Mycorrhizal Maps som et verktøy for å utforske koloniseringsmønstre og soppstrategier i røttene til Festuca rubra og Zea mays

Summary

Protokollen beskriver her metodene for vurdering av arbuscular mycorrhizal koloniseringsmønstre og strategi i røtter for to arter: Zea mays og Festuca rubra. Bruken av MycoPatt-metoden tillater beregning av parametere, konvertering av mykorrhizalstrukturer til digitale data og kartlegging av deres virkelige posisjon i røtter.

Abstract

Arbuscular mycorrhizal sopp er symbionter i plantens røtter. Deres rolle er å opprettholde vertsutvikling og opprettholde næringsbalansen i økosystemene. Koloniseringsprosessen er avhengig av flere faktorer som jordøkologi, det genetiske mangfoldet av sopp og vert, og agronomisk praksis. Deres synkroniserte handling fører til utvikling av et komplekst hyphalnettverk og fører til sekundær utvikling av vesikler og arbuscules i rotcellene. Målet med denne undersøkelsen var å analysere effektiviteten av mycorrhizal mønstre (MycoPatt) -metoden for posisjonering av soppstrukturer i røttene til Festuca rubra og Zea mays. Et annet mål var å utforske soppkoloniseringsstrategien som avslørt av mykorrhizale kart over hver art. Oppkjøpet og samlingen av flere mikroskopiske bilder tillater mycorrhizal koloniseringsvurdering i både mais og røde fescue planter for å gi informasjon om den realistiske posisjonen til de utviklede strukturer. De observerte mykorrhizale mønstrene fremhever den variable effektiviteten til hver plante når det gjelder å utvikle forbindelser med jordsymbiotiske sopp, forårsaket av påførte behandlinger og vekststadium. Mycorrhizal detaljerte kart oppnådd gjennom MycoPatt-metoden er nyttige for tidlig påvisning av planteeffektivitet i symbiotisk oppkjøp fra jorda.

Introduction

Arbuscular mycorrhiza (AM) sopp er en kategori av jordbårne endofytter som stadig er et område av interesse for forskere. Deres tilstedeværelse i røttene til de fleste planter og deres engasjement i næringssykluser gjør dem til viktige komponenter i stabiliteten til hvert økosystem der urteaktige planter er til stede ^1,2. Gjennom deres ekstra radikulære mycelium fungerer AM som en soppforlengelse for planterøtter, spesielt i vanskelig tilgjengelige områder³. Hovedaktiviteten er i vertsplanterøtter, hvor AM utvikler store hyfernettverk og spesifikke intracellulære strukturer kalt arbuscules. Mangelen på vertsspesifisitet gjør at symbionten kan kolonisere flere arter samtidig. Denne evnen gir AM rollen som ressursallokering og næringsregulering i økosystemet; Soppen gir også støtte i planteoverlevelse og hjelper til med planteytelse 4,5,6,7. Reaksjonen av AM-arter til vertsrøtter er synlig i forlengelsen og plasseringen av det intra-radikulære myceliet og tilstedeværelsen og formen av arbuskulene utviklet intracellulært. De intracellulære arbuskulene fungerer som et utvekslingspunkt mellom de to symbiontene og representerer områder preget av raske overføringsprosesser. Strukturene som AM produserer er artsavhengige, og i tillegg til arbuscules, i røttene, utvikler de også vesikler, sporer og hjelpeceller.

Det er mange utfordringer i vurderingen av AM-symbionter i planterøtter ^8,9. Den første er deres konstante utvikling i hele vegetasjonsperioden for verter, noe som fører til flere endringer i hyphal arbuscular strukturen. De forskjellige stadiene av arbuskulær vekst, opp til deres sammenbrudd, er tydelig tilstede i røtter, men de senescent AM-strukturene blir noen ganger fordøyd, noe som gjør dem bare delvis synlige¹⁰. Den andre utfordringen er representert ved fargemetoden og protokollen, det store mangfoldet av rotsystemer, dimensjonen av cellene deres og forskjellene i tykkelse, noe som gjør det vanskelig å foreslå en enhetlig metode. Den siste utfordringen er representert ved vurdering og scoring av AM-kolonisering. Det er mange metoder som scorer AM med forskjellige grader av objektivitet, og de fleste av dem er fortsatt begrenset til mikroskopiteknikker. De enkle er basert på tilstedeværelse / fravær av strukturer i rotbarken, mens de mer komplekse er basert på visuell scoring og bruk av koloniseringsklasser, med integrering av frekvensen og intensiteten av koloniseringsfenomenet. Mye data har blitt produsert de siste tiårene om mykorrhizal status for flere arter, men de fleste metodene er begrenset til den observerte verdien av kolonisering uten å peke på den virkelige posisjonen til hver struktur i rotbarken. Som et svar på nødvendigheten av mer nøyaktige resultater på AM-kolonisering, ble en metode basert på mikroskopisk analyse av mykorrhizale mønstre (MycoPatt) i røtter utviklet for å montere, i digital form, de detaljerte mykorrhizale kartene¹¹. Metoden tillater også objektiv beregning av koloniseringsparametere og bestemmelse av den faktiske posisjonen til hver struktur i roten.

