Summary
Целью этой рукописи является описание микрохирургических этапов, необходимых для выполнения гетеротопной трансплантации гортани у мышей. Преимуществами этой мышиной модели по сравнению с другими животными моделями трансплантации гортани являются ее экономическая эффективность и доступность иммунологических анализов и данных.
Abstract
Гетеротопная трансплантация гортани, хотя и является технически сложной процедурой, предлагает больше научного анализа и экономических преимуществ по сравнению с другими моделями животных. Хотя эта техника впервые описана Шипчандлером и др. в 2009 году, она не получила широкого распространения, возможно, из-за трудностей в изучении микрохирургической техники и времени, необходимого для ее освоения. В этой статье подробно описываются хирургические этапы, а также потенциальные подводные камни, которых следует избегать, чтобы стимулировать эффективное использование этой техники.
В этой модели двусторонние сонные артерии донорской гортани анастомозируются к сонной артерии реципиента и наружной яремной вене, что позволяет кровотоку через трансплантат. Кровоток может быть подтвержден интраоперационно визуализацией наполнения крови в двусторонних сонных артериях трансплантата, покраснением щитовидной железы трансплантата и кровотечением из микрососудов в трансплантате. Важнейшими элементами успеха являются деликатное сохранение сосудов трансплантата, проведение артериотомии и венотомии правильного размера, а также использование соответствующего количества швов на артериально-артериальных и артериально-венозных анастомозах для обеспечения безопасности сосудов без утечки и предотвращения окклюзии.
Любой желающий может овладеть этой моделью с достаточной подготовкой и выполнить процедуру примерно за 3 часа. В случае успешного выполнения эта модель позволяет проводить иммунологические исследования с легкостью и по низкой цене.
Introduction
Для пациентов, страдающих непоправимым повреждением гортани или раком гортани, тотальная ларингэктомия часто является единственным вариантом1. Тотальная ларингэктомия оставляет пациентов без возможности дышать и говорить самостоятельно, в дополнение к переживанию социального и психологического стресса2. Пациенты с раком гортани, которые нуждаются в тотальной ларингэктомии, являются отличными потенциальными кандидатами на трансплантацию гортани. В то время как трансплантация гортани человека в условиях непоправимого повреждения гортани была выполнена, аллотрансплантация гортани в настоящее время избегается у этих пациентов из-за страха рецидива опухоли, возможности хронического отторжения и инфекций донорского происхождения3. Иммуносупрессия является основной причиной этих проблем. Резкая потеря первого пациента с частичной трансплантацией гортани из-за рецидива опухоли после обычного иммуносупрессивного лечения является свидетельством того, что соответствующий иммуносупрессивный режим должен быть разработан до дальнейших попыток трансплантации у пациентов с раком гортани 4,5.
Чтобы лучше понять иммунный ответ хозяина на пересаженную гортань, первая модель трансплантации гортани у крыс была разработана в 1992 году Стромом, а улучшения в хирургической технике были сделаны в 2002 году 6,7. Хотя эта модель эффективна для изучения трансплантации гортани, отсутствие специфических для крыс иммунологических агентов и более высокая стоимость, связанная с моделями крыс, привели к разработке новой мышиной модели для изучения трансплантации гортани в 2009году8.
Основным применением описанной методики является изучение различных схем иммуносупрессивных препаратов при трансплантации гортани. Улучшение современных иммуносупрессивных методов лечения может расширить пул кандидатов и привести к безопасной трансплантации у больных раком. Преимуществами этой мышиной модели являются ее экономическая эффективность и широкая доступность иммунологических данных и реагентов.
Команды, работающие над иммуносупрессивными схемами лечения трансплантации гортани, могут использовать этот метод для сбора большого объема иммунологических данных, а различные схемы лечения могут быть быстро протестированы и сопоставлены. Другие потенциальные методы лечения, которые могут модулировать иммунный ответ на трансплантацию, такие как инъекции стволовых клеток, также могут быть протестированы с использованием этой модели. Наконец, эксперименты могут быть разработаны для наблюдения долгосрочных системных эффектов трансплантации гортани путем продления периода наблюдения.
Метод, описанный здесь, использует сквозные анастомозы для обеспечения артериального и венозного потока к гетеротопному трансплантату гортани. Трансплантат представляет собой ларинготрахеэзофагеальный (LTE) комплекс, включающий гортань, щитовидную железу, паращитовидные железы, трахею и пищевод донора, с двусторонними сонными артериями и нетронутыми ножками. Одна донорская сонная артерия анастомозируется к сонной артерии реципиента и обеспечивает артериальный кровоток, в то время как другая донорская сонная артерия анастомозируется к наружной яремной вене реципиента и обеспечивает венозный кровоток (рисунок 1).
Несколько модификаций были внесены в хирургическую технику модели крысы, чтобы обеспечить успех в мышиной модели. Например, вместо инъекционного агента использовался ингаляционный анестетик для повышения контроля над глубиной анестезии и уменьшения осложнений. Непрерывное наложение швов применяется при артериально-артериальном анастомозе у крыс; однако из-за меньшего размера сосудов мышей это технически сложно и может вызвать сужение просвета сосуда7. В результате прерывистые швы используются в мышиной модели и приводят к улучшению проходимости сосудов. Кроме того, в модели крысы верхняя ножка щитовидной артерии (STA) рассечена и визуализирована. Учитывая меньший размер STA у мышей, это рассечение может привести к повреждению и даже трансекции STA. В результате он не препарируется в мышиной модели. Вместо этого близлежащая фасция сохраняется, чтобы гарантировать, что STA остается нетронутым.
Основные потенциальные подводные камни этого метода включают повреждение донорских ножек комплекса LTE, проведение артериотомии или венотомии неправильного размера, окклюзию сосудов в местах анастомоза или оставление пробелов в местах анастомоза, которые могут вызвать кровотечение. Чтобы избежать этих ошибок, необходимо соблюдать осторожность при приобретении донорского трансплантата, оставляя манжету ткани вокруг ножки STA. Артериотомия и венотомия должны быть достаточно большими, чтобы обеспечить кровоток, но достаточно маленькими, чтобы предотвратить утечку. Для анастомозов должно быть использовано соответствующее количество швов, чтобы закрыть любые промежутки, но не слишком много, чтобы закрыть сосуды.
Если получено знакомство с микрохирургическими методиками, эту процедуру можно выполнить примерно через 3 ч. Эта модель трансплантации гортани может быть надежно выполнена на мышах и использована для изучения иммунного ответа хозяина после васкуляризированной композитной аллотрансплантации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было выполнено в соответствии с Комитетом по уходу и использованию животных клиники Майо (IACUC). Мыши BalbC (10-12 недель) использовались в качестве доноров, а мыши C57 / BL6 (10-12 недель) использовались в качестве реципиентов, потому что их основные комплексы гистосовместимости, H-2Db и H-2Kb, соответственно, иммунологически несовместимы, и поэтому иммунный ответ на трансплантат может быть дополнительно изучен. Все инструменты, используемые во время операции, были стерилизованы (см. Дополнительный рисунок S1 и Дополнительный рисунок S2), а хирургическое поле оставалось стерильным на протяжении всего протокола в соответствии с инструкциями IACUC.
1. Донорская хирургия и закупка трансплантата
- Вводят донору бупренорфин с пролонгированным высвобождением (3,25 мг/кг массы тела подкожно) за 30 мин до начала процедуры. Поместите мышь в ящик для анестезии грызунов для индукции анестезии при 3% изофлуране, доставляемом потоком 1 л /мин O2 . После того, как животное будет полностью обезболено, перенесите мышь в область бритья и введите 1,5% изофлурана с потоком 1 л/мин O2 для поддержания анестезии. Подтвердите глубину анестезии ущемлением пальца ноги.
- Побрейте грудь и шею мыши до линии челюсти и нанесите крем для депиляции. Через 30 с протрите крем стерильной марлевой прокладкой, смоченной водой, и перенесите мышь в хирургическую область.
- Нанесите смазку для глаз мыши на глаза мыши. Поместите мышь на драпированную дополнительную грелку, чтобы обеспечить правильную температуру тела.
- Обездвижьте мышь, трижды подготовьте хирургическую область повидон-йодом и спиртом, а затем задрапируйте мышь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте глубину анестезии с помощью щипка пальца ноги и поддерживайте анестезию на уровне 1,5% изофлурана и 1 л / мин O2 потока через маску для лица на протяжении всей процедуры. - Сделайте небольшой горизонтальный разрез, чуть превосходящий надгрудничную выемку. Используя тонкие ножницы, поднимите кожу двусторонне через этот разрез до нижней челюсти. Иссечение трапециевидного сегмента кожи, приводящего к воздействию двусторонних слюнных желез, стерномастоидных мышц, дигастральных мышц и верхнего аспекта грудины (рисунок 2А).
- Иссечение двусторонних слюнных желез с помощью прижигания в верхней части, где визуализируется небольшая вена, проходящая через железу (рисунок 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если не принять меры для прижигания сосуда перед удалением железы, на этом этапе может возникнуть значительное кровотечение. - Осторожно втягивайте лимфоидную и жировую ткани сбоку, чтобы обнажить грудиномастоидные и ремешковые мышцы. Рассекайте двусторонние грудиномастоидные мышцы от окружающих тканей и втягивайте их латерально с помощью втягивателей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот маневр полностью обнажит комплекс LTE с ремешковыми мышцами и обеспечит комфортное рабочее пространство для рассечения сонных артерий (рисунок 2B). - Сделайте разрез средней линии между мышцами ремешка и двусторонне иссекните их, заботясь о том, чтобы не повредить подлежащую щитовидную железу и оставив ее на комплексе LTE.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа должны быть видны двусторонние сонные артерии (рисунок 2C). - По окружности рассекают общие сонные артерии до уровня ключицы ниже и до уровня бифуркации сонной артерии выше. Рассечение блуждающего нерва и внутренней яремной вены от сонных артерий. Не включайте их в закупаемый трансплантат.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя щитовидная артерия может быть замечена только выше бифуркации, путешествующей медиально. Оставьте тонкую фасцию, окружающую этот сосуд, неповрежденной и не пытайтесь рассечь ее по окружности. Этот сосуд снабжает кровоток к комплексу LTE и будет служить ножкой после трансплантации. Сохранение этого судна имеет первостепенное значение. - Рассекайте внутренние и наружные сонные артерии достаточно далеко, чтобы иметь возможность связывать и разделять. Если есть трудности с визуализацией сосудов, используйте отдельный втягиватель для втягивания дигастральных мышц сбоку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте рассечения наружной сонной артерии ближе к бифуркации, чтобы предотвратить любое повреждение верхней артерии щитовидной железы. На этом этапе можно встретить затылочную артерию, которая ответвляется от наружной сонной артерии и следует параллельно внутренней сонной артерии, и ее не следует путать с внутренней сонной артерией, которая больше и находится глубже (рисунок 2D). - Использование 8-0 нейлоновые швы, перевязывают внутренние сонные артерии на 2 - 3 мм лучше, чем сонная бифуркация. Лигат наружных сонных артерий не менее чем на 3 мм превосходит точку ветвления верхней щитовидной артерии.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этих перевязок комплекс LTE будет педикирован через верхние артерии щитовидной железы к двусторонним сонным артериям. - Обжигайте общие сонные артерии на уровне грудины и перерезайте все перевязанные сосуды двусторонне. Держите сосудистые ножки поверх комплекса LTE, чтобы избежать случайного повреждения во время дальнейшего рассечения. Чтобы предотвратить утечку газа или непреднамеренную потерю анестезии, убедитесь, что срок годности животного истек, прежде чем делать какие-либо порезы дыхательных путей.
- Разделите инфрагиоидные мышцы на уровне подъязычной кости. Создают переднюю глоточную глотокомию, как раз уступающую подъязычной. Проведите разрез вниз к превертебральной фасции, чтобы лучше освободить комплекс LTE.
- Трансектируйте трахею ниже пятого трахеального кольца и проведите разрез через пищевод вниз к превертебральной фасции, чтобы освободить комплекс LTE ниже. Освободите трахею и пищевод от подлежащей превертебральной фасции с нижнего к верхнему направлению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите сосудистые ножки поверх комплекса LTE, чтобы избежать случайного повреждения во время дальнейшего рассечения. - Создают переднюю глоточную глотокомию, как раз уступающую подъязычной. Проведите разрез вниз к превертебральной фасции, чтобы лучше освободить комплекс LTE. Разделите все оставшиеся лимфоидные или соединительнотканные соединения между комплексом LTE и окружающими тканями. Удалите трансплантат.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантат содержит донорскую гортань, трахею, щитовидную железу, паращитовидные железы, пищевод и мышцы гортани в качестве составной единицы (рисунок 2E).
2. Подготовка трансплантата
- Поместите полученный трансплантат в стерильную чашку Петри и вымойте его обычным физиологическим раствором, чтобы избавиться от любых сгустков крови. Используя микрощипцы, осторожно дойте кровь и сгустки из двусторонних сонных артерий. Расширяют двусторонние сонные артерии с помощью микродилаторов 1 мм.
- Используя иглу с тупым наконечником 30 г, введите примерно 2 мл гепаринизированного физиологического раствора в каждую сонную артерию, чтобы промыть трансплантат.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь и физиологический раствор могут быть замечены вымыванием из контралатеральной сонной артерии и небольших свободных окончаний сосудов, что подтверждает интактные верхние артерии щитовидной железы. - Иссечь адвентицию от артериальных концов, чтобы у них были чистые края для анастомоза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантат можно оставить в гепаринизированном физиологическом растворе и сделать небольшой перерыв на срок до 3 ч, прежде чем пересаживать его реципиенту9.
3. Реципиентная хирургия и анастомоз сосудов
- Подготовьте мышь-реципиент таким же образом, как описано для донора после этапа индукции анестезии, бритья и хирургической подготовки. Вводят мышке-реципиенту анальгетик пролонгированного высвобождения подкожно за 30 мин до начала операции.
- Используя скальпель, сделайте разрез средней линии шеи, простирающийся от линии челюсти выше грудины ниже. Приподнимите кожу с левой стороны и втяните ее сбоку.
- Иссекайте левую слюнную железу, прижигая высшие сосуды, как описано ранее. Иссекайте жировую и лимфоидную ткань, разделяя любые видимые сосуды низкотемпературным прижиганием, следя за тем, чтобы не повредить подлежащую внешнюю яремную вену (рисунок 3А).
- Рассекните наружную яремную вену по окружности. Используйте не менее 5 мм прозрачной длины сосуда для анастомоза. Используйте низкотемпературное прижигание или лигат и разделите любые относительно крупные вены, ответвляющиеся от яремной вены.
- Рассекните грудиномастоидную мышцу и втяните ее латерально. Держите рассеченную вену защищенной позади мышцы, чтобы избежать прямого контакта с втягивающим устройством.
- Иссекните мышцы левого ремня, чтобы получить доступ к сонной артерии реципиента. По окружности рассекают общую сонную артерию от ключицы ниже до бифуркации сонной артерии (рисунок 3B).
- Пропустите фоновый материал под наружную яремную вену и нанесите двойные приближающиеся зажимы сосуда V3.
- Поместите нейлоновый шов 10-0 через переднюю стенку наружной яремной вены в месте нужной венотомии и используйте этот шов, чтобы вытянуть переднюю часть и зафиксировать сосуд.
- Нарежьте на шов микросубами достаточно глубоко, чтобы создать венотомию подходящего размера однощелевую и обеспечить, чтобы разрез полностью проходил через венозную стенку.
- Используя иглу с тупым наконечником 30 г, промыть внутреннюю часть вены гепаринизированным физиологическим раствором.
- Поместите донорский комплекс LTE между левой сонной артерией реципиента и левой наружной яремной веной. Выровняйте свободный конец донорской левой сонной артерии по направлению к левой наружной яремной вене реципиента и острыми ножницами скосите концы сосудов.
- Используя четыре 10-0 нейлоновых прерванных швов, анастомоз донора левой сонной артерии и реципиента оставила наружную яремную вену сквозным способом.
- Сдвиньте фоновый материал под общую сонную артерию реципиента и поместите двойные приближающиеся зажимы сосуда А3 на общую сонную артерию реципиента. Создайте артериотомию таким же образом, как и венотомию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что артериотомия имеет тот же размер, что и просвет донорской сонной артерии. Если он слишком большой, после снятия зажимов возникнет обильное кровотечение. Если он слишком мал, приток крови к трансплантату будет затруднен. - Анастомоз донорской правой сонной артерии к левой сонной артерии реципиента сквозным способом с использованием шести 10-0 нейлоновых прерванных швов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная микрососудистая техника должна соблюдаться во всем анастомозе сосудов. Прохождение через заднюю стенку приводит к значительному сужению кровотока, что ставит под угрозу выживание трансплантата. Из-за небольших размеров сосудов пытаться переделать швы очень сложно. - Снимите зажимы на венозной стороне. При обнаружении кровотечения примените мягкое давление ватными наконечниками.
- Снимите зажимы на артерии и сразу же приложите мягкое давление ватными наконечниками.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ожидается некоторое кровотечение, которое обычно прекращается через 1 мин при мягком давлении. - Проверьте целостность кровотока в артерии и вене.
ПРИМЕЧАНИЕ: При интактном артериальном потоке обычно наблюдается пульсация донорской сонной артерии, и донорская щитовидная железа меняется от своего покрасневшего прозрачного цвета обратно к своему первоначальному красноватому цвету. Также может наблюдаться красная окраска малых судов на комплексе LTE. - Орошайте операционное поле гепаринизированным физиологическим раствором и закройте разрез кожи 5-0 монофиламентным швом в режиме бега. Нанесите антибиотическую мазь или кожный клей на разрез.
- Введите 1 мл теплого физиологического раствора подкожно, чтобы учесть потерю жидкости во время операции.
- Прекратите анестезию и переведите мышь в клетку восстановления. Наблюдайте за мышью на грелке до тех пор, пока она полностью не проснется, чтобы избежать переохлаждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подтверждение успешной трансплантации
Используя протокол, описанный выше, можно оценить приток крови к комплексу LTE, наблюдая пульсацию донорской сонной артерии после удаления зажимов сосудов. Пульсация обычно видна, а немедленная красная окраска донорской артерии подтверждает активный кровоток (рисунок 4А). Если анастомоз не эффективен, артерия не будет иметь пульсации, выглядеть частично разрушенной и иметь бледный цвет (рисунок 4B).
Другой метод подтверждения артериальной проходимости заключается в поиске изменения цвета на донорской щитовидной железе после удаления зажимов; изменение цвета щитовидной железы с бледного на красный виден в течение нескольких минут. Правая доля донорской щитовидной железы также краснеет при артериальном потоке. В отличие от этого, левая доля, которая находится дальше от артериальной стороны, занимает больше времени, чтобы получить правильный поток. Кровоток через небольшие свободные окончания сосудов на донорском LTE-комплексе можно рассматривать как дополнительное подтверждение.
Закупка трансплантированного ларинготрахеального комплекса
Через 15 дней реципиент и пересаженные комплексы LTE собирают. Проходимость анастомозированной артерии может быть оценена путем рассечения комплекса LTE, свободного от окружающих тканей реципиента, и визуализации сквозного анастомоза (рисунок 4A). Трансплантированный комплекс LTE обычно инкапсулируется в слой фиброзной ткани в этот момент времени. Иссеченный несоответствующий аллотрансплантат обычно больше по сравнению с нативной гортанью из-за образования фиброзных капсул (рисунок 5А). В условиях отторжения аллотрансплантата, через 15 дней при отсутствии иммуносупрессии, реципиенты, вероятно, имеют отсутствующий приток крови к трансплантированному аллотрансплантату10.
Гистологическая оценка пересаженной гортани
Согласно ранее разработанной системе классификации отторжения трансплантации гортани мыши, полное отторжение пересаженной гортани при отсутствии иммуносупрессии обычно наблюдается на 1510 день. Гортанные хрящи в основном деградируют с заметно сниженной клеточностью. Плотность ядерных клеток также уменьшается в жировых и мышечных тканях. Лимфоцитарная инфильтрация видна отчетливо, в то время как фолликулы щитовидной железы отсутствуют в пересаженном аллотрансплантате. Дополнительный рисунок S3 показывает гистологию свежеиссеченной нативной гортани по сравнению с отторгнутой пересаженной гортанью на 15-й день.
Рисунок 1: Донорская гортань пересаживается в тандеме с гортанью реципиента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Ларинготрахеальный комплекс анатомии и этапы закупок. (А) Поверхностное рассечение шеи, показывающее, что слюнные железы втянуты сбоку и ремешком мышц. (B) Втягивание правых грудиномастоидных мышц обеспечивает легкий доступ к мышцам ремешка и лежащему в их основе комплексу LTE. (C) После удаления мышц ремешка видны гортань, трахея, двусторонние щитовидные железы и структуры сонной оболочки. (D) Видна правая затылочная артерия, берущая начало из наружной сонной артерии и движущаяся сзади. (E) Иссеченный донорский комплекс LTE с видимыми гортанью, трахеей, двусторонними щитовидными железами, сонными артериями и пищеводом. Сокращения: CCA = общая сонная артерия; Di = дигастральная мышца; ЭКА = наружная сонная артерия; Eso = пищевод; Hy = подъязычная кость; ICA = внутренняя сонная артерия; IJV = внутренняя яремная вена; L = гортань; ОА = затылочная артерия; S = слюнная железа; Sm = грудиномастоидная мышца; St = мышцы ремешка; STA = верхняя щитовидная артерия; T = трахея; Thy = щитовидная железа; V = сосуды, проходящие через слюнную железу; Vg = блуждающий нерв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анатомия шеи реципиента и правильное положение трансплантата. (А) Обнажается левая наружная яремная вена после рассечения жировой и лимфоидной тканей. (B) По окружности рассеченная левая сонная артерия видна с блуждающим нервом и внутренней яремной веной, втянутыми сбоку. Сокращения: CCA = общая сонная артерия; EJV = наружная яремная вена; IJV = внутренняя яремная вена; L = гортань; S = слюнная железа; Sm = грудиномастоидная мышца; St = мышцы ремешка; T = трахея; Vg = блуждающий нерв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Результаты артериальных и венозных анастомозов. (А) Положительный результат: донорская гортань с рабочим артериальным анастомозом, ярко-красная окраска донорской общей сонной артерии и отсутствие коллапса стенок сосудов (синяя стрелка). (B) Отрицательный результат: общая сонная артерия, с нарушенным артериальным анастомозом и отсутствием кровотока, бледная и частично разрушенная (синяя стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Закупка трансплантированного комплекса LTE. (A) Валовая оценка сквозного анастомоза от донорской левой сонной артерии до правой сонной артерии реципиента через 15 дней после операции. Изображение сквозного анастомоза видно на 15 день после трансплантации (черная стрелка). Пересаженная гортань также видна рядом с втягивающим устройством, окруженным фиброзной капсулой (синяя стрелка). (B) Грубое сравнение трансплантированного аллотрансплантата комплекса LTE с нативной гортанью. С правой стороны находится пересаженная гортань при отсутствии иммуносупрессии на 15 день, а с левой стороны – родная гортань реципиента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Донорские хирургические инструменты. (1) 8-0 нейлоновый шов. (2) Стерильные хлопковые наконечники. (3) Втягивающие устройства, изготовленные из скрепки и стерилизованные. (4) 35 мм стерильная, одноразовая чашка Петри. (5) Стерильные бинты. (6) Стерильные марлевые подушечки. (7) Низкотемпературное микротонкое прижигание. (8) Тканевые щипцы Адсона. (9) Тонкие ножницы. (10) Держатель иглы. (11) Узор Vannas изогнутые ножницы, режущая кромка 7 мм. (12) Ножницы Adventitia - прямая, режущая кромка 19 мм. (13) Пружинные ножницы Vannas изогнутые, режущая кромка 3 мм. (14) Расширитель сосуда - диаметр 0,1 мм. (15) Прямые микрощипцы. (16) Угловые микрощипцы. (17) Стерильная рассеченная доска. (18) 25 G прецизионная скользящая игла. (19) Стандартная тупая игла 30 г. (20) Шприц с наконечником люэр-лока 3 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Хирургические инструменты-реципиенты. (1) 35 мм стерильная, одноразовая чашка Петри. (2) Стерильные хлопковые наконечники. (3) Микрососудистый аппроксиматорный зажим - диаметр сосуда 0,4-1 мм. (4) Одиночные мини-зажимы для сосудов. (5) Мини-клей для кожи. (6) Низкотемпературное микротонкое прижигание наконечника. (7) Стандартная тупая игла 30 г. (8) Шприц с наконечником 3 мл. (9) 5-0 монокриловый шов. (10) Нейлоновый шов 10-0. (11) Мерсианская видимость фонового материала, требуемая часть вырезана. (12) Стерильные бинты. (13) Стерильные марлевые подушечки. (14) Втягивающие устройства, изготовленные из скрепки и стерилизованные. (15) Щипцы ДеБейки. (16) Держатель иглы. (17) Тонкие ножницы. (18) Зажим, накладывающий щипцы. (19) Тканевые щипцы. (20) Узор Vannas изогнутые ножницами, режущая кромка 7 мм. (21) Ножницы Adventitia - прямой, режущая кромка 19 мм. (22) Пружинные ножницы Vannas изогнутые, режущая кромка 3 мм. (23) Прямые микрощипцы. (24) Расширитель сосуда - диаметр 0,3 мм. (25) Расширитель сосуда - диаметр 0,1 мм. (26) Угловые микрощипцы. (27) Стерильная рассеченная доска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Гистологическая оценка ларингов донора и реципиента с использованием окрашивания H&E через 15 дней после операции. (A) Нативная свежеиссеченная гортань и (B) посттрансплантированная гортань на 15-й день справа. Хрящ показывает заметно сниженную клеточность (синие стрелки). Мышечные клетки показывают потерю ядер при трансплантации по сравнению с нативными мышцами (красные стрелки). Фолликулы щитовидной железы, легко видимые на нативной ткани (зеленая стрелка), отсутствуют в пересаженной ткани. Выраженная лимфоцитарная инфильтрация вокруг пересаженных тканей видна с правой стороны (черная стрелка). Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Заболеваемость и распространенность рака гортани увеличились на 12% и 24% соответственно за последние три десятилетия, и многие из этих пациентов проходят ларингэктомию для лечения10. Эта процедура значительно ухудшает качество жизни человека, а потому желательно альтернативное лечение. Васкуляризированная композитная аллотрансплантация гортани может улучшить способность пациента дышать и говорить; тем не менее, исследования все еще необходимы, прежде чем этот метод может быть использован клинически для этой популяции пациентов. В этой статье предлагается экономически эффективная мышиная модель трансплантации гортани, которая может позволить исследовать различные иммуносупрессивные схемы.
Есть несколько критических шагов в этой процедуре, которые могут диктовать успех операции. Для донора важно держать рассечение подальше от верхней артерии щитовидной железы, чтобы избежать повреждения ножки. При приобретении гортани также важно оставить манжету фасции вокруг верхних артерий щитовидной железы, чтобы защитить ножки и избежать скручивания сосудов. Целостность ножек следует проверять при промывке трансплантата физиологическим раствором. При правильном получении кровь должна вытекать из контралатеральной сонной артерии и мелких капилляров, покрывающих трансплантат.
Следующими критическими шагами являются создание артериотомии и венотомии. При прохождении шва через сосуд в палатку стенки сосуда убедитесь, что он входит и выходит через просвет, а не только адвентицию. Таким образом, однощелевая артериотомия и венотомия обнажают просвет сосуда и позволяют кровотоку. При проведении артериотомии и венотомии отверстие должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить кровоток, но достаточно маленьким, чтобы предотвратить утечку. Если отверстие слишком маленькое, его можно расширить, чтобы соответствовать размеру просвета донорского сосуда.
Наконец, выполнение артериальных и венозных анастомозов является самой сложной, но и самой важной частью операции. Наиболее важным аспектом является определение соответствующего количества швов для наложения. Лучше всего оценить это до наложения первого шва, чтобы можно было спланировать равномерное расстояние. Наложение слишком большого количества швов приводит к затруднению кровотока, а также к большему повреждению эндотелия. Наложение слишком малого количества швов позволяет крови просачиваться через щели в просвете. Для размера мышей, используемых в этом исследовании, обычно четыре шва хорошо работают для вены и шесть швов хорошо работают для артерии. Артерия требует больше швов из-за ее кровотока с более высоким давлением.
Несколько модификаций были сделаны на протяжении всего исследования, чтобы усовершенствовать эту операцию. Первоначально использовалась инъекционная анестезия, что привело к более высокому уровню смертности, вероятно, из-за передозировки анестетика, и послеоперационному времени восстановления примерно 3 ч. Переход на ингаляционную анестезию значительно снизил смертность и сократил время послеоперационного восстановления примерно до 30 мин. Еще одним улучшением было использование тупой иглы для промывки трансплантата. Первоначально использовалась скошенная игла, которая приводила к непреднамеренным разрывам в донорских сонных артериях, что приводило к повреждению и утечке сосудов. Наконец, в этом протоколе было введено использование контрастного справочного материала. Использование зеленого фонового материала под сосудами позволило улучшить визуализацию во время анастомозов и помогло поднять сосуды и сделать их более доступными.
Устранение неполадок во время первоначальных операций было сосредоточено на решении проблемы отсутствия артериального кровотока в трансплантате. Мы предполагаем, что это, вероятно, было связано с обструкцией потока в месте артериального анастомоза. Чтобы исправить это, на донорской сонной артерии был сделан более резкий скос, чтобы гарантировать, что она находится вровень с сонной артерией реципиента. При наложении швов анастомоза было использовано как можно меньше швов и подтверждено, что квадратные узлы удерживают сосуды от вращения на себе.
При использовании этой модели необходимо иметь в виду несколько технических ограничений. Подтверждение пульсации артерий или наблюдение за начальным пополнением щитовидной железы после трансплантации не всегда гарантирует, что комплекс LTE будет иметь непрерывный кровоток. Чтобы проверить проходимость анастомоза в разные моменты времени, следует использовать более сложные методы, такие как допплерография. Чтобы лучше дифференцировать потерю кровотока из-за иммунного отторжения и неудачной хирургической техники, инструменты непрерывного мониторинга кровотока могут быть реализованы в дальнейших исследованиях. Другим ограничением этого протокола является то, что он оставляет мало места для ошибок. Если один из сосудов донора или реципиента разрывается, нет возможности успешно завершить процедуру. Кроме того, в качестве гетеротопной трансплантации донорская гортань не является полностью функционирующим органом. Эта модель полезна для изучения иммунного ответа, но поскольку трансплантат фактически не связан с дыхательными путями и реиннервация не производится, функциональная оценка пересаженной гортани не может быть выполнена.
Наиболее значительным вкладом этого протокола является снижение стоимости и улучшение доступности иммунологических анализов, антител и данных. Трансплантация гортани была ранее опубликована у крыс, собак и свиней; однако эти животные стоят дороже, и существует меньше иммунологических анализов и данных, доступных 11,12,13. Было обнаружено, что 30-дневная смертность от этой процедуры у крыс составляет 41%11; по нашему опыту с мышами, это число сократилось до 5%. Наконец, использование ингаляционного анестетика для трансплантации гортани является уникальным для этого протокола, поскольку большинство опубликованных моделей трансплантации гортани на животных используют инъекционный анестетик, такой как пентобарбитал 8,11,14. Ингаляционный анестетик значительно сокращает время восстановления и позволяет лучше контролировать глубину анестезии, чем инъекционные анестетики. Маска для доставки анестетика также помогает с правильным позиционированием, вытягивая шею.
Существует несколько применений для этой модели трансплантации. Наиболее значимыми являются способность оценивать иммунный ответ на васкуляризированный композитный аллотрансплант и тестировать различные схемы иммуносупрессии 15,16,17. Кроме того, эта модель может быть использована для изучения сосудистой системы в условиях нерабочего артериального анастомоза, анастомоза нерабочих вен или атеросклероза из-за отторжения. В этой статье описывается, как гетеротопно пересадить комплекс LTE от одной мыши к другой за ~ 3 ч. Эта осуществимая и относительно недорогая модель предлагает значительный потенциал в изучении роли иммунной системы в отказе от комплекса LTE, тем самым предлагая потенциал для новых методов лечения в трансплантации органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Расходы на проезд и проживание Эгехана Салепчи на исследования финансировались Советом по научным и технологическим исследованиям Турции (TUBITAK).
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Рэндалла Райша за его отличную видеографию и помощь в редактировании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R.
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
