)データセット全体について、10セルx150セルの大きなマップがMycoPatの グラフ シートで利用できます。(B)植民地化マップを画像として抽出します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8: Zea maysの加工根におけるAMF構造の顕微鏡画像 。 (A)菌糸網 アーバスキュールの細胞間および細胞内発達。(B)細胞内に多数のアーバスキュールが発達する密な菌糸ネットワーク。(C)異なる寸法の一連の小胞。略語:H =菌糸;A =アーバスキュル;V =小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9: フェストゥカルブラの加工根におけるAMF構造の顕微鏡画像 。 (A)小胞とアーバスキュールが別々の領域に発達した複数の菌糸ネットワーク。(B)コイル状の菌糸網の詳細。(C)エントリポイントと2つのコイル状の菌糸の詳細。(D)コイル状の菌糸の端にある小胞の詳細。(E)細胞内アーバスキュールの詳細、コイル状の菌糸の詳細、および菌糸の端にある小胞の存在。略語:H =菌糸;A =アーバスキュル;V =小胞;Ep = エントリ ポイント。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:不完全な透明および染色された根の フェストゥカルブラ (A-C)および ゼアメイ( D-E)の根におけるAMF構造の不明瞭な顕微鏡画像。 (A)菌糸の数が少なく、根の本来の色が見える、不明瞭な染色根。(B)根細胞と菌糸の区別が不明瞭な青色と濃い青色の勾配の菌糸。(C)画像上部の明確な染色された菌糸網と画像の下部の不完全な染色された菌糸。(D)根と菌糸が強く染色されているため、AM構造の同定が不可能です。(E)細胞内にアーチファクトが存在する強烈な染色根の詳細により、AM構造の同定が不可能になります。略語:H =菌糸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:処理された Zeaメイの根における菌根コロニー形成パターン(Av、Av−、およびAv+)。 略語:A0 =治療適用の瞬間;A1 =対照変異体(治療なし)/ A2 =治療された変異体。B1 = 2〜4枚の葉(菌根コロニー形成の開始のための対照点として)。B2 = 6葉;B3 = 8-10葉;B4 =穂軸形成;B5 =生理学的成熟度。バリアントの組み合わせはA0-B1です。A1-B2/A2-B2;A1-B3/A2-B3;A1-B4/A2-B4;およびA1B5 / A2-B5。治療の完全な説明は、Pop-Moldovan et al.12にあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図12:長期処理されたフェストゥカルブラの根における菌根定着パターン(Av、Av−、およびAv+)。 略語:V1 =対照、非受精;V2 = 10トン・ヘクタール−1肥料;V3 = 10 t·ha−1肥料+ N 50 kg・ha-1, P 2 O5 25 kg・ha−1, K2O 25 kg・ha−1;V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O5 50 kg·ha−1, K2O 50 kg·ha−1;V5 = 10 t·ha−1肥料+ N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha−1, K2O 50 kg·ha−1.治療の完全な説明は、以前の研究13,14にあります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:発生段階に基づく Zea の根の菌根コロニー形成パラメータの値。 凡例:A0 =治療適用の瞬間。A1 =対照変異体(治療なし)/ A2 =治療された変異体。B1 = 2〜4枚の葉(菌根コロニー形成の開始のための対照点として)。B2 = 6葉;B3 = 8-10葉;B4 =穂軸形成;B5 =生理学的成熟度。バリアントの組み合わせはA0-B1です。A1-B2/A2-B2;A1-B3/A2-B3;A1-B4/A2-B4;およびA1B5 / A2-B5。治療の完全な説明は、Pop-Moldovan et al.12にあります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:適用施肥に基づくフェストゥカルブラの根の菌根コロニー形成パラメータの値。凡例:V1 =コントロール、非受精。V2 = 10トン・ヘクタール−1肥料;V3 = 10 t·ha−1肥料+ N 50 kg・ha-1, P 2 O5 25 kg・ha−1, K2O 25 kg・ha−1;V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O5 50 kg·ha−1 K2O 50 kg·ha−1;V5 = 10 t·ha−1肥料+ N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha−1 K2O 50 kg·ha−1.治療の完全な説明は、以前の研究13,14にあります。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:根のフィールドサンプリングから生データ分析および菌根マップ抽出までの詳細なプロトコルステップ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
菌根のコロニー形成に関する研究は、農学分野における新しい戦略開発に不可欠です。複数の栽培植物がアーバスキュラー菌根と共生関係を形成する可能性は、それらを農業生態系の持続可能な開発とその健康の維持の重要な要素にしました16,17,18,19,20。したがって、植物が土壌からの栄養ネットワークとどのように接続できるか、その収量、およびその生存の可能性に関する重要なデータを提供するコロニー形成メカニズムと真菌戦略をよりよく理解する必要があります。したがって、スマート農業の文脈では、これは今世紀の必需品であり、植民地化の詳細な評価を実行することが重要であり、研究は根の真菌の位置の現実的なイメージを提供する必要があります。
根菌根パターン法は、根のそのような深いスキャンを提供しますが、それは制限と利点の両方を持っています11。提示された制限は、植物を初めて分析するときにスコアリングする必要がある多数のサンプル、画像操作の必要性、および根の菌根構造の手動割り当てですが、これらはすべて、複数の長期的な利点によって克服できます。この方法の適用と顕微鏡とMycoPattツールの統合から得られる大規模なデータベースは、安定性、結果の統計的保証、および結果比較の観点からの永続性を提供します。1つの特定の植物の根の菌根パターンの識別は、比較の観点からその後の研究を容易にします。また、コロニー形成メカニズムと真菌戦略の進化に関する情報を提供できる新しいパターンの識別を改善します。水平および垂直発達に基づく平均コロニー形成パラメータの計算は、グリッド交差、ルートセグメント推定、および拡大交差9,11などの視覚的推定方法と比較して、より現実的で複雑な値の取得を可能にする。全体として、菌根パターン法は、根における真菌の前進および分岐の評価、ならびに外部コロニー形成の新しい点の特定および根に沿った菌糸の伸長を可能にする。アーバスキュールと小胞の位置決めを可能にし、グローバルパターンの現実的な位置と寸法を割り当てます。
MycoPattメソッドの正しい適用は、プロトコルの各ステップが正常に完了することに依存しています(表3)。より高い効率のために、メソッドのフロー全体は、異なるトレーニングレベルの1人または複数の人によって実行されるように設計されています。これにより、各ステップから複数の結果が抽出され、連続分析が可能になります。生物学的材料の選択、根のサンプリング、および保管ステップのためには、その成長段階に関係なく、高度に訓練された人が種を正しく識別することが必要です。種が特定されると、根のサンプリングは誰でも行うことができ、穏やかな土壌粒子除去のための最小限のトレーニングが必要です。2番目のステップである顕微鏡検査のための根の処理、透明化、および染色には、訓練を受けた人が必要です。このプロセスには複数の検証ステップがあり、各ステップは手順の成功に必要です。最初の2つのステップで複数のサンプルを同時に処理できます。顕微鏡検査のための根の加工(ステップ3)と根のサンプルの顕微鏡分析(ステップ4)は、セグメントを1cmの小片に切断するために必要な高い注意と、スライド調製のための穏やかな粉砕を組み合わせるために非常に重要です。顕微鏡は、高品質の画像を取得するために、光とソフトウェアのキャリブレーションに注意する必要があります。どちらのステップでも、専門家の監督下で高度な訓練を受けた人または中程度の訓練を受けた人が必要です。顕微鏡後の画像集合では、セグメントを再構築するための画像の正しい重なりと順序について、高度な訓練を受けた担当者が必要です。菌根コロニー形成のスコアリングは、AM菌類の専門家がそれらの構造とコロニー形成性能を特定し、グリッド画像上の各構造にスコアを割り当てる必要があるステップです。最後のステップである生データの分析と結果の抽出には、データベースをコンパイルし、データフィルタリングと最も関連性の高いマップの抽出の背後にある統計を管理する高度なトレーニングを受けたデータアナリストが必要です。このステップは、プロセスの最大の効率のために菌根の専門家の仕事と組み合わせることができます。全体として、フロー全体では、学際的な研究に複数の専門家が関与することを可能にし、高品質の結果につながります。
他の新しい方法と同様に、菌根パターン法は進化し、改善する必要があります。将来的には、このメソッドを使いやすくし、複数の結果を提供するいくつかの変更があります。スロークリアリングおよび染色技術によって行われる場合、この方法では、一度に複数のサンプルを操作して、手順の各ステップの後に分析を一時停止/再開し、複数のデジタルデータベースを取得できます。重要な改善点は、より高速な画像取得のための高性能スキャナーの使用と、菌根構造認識のための適切で効率的なツールの開発後、このプロセスの自動化です。技術の進化の文脈では、菌根パターンの迅速な取得は、この分野での将来の研究を維持します。
自動ソフトウェアの使用にはいくつかの困難があります。1)AM構造(菌糸と小胞)は、根細胞の外側と根細胞内のアーバスキュールの位置が異なるため、同じ画像でそれらを認識するようにソフトウェアを校正およびトレーニングすることは困難です。2)1つのセグメントからの画像の集合の場合、ソフトウェアは常にセグメントを再作成するために画像を整列させるとは限らず、ランダムに配置され、プロセスが変更される可能性があります。3)別の問題は、ソフトウェアが2つの画像の一部が同一であるかどうか、または顕微鏡手順でいくつかのフィールドが重なっているかどうかを識別できないことです。したがって、このプロセスは訓練を受けた専門家によって手動で実行される必要があります。
全体として、各変異体からの60cmの根が複数の植物から分析された。現在の原稿は、MycoPattシステムとツールを使用するという概念を提示するように設計されており、その結果はこの方法の機能を示しています。この方法と比較して、グリッド交差法は、染色された根のランダムな配置のために主観性が高くなります。将来的には、AMプラントごとに使用するセグメント数を設定する必要があると考えています。これは菌根の分野のすべての研究者によって行われる必要がある研究です。複数の方法を比較した記事の1つ9 は、50から200の根のセグメント/植物という同様のコロニー形成率を示しました。彼らの結論は、各セグメントを分析するには、より客観的な方法が必要であると述べています。私たちの研究に基づいて、MycoPattは主観性を0に減らします。各セグメントはスキャンされ、詳細に分析されます。また、この方法を使用して、分析されたすべてのセグメント結果の画像データベースを開発することができます。これは、必要に応じてデータを再分析するためにも使用できます。
全体の方法は、複数の研究および商業分野に必要な結果を提供します。植物育種家は絶えず特定の土壌条件に適応するより抵抗力のある品種と雑種を作ろうとします。これに関連して、植物育種プロセスは、最初の選択段階からの土壌からの菌根ネットワークへの植物の接続性の点で利益を得るであろう。菌根パターン分析は、土壌からの菌根採取と現場条件への順応の観点からハイブリッド間の違いを示します。育種分野の研究者は、この方法を使用して、選択プロセスの初期段階からでも、土壌菌根条件に対する新品種/雑種の適合性を検出できます。このようにして、多数の条件や技術に容易に適応できる品種/ハイブリッドだけでなく、受け入れ性が低く、狭い条件に対する特異性の高い品種/ハイブリッドもあります。草原の生態系の場合、菌根パターン法は複数の用途に完全に適合します:真菌のサポートに関連する多様な植生群集における植物の生存のより良い理解。固有種および絶滅危惧種における特定のコロニー形成パターンの分析。外因性種の侵入の可能性;そして、様々な入力21の適用によるドミナンス・コドミナンス変動。このパターンは、活性伝播とエントリポイントに基づいて潜在的な線量を計算する必要がある接種材料生産者によってさらに使用できます。また、同じ生殖器を共有する植物に適した接種材料を含む、高度に特異的なバイオ肥料を開発することができます。研究では、菌根パターンは、視覚的および数値的観点から、非常に比較された研究を表しています。菌根種とそれらがテスター植物の根で発達できる構造を提示する複数のデータベース22、23、24がありますが、これまでのところ、それらのどれも完全なコロニー形成画像を提示していません。これらすべての要件と、より現実的で適用可能な研究の必要性は、土壌-微生物-植物相互作用研究における菌根パターン法の統合をサポートします。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この論文は、ビクトリアポップモルドバが実施した「農学的投入によって駆動されるトウモロコシ菌根パターン」と、ロクサナビディカン教授の協力の下でラリサコルコズが実施した「山岳草原優勢種における菌根の状態とコロニー形成の発展」のテーマ領域における2つの博士号研究の結果得られたデータを使用します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
References
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