Plasseringen av AM-soppstrukturene kan være viktig for å svare på følgende to spørsmål. Den første er relatert til analysen av koloniseringen i et bestemt øyeblikk fra vegetasjonssyklusen til en plante. I denne sammenheng er det veldig nyttig å observere arbuscular / vesikkel overflod, rapportere hvordan de befinner seg i roten, og gi et veldig klart koloniseringsbilde og parametere. Den andre er relatert til deteksjon av soppstrategi og dens orientering og til og med prognosen for fremtidig utvikling. En applikasjon av MycoPatt kan være for planter analysert daglig, hver 2-3 dager, ukentlig eller i ulike vekststadier. I denne sammenheng er plasseringen av vesiklene / arbuscules viktig for å bedre forstå den biologiske mekanismen for AM-kolonisering. Disse parametrene og observasjonene er svært nyttige for å supplere de matematiske parametrene.

Målet med denne artikkelen er å demonstrere MycoPatt-systemets evne til å utforske det opprinnelige AM-soppkoloniseringspotensialet og strategien i Zea mays (mais) røtter i forskjellige utviklingsstadier og i Festuca rubra (rød fescue) røtter under forskjellige langsiktige befruktningsforhold. For å oppfylle målet ble to store databaser fra to eksperimenter analysert. Maiseksperimentet ble etablert ved Cojocna (46°44′56" lat N og 23°50′0" langt. E), i eksperimentell didaktisk gård ved Universitetet for landbruksvitenskap og veterinærmedisin Cluj på et phaeoziom med en lammende teksturjord¹². Det røde fescue-eksperimentet er en del av et større eksperimentelt område etablert i 2001 i Ghețari, Apuseni-fjellene (46 ° 49'064 " lat N og 22 ° 81'418 '' lang. E), på en preluvosol (terra rossa) jordtype^13,14. Mais ble samlet i fem forskjellige vekstfenofaser¹²: B1 = 2-4 blader (som et kontrollpunkt for starten av mykorrhizal kolonisering); B2 = 6 blader; B3 = 8-10 blader; B4 = cob formasjon; B5 = fysiologisk modenhet. Fra 2-4 bladstadiet (A0) ble det brukt en organisk behandling som resulterte i en tograderingsfaktor (A1 = kontroll og A2 = behandlet). Røtter av rød fescue ble samlet ved blomstring fra et eksperiment med fem langsiktige befruktninger^13,14: V1 = kontroll^, ikke-befruktet; V2 = 10 t ·^ha-1 gjødsel; V3 = 10 t·ha-1 gjødsel + N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 gjødsel + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Fem planter ble samlet inn i hvert utviklingsstadium fra hver gjødslingsvariant. Fargeprotokollene og deres ytelse når det gjelder prøvebehandlingstid og kvalitet på farging ble analysert. Forholdet mellom AM-hyferutvikling og tilstedeværelsen av dens strukturer i røtter ble analysert separat for hver art og fortsatte med identifisering av de mest permissive røttene for kolonisering. De spesifikke koloniseringsmønstrene til hvert rotsystem ble analysert basert på koloniseringskart og verdien av AM-parametere.

Mais er en årlig plante, noe som innebærer kontinuerlig vekst av røttene, og det var hovedårsaken til å bruke MycoPatt i vekststadiene. Rød fescue er en flerårig plante fra et gressletter behandlet i lang tid med forskjellige gjødsel. Dens røtter har en kortere utvikling på 1 år, og anthesis betraktes som vegetasjonspunktet når planten endrer stoffskiftet fra vegetativ til generativ. For å fange disse plantene i løpet av disse intense aktivitetsperiodene ble de ovennevnte tidspunktene valgt. Prøvetaking i vegetasjonsperioden er vanskelig for denne arten når den vokser i naturlige gressletter.

Protocol

1. Valg av biologisk materiale, rotprøvetaking og lagring

1. Samle hele roten av planter med en spade (figur 1A) separat for hver variant og replikere. Fjern forsiktig, for hånd, de store jordaggregatene fra røttene. Vask hele rotsystemet og mål det på en skala med 1 cm x 1 cm celler (figur 1B). Klipp røttene separat for hver plante, og legg dem i en plastpose.
2. Samle alle de rene røttene fra hver plante i en plastpose, og samle alle prøver fra en variant i en større pose. Skriv på hver pose scenen / variantnavnet og prøvetakingsdatoen. Oppbevar røttene i kjøleskap eller fryser ved en temperatur mellom -4 °C og -20 °C til bearbeiding.

2. Rotbehandling, rydding og farging for mikroskopi

MERK: Bruk hansker, maske og en mikrobiologisk/kjemisk hette for dette trinnet i protokollen.

1. Forsikre deg om at rottiningsprosessen gjøres sakte ved romtemperatur. For alle trinnene i behandlingen, bruk små krukker (30-50 ml) for å redusere mengden nødvendige midler.
2. Utfør følgende fire trinn i den langsomme ryddings- og fargeprosedyren¹⁵. Gjør alle trinnene ved romtemperatur. Denne metoden tillater behandling av et stort antall prøver samtidig uten bruk av et vannbad for koking.
   1. Rotrydding: Plasser alle røtter fra en plante i en krukke. Forbered en 10% NaOH-løsning med vann fra springen og hell den i hver krukke til den dekker røttene helt. Rist glassene kraftig i 1 min eller 2 minutter for å produsere en homogen dispersjon av ryddeløsning i røttene. Gjenta denne prosedyren etter 24 timer og la røttene ligge i clearingløsningen i minst 48 timer.
      MERK: Rene røtter har et blekgult (opptil hvitt) aspekt, og konsistensen er myk (de kan lett knuses ved å trykke med en pinsett).
   2. Rotskylling: Pass innholdet i en krukke om gangen gjennom en sigte. Resirkuler clearingløsningen. Skyll røttene flere ganger i vann fra springen til ryddeløsningen er helt fjernet.
      MERK: Hvis ryddeløsningen ikke fjernes helt, vil det påvirke kvaliteten på fargeprosedyren.
   3. Rotfarging: Legg de skyllede røttene i en ren krukke. Forbered en 5%: 5% blekkeddikløsning med vann fra springen (5 ml blått blekk + 5 ml 9% eddiksyre + 90 ml vann fra springen). Hell løsningen i hver krukke til den helt dekker røttene. Rist glassene kraftig i 1 min eller 2 minutter for å produsere en homogen dispersjon av fargeløsning i røttene. Gjenta denne prosedyren etter 24 timer og la røttene ligge i denne løsningen i 48 timer.
      MERK: Fargede røtter har en intens blå farge.
   4. Delvis avsporing av rot: Skyll de flekkete røttene i vann fra springen i 1-2 minutter. Rist glassene kraftig for å fjerne den ekstra fargeløsningen. Gjenta prosedyren hvis fargingen er for intens og ikke tillater en klar mikroskopisk evaluering.
      MERK: Flekkete røtter kan oppbevares i vann fra springen i opptil 1 uke ved romtemperatur uten å endre fargekvaliteten (figur 2). I lengre perioder kan røttene opprettholdes i opptil 2-3 måneder i en 5% kommersiell epleeddikløsning (5% eddiksyre).

3. Rotbehandling for mikroskopi

1. Rotsegmentering: Plasser de fargede røttene fra hver prøve på et skalert skjærebrett (figur 3A). Skjær røttene i 1 cm segmenter (figur 3B). Velg 15 segmenter for hver variant.
2. Skånsom knusemetode for segmentforberedelse: Spred røttene på et lysbilde. Bruk en lamineringspose for å dekke røttene og knus dem forsiktig fra en kant (figur 3C, D). Bruk et mykt plastverktøy, for eksempel pinsett, skalpellhåndtak, penn eller en blyant med viskelær, for å sakte vise røttene på lysbildet. Fjern lamineringsposen forsiktig og dekk prøven med en deksel (figur 3E).
   MERK: Røtter har en rørformet form, så det er nødvendig å skille dem i et todimensjonalt plan. Denne handlingen forutsetter separasjon av røtter på midtpunktet, noe som fører til visning av de to delene av den indre diameteren. Bruken av lamineringsposer i den milde knuseprosedyren tillater visning av røttene, som har en sylinderform, i to stykker - en til venstre og en til høyre - mot midtpunktet. På denne måten analyseres hele roten grundig, og koloniseringsgrad er parameteren som viser volumetrisk kolonisering (beskrevet i det opprinnelige arbeidet med MycoPatt¹¹). I utgangspunktet kutter vi en sylinder i to, og etter det gjenoppbygger vi den matematisk.
3. Tilsett vann i et hjørne av lysbildet med en pipette og la vannet sakte spre seg på lysbildet (figur 3F). Fjern det ekstra vannet med et papirhåndkle.

4. Mikroskopisk analyse av rotprøvene

1. Bruk et mikroskop utstyrt med et kamera med god oppløsning.
2. Analyser lysbildene fra en ekstremitet. Fang hvert mikroskopisk felt. Gi nytt navn til hvert bilde som er tatt med en kode som tillater den virkelige ettermonteringen av rotdeler. For tykke røtter, bruk 10x eller 40x forstørrelse, og for tynne røtter, bruk 40x forstørrelse. Bruk samme mål og forstørrelse for hele settet med røtter fra en art.

5. Bildesamling etter mikroskopi

1. Bruk presentasjonsprogramvare til å designe et tegnebrett for bildemontering. Angi bredden 2-3 cm bredere enn bildebredden. Legg til alle bilder som er tatt fra ett segment i den rekkefølgen de er tatt, og rekonstruer hele lengden på rotsegmentet (figur 4A).
   1. Kort sagt, samle totalt 15 bilder for hvert 1 cm segment og organiser dem vertikalt, starter med 1 til 15, i presentasjonsprogramvaren for å rekonstruere segmentet.
2. Juster bildene i midten. Bruk den vertikale justeringen for å sikre at hvert bilde følger det forrige. På alle bilder plasserer du et rutenett med 10 celler x 150 celler for å dekke hele rotsegmentet.
   1. I tillegg, på hvert enkelt bilde, plasser et rutenett på 10 x 10, og i hver celle i dette rutenettet, sett inn et tall fra ett til seks hvis en AM-struktur er synlig eller la den stå tom hvis ingen AM-struktur er til stede. På denne måten er nøyaktigheten av prosessen maksimal uten feil i plasseringen av AM-strukturene som observeres.
3. Legg til en tabell for et rutenett på 10 celler i bredde og 150 celler i lengde (15 firkanter av 10 celler x 10 celler). Endre dimensjonene for tabellbredden til bredden på bildene. Endre lengden på tabellen slik at den består av alle bildene (figur 4B).

6. Skåring av mykorrhizal kolonisering

1. Bruk det unike tallet til å score hver type struktur som beskrevet i mykorrhizamønstermetoden¹¹: 1 for hyfer; 2 for arbuscules; 3 for vesikler; 4 for sporer; 5 for hjelpeceller; og 6 for inngangspunkter (figur 4C). Skår hver observerte mykorrhizastruktur fra hver celle i de tidligere anvendte rutenettene (figur 4D).

7. Rådataanalyse og resultatutvinning

1. Sett inn alle oppnådde poengsummer i MycoPatt-regnearket¹¹. Bruk kopier/lim inn-funksjonen til å overføre alle partiturene fra presentasjonen til det første arket med navnet rawdata (figur 5).
2. Primær analyse av resultater: Bruk det tredje arket med navngitte parametere i regnearkverktøyet MycoPatt til å visualisere resultatene som prosentandeler (%) separat i tre former (figur 6A-C). Bruk kolonne A til K for å analysere det horisontale bildet av kolonisering; kolonner M til W for å analysere det vertikale bildet av kolonisering; og kolonne Y til AI for å analysere den tverrgående (gjennomsnittlige) koloniseringen for hver av de 15 10 x 10 kvadratene (linje 2-17) og den endelige gjennomsnittlige koloniseringen (linje 19-20).
   MERK: Den tverrgående gjennomsnittlige koloniseringen brukes til beregning av de virkelige koloniseringsparametrene, relatert til både horisontal og vertikal analyse. På denne måten kan det ikke gjøres feil i forhold til om bare den horisontale eller vertikale analysen brukes (beskrevet i detalj i det opprinnelige arbeidet¹¹). Også dette settet av parametere beregnes for hele overflaten av det mikroskopiske feltet.
   1. Bruk definisjonene og formlene, spesifikke for hver parameter, for å analysere resultatene¹¹. Bruk følgende koloniseringsparametere: koloniseringsfrekvens (%), intensitet av kolonisering (%), arbuscules (%) og vesikler (%), sporer (%) og hjelpeceller (%), inngangspunkter (%), prosentandelen av ikke-mykorrhizale områder (%), total koloniseringsgrad (%), og rapporten om mykorrhizal / ikke-mykorrhizale områder.
      MERK: Hvis arbuskuler, vesikler, sporer, hjelpeceller og inngangspunkter mangler i analyserte prøver, vil MycoPatt-regnearket score dem som null (0).
3. Produksjon og utvinning av mykorrhizal kart: Visualiser bildet hentet fra konvertering av mycorrhizal strukturer kode til farger i det andre arket av MycoPatt navngitte grafer (figur 7A). Eksporter det resulterende bildet i diagramarket som et bilde (figur 7B). Bruk fargekoden i forklaringen for analyse av mykorrhizamønstre.
4. Mycorrhizal kartanalyse: Identifiser de viktigste strukturene og deres montering på mycorrhizal kart. Beskriv mycorrhizal koloniseringsmønsteret observert i de analyserte røttene. Beskrive mycorrhizal koloniseringsstrategi basert på observert strukturell utvikling i roten, forgreningsmønsteret og arbuscule / vesikkelutvikling.

Representative Results

Riktig bruk av røttenes skånsomme knusemetode etter fargingsprosedyrene gir gode detaljer om mykorrhizastrukturer, både for Zea mays (Figur 8A-C) og Festuca rubra (Figur 9A-E), god kontrast mellom mykorrhizastrukturer og rotceller, og en bekreftelse på stelen på grunn av den blå fargen. Hvis rydde- og fargeprosedyrene ikke lykkes, er rotprøver vanskelige å knuse og viser ikke tydelig mykorrhizastrukturer (figur 10A-E). I dette tilfellet gjentar du hele klaringsfargingsprosedyren.

Bruken av mykorrhizal mønstermetoden og MycoPatt-verktøyet tillot en fullstendig utforskning av koloniseringsmekanismen. Metoden gir en dyp, liten utforskning av koloniseringsmønstre og strategier for hver art (figur 11 og figur 12) med et ekstra visuelt uttrykk for koloniseringsparametere (tabell 1 og tabell 2). De to studiene utført på Zea mays, beskrevet omfattende av Pop-Moldovan et ^al.12, og Festuca rubra, detaljert av Corcoz et al. ^13,14, ga en stor database med observasjoner, mycorrhizal kart og koloniseringsparametere. Begge databasene skåret frekvens av kolonisering (%), intensitet av kolonisering (%), arbuscules (%) og vesikler (%), prosentandelen av ikke-mykorrhizal områder (%), samlet koloniseringsgrad (%), og rapporten om mycorrhizal / ikke-mycorrhizal områder som koloniseringsparametere. For Zea mays besto databasen av 5 850 linjeoppføringer i regnearkdatabasen, samlet i 390 koloniseringskart. Zea mays-eksperimentet foreslo rapporten om mykorrhizal / ikke-mykorrhizale områder som en parameter for beskrivelse av veksling og forstyrrelse mellom koloniserte områder i røttene. Tilnærmingen tillater en grundig analyse av koloniseringsmekanismen og dens utvikling langs røttene. Festuca rubra ga en database med 4,500 linjeoppføringer i regnearket, samlet i 300 kart. En ny indeks ble foreslått, arbuscules/vesicles-rapporten, som videre ble brukt som en indikator på koloniseringsstrategi. Den samlede vurderingen av koloniseringsstrategien foreslo fire forskjellige scenarier for mykorrhizal utvikling: 1) forplantningsstrategi, 2) overføringsstrategi, 3) lagringsstrategi og 4) plantebestandighetsstrategi. For utvinning av de mest representative mykorrhizalkartene ble begge databasene utforsket basert på transformerte gjennomsnittsverdier for frekvens og intensitet av kolonisering, noe som resulterte i utvinning av tre forskjellige kart for hver analysert variant (tabell 1 og tabell 2). De tre kartene representerer AM-koloniseringen fra rotsegmentene som har de nærmeste verdiene til følgende: gjennomsnittet (Av) for hver variant, som beregnes basert på alle data som er tilgjengelige for en variant; Av−, som representerer en verdi beregnet av forskjellen mellom gjennomsnitt og gjennomsnitt/2 (Av−Av/2) og viser et lavere normalt koloniseringspotensial; og Av+, som representerer en verdi beregnet av summen mellom gjennomsnitt og gjennomsnitt/2 (Av+Av/2) og viser et høyere normalt koloniseringspotensial. Bruken av denne ekstraksjonsformelen tillater brukeren å unngå ytterpunktene (høyeste eller laveste) av koloniseringen. Metoden tillater utvinning av de mest mulige tilfellene av mykorrhizal kolonisering.

Zea mays presenterte svært svingende koloniseringspotensial, som var avhengig av utviklingsstadiet av planten (tabell 1, figur 11). Verdiene av koloniseringsfrekvens varierte sterkt mellom 3,67% -69,60%, støttet av verdier på 50% for intensiteten av koloniseringen. Hovedårsaken til dette fenomenet er at rotsystemet kontinuerlig utvikler seg gjennom hele vegetasjonsperioden. Arbuscules presenterte maksimale verdier i utviklingsstadiet 6 blader (B2), med en reduksjon i følgende vekststadier. Vesikler dukket opp sporadisk, med verdier lavere enn 1%. Utforskningen av mykorrhizale mønstre viste at hyfer ble utviklet i forskjellige områder av røttene, med begrenset forlengelse. Det ble observert store diskontinuiteter mellom koloniserte områder, med en uregelmessig utvikling av hyfer rundt det sentrale koloniseringspunktet. Koloniseringsstrategien viste store variasjoner i intervallet mellom plantemotstanden og sprednings- og overføringsstrategiene. Stadiet på 6 blader (B2), etterfulgt av stadiet av kobdannelse (B4), viste en overføringsstrategi for kolonisering, opprettholdt av mycorrhized / ikke-mycorrhized området rapporter er lavere enn 0,14. Det eneste tilfellet med en synlig høy overføringsstrategi ble registrert i B2-stadiet da store områder av røtter presenterte arbuscules. Deres overordnede posisjonering viste et klart skille mellom området der arbuscules ble utviklet og området der arbuscules var i et fremvoksende stadium. Det mest homogene gjennomsnittlige koloniseringsmønsteret ble observert i B5-utviklingsstadiet, med konstante ikke-koloniserte områder mellom de koloniserte. Den samlede vurderingen av dette visuelle fenomenet korresponderte med den endelige vegetasjonsperioden, med små verdier av arbuscules, noe som indikerte regresjonen av disse strukturene.

Festuca rubra er en dominerende art i fjellgressletter med et flerårig rotsystem. På grunn av denne tilpasningen foregår de fleste koloniseringsprosessene inne i røttene, og utviklingen av hyphalnettverk er korrelert med en lav utviklingshastighet av røttene (tabell 2, figur 12). På grunn av anvendelsen av gjødsel presenterte koloniseringsparametrene høye forskjeller mellom varianter. Forskjellene i koloniseringsfrekvensen var 65%, opprettholdt av en 36% forskjell i de registrerte intensitetene. Hver variant viste et annet koloniseringsmønster, korrelert med den langsiktige anvendelsen av behandlinger, og ledsaget av avariation mellom 0,09-0,96 i mycorrhized/non-mycorrhized areas report og 0-9,43 i arbuscules/vesicles-rapporten. Kontrollvarianten (V1) viste en gjennomsnittlig lagringsorientert strategi, med et begrenset område som begrenset utviklingen av arbuscules for Av + koloniseringskartet. Det forenklede bildet av koloniseringen (Av−) viste lineær så vel som lateral utvikling av hyfer, som var fullstendig orientert mot irregulær kolonisering for de to øvre modellene (Av− og Av+). Anvendelsen av organiske behandlinger (V2) induserte dobbel, lineær og uregelmessig hyphalutvikling i røttene. Koloniseringsstrategien som ble identifisert for den organiske behandlingen viste en orientering mot en lagringsstrategi, knyttet til langsom frigjøring av gjødsel i jord og dens utholdenhet fra en sesong til den neste. Av + -modellen presenterte det høyeste koloniseringspotensialet, med en intens tilstedeværelse av vesikler. Rapporten Mycorrhized/non-mycorrhized areas presenterte homogen kolonisering, med sjeldne diskontinuiteter mellom koloniserte områder. I motsetning til dette induserte anvendelsen av mineralgjødsel (V4) regresjonen av mykorrhizal kolonisering. De koloniserte områdene presenterte et uregelmessig mønster, med store ukoloniserte diskontinuiteter mellom dem. Den observerte strategien var generelt orientert mot en plantebestandighet, med små områder der enten en punktlig lagrings- eller overføringsstrategi var synlig. Den komparative analysen mellom lavmineralorganiske (V3) og høymineralorganiske (V5) behandlinger viste en kontinuerlig regresjon av kolonisering og skift i koloniseringsstrategi, tilpasset mellom de to motsatte behandlingene (V2 og V4). Alle områdene som ble kolonisert utviklet seg uregelmessig rundt et sentralt punkt, med en homogen tilstedeværelse av ikke-koloniserte områder. Koloniseringsstrategien var orientert mot en spredningsoverføring, med tilstedeværelse av vesikler i begrensede områder. De største ikke-koloniserte diskontinuitetene ble identifisert i varianten med en høyere mengde mineralgjødsel (V5).

Figur 1: Prosedyrer for rotprøvetaking . (A) Utvinning av prøver med jord for å beskytte røttenes integritet. (B) Målinger av rotsystemet etter den første ryddingsprosedyren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Fargede røtter opprettholdes i en krukke med vann fra springen til behandling. Rødder opprettholder fargen i opptil 1 uke ved romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Rotbehandling . (A) Hold alle røttene fra en prøve i vann i en petriskål. (B) Skjær røttene i segmenter på 1 cm lengde. (CD) Trykk forsiktig på lamineringsposen for å knuse røttene og vis dem sakte på et lysbilde. (E-F) Dekk rotsegmentene med en coverslip og legg til en dråpe vann fra springen i ett hjørne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Bildebehandling. (A) Legg til alle bildene som er tatt fra ett eksempel i en presentasjon. Juster alle bildene for å rekonstruere den mikroskopiske visningen av hver rot. (B) Legg til en tabell for å klargjøre rutenettet, med en bredde på 10 celler x 10 celler lengde for hvert bilde. Sett de indre grensene til ingen. Den indre grensen vil fortsatt være synlig, men deres gjennomsiktighet vil ikke forstyrre mykorrhizalanalysen. (CD) Bruk forklaringen om MycoPatt til å score hver struktur som er synlig på bildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Innsetting av data i MycoPatt. Kopier hele databasen med observasjoner fra presentasjonen til MycoPatt. Lim den inn som tall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: Utvinning av rådata og primærdataanalyse. (A) Koloniseringsvurdering for alle 10 horisontale celler fra en rad. (B) Koloniseringsvurdering for alle 10 celler fra en kolonne (vertikal) i hver av de 10 cellene x 10 cellers firkanter fra MycoPatt. (C) Transversal koloniseringsvurdering og beregning av gjennomsnittlige koloniseringsparametere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7: Ekstraksjon av mykorrhizale mønsterkart . (A) For hele datasettet er et stort kart over 10 celler x 150 celler tilgjengelig i grafarket til MycoPatt. (B) Trekk ut koloniseringskartet som et bilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8: Mikroskopiske bilder av AMF-strukturer i bearbeidede røtter av Zea mays. (A) Hyphal nettverk intercellulær og intracellulær utvikling av arbuscules. (B) Tett hyphalnettverk med mange arbuscules som utvikler seg intracellulært. (C) Serie vesikler av forskjellige dimensjoner. Forkortelser: H = hyfer; A = arbuscules; V = vesikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9: Mikroskopiske bilder av AMF-strukturer i bearbeidede røtter av Festuca rubra. (A) Flere hyphalnettverk med vesikler og arbuscules utviklet i separate områder. (B) Detalj av et kveilet hyphalnettverk. (C) Detalj av et inngangspunkt og to kveilede hyfer. (D) Detalj av en vesikkel på slutten av en kveilet hypha. (E) Detalj av en intracellulær arbuscule, detalj av en kveilet hypha, og tilstedeværelsen av en vesikkel på slutten av en hypha. Forkortelser: H = hyfer; A = arbuscules; V = vesikler; Ep = inngangspunkter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 10: Uklare mikroskopiske bilder av AMF-strukturer i røtter av Festuca rubra (A-C) og Zea mays (D-E) i ufullstendige klarerte og fargede røtter. (A) Uklar farget rot med et lavt antall hyfer synlige og den opprinnelige fargen på røttene synlig. (B) Hyfer av blå og intens blå fargegradient med uklart skille mellom rotcellene og hyfer. (C) Fjern farget hyphalnettverk i den øvre delen av bildet og ufullstendige fargede hyfer i den nedre delen av bildet. (D) Intens farget rot og hyfer, noe som gjør identifisering av AM-strukturer umulig. (E) Detalj av en intens farget rot med gjenstander tilstede i cellene, noe som gjør identifisering av AM-strukturer umulig. Forkortelser: H = hyfer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 11: Mycorrhizal koloniseringsmønstre (Av, Av− og Av+) i røtter av behandlede Zea mays. Forkortelser: A0 = øyeblikk av behandlingssøknad; A1 = kontrollvariant (ingen behandling)/A2 = behandlet variant; B1 = 2-4 blader (som et kontrollpunkt for starten av mykorrhizal kolonisering); B2 = 6 blader; B3 = 8-10 blader; B4 = cob formasjon; B5 = fysiologisk modenhet. Variantkombinasjoner er A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; og A1B5/A2-B5. Den fullstendige beskrivelsen av behandlinger finnes i Pop-Moldovan et ^al.12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 12: Mycorrhizal koloniseringsmønstre (Av, Av− og Av+) i røttene til langtidsbehandlet Festuca rubra. Forkortelser: V1 = kontroll, ikke-befruktet; V2 = 10 t ·ha⁻¹ gjødsel; V3 = 10 t·ha−1 gjødsel + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 gjødsel + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹. Den fullstendige beskrivelsen av behandlinger finnes i tidligere arbeid^13,14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Verdier av mycorrhizal koloniseringsparametere i røtter av Zea mays basert på utviklingsstadium. Forklaring: A0 = brukstid for behandling; A1 = kontrollvariant (ingen behandling)/A2 = behandlet variant; B1 = 2-4 blader (som et kontrollpunkt for starten av mykorrhizal kolonisering); B2 = 6 blader; B3 = 8-10 blader; B4 = cob formasjon; B5 = fysiologisk modenhet. Variantkombinasjoner er A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; og A1B5/A2-B5. Den fullstendige beskrivelsen av behandlinger finnes i Pop-Moldovan et ^al.12. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Verdier av mycorrhizal koloniseringsparametere i røtter av Festuca rubra basert på anvendt befruktning. Forklaring: V1 = kontroll, ikke-befruktet; V2 = 10 t ·ha⁻¹ gjødsel; V3 = 10 t·ha−1 gjødsel + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 gjødsel + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1K₂O 50 kg·ha⁻¹. Den fullstendige beskrivelsen av behandlinger finnes i tidligere arbeid^13,14. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Detaljerte protokolltrinn fra feltprøvetaking av røtter til rådataanalyse og ekstraksjon av mykorrhizakart. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Studier på mykorrhizal kolonisering er avgjørende for ny strategiutvikling i agronomisk felt. Potensialet til flere dyrkede planter for å danne en symbiotisk forening med arbuscular mycorrhizas gjorde dem til en viktig del av agroøkosystemets bærekraftige utvikling og vedlikehold av helsen 16,17,18,19,20. Dermed er det behov for en bedre forståelse av koloniseringsmekanismen og soppstrategiene, som gir viktige data om hvordan en plante kan koble seg til ernæringsmessige nettverk fra jorda, dens utbytte og dens overlevelsespotensial. Derfor, i smart landbrukskontekst, er dette et must-have fra dette århundret, det er viktig å utføre en grundig vurdering av kolonisering, og studier må gi et realistisk bilde av soppposisjonen i røttene.

Metoden med rotmykorrhizamønstre gir en så dyp skanning av røttene, men den kommer med både begrensninger og fordeler¹¹. Begrensningene som presenteres er det store antallet prøver som må scores når en plante analyseres for første gang, nødvendigheten av bildemanipulering og manuell tildeling av mykorrhizastrukturer i røtter, men alle disse kan overvinnes av flere langsiktige fordeler. Den store databasen som følge av anvendelsen av denne metoden og integrering av mikroskopi med MycoPatt-verktøyet gir stabilitet, statistisk sikkerhet for resultater og flerårighet når det gjelder resultatsammenligning. Mycorrhizal mønsteridentifikasjon for røttene til en bestemt plante vil lette etterfølgende studier når det gjelder sammenligning. Det forbedrer også identifiseringen av nye mønstre, som kan gi informasjon om utviklingen av koloniseringsmekanismer og soppstrategi. Beregningen av gjennomsnittlige koloniseringsparametere basert på horisontal og vertikal utvikling tillater oppkjøp av mer realistiske og komplekse verdier sammenlignet med de visuelle estimeringsmetodene, som rutenettkryss, rotsegmentestimering og forstørret skjæringspunkt ^9,11. Samlet sett tillater mykorrhizal mønstermetoden vurdering av soppfremgang og forgrening i røtter og identifisering av nye punkter for ekstern kolonisering og utvidelse av hyfer langs røttene. Det tillater posisjonering av arbuscules og vesikler og tildeler dem en realistisk posisjon og dimensjon i det globale mønsteret.

Riktig anvendelse av MycoPatt-metoden er avhengig av vellykket gjennomføring av hvert trinn i protokollen (tabell 3). For høyere effektivitet er hele flyten av metoden designet for å bli utført av en eller flere personer med forskjellige treningsnivåer. På denne måten blir flere resultater hentet fra hvert trinn, og kontinuerlig analyse er mulig. For valg av biologisk materiale, rotprøvetaking og lagringstrinn, er det nødvendig at en høyt utdannet person identifiserer arten riktig, uavhengig av vekststadiet. Når arten er identifisert, kan rotprøvetakingen gjøres av enhver person, med minimal trening for forsiktig fjerning av jordpartikler. Det andre trinnet, rotbehandling, rydding og farging for mikroskopi, krever trente personer; Prosessen har flere bekreftelsestrinn, og hvert trinn er nødvendig for å lykkes med prosedyren. Flere prøver kan behandles samtidig i de to første trinnene. Rotbehandling for mikroskopi (trinn 3) og mikroskopisk analyse av rotprøver (trinn 4) er svært viktige på grunn av den høye oppmerksomheten som kreves for å kutte segmentene i 1 cm stykker kombinert med deres milde knusing for lysbildeforberedelse. Mikroskopi trenger oppmerksomhet for kalibrering av lys og programvaren for å oppnå bilder av høy kvalitet. Begge trinnene krever høyt utdannede personer eller middels trente under tilsyn av en ekspert. Postmikroskopi bildesamling krever høyt utdannet personell for riktig overlapping og rekkefølge av bilder for å rekonstruere segmentet. Scoring av mykorrhizal kolonisering er et skritt som krever en spesialist i AM-sopp for å identifisere deres strukturer og koloniseringsytelse, samt å tildele poeng for hver struktur på gridded bilder. Det siste trinnet, rådataanalyse og resultatutvinning krever en høyt utdannet dataanalytiker som samler databasene og administrerer statistikken bak datafiltrering og utvinning av de mest relevante kartene. Dette trinnet kan kombineres med arbeidet til mykorrhizalspesialisten for maksimal effektivitet i prosessen. Samlet sett tillater hele flyten involvering av flere spesialister i en tverrfaglig studie, noe som fører til resultater av høy kvalitet.

Som enhver ny metode må mykorrhizalmønstermetoden utvikles og forbedres. Det er noen modifikasjoner som i fremtiden vil gjøre denne metoden enklere å bruke og gi flere resultater. Hvis det gjøres ved langsom rydding og fargingsteknikk, tillater denne metoden manipulering av flere prøver om gangen for å pause / starte analysen på nytt etter hvert trinn i prosedyren og få flere digitale databaser. En viktig forbedring vil være bruken av performant skannere for raskere bildeoppkjøp og, etter utvikling av egnede og effektive verktøy for mykorrhizal strukturgjenkjenning, automatisering av denne prosessen. I sammenheng med teknikkutvikling vil rask oppkjøp av mycorrhizal mønstre opprettholde fremtidige studier på feltet.

Det er flere vanskeligheter med bruk av automatisk programvare. 1) På grunn av de forskjellige posisjonene til AM-strukturer - hyfer og vesikler - utenfor rotcellene og arbuskulene inne i rotcellene, er det vanskelig å kalibrere og trene programvare for å gjenkjenne dem i samme bilde. 2) For montering av bildene fra ett segment, vil programvaren ikke alltid justere bildene for å gjenskape segmentet, og det er mulig at det kan plassere dem tilfeldig, noe som vil endre prosessen. 3) Et annet problem er at programvare ikke kan diskriminere hvis noen deler av to bilder er identiske eller hvis noen felt i mikroskopiprosedyrene ble overlappet. Dermed krever prosessen å bli utført manuelt av trente eksperter.

Totalt ble 60 cm rot fra hver variant analysert fra flere planter. Det nåværende manuskriptet er designet for å presentere konseptet med å bruke MycoPatt-systemet og verktøyet, og resultatene presenterer funksjonaliteten til denne metoden. Sammenlignet med denne metoden har rutenettskjæringsmetoden høyere subjektivitet på grunn av tilfeldig plassering av fargede røtter. Vi tror at det vil være nødvendig for fremtiden å etablere for hvert AM-anlegg antall segmenter som skal brukes. Dette er forskning som må gjøres av alle forskerne innen mykorrhizas. En av artiklene som sammenlignet flere metoder⁹ presenterte en tilsvarende koloniseringsrate på 50 opp til 200 rotsegmenter/planter. Deres konklusjoner uttalte at en mer objektiv metode er nødvendig for å analysere hvert segment. Basert på vår forskning reduserer MycoPatt subjektiviteten til 0. Hvert segment skannes og analyseres i dybden. En bildedatabase for alle analyserte segmentresultater kan også utvikles ved hjelp av denne metoden. Dette kan også brukes til å analysere dataene på nytt om nødvendig.

Hele metoden gir resultater som er nødvendige for flere forsknings- og kommersielle felt. Planteoppdrettere prøver hele tiden å skape mer motstandsdyktige varianter og hybrider som tilpasser seg spesifikke jordforhold. I denne sammenheng vil planteavlsprosesser ha nytte når det gjelder planteforbindelse til mykorrhiza-nettverk fra jorda fra de første utvalgsstadiene. Mycorrhizal mønsteranalyse vil vise forskjellene mellom hybrider når det gjelder mykorrhizal høsting fra jord og akklimatisering til stedsforhold. Forskere i avlsfeltet kan bruke denne metoden til å oppdage, selv fra de tidlige stadiene av utvelgelsesprosessene, egnetheten til nye varianter / hybrider for jordmykorrhizaforhold. På denne måten vil det være varianter / hybrider som lett tilpasser seg et stort antall forhold og teknologier, men også varianter / hybrider med lavere aksept og høy spesifisitet for smale forhold. For økosystemer på gressletter vil mykorrhizal mønstermetoden passe perfekt for flere bruksområder: en bedre forståelse av planteoverlevelse i forskjellige vegetasjonssamlinger relatert til soppstøtte; analysen av spesifikke koloniseringsmønstre i endemiske og truede arter; det invasive potensialet til eksogene arter; og dominans-kodominans svingninger på grunn av anvendelse av ulike innganger²¹. Mønstrene kan videre brukes av inokulumprodusenter som trenger å beregne potensielle doser basert på aktive propaguler og inngangspunkter. Også svært spesifikke biogjødsel kan utvikles som vil inneholde egnet inokulum for planter som deler samme genitors. I forskning representerer mycorrhizal mønstre en svært komparativ studie, både fra et visuelt og numerisk synspunkt. Det er flere databaser^22,23,24 som presenterer mykorrhizale arter og strukturene de kan utvikle i røttene til testerplanter^, men ingen av dem presenterer til dags dato hele koloniseringsbildet. Alle disse kravene og behovet for mer realistiske og anvendelige studier støtter integreringen av mykorrhiza-mønstermetoden i jord-mikrobe-planteinteraksjonsstudier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb