Mapas de micorrizas como herramienta para explorar patrones de colonización y estrategias fúngicas en las raíces de Festuca rubra y Zea mays

Summary

El protocolo aquí describe los métodos para la evaluación de los patrones de colonización de micorrizas arbusculares y la estrategia en raíces para dos especies: Zea mays y Festuca rubra. El uso del método MycoPatt permite el cálculo de parámetros, la conversión de estructuras micorrízicas en datos digitales y el mapeo de su posición real en raíces.

Abstract

Los hongos micorrízicos arbusculares son simbiontes en las raíces de las plantas. Su función es sostener el desarrollo del huésped y mantener el equilibrio nutricional en los ecosistemas. El proceso de colonización depende de varios factores como la ecología del suelo, la diversidad genética de los hongos y el huésped, y las prácticas agronómicas. Su acción sincronizada conduce al desarrollo de una compleja red hifal y conduce al desarrollo secundario de vesículas y arbúsculos en las células de la raíz. El objetivo de esta investigación fue analizar la eficiencia del método de patrones micorrícicos (MycoPatt) para el posicionamiento de estructuras fúngicas en las raíces de Festuca rubra y Zea mays. Otro objetivo fue explorar la estrategia de colonización fúngica revelada por los mapas micorrícicos de cada especie. La adquisición y ensamblaje de múltiples imágenes microscópicas permite la evaluación de la colonización micorrízica tanto en plantas de maíz como de festuca roja para proporcionar información sobre la posición realista de las estructuras desarrolladas. Los patrones micorrízicos observados resaltan la eficiencia variable de cada planta en términos de desarrollar conexiones con hongos simbióticos del suelo, causados por los tratamientos aplicados y la etapa de crecimiento. Los mapas detallados de micorrizas obtenidos a través del método MycoPatt son útiles para la detección temprana de la eficiencia de la planta en la adquisición simbiótica del suelo.

Introduction

Los hongos micorrizas arbusculares (AM) son una categoría de endófitos transmitidos por el suelo que son constantemente un área de interés para los investigadores. Su presencia en las raíces de la mayoría de las plantas y su participación en los ciclos de nutrientes los convierte en componentes vitales en la estabilidad de todos los ecosistemas donde las plantas herbáceas están presentes ^1,2. A través de su micelio extrarradicular, AM actúa como una extensión fúngica para las raíces de las plantas, especialmente en áreas de difícil acceso³. La actividad principal es en las raíces de la planta huésped, donde la AM desarrolla grandes redes de hifas y estructuras intracelulares específicas llamadas arbúsculos. La falta de especificidad del huésped permite que el simbionte colonice múltiples especies al mismo tiempo. Esta capacidad proporciona a la AM el papel de la asignación de recursos y la regulación de nutrientes en el ecosistema; El hongo también proporciona apoyo en la supervivencia de la planta y ayuda en el rendimiento de la planta 4,5,6,7. La reacción de las especies AM a las raíces huésped es visible en la extensión y localización del micelio intrarradicular y la presencia y forma de los arbúsculos desarrollados intracelularmente. Los arbúsculos intracelulares actúan como un punto de intercambio entre los dos simbiontes y representan áreas caracterizadas por procesos de transferencia rápida. Las estructuras que produce la AM dependen de la especie y, además de los arbúsculos, en las raíces, también desarrollan vesículas, esporas y células auxiliares.

Existen muchos desafíos en la evaluación de simbiontes AM en raíces de plantas ^8,9. El primero es su desarrollo constante durante todo el período vegetativo de los huéspedes, lo que conduce a múltiples cambios en la estructura arbuscular hifal. Las diferentes etapas del crecimiento arbuscular, hasta su colapso, están claramente presentes en las raíces, pero las estructuras AM senescentes a veces se digieren, lo que las hace solo parcialmente visibles¹⁰. El segundo desafío está representado por el método y el protocolo de tinción, la gran diversidad de sistemas radiculares, la dimensión de sus células y las diferencias de grosor, que dificultan la propuesta de un método unificado. El último desafío está representado por la evaluación y puntuación de la colonización AM. Existen numerosos métodos que puntúan AM con diferentes grados de objetividad, y la mayoría de ellos todavía están restringidos a las técnicas de microscopía. Los simples se basan en la presencia/ausencia de estructuras en la corteza radicular, mientras que los más complejos se basan en la puntuación visual y el uso de clases de colonización, con la integración de la frecuencia e intensidad del fenómeno de colonización. Se han producido muchos datos en las últimas décadas sobre el estado micorrízico de múltiples especies, pero la mayoría de los métodos se limitan al valor observado de la colonización sin apuntar a la posición real de cada estructura en la corteza radicular. Como respuesta a la necesidad de resultados más precisos sobre la colonización de AM, se desarrolló un método basado en el análisis microscópico de patrones de micorrizas (MycoPatt) en raíces para ensamblar, en forma digital, los mapas micorrícicos detallados¹¹. Además, el método permite el cálculo objetivo de los parámetros de colonización y la determinación de la posición real de cada estructura en la raíz.

