Summary
يصف البروتوكول هنا طرق تقييم أنماط الاستعمار الفطري المفصلي والاستراتيجية في الجذور لنوعين: Zea mays و Festuca rubra. يسمح استخدام طريقة MycoPatt بحساب المعلمات ، وتحويل الهياكل الفطرية إلى بيانات رقمية ، ورسم خرائط لموقعها الحقيقي في الجذور.
Abstract
الفطريات الفطرية المفصلية هي متكافلات في جذور النباتات. ويتمثل دورها في الحفاظ على تنمية المضيف والحفاظ على التوازن الغذائي في النظم الإيكولوجية. تعتمد عملية الاستعمار على عدة عوامل مثل بيئة التربة ، والتنوع الجيني للفطريات والمضيف ، والممارسات الزراعية. يؤدي عملها المتزامن إلى تطوير شبكة واصلة معقدة ويؤدي إلى التطور الثانوي للحويصلات والمفصليات في الخلايا الجذرية. كان الهدف من هذا البحث هو تحليل كفاءة طريقة أنماط الميكوريزال (MycoPatt) لتحديد مواقع الهياكل الفطرية في جذور Festuca rubra و Zea mays. كان الهدف الآخر هو استكشاف استراتيجية الاستعمار الفطري كما كشفت عنها الخرائط الفطرية لكل نوع. يسمح الحصول على صور مجهرية متعددة وتجميعها بتقييم الاستعمار الفطري في كل من نباتات الذرة والبراز الأحمر لتوفير معلومات عن الوضع الواقعي للهياكل المتقدمة. تسلط أنماط الميكوريزال المرصودة الضوء على الكفاءة المتغيرة لكل نبات من حيث تطوير الروابط مع الفطريات التكافلية للتربة ، الناجمة عن العلاجات التطبيقية ومرحلة النمو. الخرائط التفصيلية Mycorrhizal التي تم الحصول عليها من خلال طريقة MycoPatt مفيدة للكشف المبكر عن كفاءة النبات في الاستحواذ التكافلي من التربة.
Introduction
فطريات الميكوريزا المفصلية (AM) هي فئة من النباتات الداخلية التي تنقلها التربة والتي تعد باستمرار مجالا لاهتمام الباحثين. وجودها في جذور معظم النباتات ومشاركتها في دورات المغذيات يجعلها مكونات حيوية في استقرار كل نظام بيئي حيث توجد النباتات العشبية 1,2. من خلال الميسيليوم خارج الجذر ، يعمل AM كامتداد فطري لجذور النباتات ، خاصة في المناطق التي يصعب الوصول إليها3. النشاط الرئيسي هو في جذور النباتات المضيفة ، حيث تقوم AM بتطوير شبكات hyphae كبيرة وهياكل محددة داخل الخلايا تسمى arbuscules. يسمح عدم وجود خصوصية للمضيف للتكافل باستعمار أنواع متعددة في نفس الوقت. توفر هذه القدرة ل AM دور تخصيص الموارد وتنظيم المغذيات في النظام الإيكولوجي ؛ يوفر الفطر أيضا الدعم في بقاء النبات ويساعد في أداء النبات4،5،6،7. يكون تفاعل أنواع AM مع الجذور المضيفة مرئيا في امتداد وموقع الميسيليوم داخل الجذر ووجود وشكل المفصليات التي تطورت داخل الخلايا. تعمل المفصليات داخل الخلايا كنقطة تبادل بين المتكافلتين وتمثل مناطق تتميز بعمليات نقل سريعة. تعتمد الهياكل التي تنتجها AM على الأنواع ، وبالإضافة إلى arbuscules ، في الجذور ، فإنها تطور أيضا حويصلات وجراثيم وخلايا مساعدة.
هناك العديد من التحديات في تقييم التكافل AM في جذور النباتات 8,9. الأول هو تطورها المستمر خلال فترة الغطاء النباتي بأكملها للمضيفين ، مما يؤدي إلى تغييرات متعددة في البنية المفصلية الواصلة. المراحل المختلفة من النمو المفصلي ، حتى انهيارها ، موجودة بوضوح في الجذور ، ولكن يتم هضم هياكل AM الشائخة في بعض الأحيان ، مما يجعلها مرئية جزئيا فقط10. ويتمثل التحدي الثاني في طريقة التلطيخ وبروتوكوله ، والتنوع الكبير في أنظمة الجذر ، وأبعاد خلاياها ، والاختلافات في السمك ، مما يجعل من الصعب اقتراح طريقة موحدة. ويتمثل التحدي الأخير في تقييم وتسجيل الاستعمار AM. هناك العديد من الطرق التي تسجل AM بدرجات مختلفة من الموضوعية ، ولا يزال معظمها مقتصرا على تقنيات الفحص المجهري. تعتمد الهياكل البسيطة على وجود / عدم وجود هياكل في قشرة الجذر ، في حين أن الهياكل الأكثر تعقيدا تستند إلى التسجيل البصري واستخدام فئات الاستعمار ، مع دمج تواتر وشدة ظاهرة الاستعمار. تم إنتاج الكثير من البيانات في العقود الأخيرة حول الحالة الفطرية لأنواع متعددة ، ولكن معظم الطرق تقتصر على القيمة الملحوظة للاستعمار دون الإشارة إلى الموقع الحقيقي لكل هيكل في قشرة الجذر. استجابة لضرورة الحصول على نتائج أكثر دقة حول استعمار AM ، تم تطوير طريقة تعتمد على التحليل المجهري لأنماط mycorrhizal (MycoPatt) في الجذور لتجميع ، في شكل رقمي ، خرائط mycorrhizal التفصيلية11. أيضا ، تسمح الطريقة بالحساب الموضوعي لمعلمات الاستعمار وتحديد الموضع الفعلي لكل هيكل في الجذر.
يمكن أن يكون موضع الهياكل الفطرية AM مهما في الإجابة على السؤالين التاليين. الأول يتعلق بتحليل الاستعمار في لحظة واحدة محددة من دورة الغطاء النباتي للنبات. في هذا السياق ، من المفيد جدا مراقبة وفرة المفصليات / الحويصلات ، والإبلاغ عن كيفية وجودها في الجذر ، وتقديم صورة ومعلمات استعمارية واضحة للغاية. والثاني يتعلق بالكشف عن الاستراتيجية الفطرية وتوجهها وحتى التنبؤ بتطورها المستقبلي. يمكن أن يكون أحد تطبيقات MycoPatt للنباتات التي يتم تحليلها يوميا ، كل 2-3 أيام ، أسبوعيا ، أو خلال مراحل النمو المختلفة. في هذا السياق ، يعد موقع الحويصلات / arbuscules مهما لفهم الآلية البيولوجية لاستعمار AM بشكل أفضل. هذه المعلمات والملاحظات مفيدة جدا لتكملة المعلمات الرياضية.
الهدف من هذه المقالة هو إظهار قدرة نظام MycoPatt على استكشاف إمكانات واستراتيجية استعمار الفطريات AM الأصلية في جذور Zea mays (الذرة) خلال مراحل التطور المختلفة وفي جذور Festuca rubra (الفسكو الأحمر) في ظل ظروف إخصاب مختلفة طويلة الأجل. لتحقيق الهدف ، تم تحليل قاعدتي بيانات كبيرتين من تجربتين. تم تأسيس تجربة الذرة في كوجوكنا (46°44′56" lat. N و 23°50′0" طويلة. E) ، في المزرعة التعليمية التجريبية بجامعة العلوم الزراعية والطب البيطري كلوج على phaeoziom مع تربة طميية الملمس12. تجربة الفسكو الأحمر هي جزء من موقع تجريبي أكبر تم إنشاؤه في عام 2001 في غيتشاري ، جبال أبوسيني (46 ° 49'064 " lat. N و 22 ° 81'418 ''' طويلة. E) ، على نوع التربة preluvosol (terra rossa)13,14. تم جمع الذرة في خمس مراحل ظاهرية مختلفة للنمو12: B1 = 2-4 أوراق (كنقطة تحكم لبدء الاستعمار الفطري) ؛ B2 = 6 أوراق; B3 = 8-10 أوراق ؛ B4 = تكوين قطعة خبز. B5 = النضج الفسيولوجي. بدءا من مرحلة 2-4 أوراق (A0) ، تم تطبيق معالجة عضوية ، مما أدى إلى عامل التخرج المزدوج (A1 = التحكم و A2 = المعالجة). تم جمع جذور الفسكو الأحمر عند الإزهار من تجربة مع خمسة تسميد طويل الأجل13,14: V1 = التحكم ، غير المخصب. V2 = 10 t·ha-1 السماد; V3 = 10 t·ha-1 السماد + N 50 كجم ·ha-1 ، P 2 O5 25 kg·ha-1 ، K2O 25 kg ·ha-1 ؛ V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 السماد + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. تم جمع خمسة نباتات في كل مرحلة تطوير من كل متغير تسميد. تم تحليل بروتوكولات التلطيخ وأدائها من حيث وقت معالجة العينات وجودة التلطيخ. تم تحليل العلاقة بين تطور AM-hyphae ووجود هياكلها في الجذور بشكل منفصل لكل نوع واستمرت مع تحديد الجذور الأكثر تساهلا للاستعمار. تم تحليل أنماط الاستعمار المحددة لكل نظام جذر بناء على خرائط الاستعمار وقيمة معلمات AM.
الذرة هي نبات سنوي ، مما يعني النمو المستمر للجذور ، وكان هذا هو السبب الرئيسي لتطبيق MycoPatt في مراحل النمو. Red fescue هو نبات معمر من أرض عشبية تعامل لفترة طويلة بأسمدة مختلفة. جذورها لها تطور أقصر من 1 سنة ، ويعتبر anthesis كنقطة الغطاء النباتي عندما يغير النبات عملية التمثيل الغذائي من الخضري إلى التوليدية. للقبض على هذه النباتات خلال فترات النشاط المكثف هذه ، تم اختيار النقاط الزمنية المذكورة أعلاه. أخذ العينات خلال فترة الغطاء النباتي أمر صعب بالنسبة لهذا النوع عندما يزرع في الأراضي العشبية الطبيعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اختيار المواد البيولوجية ، وأخذ عينات الجذر ، والتخزين
- جمع الجذر الكامل للنباتات مع مجرفة (الشكل 1A) بشكل منفصل لكل متغير وتكرارها. إزالة بلطف ، باليد ، مجاميع التربة الكبيرة من الجذور. اغسل نظام الجذر بأكمله وقم بقياسه على مقياس بخلايا 1 سم × 1 سم (الشكل 1B). قطع الجذور بشكل منفصل لكل نبات ، ووضعها في كيس بلاستيكي.
- جمع جميع الجذور النظيفة من كل نبات في كيس بلاستيكي ، وجمع جميع العينات من متغير واحد في كيس واحد أكبر. اكتب على كل حقيبة اسم المرحلة / البديل وتاريخ أخذ العينات. قم بتخزين الجذور في ثلاجة أو فريزر عند درجة حرارة تتراوح بين -4 درجة مئوية و -20 درجة مئوية حتى المعالجة.
2. معالجة الجذر ، والمقاصة ، وتلطيخ للفحص المجهري
ملاحظة: استخدم قفازات وقناعا وغطاء ميكروبيولوجيا / كيميائيا لهذه الخطوة من البروتوكول.
- تأكد من أن عملية ذوبان الجذر تتم ببطء في درجة حرارة الغرفة. لجميع خطوات المعالجة ، استخدم الجرار الصغيرة (30-50 مل) لتقليل كمية العوامل الضرورية.
- نفذ الخطوات الأربع التالية من إجراء التنظيف والتلطيخ البطيء15. قم بجميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة. تسمح هذه الطريقة بمعالجة عدد كبير من العينات في نفس الوقت دون استخدام حمام مائي للغليان.
- تطهير الجذر: ضع جميع الجذور من نبات واحد في جرة. تحضير محلول NaOH بنسبة 10٪ مع ماء الصنبور وصبه في كل جرة حتى يغطي الجذور بالكامل. هز الجرار بقوة لمدة 1 دقيقة أو 2 دقيقة لإنتاج تشتت متجانس لمحلول التطهير في الجذور. كرر هذا الإجراء بعد 24 ساعة واترك الجذور في محلول المقاصة لمدة 48 ساعة على الأقل.
ملاحظة: الجذور النظيفة لها جانب أصفر شاحب (يصل إلى الأبيض) ، والاتساق ناعم (يمكن سحقها بسهولة عن طريق الضغط باستخدام الملقط). - شطف الجذر: مرر محتوى جرة واحدة في كل مرة من خلال غربال. أعد تدوير حل المقاصة. شطف الجذور عدة مرات في ماء الصنبور حتى تتم إزالة محلول المقاصة تماما.
ملاحظة: إذا لم تتم إزالة محلول الإزالة بالكامل ، فسيؤثر ذلك على جودة إجراء التلطيخ. - تلطيخ الجذر: ضع الجذور المغسولة في وعاء نظيف. تحضير محلول خل الحبر بنسبة 5٪: 5٪ بماء الصنبور (5 مل من الحبر الأزرق + 5 مل من حمض الخليك بنسبة 9٪ + 90 مل من ماء الصنبور). صب المحلول في كل جرة حتى يغطي الجذور بالكامل. هز الجرار بقوة لمدة 1 دقيقة أو 2 دقيقة لإنتاج تشتت متجانس لمحلول التلطيخ في الجذور. كرر هذا الإجراء بعد 24 ساعة واترك الجذور في هذا المحلول لمدة 48 ساعة.
ملاحظة: الجذور الملطخة لها لون أزرق مكثف. - إزالة البقع الجزئية من الجذر: شطف الجذور الملطخة في ماء الصنبور لمدة 1-2 دقيقة. رج الجرار بقوة لإزالة محلول التلطيخ الإضافي. كرر الإجراء إذا كان التلطيخ شديدا جدا ولا يسمح بإجراء تقييم مجهري واضح.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالجذور الملطخة في ماء الصنبور لمدة تصل إلى 1 أسبوع في درجة حرارة الغرفة دون تغيير جودة التلطيخ (الشكل 2). لفترات أطول ، يمكن الحفاظ على الجذور لمدة تصل إلى 2-3 أشهر في محلول خل التفاح التجاري بنسبة 5٪ (5٪ حمض الخليك).
- تطهير الجذر: ضع جميع الجذور من نبات واحد في جرة. تحضير محلول NaOH بنسبة 10٪ مع ماء الصنبور وصبه في كل جرة حتى يغطي الجذور بالكامل. هز الجرار بقوة لمدة 1 دقيقة أو 2 دقيقة لإنتاج تشتت متجانس لمحلول التطهير في الجذور. كرر هذا الإجراء بعد 24 ساعة واترك الجذور في محلول المقاصة لمدة 48 ساعة على الأقل.
3. معالجة الجذر للفحص المجهري
- تجزئة الجذر: ضع الجذور الملطخة من كل عينة على لوح تقطيع متدرج (الشكل 3A). قطع الجذور إلى شرائح 1 سم (الشكل 3B). اختر 15 شريحة لكل متغير.
- طريقة التكسير اللطيفة لإعداد الجزء: انشر الجذور على شريحة. استخدم حقيبة ترقق لتغطية الجذور وسحقها بلطف بدءا من حافة (الشكل 3C ، D). استخدم أداة بلاستيكية ناعمة، على سبيل المثال، ملاقط أو مقبض مشرط أو قلم رصاص أو قلم رصاص مزود بممحاة، لعرض الجذور ببطء على الشريحة. قم بإزالة الحقيبة الترققية بعناية وقم بتغطية العينة بغطاء (الشكل 3E).
ملاحظة: الجذور لها شكل أنبوبي ، لذلك من الضروري فصلها في مستوى ثنائي الأبعاد. يفترض هذا الإجراء فصل الجذور على النقطة الوسطى ، مما يؤدي إلى عرض جزأين من القطر الداخلي. يسمح استخدام أكياس الترقق في إجراء التكسير اللطيف بعرض الجذور ، التي لها شكل أسطوانة ، في قطعتين - واحدة على اليسار والأخرى على اليمين - نحو نقطة الوسط. وبهذه الطريقة ، يتم تحليل الجذر بأكمله بعمق ، ودرجة الاستعمار هي المعلمة التي تظهر الاستعمار الحجمي (الموصوف في العمل الأصلي على MycoPatt11). في الأساس ، نقطع أسطوانة إلى نصفين ، وبعد ذلك ، نعيد بناءها رياضيا. - أضف الماء إلى زاوية من الشريحة باستخدام ماصة واترك الماء ينتشر ببطء على الشريحة (الشكل 3F). قم بإزالة الماء الزائد بمنشفة ورقية.
4. التحليل المجهري لعينات الجذر
- استخدم مجهرا مزودا بكاميرا جيدة الدقة.
- تحليل الشرائح بدءا من طرف. التقط كل حقل مجهري. أعد تسمية كل صورة تم التقاطها باستخدام رمز يسمح بتجميع أجزاء الجذر الحقيقية بعد التجميع. بالنسبة للجذور السميكة، استخدم التكبير 10x أو 40x، وبالنسبة للجذور الرقيقة، استخدم التكبير 40x. استخدم نفس الهدف والتكبير لمجموعة كاملة من الجذور من الأنواع.
5. تجميع الصور بعد الفحص المجهري
- استخدم برنامج العرض التقديمي لتصميم لوحة رسم لتجميع الصور. اضبط العرض 2-3 سم أوسع من عرض الصورة. أضف جميع الصور الملتقطة من مقطع واحد حسب ترتيب التقاطها وأعد بناء كامل طول مقطع الجذر (الشكل 4A).
- باختصار ، اجمع ما مجموعه 15 صورة لكل مقطع طوله 1 سم وقم بتنظيمها عموديا ، بدءا من 1 إلى 15 ، في برنامج العرض التقديمي لإعادة بناء الشريحة.
- محاذاة الصور في المنتصف. استخدم المحاذاة الرأسية للتأكد من أن كل صورة تتبع الصورة السابقة. في جميع الصور، ضع شبكة من 10 خلايا × 150 خلية لتغطية الجزء الجذر بأكمله.
- بالإضافة إلى ذلك، في كل صورة على حدة، ضع شبكة 10 × 10، وفي كل خلية من هذه الشبكة، أدخل رقما من واحد إلى ستة إذا كانت بنية AM مرئية أو اتركها فارغة إذا لم تكن بنية AM موجودة. وبهذه الطريقة ، تكون دقة العملية قصوى مع عدم وجود أخطاء في موقع هياكل AM التي تتم ملاحظتها.
- أضف جدولا لشبكة من 10 خلايا بعرض وطول 150 خلية (15 مربعا من 10 خلايا × 10 خلايا). تغيير أبعاد عرض الجدول إلى عرض الصور. قم بتغيير طول الجدول ليشمل جميع الصور (الشكل 4B).
6. تسجيل الاستعمار الفطري
- استخدم الرقم الفريد لتسجيل كل نوع من أنواع البنية كما هو موضح في طريقة أنماط mycorrhizal11: 1 ل hyphae ؛ 2 ل arbuscules. 3 للحويصلات. 4 للجراثيم. 5 للخلايا المساعدة. و 6 لنقاط الدخول (الشكل 4 جيم). سجل كل بنية فطرية ملحوظة من كل خلية من الشبكات المطبقة سابقا (الشكل 4D).
7. تحليل البيانات الخام واستخراج النتائج
- أدخل جميع الدرجات التي تم الحصول عليها في جدول بيانات MycoPatt11. استخدم وظيفة النسخ / اللصق لنقل جميع الدرجات من العرض التقديمي إلى الورقة الأولى المسماة rawdata (الشكل 5).
- التحليل الأولي للنتائج: استخدم الورقة الثالثة المسماة المعلمات في أداة جدول بيانات MycoPatt لتصور النتائج كنسب مئوية (٪) بشكل منفصل في ثلاثة أشكال (الشكل 6A-C). استخدام الأعمدة من A إلى K لتحليل الصورة الأفقية للاستعمار؛ الأعمدة من M إلى W لتحليل الصورة الرأسية للاستعمار ؛ والأعمدة Y إلى الذكاء الاصطناعي لتحليل الاستعمار المستعرض (المتوسط) لكل من المربعات 15 10 × 10 (الأسطر 2-17) ومتوسط الاستعمار النهائي (الأسطر 19-20).
ملاحظة: يستخدم متوسط الاستعمار المستعرض لحساب معلمات الاستعمار الحقيقية ، المتعلقة بكل من التحليل الأفقي والرأسي. وبهذه الطريقة ، لا يمكن ارتكاب أي أخطاء مقارنة بما إذا تم استخدام التحليل الأفقي أو الرأسي فقط (الموضح بالتفصيل في العمل الأصلي11). أيضا ، يتم حساب هذه المجموعة من المعلمات لكامل سطح الحقل المجهري.- استخدم التعاريف والصيغ، الخاصة بكل معلمة، لتحليل النتائج11. استخدم معلمات الاستعمار التالية: تواتر الاستعمار (٪) ، شدة الاستعمار (٪) ، arbuscules (٪) والحويصلات (٪) ، الجراثيم (٪) والخلايا المساعدة (٪) ، نقاط الدخول (٪) ، النسبة المئوية للمناطق غير الفطرية (٪) ، درجة الاستعمار الإجمالية (٪) ، وتقرير المناطق الفطرية / غير الفطرية.
ملاحظة: إذا كانت المفصليات والحويصلات والجراثيم والخلايا المساعدة ونقاط الدخول مفقودة من العينات التي تم تحليلها، فسيقوم جدول بيانات MycoPatt بتسجيلها على أنها صفر (0).
- استخدم التعاريف والصيغ، الخاصة بكل معلمة، لتحليل النتائج11. استخدم معلمات الاستعمار التالية: تواتر الاستعمار (٪) ، شدة الاستعمار (٪) ، arbuscules (٪) والحويصلات (٪) ، الجراثيم (٪) والخلايا المساعدة (٪) ، نقاط الدخول (٪) ، النسبة المئوية للمناطق غير الفطرية (٪) ، درجة الاستعمار الإجمالية (٪) ، وتقرير المناطق الفطرية / غير الفطرية.
- إنتاج واستخراج الخرائط الفطرية: تصور الصورة التي تم الحصول عليها من تحويل رمز الهياكل الفطرية إلى ألوان في الورقة الثانية من الرسوم البيانية المسماة MycoPatt (الشكل 7A). تصدير الصورة الناتجة في ورقة الرسوم البيانية كصورة (الشكل 7B). استخدم رمز اللون في وسيلة الإيضاح لتحليل أنماط الميكورهازال.
- تحليل خريطة الميكورهازال: تحديد أهم الهياكل وتجميعها على الخرائط الفطرية. وصف نمط الاستعمار الفطري الذي لوحظ في الجذور التي تم تحليلها. وصف استراتيجية الاستعمار الفطري على أساس التطور الهيكلي الملحوظ في الجذر ، ونمط التفرع ، وتطوير arbuscule / vesicle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر الاستخدام الصحيح لطريقة التكسير اللطيفة للجذور بعد إجراءات التلطيخ تفاصيل جيدة عن الهياكل الفطرية ، لكل من Zea mays (الشكل 8A-C) و Festuca rubra (الشكل 9A-E) ، والتباين الجيد بين الهياكل الفطرية والخلايا الجذرية ، وتأكيد اللوح بسبب اللون الأزرق. إذا فشلت إجراءات التطهير والتلطيخ في النجاح ، فمن الصعب سحق عينات الجذر ولا تظهر بوضوح هياكل الميكوريزال (الشكل 10A-E). في هذه الحالة ، كرر إجراء تلطيخ التطهير بأكمله.
سمح استخدام طريقة نمط mycorrhizal وأداة MycoPatt باستكشاف كامل لآلية الاستعمار. وتوفر هذه الطريقة استكشافا عميقا وصغيرا لأنماط واستراتيجيات الاستعمار لكل نوع (الشكل 11 والشكل 12) مع تعبير مرئي إضافي عن بارامترات الاستعمار (الجدول 1 والجدول 2). الدراستان اللتان أجريتا على Zea mays، وصفهما على نطاق واسع Pop-Moldovan et al.12، و Festuca rubra، بالتفصيل من قبل Corcoz et al. 13,14 ، قدمت قاعدة بيانات كبيرة من الملاحظات ، والخرائط الفطرية ، ومعلمات الاستعمار. سجلت كلتا قاعدتي البيانات تواتر الاستعمار (٪) ، وشدة الاستعمار (٪) ، والمفصليات (٪) والحويصلات (٪) ، والنسبة المئوية للمناطق غير الفطرية (٪) ، ودرجة الاستعمار الإجمالية (٪) ، وتقرير المناطق الفطرية / غير الفطرية كمعلمات استعمار. بالنسبة ل Zea mays ، تألفت قاعدة البيانات من 5,850 إدخال سطر في قاعدة بيانات جداول البيانات ، تم تجميعها في 390 خريطة استعمار. اقترحت تجربة Zea mays تقرير المناطق الفطرية / غير الفطرية كمعلمة لوصف التناوب والاضطراب بين المناطق المستعمرة في الجذور. ويسمح هذا النهج بإجراء تحليل متعمق لآلية الاستعمار وتطورها على طول الجذور. قدمت Festuca rubra قاعدة بيانات تضم 4500 إدخال سطر في جدول البيانات ، تم تجميعها في 300 خريطة. واقترح مؤشر جديد واحد، هو تقرير المفصليات/الحويصلات الذي استخدم كذلك كمؤشر لاستراتيجية الاستعمار. واقترح التقييم العام لاستراتيجية الاستعمار أربعة سيناريوهات مختلفة لتطور الميكورهازال: 1) استراتيجية الانتشار، 2) استراتيجية النقل، 3) استراتيجية التخزين، 4) استراتيجية مقاومة النباتات. ومن أجل استخراج الخرائط الفطرية الأكثر تمثيلا، تم استكشاف قاعدتي البيانات كلتيهما استنادا إلى القيم المتوسطة المحولة لتواتر وشدة الاستعمار، مما أدى إلى استخراج ثلاث خرائط مختلفة لكل متغير تم تحليله (الجدول 1 والجدول 2). تمثل الخرائط الثلاث استعمار AM من الأجزاء الجذرية التي تحتوي على أقرب القيم إلى ما يلي: المتوسط (Av) لكل متغير ، والذي يتم حسابه استنادا إلى جميع البيانات المتاحة للمتغير ؛ والمتوسط (Av) لكل متغير ، والذي يتم حسابه على أساس جميع البيانات المتاحة للمتغير ؛ والمتوسط (Av) لكل متغير ، والذي يتم حسابه على أساس جميع البيانات المتاحة للمتغير ؛ والمتوسط (Av) لكل متغير ، والذي يتم حسابه على أساس جميع البيانات المتاحة للمتغير ؛ والمتوسط (Av) لكل متغير ، والذي يتم حسابه على أساس جميع البيانات المتاحة للمتغير ؛ والمتوسط (Av) لكل متغير ، والذي يتم حسابه Av− ، والتي تمثل قيمة محسوبة بالفرق بين المتوسط والمتوسط / 2 (Av−Av / 2) وتظهر إمكانات استعمار طبيعية أقل ؛ و Av + ، والتي تمثل قيمة محسوبة بالمجموع بين المتوسط والمتوسط / 2 (Av + Av / 2) وتظهر إمكانات استعمار طبيعية أعلى. يسمح استخدام صيغة الاستخراج هذه للمستخدم بتجنب التطرف (أعلى أو أدنى) للاستعمار. تسمح هذه الطريقة باستخراج معظم الحالات الممكنة للاستعمار الفطري.
قدم Zea mays إمكانات استعمارية شديدة التقلب ، والتي تعتمد على مرحلة تطوير النبات (الجدول 1 ، الشكل 11). تفاوتت قيم تواتر الاستعمار بشكل كبير بين 3.67٪ -69.60٪ ، مدعومة بقيم عند 50٪ لشدة الاستعمار. السبب الرئيسي لهذه الظاهرة هو أن نظام الجذر يتطور باستمرار خلال فترة الغطاء النباتي بأكملها. قدم Arbuscules القيم القصوى في مرحلة تطوير 6 أوراق (B2) ، مع انخفاض في مراحل النمو التالية. ظهرت الحويصلات بشكل متقطع ، مع قيم أقل من 1 ٪. كشف استكشاف أنماط الميكوريزال أنه تم تطوير hyphae في مناطق مختلفة من الجذور ، مع امتداد محدود. ولوحظت انقطاعات كبيرة بين المناطق المستعمرة، مع تطور غير منتظم للضجيج حول النقطة المركزية للاستعمار. أظهرت استراتيجية الاستعمار اختلافات كبيرة في الفترة الفاصلة بين مقاومة النبات لاستراتيجيات التكاثر والنقل. أظهرت مرحلة 6 أوراق (B2) ، تليها مرحلة تكوين قطعة خبز (B4) ، استراتيجية نقل الاستعمار ، مدعومة بتقارير المنطقة الفطرية / غير الفطرية التي كانت أقل من 0.14. تم تسجيل الحالة الوحيدة ذات استراتيجية نقل عالية مرئية في مرحلة B2 عندما قدمت مساحات كبيرة من الجذور arbuscules. وأظهر موقعها العام فصلا واضحا بين المنطقة التي تم فيها تطوير المفصليات والمنطقة التي كانت فيها المفصليات في مرحلة ناشئة. لوحظ متوسط نمط الاستعمار الأكثر تجانسا في مرحلة تطوير B5 ، مع وجود مناطق غير مستعمرة ثابتة بين المناطق المستعمرة. يتوافق التقييم العام لهذه الظاهرة البصرية مع فترة الغطاء النباتي النهائية ، مع قيم صغيرة من arbuscules ، والتي تشير إلى انحدار هذه الهياكل.
Festuca rubra هو نوع مهيمن في الأراضي العشبية الجبلية مع نظام جذر دائم. بسبب هذا التكيف ، تحدث معظم عمليات الاستعمار داخل الجذور ، ويرتبط تطوير شبكات الواصلة بسرعة تطور منخفضة للجذور (الجدول 2 ، الشكل 12). بسبب تطبيق الأسمدة ، قدمت معلمات الاستعمار اختلافات عالية بين المتغيرات. كانت الاختلافات في تواتر الاستعمار 65٪ ، مدعومة بفارق 36٪ في الكثافة المسجلة. أظهر كل متغير نمطا مختلفا للاستعمار ، مرتبطا بالتطبيق طويل الأجل للعلاجات ، ومصحوبا بتباين بين 0.09-0.96 في تقرير المناطق الفطرية / غير الفطرية و 0-9.43 في تقرير المفصليات / الحويصلات. أظهر متغير التحكم (V1) استراتيجية متوسطة موجهة نحو التخزين ، مع مساحة محدودة تقيد تطوير arbuscules لخريطة الاستعمار Av +. أظهرت الصورة المبسطة للاستعمار (Av−) تطورا خطيا وجانبيا لل hyphae ، والذي كان موجها بالكامل نحو الاستعمار غير المنتظم للنموذجين العلويين (Av− و Av +). تطبيق العلاجات العضوية (V2) أدى إلى تطور الواصلة المزدوجة والخطية وغير المنتظمة في الجذور. أظهرت استراتيجية الاستعمار المحددة للمعالجة العضوية توجها نحو استراتيجية التخزين ، المرتبطة ببطء إطلاق السماد في التربة واستمراره من موسم إلى آخر. قدم نموذج Av + أعلى إمكانات الاستعمار ، مع وجود مكثف للحويصلات. وعرض تقرير المناطق الميسرة/غير الميكروية استعمارا متجانسا، مع انقطاع نادر بين المناطق المستعمرة. على عكس ذلك ، أدى تطبيق الأسمدة المعدنية (V4) إلى تراجع الاستعمار الفطري. قدمت المناطق المستعمرة نمطا غير منتظم ، مع انقطاع كبير غير مستعمر بينهما. كانت الاستراتيجية المرصودة موجهة بشكل عام نحو استراتيجية مقاومة النبات ، مع مناطق صغيرة حيث كانت استراتيجية التخزين أو النقل المحددة مرئية في الوقت المحدد. أظهر التحليل المقارن بين العلاجات العضوية منخفضة المعادن (V3) والعضوية عالية المعادن (V5) تراجعا مستمرا للاستعمار وتحولات في استراتيجية الاستعمار ، بين العلاجين المتقابلين (V2 و V4). تطورت جميع المناطق المستعمرة بشكل غير منتظم حول نقطة مركزية ، مع وجود متجانس للمناطق غير المستعمرة. كانت استراتيجية الاستعمار موجهة نحو استراتيجية نقل التكاثر ، مع وجود حويصلات في مناطق محدودة. تم تحديد أكبر حالات التوقف غير الاستعمارية في البديل مع كمية أكبر من الأسمدة المعدنية (V5).
الشكل 1: إجراءات أخذ عينات الجذر . (أ) استخراج العينات بالتربة لحماية سلامة الجذور. (ب) قياسات نظام الجذر بعد إجراء المقاصة الأول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الجذور الملطخة التي يتم الاحتفاظ بها في جرة مع ماء الصنبور حتى المعالجة. تحافظ الجذور على لونها لمدة تصل إلى 1 أسبوع في درجة حرارة الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: معالجة الجذر . (أ) احتفظ بجميع الجذور من عينة واحدة في الماء في طبق بتري. (ب) قطع الجذور إلى شرائح طولها 1 سم. (C-D) اضغط برفق على الحقيبة الترققية لسحق الجذور وعرضها ببطء على شريحة. (E-F) قم بتغطية أجزاء الجذر بغطاء وأضف قطرة واحدة من ماء الصنبور في زاوية واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: معالجة الصور. (أ) أضف جميع الصور التي تم التقاطها من عينة واحدة في عرض تقديمي. قم بمحاذاة جميع الصور من أجل إعادة بناء العرض المجهري لكل جذر. (ب) أضف جدولا لإعداد الشبكة، بعرض 10 خلايا × 10 خلايا طول لكل صورة. اضبط الحدود الداخلية على لا شيء. ستظل الحدود الداخلية مرئية ، لكن شفافيتها لن تتداخل مع تحليل الميكوريزال. (C-D) استخدم أسطورة MycoPatt لتسجيل كل بنية مرئية على الصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: إدراج البيانات في MycoPatt. انسخ قاعدة البيانات بأكملها مع ملاحظات من العرض التقديمي إلى MycoPatt. الصقه كأرقام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: استخراج البيانات الخام وتحليل البيانات الأولية. (أ) تقييم الاستعمار لجميع الخلايا الأفقية ال 10 من صف واحد. (ب) تقييم الاستعمار لجميع الخلايا العشر من عمود واحد (رأسي) في كل خلية من مربعات الخلايا العشر × 10 خلايا من MycoPatt. (ج) تقييم الاستعمار المستعرض وحساب متوسط بارامترات الاستعمار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: استخراج خرائط أنماط mycorrhizal . (A) بالنسبة لمجموعة البيانات بأكملها ، تتوفر خريطة كبيرة من 10 خلايا × 150 خلية في ورقة الرسوم البيانية ل MycoPatt. (ب) استخراج خريطة الاستعمار كصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: الصور المجهرية لهياكل صندوق النقد العربي في الجذور المعالجة ل Zea mays. (A) تطور شبكة Hyphal بين الخلايا وداخل الخلايا من arbuscules. (ب) شبكة واصلة كثيفة مع العديد من arbuscules النامية داخل الخلايا. (ج) سلسلة من الحويصلات ذات الأبعاد المختلفة. الاختصارات: H = hyphae; A = arbuscules; V = الحويصلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: صور مجهرية لهياكل صندوق النقد العربي في الجذور المعالجة ل Festuca rubra. (أ) تم تطوير شبكات واصلة متعددة مع حويصلات وأربوسكولات في مناطق منفصلة. (ب) تفاصيل شبكة واصلة ملفوفة. (ج) تفاصيل نقطة دخول واثنين من الضجيج الملفوف. (د) تفاصيل حويصلة في نهاية الضجيج الملفوف. (ه) تفاصيل المفصلية داخل الخلايا، وتفاصيل الضفيرة الملفوفة، ووجود حويصلة في نهاية الهيفا. الاختصارات: H = hyphae; A = arbuscules; V = الحويصلات. Ep = نقاط الدخول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: صور مجهرية غير واضحة لهياكل صندوق النقد العربي في جذور فستوكا روبرا (A-C) وزيا مايس (D-E) في جذور غير مكتملة وملطخة. (أ) جذر ملطخ غير واضح مع عدد قليل من الضجيج المرئي واللون الأصلي للجذور مرئي. (ب) Hyphae من اللون الأزرق والأزرق المكثف مع تمييز غير واضح بين الخلايا الجذرية و hyphae. (ج) شبكة واصلة ملطخة واضحة في الجزء العلوي من الصورة و hyphae ملطخة غير مكتملة في الجزء السفلي من الصورة. (د) الجذر الملطخ المكثف و hyphae ، مما يجعل تحديد هياكل AM مستحيلا. (ه) تفاصيل الجذر الملطخ المكثف مع القطع الأثرية الموجودة في الخلايا ، مما يجعل تحديد هياكل AM مستحيلا. الاختصارات: H = hyphae. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: أنماط الاستعمار الفطري (Av و Av− و Av +) في جذور Zea mays المعالجة. الاختصارات: A0 = لحظة تطبيق العلاج ؛ A1 = متغير التحكم (بدون علاج) / A2 = المتغير المعالج ؛ B1 = 2-4 أوراق (كنقطة تحكم لبدء الاستعمار الفطري) ؛ B2 = 6 أوراق; B3 = 8-10 أوراق ؛ B4 = تكوين قطعة خبز. B5 = النضج الفسيولوجي. مجموعات المتغيرات هي A0-B1. A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; و A1B5 / A2-B5. يمكن العثور على الوصف الكامل للعلاجات في Pop-Moldovan et al.12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: أنماط الاستعمار الفطري (Av و Av− و Av +) في جذور Festuca rubra المعالجة على المدى الطويل. الاختصارات: V1 = التحكم ، غير المخصب ؛ V2 = 10 t·ha−1 السماد; V3 = 10 t·ha−1 السماد + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha−1, K2O 25 kg·ha−1; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O5 50 kg·ha−1, K2O 50 kg·ha−1; V5 = 10 t·ha−1 السماد + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha−1, K2O 50 kg·ha−1. يمكن العثور على الوصف الكامل للعلاجات في العمل السابق13,14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: قيم معلمات الاستعمار الفطري في جذور Zea mays بناء على مرحلة التطور. وسيلة الإيضاح: A0 = لحظة تطبيق العلاج ؛ A1 = متغير التحكم (بدون علاج) / A2 = المتغير المعالج ؛ B1 = 2-4 أوراق (كنقطة تحكم لبدء الاستعمار الفطري) ؛ B2 = 6 أوراق; B3 = 8-10 أوراق ؛ B4 = تكوين قطعة خبز. B5 = النضج الفسيولوجي. مجموعات المتغيرات هي A0-B1. A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; و A1B5 / A2-B5. يمكن العثور على الوصف الكامل للعلاجات في Pop-Moldovan et al.12. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: قيم معلمات الاستعمار الفطري في جذور Festuca rubra على أساس الإخصاب التطبيقي. أسطورة: V1 = السيطرة ، غير المخصبة ؛ V2 = 10 t·ha−1 السماد; V3 = 10 t·ha−1 السماد + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha−1, K2O 25 kg·ha−1; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O5 50 kg·ha−1 K2O 50 kg·ha−1; V5 = 10 t·ha−1 السماد + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha−1 K2O 50 kg·ha−1. يمكن العثور على الوصف الكامل للعلاجات في العمل السابق13,14. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: خطوات البروتوكول التفصيلية من أخذ العينات الميدانية للجذور إلى تحليل البيانات الخام واستخراج الخريطة الفطرية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الدراسات حول الاستعمار الفطري حيوية لتطوير استراتيجية جديدة في المجال الزراعي. إن قدرة النباتات المزروعة المتعددة على تكوين ارتباط تكافلي مع الميكوريزا المفصلية جعلتها مكونا مهما في التنمية المستدامة للنظام الإيكولوجي الزراعي والحفاظ على صحته16،17،18،19،20. وبالتالي ، هناك حاجة إلى فهم أفضل لآلية الاستعمار والاستراتيجيات الفطرية ، والتي توفر بيانات أساسية حول كيفية اتصال النبات بالشبكات الغذائية من التربة ، وغلتها ، وإمكاناتها للبقاء على قيد الحياة. لذلك ، في سياق الزراعة الذكية ، هذا أمر لا بد منه في هذا القرن ، ومن الضروري إجراء تقييم متعمق للاستعمار ، وتحتاج الدراسات إلى تقديم صورة واقعية للموقع الفطري في الجذور.
توفر طريقة أنماط الجذر الفطري مثل هذا الفحص العميق للجذور ، ولكنها تأتي مع كل من القيود والمزايا11. القيود المقدمة هي العدد الكبير من العينات التي يجب تسجيلها عند تحليل النبات لأول مرة ، وضرورة التلاعب بالصور ، والتخصيص اليدوي للهياكل الفطرية في الجذور ، ولكن كل هذه يمكن التغلب عليها من خلال فوائد متعددة طويلة الأجل. توفر قاعدة البيانات الكبيرة الناتجة عن تطبيق هذه الطريقة ودمج الفحص المجهري مع أداة MycoPatt الاستقرار والضمان الإحصائي للنتائج والدائمة من حيث مقارنة النتائج. إن تحديد النمط الفطري لجذور نبات معين واحد سيسهل الدراسات اللاحقة من حيث المقارنة. كما أنه يحسن تحديد أنماط جديدة ، والتي يمكن أن توفر معلومات حول تطور آليات الاستعمار والاستراتيجية الفطرية. يسمح حساب متوسط معلمات الاستعمار على أساس التطور الأفقي والرأسي باكتساب قيم أكثر واقعية وتعقيدا مقارنة بطرق التقدير البصري ، مثل تقاطع الشبكة ، وتقدير جزء الجذر ، والتقاطع المكبر 9,11. بشكل عام ، تسمح طريقة النمط الفطري بتقييم التقدم الفطري والتفرع في الجذور وتحديد نقاط جديدة للاستعمار الخارجي وتمديد hyphae على طول الجذور. فهو يسمح بوضع المفصليات والحويصلات ويخصص لها موقعا وبعدا واقعيين في النمط العالمي.
يعتمد التطبيق الصحيح لطريقة MycoPatt على الإكمال الناجح لكل خطوة من خطوات البروتوكول (الجدول 3). من أجل كفاءة أعلى ، تم تصميم التدفق الكامل للطريقة ليتم إجراؤه من قبل شخص واحد أو عدة أشخاص بمستويات تدريب مختلفة. وبهذه الطريقة ، يتم استخراج نتائج متعددة من كل خطوة والتحليل المستمر ممكن. لاختيار المواد البيولوجية ، وأخذ عينات الجذر ، وخطوة التخزين ، من الضروري أن يحدد الشخص المدرب تدريبا عاليا الأنواع بشكل صحيح ، بغض النظر عن مرحلة نموها. بمجرد تحديد الأنواع ، يمكن لأي شخص إجراء أخذ عينات الجذر ، مع الحد الأدنى من التدريب لإزالة جسيمات التربة بلطف. الخطوة الثانية ، معالجة الجذر ، وإزالة ، وتلطيخ المجهر ، تتطلب أشخاصا مدربين ؛ تحتوي العملية على خطوات تحقق متعددة ، وكل خطوة ضرورية لنجاح الإجراء. يمكن معالجة عينات متعددة في نفس الوقت في الخطوتين الأوليين. تعد معالجة الجذر للفحص المجهري (الخطوة 3) والتحليل المجهري لعينات الجذر (الخطوة 4) مهمة جدا بسبب الاهتمام العالي المطلوب لقطع الأجزاء إلى قطع 1 سم جنبا إلى جنب مع سحقها اللطيف لإعداد الشرائح. يحتاج الفحص المجهري إلى الاهتمام لمعايرة الضوء والبرامج للحصول على صور عالية الجودة. تتطلب كلتا الخطوتين أشخاصا مدربين تدريبا عاليا أو مدربين تدريبا متوسطا تحت إشراف خبير. يتطلب تجميع الصور بعد الفحص المجهري موظفين مدربين تدريبا عاليا للتداخل الصحيح وترتيب الصور لإعادة بناء الجزء. يعد تسجيل الاستعمار الفطري خطوة تتطلب متخصصا في فطريات AM لتحديد هياكلها وأداء الاستعمار ، بالإضافة إلى تخصيص درجات لكل هيكل على صور شبكية. تتطلب الخطوة الأخيرة ، تحليل البيانات الخام ، واستخراج النتائج محللا للبيانات مدربا تدريبا عاليا يقوم بتجميع قواعد البيانات وإدارة الإحصاءات وراء تصفية البيانات واستخراج الخرائط الأكثر صلة. يمكن الجمع بين هذه الخطوة وعمل أخصائي mycorrhizal لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة في العملية. بشكل عام ، يسمح التدفق بأكمله بمشاركة العديد من المتخصصين في دراسة متعددة التخصصات ، مما يؤدي إلى نتائج عالية الجودة.
مثل أي طريقة جديدة ، تحتاج طريقة نمط mycorrhizal إلى التطور والتحسين. هناك بعض التعديلات التي ، في المستقبل ، ستجعل هذه الطريقة أسهل في الاستخدام وتوفر نتائج متعددة. إذا تم ذلك بواسطة تقنية التطهير والتلطيخ البطيئة ، فإن هذه الطريقة تسمح بمعالجة عينات متعددة في وقت واحد لإيقاف / إعادة تشغيل التحليل مؤقتا بعد كل خطوة من خطوات الإجراء والحصول على قواعد بيانات رقمية متعددة. سيكون التحسن المهم هو استخدام الماسحات الضوئية ذات الأداء للحصول على الصور بشكل أسرع ، وبعد تطوير أدوات مناسبة وفعالة للتعرف على بنية mycorrhizal ، أتمتة هذه العملية. في سياق تطور التقنية ، فإن الاكتساب السريع لأنماط الميكوريزال سيحافظ على الدراسات المستقبلية في هذا المجال.
هناك العديد من الصعوبات في استخدام البرامج التلقائية. 1) نظرا للمواقع المختلفة لهياكل AM - hyphae والحويصلات - خارج الخلايا الجذرية و arbuscules داخل الخلايا الجذرية ، من الصعب معايرة وتدريب البرامج للتعرف عليها في نفس الصورة. 2) لتجميع الصور من مقطع واحد ، لن يقوم البرنامج دائما بمحاذاة الصور لإعادة إنشاء المقطع ، ومن الممكن أن يضعها بشكل عشوائي ، مما سيغير العملية. 3) مشكلة أخرى هي أن البرمجيات لا يمكن أن تميز إذا كانت بعض أجزاء صورتين متطابقة أو إذا كانت بعض الحقول متداخلة في إجراءات الفحص المجهري. وبالتالي ، تتطلب العملية أن يتم تنفيذها يدويا من قبل خبراء مدربين.
بشكل عام ، تم تحليل 60 سم من الجذر من كل متغير من نباتات متعددة. تم تصميم المخطوطة الحالية لتقديم مفهوم استخدام نظام وأداة MycoPatt ، وتقدم النتائج وظيفة هذه الطريقة. بالمقارنة مع هذه الطريقة ، فإن طريقة تقاطع الشبكة لها ذاتية أعلى بسبب الوضع العشوائي للجذور الملطخة. نعتقد أنه سيكون من الضروري في المستقبل تحديد عدد الأجزاء التي سيتم استخدامها لكل مصنع AM. هذا هو البحث الذي يجب القيام به من قبل جميع الباحثين في مجال الميكوريزا. قدمت إحدى المقالات التي قارنت بين طرق متعددة9 معدل استعمار مماثل من 50 إلى 200 شريحة جذر / نبات. وذكرت استنتاجاتهم أن هناك حاجة إلى طريقة أكثر موضوعية لتحليل كل جزء. استنادا إلى بحثنا ، يقلل MycoPatt من الذاتية إلى 0. يتم مسح كل جزء وتحليله بعمق. أيضا ، يمكن تطوير قاعدة بيانات صور لجميع نتائج الشرائح التي تم تحليلها باستخدام هذه الطريقة. يمكن استخدام هذا أيضا لإعادة تحليل البيانات إذا لزم الأمر.
توفر الطريقة بأكملها نتائج ضرورية للعديد من المجالات البحثية والتجارية. يحاول مربو النباتات باستمرار إنشاء أصناف وهجينة أكثر مقاومة تتكيف مع ظروف التربة المحددة. وفي هذا السياق، ستستفيد عمليات تربية النباتات من حيث اتصال النبات بشبكات الميكوريزال من التربة من مراحل الانتقاء الأولية. سيظهر تحليل النمط الفطري الاختلافات بين الهجينة من حيث حصاد الميكوريزال من التربة والتأقلم مع ظروف الموقع. يمكن للباحثين في مجال التربية استخدام هذه الطريقة للكشف ، حتى من المراحل المبكرة من عمليات الاختيار ، عن مدى ملاءمة الأصناف / الهجينة الجديدة لظروف التربة الفطرية. وبهذه الطريقة ، سيكون هناك أصناف / هجينة تتكيف بسهولة مع عدد كبير من الظروف والتقنيات ولكن أيضا أصناف / هجينة ذات قبول أقل وخصوصية عالية للظروف الضيقة. وبالنسبة للنظم الإيكولوجية للأراضي العشبية، فإن طريقة النمط الفطري سوف تتناسب تماما مع تطبيقات متعددة: فهم أفضل لبقاء النباتات في التجمعات النباتية المتنوعة المتعلقة بالدعم الفطري؛ وفهم أفضل لبقاء النباتات في التجمعات النباتية المتنوعة المتعلقة بالدعم الفطري؛ وفهم أفضل لبقاء النباتات في التجمعات النباتية المتنوعة المتعلقة بالدعم الفطري؛ وفهم أفضل لبقاء النباتات في التجمعات النباتية المتنوعة المتعلقة بالدعم الفطري؛ وفهم أفضل لبقاء النباتات في التجمعات النباتية المتنوعة المتعلقة بالدعم الفطري؛ وفهم أفضل لبقاء النباتات في التجمعات النباتية المتنوعة المتعلقة بالدعم الفطري؛ وفهم تحليل أنماط الاستعمار المحددة في الأنواع المستوطنة والمهددة بالانقراض؛ الإمكانات الغازية للأنواع الخارجية ؛ وتقلبات الهيمنة والهيمنة المشتركة بسبب تطبيق مختلف المدخلات21. يمكن استخدام الأنماط بشكل أكبر من قبل منتجي التلقيح الذين يحتاجون إلى حساب الجرعات المحتملة بناء على البروباغولات النشطة ونقاط الدخول. أيضا ، يمكن تطوير الأسمدة الحيوية المحددة للغاية التي ستحتوي على لقاح مناسب للنباتات التي تشترك في نفس الأعضاء التناسلية. في البحث ، تمثل أنماط mycorrhizal دراسة مقارنة للغاية ، سواء من وجهة نظر بصرية أو رقمية. هناك العديد من قواعد البيانات22،23،24 التي تقدم الأنواع الفطرية والهياكل التي يمكن أن تتطور في جذور النباتات المختبرة ، ولكن أيا منها ، حتى الآن ، لا يقدم صورة الاستعمار الكاملة. كل هذه المتطلبات والحاجة إلى دراسات أكثر واقعية وتطبيقية تدعم دمج طريقة أنماط الميكوريزال في دراسات التفاعل بين التربة والميكروبات والنباتات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تستخدم هذه الورقة البيانات الناتجة عن دراستين للدكتوراه في المجال المواضيعي "أنماط الذرة الفطرية المدفوعة بالمدخلات الزراعية" ، التي أجرتها فيكتوريا بوب مولدوفا ، و "حالة الميكوريزال وتطور الاستعمار في الأنواع المهيمنة في الأراضي العشبية الجبلية" ، التي أجرتها لاريسا كوركوز ، بتنسيق من الأستاذة الدكتورة روكسانا فيديكان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
References
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).
- Jeffries, P., Barea, J. M. 4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems. The Mycota. IX Fungal Associations. Hock, B. , SpringerVerlag. Berlin, Germany. 51-75 (2012).
- Parniske, M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature Reviews Microbiology. 6 (10), 763-775 (2008).
- Gianinazzi, S., et al. Agroecology: The key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Lee, E. -H., Eo, J. -K., Ka, K. -H., Eom, A. -H. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and their roles in ecosystems. Mycobiology. 41 (3), 121-125 (2013).
- Zhang, Y., Zeng, M., Xiong, B., Yang, X. Ecological significance of arbuscular mycorrhiza biotechnology in modern agricultural system. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao = The Journal of Applied Ecology. 14 (4), 613-617 (2003).
- Shah, A. A., et al. Effect of endophytic Bacillus megaterium colonization on structure strengthening, microbial community, chemical composition and stabilization properties of Hybrid Pennisetum. Journal of the Science of Food and Agriculture. 100 (3), 1164-1173 (2020).
- Souza, T. Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , Springer. New York City, NY. (2015).
- Sun, X. -G., Tang, M. Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. Botany. 90 (11), 1073-1083 (2012).
- Smith, S., Read, D. Colonization of Roots and Anatomy of Arbuscular Mycorrhiza. Mycorrhizal Symbiosis. Smith, S. E., Read, D. J. , Academic Press. London, UK. 42-90 (2008).
- Stoian, V., et al. Sensitive approach and future perspectives in microscopic patterns of mycorrhizal roots. Scientific Reports. 9 (1), 10233 (2019).
- Pop-Moldovan, V., et al. Divergence in corn mycorrhizal colonization patterns due to organic treatment. Plants. 10 (12), 2760 (2021).
- Corcoz, L., et al. Mycorrhizal patterns in the roots of dominant Festuca rubra in a high-natural-value grassland. Plants. 11 (1), 112 (2021).
- Corcoz, L., et al. Deciphering the colonization strategies in roots of long-term fertilized Festuca rubra. Agronomy. 12 (3), 650 (2022).
- Stoian, V., Florian, V. Mycorrhiza - Benefits, influence, diagnostic method. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).
- Prates Júnior, P., et al. Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity. PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture. Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).
- Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S. Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem. Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. Gehlot, P., Singh, J. , Springer. New York City, NY. 205-220 (2018).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
- Vaida, I., Păcurar, F., Rotar, I., Tomoș, L., Stoian, V. Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland. Plants. 10 (4), 739 (2021).
- Taxonomy of Arbuscular Fungi. , Available from: http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html (2022).
- The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , Available from: https://invam.wvu.edu/collection (2022).
- The International Bank for the Glomeromycota. , Available from: https://www.i-beg.eu/ (2022).
