Summary
描述了一种使用激光显微切割来分离单个线虫组织以进行RNA测序的方案。该协议不需要物种特异性遗传工具包，允许在单组织样本水平上比较不同物种之间的基因表达谱。
Abstract
单细胞方法彻底改变了特定细胞类型转录组的分析。然而，它们通常需要物种特异性遗传“工具包”，例如驱动荧光蛋白组织特异性表达的启动子。此外，破坏组织以分离单个细胞的方案将细胞从其天然环境中移除（例如，来自邻居的信号传导），并可能导致应激反应或与天然基因表达状态的其他差异。在本方案中，激光显微切割（LMD）被优化以分离单个线虫尾尖，用于研究雄性尾尖形态发生期间的基因表达。
LMD允许在不需要细胞破坏或物种特异性工具包的情况下分离动物的一部分，因此适用于任何物种。随后，单细胞RNA-seq文库制备方案（如CEL-Seq2）可以应用于LMD分离的单组织，并使用标准管道进行分析，前提是该物种有一个注释良好的基因组或转录组。这些数据可用于确定转录组在不同物种中形成组织的基础的保守性或差异性。
局限性包括切除感兴趣组织和样本数量的能力。功率分析表明，80%的功率只需要每个条件70个尾尖。需要紧密同步发育才能在同一发育阶段获得这么多的动物。因此，还描述了一种以1小时间隔同步动物的方法。
Introduction
线虫 - 特别是与秀 丽隐杆线虫模型系统相关的横纹线虫 - 是进化发育生物学（EDB）的一组奇妙的动物，原因有很多1，2。其优点包括细胞数量少，细胞谱系明确且一致，透明度高，易于培养和饲养。还有许多可用的资源，包括多个物种的高质量基因组和 秀丽隐杆线虫，广泛的分子遗传工具和有关发育，遗传学，解剖学和生理学的知识3，4，5，6。
与许多其他生物体一样，表征单个组织或单个细胞中转录组动力学的能力彻底改变了秀丽隐杆线虫7，8，9，10的发育分析。能够比较线虫之间的单细胞转录组同样会使用这些生物体改变EDB。例如，这种比较将深入了解基因调控网络如何为保守的字符（性状），已经分化的字符或独立进化的字符进化。
然而，从线虫中分离出特定的组织或细胞是最大的挑战之一。对于许多生物体，单细胞可以从组织中解离并以无偏倚的方式收获，或者可以用荧光蛋白的组织特异性表达进行标记，并通过荧光活化细胞分选（FACS）11进行分类。在秀丽隐杆线虫中，细胞的高通量（HTP）分离主要局限于胚胎，因为坚韧的外部角质层（和流体静压骨架）阻碍了细胞从幼虫和成虫的分离。为了解决这一挑战，一些方法在整个秀丽隐杆线虫中采用了遗传工具，例如组织特异性mRNA标记12，以及影响细胞类型13的野生型和突变体之间的差异表达比较。最近的方法通过溶解角质层来分离细胞核14或整个细胞8，9，15来克服这一挑战。然而，细胞分离和细胞培养具有明显的缺点，即细胞从其自然发育或解剖学环境中移除 - 例如，远离细胞 - 细胞信号传导和与细胞外基质的接触 - 这预计会影响基因表达谱15。此外，遗传工具和组织特异性标记是物种特异性的（即，它们只能用于秀丽隐杆线虫）。
LMD提供了一种在不破坏细胞自然环境的情况下分离组织的替代方法。对于EDB来说，LMD还允许比较来自不同物种的同源组织的转录组，而无需物种特异性遗传工具包（如果这些物种的基因组或全转录组序列可用）。LMD涉及通过直接显微镜观察和使用集成到显微镜光学元件中的激光微束来靶向组织，以切割和收获（捕获）感兴趣的组织16。LMD的局限性在于它不利于非常HTP的方法（尽管如本实验方案中所述，尾尖的转录谱对于约70个样品是稳健的），某些样品可能难以剖析，并且切割仅限于激光的精度和可以在显微镜中可视化的内容。
本方案的目的是描述LMD（然后是单组织RNA-Seq）如何用于从线虫获得阶段和组织特异性转录组数据。具体而言，它证明了LMD用于从 秀丽隐杆线虫的第四阶段幼虫（L4）中分离尾尖。然而，这种方法可以适应其他组织，当然还有不同的物种。
在 秀丽隐杆线虫中，有4个细胞在雄性和雌雄同体中形成尾尖。在雄性的L4阶段 - 但不是雌雄同体 - 尾尖细胞改变其形状并向前和向内迁移。这个过程也发生在一些但不是所有其他横纹线虫物种中。因此，尾尖是有性二态形态发生进化的良好模型。由于其位置，尾尖也很容易被LMD隔离。
为了从尾尖获得转录组图谱，本方案使用CEL-Seq2，这是一种为单细胞17，18开发的RNA-seq方法。该方法对于LMD衍生的组织有几个优点。CEL-Seq2 具有高灵敏度和高效率，使用独特的分子标识符 （UMI） 对 mRNA 读数进行直接定量， 通过体外 转录确保线性扩增，以及条形码（允许对单个组织样品进行多路复用）。CEL-Seq2的唯一限制是恢复的读数偏向于mRNA的3'末端，因此无法区分大多数亚型。
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Protocol
1. 蠕虫病毒同步
注意：下面描述了两种方法来同步 秀丽隐杆线虫 和其他横纹虫物种的发育。
- 在碱性次氯酸盐（漂白剂）处理后，通过第一幼虫期（L1）停滞同步。
注意：此方法在前面已详细描述19。这种方法依赖于秀丽隐杆线虫的两个特征，这些特征也适用于其他几种横纹虫物种：（1）蛋壳对漂白剂具有抗性，而成年和幼虫周围的角质层则不然。- 用稀释的漂白剂溶液处理妊娠雌雄同体（或雌性），以分解其角质层并释放胚胎。
- 从漂白剂中取出胚胎，并保持它们没有食物，直到所有L1孵化。
- 将被捕的L1放在食物上，所有L1几乎同时恢复发育。
注意：退出 L1 逮捕可在一小时内发生。
- 与“舱口关闭”方法同步（此处使用; 图 1 顶部）：
注意：舱口关闭方法允许在不中断开发的情况下实现紧密同步（L1停滞甚至会影响后期阶段21的开发）。该协议改编自Pepper等人22。该方法的目的是从仅包含胚胎的板中收集在特定时期内孵化的L1。- 选择母亲： 在进行孵化前的晚上，将约30个妊娠雌雄同体取到用 大肠杆菌 OP50播种的平板上。
- 在25°C下孵育过夜。
注意：选择一个没有裂缝或气泡的板，蠕虫可能会被卡住。避免使用具有非常厚的细菌草坪的板，因为以后很难清除所有蠕虫。如果使用对温度敏感的菌株，请调整产卵时间以考虑更长的胚胎发生时间。在最大产卵阶段选择母亲。 - 取出母亲和幼虫： 第二天早上，在解剖显微镜（20倍放大倍率）下，轻轻移液1-2 mL M9缓冲液对板壁而不喷射;旋转板以除去蠕虫。
- 通过将移液器尖端放在琼脂边缘的板壁上来去除并丢弃所有液体和蠕虫，以避免戳孔。检查盘子上是否没有蠕虫（只有卵/胚胎），特别是L1s;否则，请重复洗涤。
- 将板置于25°C下1小时，等待一些L1孵化。
- 收集新孵化的L1：小心地将1 mL M9缓冲液滴到琼脂上。旋转板以除去L1而不是胚胎。轻轻地将缓冲液和蠕虫移液到1 mL离心管中。
- 将管以~18，000× g离心1分钟。取出上清液。
- 将L1直接移液到种子板的细菌草坪上。在解剖显微镜下验证是否存在成虫或胚胎。
- 将蠕虫保持在25°C，直到它们发展到所需的阶段。
注意：如果条件最佳，可以从同一板中再收集两批L1。检查初始板以确保不存在L1。如有必要，请再次清洗。重复步骤 1.2.5-1.2.9。 -
检查发育时间。 在进行下游应用之前，请在复合显微镜下以400倍放大率检查一些蠕虫，以确认它们已达到所需的发育阶段，此处为L3。
注意：除了外阴发育外，远端尖端细胞或连接细胞的迁移距离也可用作指导。对于外阴发育，Mock等人23 提供了有用的指导，尽管该研究中的时间是在20°C下确定的。 在25°C时，野生 秀丽隐杆线虫 将在孵化后24小时经历L3-L4蜕皮。
2.收集L4雄性和雌雄同体并固定
- 在固定前准备无RNAse，冷（-20°C），70%甲醇。
- 在30-50倍放大倍率的解剖显微镜下，一旦可以区分性别（孵化后约21小时， 图2），就开始从同步板中挑选雄性和雌雄同体到单独的未种子板上，并继续挑选1-2小时或直到收集200只动物。
- 将蠕虫保持在25°C，直到它们达到实验所需的阶段。
- 使用用含有0.01%洗涤剂的M9缓冲液预洗的移液器吸头（以防止蠕虫粘附在吸头上），用1-2mL M9缓冲液从板上洗掉蠕虫。
- 将蠕虫转移到1 mL离心管中。
- 以21，000× g 旋转1分钟以沉淀蠕虫。取出上清液。
- 加入1 mL M9缓冲液并混合以粉碎沉淀。
- 以21，000× g 旋转1分钟以沉淀蠕虫。取出上清液。
- 重复洗涤。
- 加入1毫升冰冷的70%甲醇并充分混合。
- 以21，000× g 旋转1分钟以沉淀蠕虫。取出上清液。
- 重复步骤 2.10 和 2.11。
- 加入500μL70%甲醇，混合，并在4°C下储存1小时至过夜。
3. 激光显微切割
注意：从现在开始，使用不含RN酶的试剂和消耗品;使用过滤器提示。
- 如果使用CEL-Seq2方法处理样品，则为每个CEL-Seq2引物制备预混液（补充表S1）：将2μLCEL-Seq2引物，1μL10mM dNTP和9μL1%β-巯基乙醇（在无RNase的水中）移入标记的200μL管中。
- 安装在滑轨上
- 在解剖显微镜下，将20μL固定蠕虫（步骤2.13中的20-40个蠕虫）移液到聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片（膜所在的位置）的哑光侧。
- 等待甲醇蒸发。使用载玻片加热器加速蒸发。
注意：可以应用额外的甲醇滴剂，如果蠕虫在干燥时开始结块，则可以使用移液器吸头将蠕虫扩散出去。当蠕虫成团时，它们可能很难解剖。
- 设置显微镜
注：以下协议特定于 材料表中列出的仪器。如果使用不同的LMD显微镜，则需要对其进行调整。- 将台式加湿器放在载物台后面的LMD显微镜侧面。确保蒸汽直接吹到舞台上。
注意：加湿器有助于减少静电，否则可以防止小膜部分落入管帽中。 - 转动激光功率的钥匙。
- 打开舞台控制电源。
- 打开显微镜控制盒。
- 打开 激光显微切割 软件。
- 卸下舞台上的塑料护罩。
- 单击带有向上箭头的 卸载 按钮以加载膜载玻片。
- 确保载玻片完全干燥，翻转，使膜朝下。
- 插入载玻片，然后在更改试样窗口中单击继续。
- 更换塑料护罩。
- 在屏幕底部，选择包含幻灯片的幻灯片架。
- 要加载管子，请单击带有向下箭头的 卸载 按钮。
- 拉出托盘并取下管块。
注意：用于本实验的试管块用于500μLPCR试管。 - 将500μL PCR管的管盖插入支架中，然后将管折叠在下面。
- 将块放回托盘，然后将托盘滑回显微镜载物台。
- 在 更改收集器设备 弹出窗口中，选择 PCR 管， 然后单击 确定。
- 单击屏幕左下角 收集器管盖下的空管位置。
- 在 显微镜控制面板 中，选择 TL-BF 进行透射光明场照明。
- 将台式加湿器放在载物台后面的LMD显微镜侧面。确保蒸汽直接吹到舞台上。
- 切削
注意：此协议特定于 材料表中列出的仪器。- 使用2.5倍镜头，调整焦点，直到蠕虫和膜的结构可见。
- 切换到 20 倍镜头。
- 将舞台移动到没有蠕虫的区域。调整焦点，使膜中的气泡状结构具有淡黄色（图3A，B），以将激光聚焦在正确的焦平面上。
- 设置激光参数;对于尾尖，从 功率45， 孔径30和 速度20开始。
- 在 “激光控制 ”面板中，选择“ 校准”。按照说明进行操作。
注：仪器将自动执行此步骤。它将确保用鼠标在屏幕上绘制的形状与激光切割的形状相同。 - 在屏幕底部的 集电极装置管盖上，单击 位置 A。
- 在屏幕右侧，选择 单个形状|绘制 + 剪切。在屏幕左侧，选择“ PtoP”。
- 画一条线。
- 单击 “开始剪切 ”，以便激光穿过膜。
注意：它也可以将一条线蚀刻到玻璃杯中。 - 如果此测试切口看起来不错（膜被切开，切口边缘看起来光滑），请继续执行下一步。否则，调整焦点并剪切另一条线。
- 找到一条蠕虫。切换到 “移动 + 剪切” ，然后使用鼠标剪切尾部。
注：如果激光器没有穿过尾部，请调整焦点并增加激光功率。对于较厚的组织，激光功率可能必须设置为60。 - 保存参数： “文件”选项卡|保存应用程序配置;对于以后的检索， 请还原应用程序配置。
- 要收集样品，请使用PtoP功能切换到“绘制+切割”设置，然后绘制形状以完成膜切片的切割（图3C）。
注意：较大的膜部分和形状像矩形或三角形而不是圆形或椭圆形的部分更容易在收集管盖中找到。 - 在屏幕底部的 收集器设备管盖 处选择下一个管子，然后剪切下一个尾尖。
- 切割四条尾巴后，卸下管架（单击向下箭头 卸载 ）并在解剖显微镜下找到膜部分（图3D）。
注：这些部分可能位于管盖的中间或粘在管盖的侧面。 - 继续下游应用程序。对于 CEL-Seq2，将 1.2 μL CEL-Seq2 引物预混液（从步骤 3.1 开始）直接移取在样品顶部。
- 关闭试管，用引物编号标记，并立即将试管盖直接放在一块干冰上，以快速冷冻样品并防止RNA降解。
- 装载更多的试管，将试管块返回到载物台，并切割更多的样品。在每个尾尖加入不同的 CEL-Seq2 底漆混合物。
- 将所有管储存在-70°C。
4. 使用 CEL-Seq2 进行单尾 RNA 测序
注意：有关 CEL-Seq2 协议的完整详细信息，请参阅柳井和哈希姆肖尼18。
- 用 RNase 去污溶液清洁实验室工作台区域，以防止 RNA 降解。
- 准备预混液并将它们放在冰上。
- 制备逆转录预混液：每个样品0.4μL第一链缓冲液，0.1μL0.1M DTT，0.1μLRN酶抑制剂和0.1μL逆转录酶。
- 制备第二链反应预混液：每份样品7 μL水，2.31 μL第二链缓冲液，0.23 μL dNTP，0.08 μL 大肠 杆菌连接酶，0.3 μL 大肠杆菌 DNA聚合酶，0.08 μL RNaseH。
- 打破打开的细胞并用引物退火（有关引物的完整列表，请参见 补充表S1 ）：
- 将热循环仪及其盖子编程至65°C。
- 从-70°C取出样品并将其在热循环器中孵育2.5分钟。
- 以21，000× g 旋转30-40秒。
- 在65°C下孵育2.5分钟。
- 立即将它们移动到冰上。
- 以21，000× 克 旋转30-40秒，并将它们返回冰中。
- 将核糖核酸转化为化学原细胞核酸：
- 向每个尾尖加入0.8μL逆转录混合物。
- 在42°C孵育1小时。
- 在70°C下加热灭活10分钟。
- 立即将其移至冰上。
- 向每个尾尖加入10μL第二股混合物。
- 轻拂样品。
- 以21，000× g 旋转30-40秒。
- 在16°C孵育2小时。
- 二甲基生物酸清除：
- 将DNA纯化珠预热至室温。
- 在 1.5 mL 离心管（最多 480 μL）中池化多达 40 个样品。
- 混合磁珠直至它们充分分散，并为每100 μL混合样品加入20 μL磁珠和100 μL磁珠结合缓冲液（对于480 μL样品，加入480 μL磁珠缓冲液和96 μL磁珠，最终体积高达1，056 μL）。通过移液充分混合。
- 在室温下孵育15分钟。
- 放在磁性支架上至少5分钟，直到液体看起来清澈。
- 除去并丢弃除20μL上清液以外的所有上清液。
- 加入200μL新鲜制备的80%乙醇。
- 孵育至少30秒，通过移液取出上清液而不干扰珠子来除去上清液。弃去上清液。
- 重复步骤 4.5.7 和 4.5.8 一次。
- 风干珠15分钟或直到它们完全干燥。
- 将磁珠（~6.4 μL）重悬于6.4 μL水中。通过将整个体积上下移液十次彻底混合。
- 在室温下孵育2分钟。
- 直接进行 体外 转录（IVT）。
- 体外 转录和片段化：
- 向含有6.4μL样品和微球的管中，加入以下混合物（总共9.6μL）：1.6μL10x T7缓冲液，1.6μLATP，1.6μL双绞线，1.6μLCTP和1.6μL GTP（每个dNTP在75mM浓度下）1.6μLf T7酶。
- 在37°C下孵育13小时，并保持4°C。
- 加入6μL外切酶溶液（最终体积应为22μL）。
- 在37°C下孵育15分钟。
- 将管放回冰上，加入5.5μL破碎缓冲液（0.25×反应体积）。
- 在94°C下孵育3分钟。
- 立即将管移至冰中，加入2.75μL片段停止缓冲液（加入0.5×体积的片段缓冲液）。
- 通过将管子放在磁性支架上至少5分钟直到液体看起来清澈，以取出磁珠。
- 将上清液转移到新管中。
- 扩增的核糖核酸 （aRNA） 纯化：
- 将RNA纯化珠预热至室温。
- 混合珠子，直到它们充分分散。
- 移液器55μL微球（1.8×反应体积）。
- 在室温下孵育10分钟。
- 将管子放在磁性支架上至少5分钟，直到液体看起来清澈。
- 取出并丢弃80μL上清液。
- 加入200μL新鲜制备的70%乙醇。
- 孵育至少30秒，通过移液除去上清液，而不会干扰磁珠。弃去上清液。
- 重复乙醇洗涤两次。
- 风干珠15分钟或直到它们完全干燥。
- 用7μL水重悬珠。将整个体积上下移液10次以彻底混合。
- 在室温下孵育2分钟。
- 将带有磁珠的管子放在磁性支架上5分钟，直到液体看起来清澈。
- 将上清液转移到新管中。
注意：停止点：样品可以保持在-70°C。
- 可选：根据制造商的方案，使用自动电泳系统检查aRNA量和质量。
- 图书馆准备：
- 向 5 μL RNA 中加入 1 μL 100 μM 随机六聚体 RT 引物（参见 材料表）和 0.5 μL 10 mM dNTP。
- 在65°C下孵育5分钟。
- 在室温下加入4μL以下混合物：2μL第一链缓冲液，1μL0.1M DDT，0.5μLRNase抑制剂，0.5μL逆转录酶。
- 在25°C下孵育10分钟。
- 在42°C下孵育1小时（在杂交炉或预热的热循环仪中，盖子设置为50°C）。
- 在70°C下孵育10分钟。
- 将5μL转移到新管中（将反应的其余部分保持在-20°C）。加入 5.5 μL 超纯水、1 μL RNA 聚合酶链反应引物 （RP1）、1 μL 索引 RNA 聚合酶链反应引物 （RPIX） 和 12.5 μL 聚合酶链反应混合物。
- 在热循环仪上使用以下程序：98°C时30秒，11个循环：（98°C下10秒，60°C时30秒，72°C时30秒），72°C下10分钟，4°C保持。
注意：停止点：样品可以保持在-20°C。
- 库清理：
- 将DNA纯化珠预热至室温。
- 混合珠子，直到它们充分分散。
- 将25μL微球加入PCR反应中。通过移液充分混合。
- 在室温下孵育15分钟。
- 将管子放在磁性支架上至少5分钟，直到液体看起来清澈。
- 取出并丢弃45μL上清液。
- 加入200μL新鲜制备的80%乙醇。
- 孵育至少30秒，除去并丢弃上清液，而不会干扰珠子。
- 重复乙醇洗涤一次。
- 风干珠15分钟或直到它们完全干燥。
- 用25μL水重悬它们。通过移液充分混合。
- 在室温下孵育2分钟。
- 将管子放在磁性支架上5分钟，直到液体看起来清澈。
- 将25μL上清液转移到新管中。
- 重复步骤 4.10.2-4.10.10 一次。
- 用10.5μL水重悬。通过移液充分混合。
- 在室温下孵育2分钟。
- 将管子放在磁性支架上5分钟，直到液体看起来清澈。
- 将10μL上清液转移到新管中并储存在-20°C。
- 根据测序设施的要求评估文库的质量和数量。
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Representative Results
激光捕获显微切割后，雄性和雌雄同体的个体尾尖在4个时间点（L3孵化后22小时;使用CEL-Seq2方案制备L4 24，26和28 h）用于RNA测序。CEL-Seq2引物包含独特的条形码，能够以生物信息学方式识别来自特定样品（在本例中为单个尾尖）的测序读数。使用这种方法生成了总共557个尾尖的测序数据（266个雌雄同体和291个雄性，分布在4个发育时间点，每个性别和时间点59-78个尾巴）。回收了这些尾尖97%（即543个）的CEL-Seq2条形码（补充表S2）。对于大多数图书馆，回收率为99-100%;然而，对于一个男性时间点来说，这是88%。值得注意的是，由于与COVID-19相关的延迟，22小时，24小时和28小时时间点的雄性尾巴尖端中约有一半在-80°C下储存约4个月。这表明，虽然在取样后不久制备测序文库是理想的，但在文库制备之前，可以将解剖后的样品储存更长的时间。
CEL-Seq2引物还向每个mRNA转录本添加一个UMI。这使得PCR能够重复去除和精确定量样品中的基因表达。UMI的数量在尾尖上变化很大（图4，雄性平均值= 92，560，雄性最小= 155，雄性最大= 1，183，998，雌雄同体平均值= 67，597，雌雄同体最小= 132，雌雄同体最大= 630，427）。有关每个尾尖的 UMI 计数，请参见 补充表 S3。由于用于单细胞文库制备的输入RNA量较低，已知单细胞测序数据具有大量的技术噪声。因此，建议在分析24之前过滤具有非常低或非常高UMI计数的样品。
R包powsimR25 用于评估在单细胞或体RNA-seq实验中可靠地检测差异表达（DE）基因的统计功效和样本量要求。模拟的参数基于使用此处描述的方法获得的70个单独的雄性尾尖（在24小时时间点）的测序数据集。预期的对数折叠变化基于一个单独的RNA-seq实验的结果，该实验汇集了80-100个尾尖。模拟确定，单尾尖数据具有足够的功率（真阳性率= TPR）来检测DE基因，但平均表达值非常低的基因除外（ 图5的顶部，虚线表示80%TPR）。每个时间点添加更多模拟的尾尖，在一定程度上增加了低表达基因的功效。错误发现率 （FDR） 也存在类似的模式。低表达基因的罗斯福率高（>0.10）;然而，对于更高表达的基因，它落在或低于标称的0.10截止值（ 图5底部的FDR虚线）。总之，将每个时间点采样的尾部数量增加到70以上对降低FDR或增加功率几乎没有作用。然而，70个尾尖提供的FDR要比30个尾尖大得多，功率也更强。
图1： 秀丽隐杆线虫 与孵化方法和尾尖激光显微切割同步的程序概述。 缩写：L1-L4 =幼虫阶段1至4;PEN = 聚萘二甲酸乙二醇酯;LMD = 激光显微切割。 请点击此处查看此图的大图。
图2： 秀丽隐杆线虫 L3雌雄同体和雄性在解剖显微镜下的外观。 雌雄同体（A，B）和雄性（C，D）在孵化后21-23小时可以通过解剖显微镜（约50倍放大倍率）通过其尾巴（箭头）的形态来区分。雌雄同体的尾巴很窄，而雄性的尾巴肿胀，看起来很清晰。比例尺 = 0.1 mm .请点击此处查看此图的大图。
图3：PEN膜滑动结构和蠕虫尾部的外观。 对于在显微镜下用20x（A）和40x（B）透镜观察的组织，聚焦是正确的。（C）解剖尾巴并部分切除笔膜。在关闭切割间隙后，膜片将落入滑块下方的管盖中。（D）带有PEN膜部分的管帽，其中包含解剖的尾尖。比例尺 = 0.1 毫米 （交流-C）， 1 毫米 （深）。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：不同时间点和性别的每个尾尖的自然对数变换 UMI 计数。 使用CEL-Seq2方法制备来自单个尾巴的RNA以进行测序;总共有557条尾巴，每个性别和时间点有59-78条尾巴。在分析之前，极低和高UMI异常值将从数据中删除。缩写：UMI = 唯一分子标识符。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用 powsimR 仿真进行 后验 功率分析的结果。 powsimR软件确定在各种表达水平上检测DE基因所需的独立样品数量。基因通过平均表达进行分箱，转化为UMI计数的自然对数。（A）在两个条件（这里，男性与雌雄同体）之间检测DE基因的功率（TPR），用于四种不同的模拟（不同颜色的图表），包括每个条件的不同样本量（单个尾尖的数量）。虚线表示 80% 的 TPR。（B） 罗斯福在与（A）中相同的四个模拟中，虚线表示10%的罗斯福。图表显示，每个条件70个尾尖（绿色）的样本量足以检测DE基因，但表达水平非常低的基因除外。也就是说，这些基因的功效和错误发现率不能通过增加样本量超过70来大大提高。缩写：DE = 微分表达;UMI = 唯一分子标识符;TPR = 真阳性率;FDR = 错误发现率。 请点击此处查看此图的大图。
补充表S1：CEL-Seq2协议中使用的引物序列。请按此下载此档案。
补充表S2：采样与恢复的单个尾尖。 CEL-Seq2引物包含独特的条形码，能够识别每个样品的测序读数，以便通过生物信息识别。从为测序准备的97%的尾尖样品中回收读数。 请按此下载此档案。
补充表S3： UMI计数所有具有恢复条形码的样品，如 补充表S2所示。 缩写：UMI = 唯一分子标识符。 请按此下载此档案。
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Discussion
该方法的关键步骤
如果操作正确，此处描述的方法将使用相对较少的激光解剖样品（本例中有70个尾尖）获得稳健的RNA图谱。然而，对于来自发育中的动物的样品，紧密同步对于减少样品之间的变异性至关重要。因此，该协议建议使用删除出雏方法进行蠕虫病毒同步。在这里，研究人员可以确定并精确控制个体之间的年龄差异（本方案中的1小时）。此外，孵化方法适用于任何物种，即使胚胎对漂白剂敏感，L1不会停止，或者从L1停止中恢复是可变的。为了通过孵化成功同步，洗涤步骤至关重要：所有成虫和幼虫必须在孵化期开始时移除，并且在孵化期结束时，任何胚胎都不应与新孵化的L1一起洗掉。只有当板的琼脂表面未被裂缝，孔洞或气泡损坏，板上的细菌草坪新鲜且不太厚，并且液体仅非常温和地加入和搅拌时，这才成功。
如果要分别获得男性和雌雄同体/女性的数据，可靠地识别性别也很重要。按性别区分L3幼虫（见 图2）需要经验。建议练习挑选L3雄性和雌雄同体/雌性，并在动物发育成成虫后检查成功率，并且性别易于区分。在单组织RNA-Seq之后，还可以通过主成分分析来识别异常值，并在必要时将其删除。
为了成功回收激光切割样品，尽可能减少静电非常重要。带电的PEN膜片通常不会落入管盖，而是粘在载玻片或显微镜的任何其他部分。一种补救措施是通过在载物台旁边放置一个小加湿器来提高房间内的湿度，特别是在显微镜周围。此外，膜载玻片可以用紫外线处理。为此，在UV-C（254nm）交联室中孵育载玻片并提供至少1焦耳的能量，或将载玻片暴露在层流气流工作台中的紫外光下30分钟。
由于该方案的目标是RNA-Seq，因此保持无RNase的工作环境至关重要。从固定液开始，试剂，容器和消耗品应不含RNase，工作表面应进行去污，研究人员应戴上干净的手套。解剖的样品应尽快冷冻并保持在-70°C直至进一步处理。还建议在协议的CEL-Seq2部分使用低保留管和吸头。
本文仅提供了 CEL-Seq2 协议的基本概述，该协议之前由其开发人员发布，并提供了有用的注释和提示17，18。建议在使用 CEL-Seq2 方法之前查阅这些出版物。
LMD-RNA-Seq 数据可以通过单分子 RNA 荧光原位杂交 （smRNA FISH） 26，27，28 进行验证。smRNA FISH已被广泛用于秀丽隐杆线虫，适用于其他线虫物种，不同于使用现有抗体（可能不会交叉反应）进行免疫染色或通过转基因引入转录报告基因。后者在秀丽隐杆线虫和一些相关的Caenorhabditis物种29中效果很好，但在其他线虫物种30，31中，转基因可能更具挑战性。
方法的局限性
这里描述的方法非常适合收集尾巴尖端，尾巴尖端是蠕虫末端的薄组织。在较厚的幼虫或成虫的较厚中间解剖组织更具挑战性。这里使用的仪器软件包括一个设置，用于在随后的组织中更深的水平放置多个切口。此设置可用于切割动物较厚的区域。由于解剖前需要固定蜗杆，因此结构细节很难看到，这阻碍了对特定小结构的精确解剖。如上所述， 改性活酶促酶Q 不是一种 HTP 方法.但是，一个下午可以解剖50-70个样本。
该方法相对于现有/替代方法的重要性
LMD-RNA-Seq可用于任何物种，即使没有转基因工具可用。其他方法依赖于荧光标记细胞8，9，32的FACS分选或标记的细胞核33，34的分离，因此需要转基因动物。在胚胎后秀丽隐杆线虫中解离和分离细胞的方法往往会错过蠕虫两端的组织（Dylan Rahe，个人交流）。通过将单细胞RNA-Seq与整个蠕虫的冷冻切片（RNA断层扫描）相结合来克服这些警告35。该方法用于比较秀丽隐杆线虫与另一种横纹线虫太平洋线虫36之间的空间基因表达。或者，可以尝试使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）蠕虫。这种材料已成功用于哺乳动物组织样品LMD 37之后的RNA-Seq。然而，FFPE蠕虫的RNA断层扫描和LMD仅限于对少数动物的分析。因此，它们不像LMD-RNA-Seq那样适合研究发育组织中的动态基因表达。
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Disclosures
所有作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由NIH（R01GM141395）和NSF（1656736）资助DF和NIH奖学金（F32GM136170）到AW。 图 1 是在 BioRender.com 的帮助下创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free | Leica | 11600288 | for LMD |
| 500 µL PCR tubes (nuclease-free) | Axygen | 732-0675 | to cut the tail tips into |
| Compound microscope with 40x objective and DIC | any | to check age of worms | |
| Desktop humidifier | any | ||
| Dissection microscope with transmitted light base | any | for all worm work | |
| glass pasteur pipets | any | handle of worm pick | |
| glass slides and coverslips | any | to check age of worms | |
| LMD6 microdissection system | Leica | multiple | to cut tail tips |
| LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf | 22431005 | |
| M9 Buffer | Recipe in WormBook | ||
| Methanol 99.8% | Sigma | 322415 | to fix worms |
| NGM growth medium | US Biological | N1000 | Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook |
| P10 pipette variablle volume | e.g. Gilson | ||
| P1000 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| P2 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| Pipette tips 1,000 µL | any | ||
| Pipette tips 1-10 µL filtered | any | ||
| platinum iridium wire | Tritech | PT-9010 | to make worm pick |
| sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes | any | ||
| Tween 20 | Sigma | P9416 | Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips |
| vented 6 mm plastic Petri dishes | any | ||
| For CEL-Seq2 | |||
| 4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection | Aligent | automated electrophoresis system | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA cleanup beads |
| Bead binding buffer 20% PEG8000, 2.5 M NaCl | |||
| CEL-Seq2 primers (see Table S1) | Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf | 6335000020 | Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes. |
| DNA Polymerase I (E. coli) | Invitrogen | 18052-025 | |
| dNTP mix 10 mM | any | ||
| E. coli DNA ligase | Invitrogen | 18052-019 | |
| Ethanol | |||
| ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up | Affymetrix | 78200 | exonuclease solution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | For step 4.6.1 |
| Nuclease-free water | any | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531 | PCR mix step 4.9.7 |
| random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN |
IDT | a primer with 6 nucleotides that are random | |
| RNA Fragmentation buffer | NEB | E6150S | |
| RNA Fragmentation stop buffer | NEB | E6150S | |
| RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) | Illumina, NEB, or IDT | RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina | |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Scientific | 7000TS1 | or any other similar product |
| RNaseH (E. coli) | Invitrogen | 18021-071 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | |
| Second strand buffer | Invitrogen | 10812-014 | |
| Superscripit II | Invitrogen | 18064-014 | reverse transcriptase |
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