La posición de las estructuras fúngicas AM puede ser importante para responder a las siguientes dos preguntas. El primero está relacionado con el análisis de la colonización en un momento específico del ciclo vegetativo de una planta. En este contexto, es muy útil observar la abundancia arbuscular/vesicular, informar cómo se ubican en la raíz y proporcionar una imagen y parámetros de colonización muy claros. El segundo está relacionado con la detección de la estrategia fúngica y su orientación e incluso la previsión de su desarrollo futuro. Una aplicación del MycoPatt puede ser para plantas analizadas diariamente, cada 2-3 días, semanalmente o durante varias etapas de crecimiento. En este contexto, la ubicación de las vesículas/arbúsculas es importante para comprender mejor el mecanismo biológico de la colonización AM. Estos parámetros y observaciones son muy útiles para complementar los parámetros matemáticos.

El objetivo de este artículo es demostrar la capacidad del sistema MycoPatt para explorar el potencial y la estrategia de colonización de hongos AM nativos en raíces de Zea mays (maíz) durante diferentes etapas de desarrollo y en raíces de Festuca rubra (festuca roja) bajo diferentes condiciones de fertilización a largo plazo. Para cumplir con el objetivo, se analizaron dos grandes bases de datos de dos experimentos. El experimento de maíz se estableció en Cojocna (46°44′56" lat. N y 23°50′0" de largo. E), en la Granja Didáctica Experimental de la Universidad de Ciencias Agrícolas y Veterinarias de Cluj sobre un feozión con un suelo de textura arcillosa¹². El experimento de la festuca roja es parte de un sitio experimental más grande establecido en 2001 en Ghețari, montañas Apuseni (46 ° 49'064 "lat. N y 22 ° 81'418 '' de largo. E), sobre un suelo preluvosol (terra rossa) tipo^13,14. El maíz se recolectó en cinco fenofases de crecimiento diferentes¹²: B1 = 2-4 hojas (como punto de control para el inicio de la colonización micorrízica); B2 = 6 hojas; B3 = 8-10 hojas; B4 = formación de mazorca; B5 = madurez fisiológica. A partir de la etapa de 2-4 hojas (A0), se aplicó un tratamiento orgánico, que resultó en un factor de dos graduación (A1 = control y A2 = tratado). Las raíces de festuca roja fueron recolectadas en la floración de un experimento con cinco fertilizaciones a largo plazo^13,14: V1 = control^, no fertilizada; V2 = 10 t·^ha-1 estiércol; V3 = 10 t·ha-1 estiércol + N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 estiércol + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Se recolectaron cinco plantas en cada etapa de desarrollo de cada variante de fertilización. Se analizaron los protocolos de tinción y su rendimiento en términos de tiempo de procesamiento de la muestra y calidad de la tinción. La relación entre el desarrollo de las hifas AM y la presencia de sus estructuras en las raíces se analizó por separado para cada especie y se continuó con la identificación de las raíces más permisivas para la colonización. Los patrones de colonización específicos de cada sistema radicular se analizaron en base a mapas de colonización y el valor de los parámetros AM.

El maíz es una planta anual, lo que implica un crecimiento continuo de las raíces, y esa fue la razón principal para aplicar el MycoPatt en las etapas de crecimiento. La festuca roja es una planta perenne de un pastizal tratada durante mucho tiempo con diferentes fertilizantes. Sus raíces tienen un desarrollo más corto de 1 año, y la antesis se considera como el punto de vegetación cuando la planta cambia su metabolismo de vegetativo a generativo. Para capturar estas plantas durante estos intensos períodos de actividad, se eligieron los puntos de tiempo mencionados anteriormente. El muestreo durante el período de vegetación es difícil para esta especie cuando se cultiva en pastizales naturales.

Protocol

1. Selección del material biológico, muestreo radicular y almacenamiento

1. Recoja toda la raíz de las plantas con una pala (Figura 1A) por separado para cada variante y replíquela. Retire suavemente, a mano, los grandes agregados de tierra de las raíces. Lave todo el sistema radicular y mídalo en una escala con células de 1 cm x 1 cm (Figura 1B). Corte las raíces por separado para cada planta y colóquelas en una bolsa de plástico.
2. Recoja todas las raíces limpias de cada planta en una bolsa de plástico y recoja todas las muestras de una variante en una bolsa más grande. Escriba en cada bolsa el nombre de la etapa/variante y la fecha de muestreo. Almacene las raíces en un refrigerador o congelador a una temperatura entre -4 ° C y -20 ° C hasta el procesamiento.

2. Procesamiento radicular, limpieza y tinción para microscopía

NOTA: Use guantes, una máscara y una capucha microbiológica/química para este paso del protocolo.

1. Asegúrese de que el proceso de descongelación de la raíz se realiza lentamente a temperatura ambiente. Para todos los pasos del procesamiento, use frascos pequeños (30-50 ml) para reducir la cantidad de agentes necesarios.
2. Realice los siguientes cuatro pasos del procedimiento de limpieza y tinción lenta¹⁵. Haga todos los pasos a temperatura ambiente. Este método permite el procesamiento de una gran cantidad de muestras al mismo tiempo sin el uso de un baño de agua para hervir.
   1. Limpieza de raíces: Coloque todas las raíces de una planta en un frasco. Prepare una solución de NaOH al 10% con agua del grifo y viértala en cada frasco hasta que cubra completamente las raíces. Agite los frascos vigorosamente durante 1 minuto o 2 minutos para producir una dispersión homogénea de la solución de aclaramiento en las raíces. Repita este procedimiento después de 24 h y deje las raíces en la solución de aclaramiento durante al menos 48 h.
      NOTA: Las raíces limpias tienen un aspecto amarillo pálido (hasta blanco), y la consistencia es suave (se pueden aplastar fácilmente presionando con una pinza).
   2. Enjuague de raíces: Pase el contenido de un frasco a la vez a través de un tamiz. Recicle la solución de limpieza. Enjuague las raíces varias veces con agua del grifo hasta que la solución de limpieza se elimine por completo.
      NOTA: Si la solución de limpieza no se elimina por completo, afectará la calidad del procedimiento de tinción.
   3. Tinción de la raíz: Coloque las raíces enjuagadas en un frasco limpio. Prepare una solución de vinagre de tinta al 5%:5% con agua del grifo (5 ml de tinta azul + 5 ml de ácido acético al 9% + 90 ml de agua del grifo). Vierta la solución en cada frasco hasta que cubra completamente las raíces. Agite los frascos vigorosamente durante 1 minuto o 2 minutos para producir una dispersión homogénea de la solución de tinción en las raíces. Repita este procedimiento después de 24 h y deje las raíces en esta solución durante 48 h.
      NOTA: Las raíces manchadas tienen un color azul intenso.
   4. Decoloración parcial de la raíz: Enjuague las raíces manchadas con agua del grifo durante 1-2 minutos. Agite los frascos vigorosamente para eliminar la solución de tinción adicional. Repita el procedimiento si la tinción es demasiado intensa y no permite una evaluación microscópica clara.
      NOTA: Las raíces teñidas se pueden mantener en agua del grifo hasta por 1 semana a temperatura ambiente sin alterar la calidad de la tinción (Figura 2). Durante períodos más largos, las raíces se pueden mantener hasta 2-3 meses en una solución comercial de vinagre de manzana al 5% (ácido acético al 5%).

3. Procesamiento radicular para microscopía

1. Segmentación de raíces: Coloque las raíces teñidas de cada muestra en una tabla de cortar a escala (Figura 3A). Corte las raíces en segmentos de 1 cm (Figura 3B). Elija 15 segmentos para cada variante.
2. Método de trituración suave para la preparación de segmentos: Extienda las raíces en un portaobjetos. Use una bolsa laminadora para cubrir las raíces y aplastarlas suavemente comenzando desde un borde (Figura 3C, D). Use una herramienta de plástico blando, por ejemplo, pinzas, mango de bisturí, bolígrafo o un lápiz con un borrador, para mostrar lentamente las raíces en la diapositiva. Retire con cuidado la bolsa laminadora y cubra la muestra con un cubreobjetos (Figura 3E).
   NOTA: Las raíces tienen una forma tubular, por lo que es necesario separarlas en un plano bidimensional. Esta acción supone la separación de raíces en el punto medio, lo que lleva a la visualización de las dos partes del diámetro interno. El uso de bolsas laminadas en el procedimiento de trituración suave permite la visualización de las raíces, que tienen forma de cilindro, en dos piezas, una a la izquierda y otra a la derecha, hacia su punto medio. De esta manera, toda la raíz se analiza en profundidad, y el grado de colonización es el parámetro que muestra la colonización volumétrica (descrito en el trabajo original sobre MycoPatt¹¹). Básicamente, cortamos un cilindro por la mitad, y después de eso, lo reconstruimos matemáticamente.
3. Agregue agua a una esquina del tobogán con una pipeta y deje que el agua se extienda lentamente sobre el portaobjetos (Figura 3F). Retire el exceso de agua con una toalla de papel.

4. Análisis microscópico de las muestras radiculares

1. Utilice un microscopio equipado con una cámara de buena resolución.
2. Analice las diapositivas a partir de una extremidad. Captura cada campo microscópico. Cambie el nombre de cada imagen capturada con un código que permita el post-ensamblaje real de las partes raíz. Para raíces gruesas, use el aumento de 10x o 40x, y para raíces delgadas, use el aumento de 40x. Utilice el mismo objetivo y aumento para todo el conjunto de raíces de una especie.

5. Ensamblaje de imágenes post-microscopía

1. Utilice software de presentación para diseñar un tablero de dibujo para el ensamblaje de imágenes. Establezca el ancho 2-3 cm más ancho que el ancho de la imagen. Agregue todas las imágenes capturadas de un segmento en el orden de su captura y reconstruya toda la longitud del segmento raíz (Figura 4A).
   1. En resumen, reúna un total de 15 imágenes para cada segmento de 1 cm y organícelas verticalmente, comenzando con 1 a 15, en el software de presentación para reconstruir el segmento.
2. Alinee las imágenes en el centro. Utilice la alineación vertical para asegurarse de que cada imagen sigue a la anterior. En todas las imágenes, coloque una cuadrícula de 10 celdas x 150 celdas para cubrir todo el segmento de raíz.
   1. Además, en cada imagen individual, coloque una cuadrícula de 10 x 10, y en cada celda de esta cuadrícula, inserte un número del uno al seis si una estructura AM es visible o déjela en blanco si no hay ninguna estructura AM presente. De esta manera, la precisión del proceso es máxima sin errores en la ubicación de las estructuras AM que se observan.
3. Agregue una tabla para una cuadrícula de 10 celdas de ancho y 150 celdas de largo (15 cuadrados de 10 celdas x 10 celdas). Cambie las dimensiones del ancho de la tabla al ancho de las imágenes. Cambie la longitud de la tabla para que comprenda todas las imágenes (Figura 4B).

6. Puntuación de la colonización micorrízica

1. Utilice el número único para puntuar cada tipo de estructura como se describe en el método de patrones micorrícicos¹¹: 1 para hifas; 2 para arbúsculos; 3 para vesículas; 4 para esporas; 5 para las células auxiliares; y 6 para los puntos de entrada (Figura 4C). Puntúe cada estructura micorrízica observada de cada celda de las cuadrículas aplicadas previamente (Figura 4D).

7. Análisis de datos brutos y extracción de resultados

1. Inserte todas las puntuaciones obtenidas en la hoja de cálculo¹¹ de MycoPatt. Utilice la función de copiar/pegar para transferir todas las puntuaciones de la presentación a la primera hoja denominada rawdata (Figura 5).
2. Análisis primario de resultados: Utilice la tercera hoja con nombres de parámetros en la herramienta de hoja de cálculo MycoPatt para visualizar los resultados como porcentajes (%) por separado en tres formas (Figura 6A-C). Utilice las columnas A a K para analizar la imagen horizontal de la colonización; columnas M a W para analizar la imagen vertical de la colonización; y las columnas Y a AI para analizar la colonización transversal (promedio) para cada uno de los 15 cuadrados de 10 x 10 (líneas 2-17) y la colonización promedio final (líneas 19-20).
   NOTA: La colonización media transversal se utiliza para el cálculo de los parámetros de colonización real, relacionados con el análisis horizontal y vertical. De esta manera, no se pueden cometer errores en comparación con si solo se utiliza el análisis horizontal o vertical (descrito en detalle en el trabajo original¹¹). Además, este conjunto de parámetros se calcula para toda la superficie del campo microscópico.
   1. Utilice las definiciones y fórmulas, específicas para cada parámetro, para analizar los resultados¹¹. Utilice los siguientes parámetros de colonización: frecuencia de colonización (%), intensidad de colonización (%), arbúsculos (%) y vesículas (%), esporas (%) y células auxiliares (%), puntos de entrada (%), el porcentaje de áreas no micorrízicas (%), el grado general de colonización (%) y el informe de áreas micorrizas/no micorrízicas.
      NOTA: Si faltan arbúsculos, vesículas, esporas, células auxiliares y puntos de entrada en las muestras analizadas, la hoja de cálculo MycoPatt las calificará como cero (0).
3. Producción y extracción de mapas de micorrizas: Visualizar la imagen obtenida de la conversión de código de estructuras micorrízicas en colores en la segunda hoja de los gráficos de MycoPatt (Figura 7A). Exporte la imagen resultante en la hoja de gráficos como una imagen (Figura 7B). Utilice el código de color en la leyenda para el análisis de patrones micorrízicos.
4. Análisis de mapas de micorrizas: Identificar las estructuras más importantes y su ensamblaje en mapas de micorrizas. Describir el patrón de colonización micorrízica observado en las raíces analizadas. Describir la estrategia de colonización micorrízica basada en el desarrollo estructural observado en la raíz, el patrón de ramificación y el desarrollo de arbúsculas/vesículas.

Representative Results

El uso correcto del método de trituración suave de las raíces después de los procedimientos de tinción proporciona buenos detalles de las estructuras micorrízicas, tanto para Zea mays (Figura 8A-C) como para Festuca rubra (Figura 9A-E), buen contraste entre las estructuras micorrízicas y las células radiculares, y una confirmación de la estela debido al color azul. Si los procedimientos de limpieza y tinción no tienen éxito, las muestras de raíces son difíciles de triturar y no muestran claramente las estructuras micorrízicas (Figura 10A-E). En este caso, repita todo el procedimiento de limpieza-tinción.

El uso del método de patrón micorrízico y la herramienta MycoPatt permitió una exploración completa del mecanismo de colonización. El método proporciona una exploración profunda y a pequeña escala de los patrones y estrategias de colonización para cada especie (Figura 11 y Figura 12) con una expresión visual adicional de los parámetros de colonización (Tabla 1 y Tabla 2). Los dos estudios realizados sobre Zea mays, descritos extensamente por Pop-Moldovan et ^al.12, y Festuca rubra, detallados por Corcoz et al. ^13,14, proporcionó una gran base de datos de observaciones, mapas de micorrizas y parámetros de colonización. Ambas bases de datos calificaron la frecuencia de colonización (%), la intensidad de la colonización (%), los arbúsculos (%) y las vesículas (%), el porcentaje de áreas no micorrízicas (%), el grado general de colonización (%) y el informe de áreas micorrízicas / no micorrízicas como parámetros de colonización. Para Zea mays, la base de datos consistía en 5.850 entradas de línea en la base de datos de hojas de cálculo, compiladas en 390 mapas de colonización. El experimento Zea mays propuso el informe de áreas micorrizas/no micorrízicas como parámetro para la descripción de la alternancia y alteración entre áreas colonizadas en las raíces. El enfoque permite el análisis en profundidad del mecanismo de colonización y su desarrollo a lo largo de las raíces. Festuca rubra proporcionó una base de datos de 4.500 entradas de línea en la hoja de cálculo, compilada en 300 mapas. Se propuso un nuevo índice, el informe de arbúsculos/vesículas, que se utilizó además como indicador de la estrategia de colonización. La evaluación general de la estrategia de colonización propuso cuatro escenarios diferentes de desarrollo micorrízico: 1) estrategia propagativa, 2) estrategia de transferencia, 3) estrategia de almacenamiento y 4) estrategia de resistencia de las plantas. Para la extracción de los mapas micorrízicos más representativos, ambas bases de datos se exploraron con base en valores promedio transformados de frecuencia e intensidad de colonización, resultando en la extracción de tres mapas diferentes para cada variante analizada (Tabla 1 y Tabla 2). Los tres mapas representan la colonización AM de los segmentos raíz que tienen los valores más cercanos a los siguientes: el promedio (Av) de cada variante, que se calcula en función de todos los datos disponibles para una variante; el Av−, que representa un valor calculado por la diferencia entre promedio y promedio/2 (Av−Av/2) y muestra un potencial de colonización normal más bajo; y el Av+, que representa un valor calculado por la suma entre promedio y promedio/2 (Av+Av/2) y muestra un potencial de colonización normal más alto. El uso de esta fórmula de extracción permite al usuario evitar los extremos (más altos o más bajos) de la colonización. El método permite la extracción de la mayor cantidad posible de casos de colonización micorrízica.

Zea mays presentaba un potencial de colonización altamente fluctuante, que dependía de la etapa de desarrollo de la planta (Tabla 1, Figura 11). Los valores de frecuencia de colonización variaron mucho entre 3.67% -69.60%, apoyados por valores en 50% para la intensidad de la colonización. La razón principal de este fenómeno es que el sistema radicular se desarrolla continuamente durante todo el período de vegetación. Los arbúsculos presentaron valores máximos en la etapa de desarrollo de 6 hojas (B2), con una disminución en las siguientes etapas de crecimiento. Las vesículas aparecieron esporádicamente, con valores inferiores al 1%. La exploración de los patrones de micorrizas reveló que las hifas se desarrollaron en diferentes áreas de las raíces, con extensión limitada. Se observaron grandes discontinuidades entre las áreas colonizadas, con un desarrollo irregular de hifas alrededor del punto central de colonización. La estrategia de colonización mostró grandes variaciones en el intervalo de la resistencia de la planta a las estrategias proliferativa y de transferencia. La etapa de 6 hojas (B2), seguida de la etapa de formación de mazorca (B4), exhibió una estrategia de transferencia de colonización, sostenida por los informes de área micorrizada/no micorrizada inferiores a 0,14. El único caso con una estrategia de transferencia alta visible se registró en la etapa B2 cuando grandes áreas de raíces presentaron arbúsculos. Su posicionamiento general mostró una clara separación entre el área donde se desarrollaron los arbúsculos y el área donde los arbúsculos estaban en una etapa emergente. El patrón de colonización promedio más homogéneo se observó en la etapa de desarrollo B5, con áreas no colonizadas constantes entre las colonizadas. La evaluación global de este fenómeno visual correspondió al período final de vegetación, con pequeños valores de arbúsculos, que indicaron la regresión de estas estructuras.

Festuca rubra es una especie dominante en los pastizales de montaña con un sistema radicular perenne. Debido a esta adaptación, la mayoría de los procesos de colonización tienen lugar dentro de las raíces, y el desarrollo de redes hifales se correlaciona con una baja velocidad de desarrollo de las raíces (Tabla 2, Figura 12). Debido a la aplicación de fertilizantes, los parámetros de colonización presentaron altas diferencias entre variantes. Las diferencias en la frecuencia de colonización fueron del 65%, sostenidas por una diferencia del 36% en las intensidades registradas. Cada variante mostró un patrón de colonización diferente, correlacionado con la aplicación a largo plazo de tratamientos, y acompañado de una variación entre 0,09-0,96 en el informe de áreas micorrizadas/no micorrizadas y 0-9,43 en el informe de arbúsculos/vesículas. La variante de control (V1) mostró una estrategia promedio orientada al almacenamiento, con un área limitada que restringe el desarrollo de arbúsculos para el mapa de colonización Av+. La imagen simplificada de la colonización (Av−) mostró un desarrollo lineal y lateral de las hifas, que estaba completamente orientado a la colonización irregular para los dos modelos superiores (Av− y Av+). La aplicación de tratamientos orgánicos (V2) indujo el desarrollo hifal dual, lineal e irregular en las raíces. La estrategia de colonización identificada para el tratamiento orgánico mostró una orientación hacia una estrategia de almacenamiento, asociada a la lenta liberación de estiércol en el suelo y su persistencia de una temporada a otra. El modelo Av+ presentó el mayor potencial de colonización, con una intensa presencia de vesículas. El informe de áreas micorrizadas/no micorrizadas presentó una colonización homogénea, con discontinuidades raras entre las áreas colonizadas. Contrario a esto, la aplicación de fertilizantes minerales (V4) indujo la regresión de la colonización micorrízica. Las áreas colonizadas presentaron un patrón irregular, con grandes discontinuidades no colonizadas entre ellas. La estrategia observada se orientó generalmente hacia una de resistencia de la planta, con áreas pequeñas donde se veía una estrategia puntual de almacenamiento o transferencia. El análisis comparativo entre los tratamientos orgánicos de bajo contenido mineral (V3) y orgánicos de alto contenido mineral (V5) mostró una regresión continua de la colonización y cambios en la estrategia de colonización, ajustados entre los dos tratamientos opuestos (V2 y V4). Todas las áreas colonizadas se desarrollaron irregularmente alrededor de un punto central, con una presencia homogénea de áreas no colonizadas. La estrategia de colonización se orientó hacia una de transferencia proliferativa, con presencia de vesículas en áreas limitadas. Las mayores discontinuidades no colonizadas se identificaron en la variante con mayor cantidad de fertilizante mineral (V5).

Figura 1: Procedimientos de muestreo radicular . (A) Extracción de muestras con tierra para proteger la integridad de las raíces. (B) Mediciones del sistema radicular después del primer procedimiento de limpieza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Raíces manchadas mantenidas en un frasco con agua del grifo hasta el procesamiento. Las raíces mantienen su color hasta por 1 semana a temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Procesamiento radicular . (A) Mantenga todas las raíces de una muestra en agua en una placa de Petri. (B) Cortar las raíces en segmentos de 1 cm de longitud. (C-D) Presione suavemente la bolsa laminada para aplastar las raíces y muéstrelas lentamente en un portaobjetos. (E-F) Cubra los segmentos de la raíz con un cubreobjetos y agregue una gota de agua del grifo en una esquina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Procesamiento de imágenes. (A) Agregue todas las imágenes capturadas de una muestra en una presentación. Alinear todas las imágenes para reconstruir la vista microscópica de cada raíz. (B) Agregue una tabla para preparar la cuadrícula, con un ancho de 10 celdas x 10 celdas de longitud para cada imagen. Establezca los bordes internos en ninguno. La frontera interior seguirá siendo visible, pero su transparencia no interferirá con el análisis de las micorrizas. (C-D) Utilice la leyenda de MycoPatt para puntuar cada estructura visible en la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Inserción de datos en MycoPatt. Copie toda la base de datos con las observaciones de la presentación a MycoPatt. Pégalo como números. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Extracción de datos sin procesar y análisis de datos primarios. (A) Evaluación de colonización para las 10 celdas horizontales de una fila. (B) Evaluación de colonización para las 10 celdas de una columna (vertical) en cada una de las 10 celdas x 10 celdas cuadradas de MycoPatt. C) Evaluación transversal de la colonización y cálculo de los parámetros medios de colonización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Mapas de extracción de patrones micorrízicos . (A) Para todo el conjunto de datos, un gran mapa de 10 celdas x 150 celdas está disponible en la hoja de gráficos de MycoPatt. (B) Extraer el mapa de colonización como una imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Imágenes microscópicas de estructuras de HMA en raíces procesadas de Zea mays. (A) Red hifal desarrollo intercelular e intracelular de arbúsculos. (B) Red hifal densa con numerosos arbúsculos que se desarrollan intracelularmente. (C) Serie de vesículas de diferentes dimensiones. Abreviaturas: H = hifas; A = arbúsculos; V = vesículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Imágenes microscópicas de estructuras de HMA en raíces procesadas de Festuca rubra. (A) Múltiples redes hifales con vesículas y arbúsculos desarrollados en áreas separadas. (B) Detalle de una red hifal enrollada. (C) Detalle de un punto de entrada y dos hifas enrolladas. (D) Detalle de una vesícula al final de una hifa enrollada. (E) Detalle de un arbúsculo intracelular, detalle de una hifa enrollada y la presencia de una vesícula al final de una hifa. Abreviaturas: H = hifas; A = arbúsculos; V = vesículas; Ep = puntos de entrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Imágenes microscópicas poco claras de estructuras de HMA en raíces de Festuca rubra (A-C) y Zea mays (D-E) en raíces incompletas aclaradas y teñidas. (A) Raíz manchada poco clara con un bajo número de hifas visibles y el color nativo de las raíces visibles. (B) Hifas de gradiente de color azul y azul intenso con distinción poco clara entre las células de la raíz y las hifas. (C) Red hifal teñida clara en la parte superior de la imagen e hifas teñidas incompletas en la parte inferior de la imagen. (D) Intensa teñida de raíz e hifas, lo que hace imposible la identificación de estructuras AM. (E) Detalle de una raíz teñida intensa con artefactos presentes en las células, lo que hace imposible la identificación de estructuras AM. Abreviaturas: H = hifas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Patrones de colonización micorrízica (Av, Av− y Av+) en raíces de Zea mays tratadas. Abreviaturas: A0 = momento de aplicación del tratamiento; A1 = variante control (sin tratamiento)/A2 = variante tratada; B1 = 2-4 hojas (como punto de control para el inicio de la colonización micorrízica); B2 = 6 hojas; B3 = 8-10 hojas; B4 = formación de mazorca; B5 = madurez fisiológica. Las combinaciones variantes son A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; y A1B5/A2-B5. La descripción completa de los tratamientos se puede encontrar en Pop-Moldovan et ^al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Patrones de colonización micorrízica (Av, Av- y Av+) en raíces de Festuca rubra tratada a largo plazo. Abreviaturas: V1 = control, no fertilizado; V2 = 10 t·ha⁻¹ estiércol; V3 = 10 t·ha−1 estiércol + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 estiércol + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹. La descripción completa de los tratamientos se puede encontrar en trabajos anteriores^13,14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Valores de los parámetros de colonización micorrízica en raíces de Zea mays basados en etapa de desarrollo. Leyenda: A0 = momento de aplicación del tratamiento; A1 = variante control (sin tratamiento)/A2 = variante tratada; B1 = 2-4 hojas (como punto de control para el inicio de la colonización micorrízica); B2 = 6 hojas; B3 = 8-10 hojas; B4 = formación de mazorca; B5 = madurez fisiológica. Las combinaciones variantes son A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; y A1B5/A2-B5. La descripción completa de los tratamientos se puede encontrar en Pop-Moldovan et ^al.12. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Valores de parámetros de colonización micorrízica en raíces de Festuca rubra basados en fertilización aplicada. Leyenda: V1 = control, no fertilizado; V2 = 10 t·ha⁻¹ estiércol; V3 = 10 t·ha−1 estiércol + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 estiércol + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹. La descripción completa de los tratamientos se puede encontrar en trabajos anteriores^13,14. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Pasos detallados del protocolo desde el muestreo de campo de las raíces hasta el análisis de datos sin procesar y la extracción del mapa micorrícico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

Los estudios sobre la colonización micorrízica son vitales para el desarrollo de nuevas estrategias en el campo agronómico. El potencial de múltiples plantas cultivadas para formar una asociación simbiótica con las micorrizas arbusculares las convirtió en un componente importante del desarrollo sostenible del agroecosistema y del mantenimiento de su salud 16,17,18,19,20. Por lo tanto, existe la necesidad de una mejor comprensión del mecanismo de colonización y las estrategias fúngicas, que proporcionan datos esenciales sobre cómo una planta puede conectarse con las redes nutricionales del suelo, su rendimiento y su potencial de supervivencia. Por lo tanto, en el contexto de la agricultura inteligente, esto es imprescindible de este siglo, es vital realizar una evaluación en profundidad de la colonización, y los estudios deben proporcionar una imagen realista de la posición fúngica en las raíces.

El método de patrones micorrízicos de la raíz proporciona un escaneo tan profundo de las raíces, pero viene con limitaciones y ventajas¹¹. Las limitaciones presentadas son el gran número de muestras que deben puntuarse cuando se analiza una planta por primera vez, la necesidad de manipulación de imágenes y la asignación manual de estructuras micorrízicas en las raíces, pero todo esto puede superarse con múltiples beneficios a largo plazo. La gran base de datos resultante de la aplicación de este método y la integración de la microscopía con la herramienta MycoPatt proporciona estabilidad, garantía estadística de resultados y perennialidad en términos de comparación de resultados. La identificación del patrón micorrízico para las raíces de una planta específica facilitará los estudios posteriores en términos de comparación. Además, mejora la identificación de nuevos patrones, que pueden proporcionar información sobre la evolución de los mecanismos de colonización y la estrategia fúngica. El cálculo de los parámetros de colonización promedio basados en el desarrollo horizontal y vertical permite la adquisición de valores más realistas y complejos en comparación con los métodos de estimación visual, como la intersección de cuadrícula, la estimación del segmento raíz y la intersección ampliada ^9,11. En general, el método del patrón micorrízico permite la evaluación del avance y ramificación fúngica en las raíces y la identificación de nuevos puntos de colonización externa y la extensión de hifas a lo largo de las raíces. Permite el posicionamiento de arbúsculos y vesículas y les asigna una posición y dimensión realistas en el patrón global.

La correcta aplicación del método MycoPatt se basa en la finalización exitosa de cada paso del protocolo (Tabla 3). Para una mayor eficiencia, todo el flujo del método está diseñado para ser conducido por una o varias personas con diferentes niveles de entrenamiento. De esta manera, se extraen múltiples resultados de cada paso y es posible un análisis continuo. Para la selección del material biológico, el muestreo de raíces y el paso de almacenamiento, es necesario que una persona altamente capacitada identifique correctamente la especie, independientemente de su etapa de crecimiento. Una vez que se identifica la especie, el muestreo de raíces puede ser realizado por cualquier persona, con un entrenamiento mínimo para la eliminación suave de partículas del suelo. El segundo paso, el procesamiento de raíces, la limpieza y la tinción para microscopía, requiere personas capacitadas; El proceso tiene múltiples pasos de verificación, y cada paso es necesario para el éxito del procedimiento. Se pueden procesar varias muestras al mismo tiempo en los dos primeros pasos. El procesamiento radicular para microscopía (paso 3) y el análisis microscópico de muestras de raíz (paso 4) son muy importantes debido a la alta atención requerida para cortar los segmentos en trozos de 1 cm combinados con su trituración suave para la preparación de portaobjetos. La microscopía necesita atención para la calibración de la luz y el software para obtener imágenes de alta calidad. Ambos pasos requieren personas altamente capacitadas o medianamente capacitadas bajo la supervisión de un experto. El ensamblaje de imágenes post-microscopía requiere personal altamente capacitado para la superposición y el orden correctos de las imágenes para reconstruir el segmento. La puntuación de la colonización micorrízica es un paso que requiere que un especialista en hongos AM identifique sus estructuras y el rendimiento de la colonización, así como para asignar puntuaciones para cada estructura en imágenes cuadriculadas. El último paso, el análisis de datos sin procesar y la extracción de resultados, requieren un analista de datos altamente capacitado que compile las bases de datos y administre las estadísticas detrás del filtrado de datos y la extracción de los mapas más relevantes. Este paso se puede combinar con el trabajo del especialista en micorrizas para obtener la máxima eficiencia del proceso. En general, todo el flujo permite la participación de múltiples especialistas dentro de un estudio interdisciplinario, lo que conduce a resultados de alta calidad.

Como cualquier método nuevo, el método del patrón micorrízico necesita evolucionar y mejorar. Hay algunas modificaciones que, en el futuro, harán que este método sea más fácil de usar y proporcionará múltiples resultados. Si se realiza mediante la técnica de limpieza y tinción lenta, este método permite la manipulación de múltiples muestras a la vez para pausar / reiniciar el análisis después de cada paso del procedimiento y obtener múltiples bases de datos digitales. Una mejora importante será el uso de escáneres de alto rendimiento para una adquisición de imágenes más rápida y, después del desarrollo de herramientas adecuadas y eficientes para el reconocimiento de estructuras micorrízicas, la automatización de este proceso. En el contexto de la evolución de la técnica, la adquisición rápida de patrones micorrícicos sustentará futuros estudios en el campo.

Existen varias dificultades en el uso de software automático. 1) Debido a las diferentes posiciones de las estructuras AM - hifas y vesículas - fuera de las células de la raíz y arbúsculos dentro de las células de la raíz, es difícil calibrar y entrenar el software para reconocerlas en la misma imagen. 2) Para el ensamblaje de las imágenes de un segmento, el software no siempre alineará las imágenes para recrear el segmento, y es posible que pueda colocarlas al azar, lo que alterará el proceso. 3) Otro problema es que el software no puede discriminar si algunas partes de dos imágenes son idénticas o si, en los procedimientos de microscopía, algunos campos se superponen. Por lo tanto, el proceso requiere ser llevado a cabo manualmente por expertos capacitados.

En general, se analizaron 60 cm de raíz de cada variante de múltiples plantas. El manuscrito actual está diseñado para presentar el concepto de uso del sistema y la herramienta MycoPatt, y los resultados presentan la funcionalidad de este método. En comparación con este método, el método de intersección de cuadrícula tiene una mayor subjetividad debido a la colocación aleatoria de raíces teñidas. Creemos que será necesario para el futuro establecer para cada planta de AM el número de segmentos a utilizar. Esta es una investigación que debe ser realizada por todos los investigadores en el campo de las micorrizas. Uno de los artículos que comparó múltiples métodos⁹ presentó una tasa de colonización similar de 50 a 200 segmentos de raíz/planta. Sus conclusiones indicaron que se necesita un método más objetivo para analizar cada segmento. Según nuestra investigación, MycoPatt reduce la subjetividad a 0. Cada segmento es escaneado y analizado en profundidad. Además, se puede desarrollar una base de datos de imágenes para todos los resultados de segmentos analizados utilizando este método. Esto también se puede utilizar para volver a analizar los datos si es necesario.

Todo el método proporciona resultados que son necesarios para múltiples campos de investigación y comerciales. Los fitomejoradores intentan constantemente crear variedades e híbridos más resistentes que se adapten a las condiciones específicas del suelo. En este contexto, los procesos de fitomejoramiento se beneficiarán en términos de conectividad de las plantas a las redes de micorrizas desde el suelo desde las etapas iniciales de selección. El análisis del patrón de micorrizas mostrará las diferencias entre los híbridos en términos de recolección de micorrizas del suelo y aclimatación a las condiciones del sitio. Los investigadores en el campo del mejoramiento pueden usar este método para detectar, incluso desde las primeras etapas de los procesos de selección, la idoneidad de nuevas variedades / híbridos para las condiciones micorrízicas del suelo. De esta manera, habrá variedades/híbridos que se adapten fácilmente a un gran número de condiciones y tecnologías, pero también variedades/híbridos con menor aceptación y alta especificidad para condiciones estrechas. Para los ecosistemas de pastizales, el método de patrón de micorrizas se adaptará perfectamente a múltiples aplicaciones: una mejor comprensión de la supervivencia de las plantas en diversos conjuntos de vegetación relacionados con el soporte fúngico; el análisis de patrones específicos de colonización en especies endémicas y en peligro de extinción; el potencial invasor de las especies exógenas; y las fluctuaciones de dominancia-codominancia debidas a la aplicación de diversos insumos²¹. Los patrones pueden ser utilizados por los productores de inóculo que necesitan calcular las dosis potenciales basadas en propágulos activos y puntos de entrada. Además, se pueden desarrollar biofertilizantes altamente específicos que contengan inóculo adecuado para plantas que comparten los mismos genitores. En la investigación, los patrones micorrícicos representan un estudio altamente comparativo, tanto desde un punto de vista visual como numérico. Existen múltiples bases de datos^22,23,24 que presentan especies de micorrizas y las estructuras que pueden desarrollar en las raíces de las plantas tester, pero ninguna de ellas, hasta la fecha^, presenta la imagen de colonización completa. Todos estos requisitos y la necesidad de estudios más realistas y aplicativos apoyan la integración del método de patrones micorrícicos en los estudios de interacción suelo-microbio-planta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb