Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63666
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Center for Developmental Genetics, New York University, 2Sacred Heart University, 3Baylor School

Summary

מתואר פרוטוקול המשתמש במיקרו-דיסקציה של לייזר כדי לבודד רקמות נמטודה בודדות לריצוף RNA. הפרוטוקול אינו דורש ערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים, מה שמאפשר להשוות פרופילי ביטוי גנים בין מינים שונים ברמה של דגימות של רקמה אחת.

Abstract

מתודולוגיות של תאים בודדים חוללו מהפכה בניתוח של תעתיקים של סוגי תאים ספציפיים. עם זאת, לעתים קרובות הם דורשים "ערכות כלים" גנטיות ספציפיות למין, כגון מקדמים המניעים ביטוי ספציפי לרקמות של חלבונים פלואורסצנטיים. יתר על כן, פרוטוקולים המשבשים רקמות כדי לבודד תאים בודדים מסירים תאים מהסביבה הטבעית שלהם (למשל, איתות משכנים) ועלולים לגרום לתגובות עקה או להבדלים אחרים ממצבי ביטוי גנים מקומיים. בפרוטוקול הנוכחי, מיקרו-דיסקציה של לייזר (LMD) מותאמת לבידוד קצוות זנב נמטודות בודדות לחקר ביטוי גנים במהלך מורפוגנזה של קצה הזנב הזכרי.

LMD מאפשר בידוד של חלק מבעל החיים ללא צורך בהפרעה תאית או בערכות כלים ספציפיות למין ולכן הוא ישים לכל מין. לאחר מכן, ניתן ליישם פרוטוקולי הכנה של ספריית RNA-seq חד-תאיים כגון CEL-Seq2 על רקמות בודדות מבודדות LMD ולנתח אותם באמצעות צינורות סטנדרטיים, בהתחשב בכך שגנום מבואר היטב או תעתיק זמין עבור המין. נתונים כאלה יכולים לשמש כדי לקבוע עד כמה השעתוקים נשמרים או שונים הם העומדים בבסיס ההתפתחות של אותה רקמה במינים שונים.

המגבלות כוללות את היכולת לחתוך את הרקמה המעניינת ואת גודל המדגם. ניתוח הספק מראה כי רק 70 קצוות זנב לכל מצב נדרשים עבור 80% כוח. יש צורך בסנכרון הדוק של ההתפתחות כדי להשיג מספר זה של בעלי חיים באותו שלב התפתחותי. לפיכך, מתוארת גם שיטה לסנכרון בעלי חיים במרווחים של שעה אחת.

Introduction

נמטודות – במיוחד הנמטודות הרבדיות הקשורות למערכת המודל Caenorhabditis elegans – הן קבוצה נפלאה של בעלי חיים לביולוגיה התפתחותית אבולוציונית (EDB) מסיבות רבות 1,2. היתרונות כוללים את מספרם הקטן של התאים, שושלות תאים מוגדרות ועקביות, שקיפות וקלות התרבית והתרבית. ישנם גם משאבים רבים זמינים, כולל גנומים באיכות גבוהה עבור מינים רבים, ועבור C. elegans, כלים גנטיים מולקולריים נרחבים וידע על התפתחות, גנטיקה, אנטומיה ופיזיולוגיה 3,4,5,6.

כמו באורגניזמים רבים אחרים, היכולת לאפיין את דינמיקת השעתוק ברקמות בודדות או בתאים בודדים חוללה מהפכה בניתוח ההתפתחות ב- C. elegans 7,8,9,10. היכולת להשוות תעתיקים של תאים בודדים על פני נמטודות תשנה באופן דומה את EDB באמצעות אורגניזמים אלה. לדוגמה, השוואות כאלה יספקו תובנה לגבי האופן שבו רשתות ויסות גנים התפתחו עבור דמויות (תכונות) שנשמרו, עבור דמויות שהתפצלו, או עבור דמויות שהתפתחו באופן עצמאי.

עם זאת, בידוד רקמות או תאים מסוימים מנמטודות הוא אחד האתגרים הגדולים. עבור אורגניזמים רבים, תאים בודדים יכולים להיות מנותקים מרקמות ונקטפים בצורה לא משוחדת או שניתן לסמן אותם בביטוי ספציפי לרקמות של חלבון פלואורסצנטי ולמיין אותם על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS)11. ב-C. elegans, בידוד תאים בתפוקה גבוהה (HTP) הוגבל בעיקר לעוברים מכיוון שהציפורן החיצונית הקשוחה (והשלד ההידרוסטטי) פגעה בבידוד התאים מהזחלים ומהבוגרים. כדי לעקוף את האתגר הזה, שיטות מסוימות השתמשו בכלים גנטיים בתולעי C. elegans שלמות, כגון תיוג mRNA ספציפי לרקמות12, והשוואות ביטוי דיפרנציאליות בין סוג בר למוטנטים המשפיעים על סוג תא13. שיטות עדכניות יותר התגברו על האתגר על ידי המסת הציפורן כדי לבודדגרעינים 14 או תאים שלמים 8,9,15. לבידוד התא ולתרבית התאים יש את החסרונות הברורים, עם זאת, שהתאים מוסרים מההקשר ההתפתחותי או האנטומי הטבעי שלהם – למשל, הרחק מאיתות תאי-תא ומגע עם המטריצה החוץ-תאית – שצפויים להשפיע על פרופיל ביטוי הגנים15. יתר על כן, הכלים הגנטיים והסמנים הספציפיים לרקמות הם ספציפיים למין (כלומר, ניתן להשתמש בהם רק ב- C. elegans).

LMD מספק שיטה חלופית לבידוד רקמות מבלי לשבש את ההקשר הטבעי של התאים. באופן משמעותי עבור EDB, LMD מאפשר גם להשוות תעתיקים מרקמות הומולוגיות של מינים שונים ללא צורך בערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים אם קיימים רצפי גנום או תעתיקים שלמים של מינים אלה. LMD כולל מיקוד רקמות על ידי תצפית מיקרוסקופית ישירה ושימוש במיקרובאם לייזר – המשולב באופטיקה של המיקרוסקופ – כדי לחתוך ולקצור (ללכוד) את הרקמה המעניינת16. המגבלות של LMD הן שהוא אינו תורם לגישות HTP מאוד (אם כי פרופילי השעתוק של קצות הזנב, כמתואר בפרוטוקול זה, היו חזקים עם ~ 70 דגימות), דגימות מסוימות עשויות להיות קשות לניתוח, וחיתוכים מוגבלים לדיוק הלייזר ולמה שניתן לדמיין במיקרוסקופ.

מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתאר כיצד ניתן להשתמש ב-LMD, ואחריו RNA-Seq חד-רקמתי, כדי לקבל נתוני שעתוק ספציפיים לשלב ולרקמות מנמטודות. באופן ספציפי, הוא מדגים LMD לבידוד קצוות זנב מזחלים בשלב הרביעי (L4) של C. elegans. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לרקמות אחרות, וכמובן, מינים שונים.

ב - C. elegans, ישנם 4 תאים היוצרים את קצה הזנב הן אצל הזכרים והן אצל ההרמפרודיטים. במהלך שלב L4 אצל זכרים – אך לא אצל הרמפרודיטים – תאי קצה הזנב משנים את צורתם ונודדים פנימה. תהליך זה מתרחש גם בחלק ממיני הנמטודות האחרים, אך לא בכולם. לכן, קצה הזנב הוא מודל טוב לאבולוציה של מורפוגנזה דימורפית מינית. בגלל מיקומו, קל גם לבודד את קצה הזנב על ידי LMD.

כדי לקבל פרופילי שעתוק מקצות הזנב, הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-CEL-Seq2, שיטת RNA-seq שפותחה עבור תאים בודדים17,18. לשיטה זו יש מספר יתרונות עבור רקמות שמקורן ב- LMD. CEL-Seq2 הוא רגיש ויעיל ביותר, ומשתמש במזהים מולקולריים ייחודיים (UMIs) כדי לאפשר כימות פשוט של קריאות mRNA, שעתוק במבחנה כדי להבטיח הגברה ליניארית וברקוד המאפשר ריבוב של דגימות רקמה בודדות. המגבלה היחידה של CEL-Seq2 היא שקריאות משוחזרות מוטות לקצה 3' של mRNA, ולכן לא ניתן להבחין ברוב האיזופורמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סנכרון תולעים

הערה: שתי שיטות מתוארות להלן כדי לסנכרן את ההתפתחות של C. elegans ומינים rhabditid אחרים.

  1. סנכרן על ידי מעצר שלב הזחל הראשון (L1) לאחר טיפול בהיפוכלוריט אלקליין (אקונומיקה).
    הערה: שיטה זו תוארה בעבר בפירוט19. שיטה זו מסתמכת על שני מאפיינים של C. elegans שנכונים גם עבור מספר מינים אחרים של rhabditid: (1) קליפת הביצה עמידה בפני אקונומיקה, בעוד שהציפורן המקיף תולעים בוגרות וזחליות אינו.
    1. טפלו בהרמפרודיטים (או נקבות) גרבידיים בתמיסת אקונומיקה מדוללת כדי לפרק את הציפורן שלהם ולשחרר עוברים.
    2. מוציאים את העוברים מהאקונומיקה ושומרים אותם ללא מזון עד שכל L1 בקע.
    3. מקם את L1 שנעצר על מזון, שם כולם מחדשים את הפיתוח בערך באותו זמן.
      הערה: היציאה ממעצר L1 יכולה להתרחש תוך שעה אחת.
  2. סנכרון עם שיטת "הבקיעה" (המשמשת כאן; איור 1 למעלה):
    הערה: שיטת הבקיעה מאפשרת סנכרון הדוק ללא הפרעה להתפתחות (מעצר L1 משפיע על ההתפתחות גם של שלבים מאוחרים יותר21). הפרוטוקול מותאם מתוך Pepper et al.22. מטרת שיטה זו היא לאסוף L1 שבקעו במשך תקופה מסוימת מצלחת המכילה רק עוברים.
    1. בחר אמהות: בערב שלפני ביצוע הבקיעה, קחו כ-30 הרמפרודיטים גרבידיים לצלחת עם זרעים עם E. coli OP50.
    2. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס להטלת ביצים למשך הלילה.
      הערה: בחר צלחת ללא סדקים או בועות שבהן תולעים עלולות להיתקע. הימנע צלחות עם מדשאה חיידקית עבה מאוד כפי שיהיה קשה להסיר את כל התולעים מאוחר יותר. אם אתם עובדים עם זן רגיש לטמפרטורה, התאימו את זמן הטלת הביציות כך שיתחשב בעוברים ארוכים יותר. בחרו אמהות בשלב הטלת הביצים המקסימלי.
    3. הסר אמהות וזחלים: למחרת בבוקר, מתחת למיקרוסקופ הניתוח (הגדלה של פי 20), פיפט בעדינות 1-2 מ"ל של חיץ M9 על דופן הצלחת מבלי להשפריץ; לסובב את הצלחת כדי לעקור את התולעים.
    4. הסר והשליכו את כל הנוזלים והתולעים על ידי הנחת קצה הפיפטה על דופן הצלחת בקצה האגר כדי למנוע חורי נקב. בדקו שלא נשארות על הצלחת תולעים (ורק ביציות/עוברים), במיוחד לא L1s; אחרת, חזור על הכביסה.
    5. הניחו את הצלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת והמתינו שכמה L1s יבקעו.
    6. אסוף L1s שזה עתה בקעו: שחרר בזהירות חיץ M9 של 1 מ"ל על האגר. סובבו את הצלחת כדי לעקור את L1 אך לא את העוברים. בעדינות חיץ פיפטה ותולעים לתוך צינור צנטריפוגה 1 מ"ל.
    7. צנטריפוגה של הצינור במשך דקה אחת ב~ 18,000 × גרם. הסר את ה-supernatant.
    8. פיפטה L1 ישירות על מדשאת החיידקים של צלחת זרעים. ודא תחת מיקרוסקופ הנתיחה שאין תולעים או עוברים בוגרים.
    9. יש לשמור על תולעים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד שהן התפתחו לשלב הרצוי.
      הערה: אם התנאים אופטימליים, ניתן לאסוף שתי אצוות נוספות של L1 מאותה צלחת. בדוק את הצלחת הראשונית כדי לוודא שאין L1. במידת הצורך, לשטוף שוב. חזור על שלבים 1.2.5-1.2.9.
    10. בדוק את התזמון ההתפתחותי. לפני שנמשיך ליישום במורד הזרם, בדוק כמה תולעים תחת מיקרוסקופ מורכב בהגדלה של פי 400 כדי לוודא שהן הגיעו לשלב ההתפתחות הרצוי, כאן L3.
      הערה: מרחק נדידה של תאי קצה דיסטליים או תאי קישור יכול לשמש כמדריך, בנוסף להתפתחות הפות. עבור פיתוח הפות, Mock et al.23 מספקים מדריך שימושי, אם כי התזמון במחקר זה נקבע ב -20 מעלות צלזיוס. בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, אלגנס מסוג C. ילגנים פראיים יעברו את ה-L3-L4 24 שעות לאחר הבקיעה.

2. איסוף זכרי L4 והרמפרודיטים וקיבוע

  1. הכן RNAse ללא RNAse, קר (-20 °C ), 70% מתנול לפני קיבוע.
  2. תחת מיקרוסקופ כריתה בהגדלה של פי 30-50, התחילו לקטוף זכרים והרמפרודיטים מלוחות הסנכרון על לוחות הסנכרון ללוחות נפרדים שלא נזרעו ברגע שניתן להבחין בין המינים (כ-21 שעות לאחר הבקיעה, איור 2), והמשיכו לקטוף במשך 1-2 שעות או עד לאיסוף 200 בעלי חיים.
  3. שמור את התולעים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד שהן מגיעות לשלב הרצוי לניסוי.
  4. לשטוף את התולעים מהצלחת עם 1-2 מ"ל של חיץ M9 באמצעות קצה פיפטה שטוף מראש עם חיץ M9 המכיל 0.01% חומר ניקוי (כדי למנוע מתולעים להידבק לקצה).
  5. העבר את התולעים לצינור צנטריפוגה של 1 מ"ל.
  6. סובבו במשך דקה אחת ב-21,000 × גרם כדי להדוף את התולעים. הסר את ה-supernatant.
  7. הוסיפו 1 מ"ל של חיץ M9 וערבבו כדי לפרק את הכדור.
  8. סובבו במשך דקה אחת ב-21,000 × גרם כדי להעיף את התולעים. הסר את ה-supernatant.
  9. חזור על הכביסה.
  10. מוסיפים 1 מ"ל של קר כקרח 70% מתנול ומערבבים היטב.
  11. סובבו במשך דקה אחת ב-21,000 × גרם כדי להעיף את התולעים. הסר את ה-supernatant.
  12. חזור על שלבים 2.10 ו- 2.11.
  13. הוסיפו 500 μL של 70% מתנול, ערבבו ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה עד לילה.

3. מיקרודיסקציה של לייזר

הערה: מכאן והלאה, השתמש בריאגנטים ומתכלים ללא RNase; השתמש בעצות סינון.

  1. אם שיטת CEL-Seq2 משמשת לעיבוד הדגימות, הכינו תערובת ראשית עבור כל פריימר CEL-Seq2 (טבלה משלימה S1): פיפטה 2 μL של פריימר CEL-Seq2, 1 μL של 10 mM dNTP, ו-9 μL של 1% β-Mercaptoethanol (במים נטולי RNase) לתוך צינור מסומן של 200 μL.
  2. הרכבה על שקופית
    1. תחת מיקרוסקופ כריתה, פיפטה 20 μL של התולעים הקבועות (20-40 תולעים משלב 2.13) על הצד המט של מגלשת זכוכית פוליאתילן נפטלט (PEN) (היכן שהממברנה נמצאת).
    2. חכו שהמתנול יתאדה. השתמש במחמם שקופיות כדי להאיץ את האידוי.
      הערה: ניתן למרוח טיפות נוספות של מתנול, וקצה פיפטה המשמש להפצת התולעים החוצה אם הן מתחילות להתקבץ כשהן מתייבשות. כאשר תולעים נמצאות בגושים, הן יכולות להיות קשות לניתוח.
  3. הגדרת המיקרוסקופ
    הערה: הפרוטוקול הבא הוא ספציפי למכשיר המפורט בטבלת החומרים. יש להתאים אותו אם נעשה שימוש במיקרוסקופ LMD אחר.
    1. מקם מכשיר אדים שולחני מאחורי הבמה בצד המיקרוסקופ LMD. ודאו שהאדים נושפים ישירות על הבמה.
      הערה: מכשיר האדים עוזר להפחית את החשמל הסטטי, שאחרת יכול למנוע את נפילת מקטע הממברנה הקטן לתוך מכסה הצינור.
    2. סובבו את המפתח לעוצמת לייזר.
    3. הפעל את כוח השליטה על הבמה.
    4. הפעל את תיבת הבקרה של המיקרוסקופ.
    5. תוכנת מיקרו-דיסקציה פתוחה בלייזר .
    6. הסר את מגן הפלסטיק מעל הבמה.
    7. לחץ על לחצן הפריקה עם החץ כלפי מעלה לטעינת שקופיות הממברנה.
    8. ודא שהמגלשה יבשה לחלוטין, הפוך כך שהממברנה פונה כלפי מטה.
    9. הוסף את השקופית ולחץ על המשך בחלון דגימת השינוי .
    10. החלף את מגן הפלסטיק.
    11. בחלק התחתון של המסך, בחר איזה מחזיק שקופיות מכיל את השקופית.
    12. כדי לטעון את הצינורות, לחץ על לחצן הפריקה עם החץ כלפי מטה.
    13. משוך את המגש החוצה ומסיר את בלוק הצינור.
      הערה: בלוק הצינור המשמש לניסוי זה הוא עבור צינורות PCR של 500 μL.
    14. הכנס את מכסי הצינור של צינורות PCR של 500 μL למחזיק ומקפל את הצינור מתחת.
    15. החזירו את הבלוק למגש והחליקו את המגש בחזרה לשלב המיקרוסקופ.
    16. בחלון הקופץ של התקן אספן השינויים , בחר צינורות PCR ולחץ על אישור.
    17. לחץ על מיקום הצינור הריק בפינה השמאלית התחתונה של המסך מתחת למכסי צינורות של התקן אספן.
    18. בלוח הבקרה של מיקרוסקופ , בחר TL-BF להארת אור בהירה המועברת.
  4. חיתוך
    הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור המכשיר המופיע בטבלת החומרים.
    1. באמצעות עדשת 2.5x, התאימו את המיקוד עד שהתולעים ומבנה הממברנה ייראו לעין.
    2. עבור לעדשת 20x.
    3. העבר את הבמה לאזור ללא תולעים. התאימו את המיקוד כך שלמבנים דמויי הבועה בממברנה יהיה צבע צהבהב (איור 3A,B) כדי למקד את הלייזר במישור המוקד הנכון.
    4. הגדר את הפרמטרים של הלייזר; לקבלת קצות זנב, התחל עם Power 45, מפתח צמצם 30 ומהירות 20.
    5. בלוח בקרת לייזר, בחר כיול. בצע את ההוראות.
      הערה: המכשיר יבצע שלב זה באופן אוטומטי. זה יבטיח כי צורה שצוירה עם העכבר על המסך תהיה זהה לצורה שנחתכה על ידי הלייזר.
    6. בחלק התחתון של המסך בפקקי צינורות של מכשיר אספן, לחץ על מיקום A.
    7. בצד ימין של המסך, בחר צורה בודדת | צייר + חתך. בצד שמאל של המסך, בחר PtoP.
    8. ציירו קו.
    9. לחץ על התחל לחתוך כך שהלייזר יחתוך דרך הממברנה.
      הערה: הוא עשוי גם לחרוט קו לתוך הזכוכית.
    10. אם חתך הבדיקה הזה נראה טוב (הממברנה נחתכת, קצוות החתך נראים חלקים), המשיכו בצעד הבא. אחרת, התאימו את המיקוד וחתכו קו נוסף.
    11. מצא תולעת. עבור אל Move + Cut והשתמש בעכבר כדי לחתוך את הזנב.
      הערה: אם הלייזר אינו חותך את הזנב, התאם את המיקוד והגבר את כוח הלייזר. עבור רקמות עבות יותר, ייתכן שיהיה צורך להגדיר את עוצמת הלייזר ל-60.
    12. שמירת הפרמטרים: הכרטיסיה 'קובץ' | שמור את תצורת היישום; לאחזור מאוחר יותר, שחזר את תצורת היישום.
    13. כדי לאסוף את הדגימה, עברו להגדרה ציור + חיתוך עם פונקציית PtoP וציירו צורה כדי להשלים את החיתוך של מקטע ממברנה (איור 3C).
      הערה: מקטעי ממברנה גדולים יותר ומקטעים בצורת מלבנים או משולשים במקום עיגולים או אליפסות קלים יותר לאיתור במכסה צינור הקולט.
    14. בחר את הצינור הבא ב - Collector Device Tube Cap בתחתית המסך וחתוך את קצה הזנב הבא.
    15. לאחר חיתוך ארבעה זנבות, פרקו את מתלה הצינורות (לחצו על 'פריקה' עם חץ כלפי מטה) ומצאו את מקטעי הממברנה תחת מיקרוסקופ מנתח (איור 3D).
      הערה: החלקים עשויים להיות ממוקמים באמצע מכסה הצינור או דבוקים לצד המכסה.
    16. המשך עם היישום במורד הזרם. עבור CEL-Seq2, פיפטה 1.2 μL של תערובת מאסטר של פריימר CEL-Seq2 (משלב 3.1) ישירות על גבי הדגימה.
    17. סגור את הצינור, סמן את מספר הפריימר, ומיד הניח את מכסה הצינור ישירות על פיסת קרח יבשה כדי להקפיא את הדגימה ולמנוע פירוק RNA.
    18. טען צינורות נוספים, החזיר את בלוק הצינור לבמה וחתוך דגימות נוספות. הוסיפו תערובת פריימרים אחרת של CEL-Seq2 לכל קצה זנב.
    19. אחסן את כל הצינורות בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס.

4. ריצוף RNA חד-זנב עם CEL-Seq2

הערה: לפרטים מלאים על פרוטוקול CEL-Seq2, ראו ינאי והאשימשוני18.

  1. נקו את אזור ספסל המעבדה בעזרת תמיסת פירוק RNase כדי למנוע פירוק RNA.
  2. הכינו תערובות מאסטר והשאירו אותם על הקרח.
    1. הכן את התערובת הראשית של שעתוק הפוך: 0.4 μL של מאגר גדיל ראשון, 0.1 μL של 0.1M DTT, 0.1 μL של מעכב RNase, ו- 0.1 μL של תעתיק הפוך לכל דגימה.
    2. הכן את תערובת המאסטר של תגובת הגדיל השני: 7 μL של מים, 2.31 μL של חיץ גדיל שני, 0.23 μL של dNTP, 0.08 μL של E. coli ligase, 0.3 μL של E. coli DNA פולימראז, 0.08 μL של RNaseH לכל דגימה.
  3. שבירת תאים פתוחים וחישול עם פריימרים (ראה טבלה משלימה S1 לרשימת הפריימרים המלאה):
    1. תכנת את התרמוצילר ואת המכסה שלו ל 65 °C (65 °F).
    2. שלפו את הדגימות מ-70 מעלות צלזיוס ודגרו אותן בתרמוציקלר למשך 2.5 דקות.
    3. סובב ב-21,000 × גרם במשך 30-40 שניות.
    4. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 2.5 דקות.
    5. העבר אותם מיד לקרח.
    6. סובבו ב-21,000 × גרם במשך 30-40 שניות והחזירו אותם לקרח.
  4. המרת RNA ל-cDNA:
    1. הוסף 0.8 μL של תערובת השעתוק ההפוכה לכל קצה זנב.
    2. אינקובציה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
    3. הושבתו בחום בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. העבירו אותו מיד לקרח.
    5. הוסיפו 10 μL של תערובת הגדילים השנייה לכל קצה זנב.
    6. הסט את הדוגמאות.
    7. סובבו ב-21,000 × גרם במשך 30-40 שניות.
    8. דגירה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  5. ניקוי cDNA:
    1. לפני המלחמה את חרוזי ניקוי הדנ"א לטמפרטורת החדר.
    2. אסוף עד 40 דגימות בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל (עד 480 μL).
    3. מערבבים את החרוזים עד שהם מפוזרים היטב ומוסיפים 20 μL של חרוזים ו-100 μL של מאגר קשירת חרוזים עבור כל 100 μL של הדגימה המאוגנת (עבור 480 μL של דגימה להוסיף 480 μL של מאגר חרוזים ו-96 μL של חרוזים לנפח סופי של עד 1,056 μL). מערבבים היטב על ידי צנרת.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    5. מניחים על מעמד מגנטי למשך 5 דקות לפחות עד שהנוזל נראה צלול.
    6. הסר והשליכו את כל ה-μL מלבד 20 μL של ה-supernatant.
    7. הוסיפו 200 μL של 80% אתנול שהוכן זה עתה.
    8. דגירה למשך 30 שניות לפחות, הסר את ה-supernatant על-ידי צנרתו מבלי להפריע לחרוזים. השליכו את הסופרנאטנט.
    9. חזור על שלבים 4.5.7 ו- 4.5.8 פעם אחת.
    10. מייבשים את החרוזים באוויר למשך 15 דקות או עד שהם יבשים לחלוטין.
    11. החייאת החרוזים (~6.4 μL) עם 6.4 μL של מים. ערבבו היטב על ידי צנרת כל הנפח למעלה ולמטה עשר פעמים.
    12. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    13. עבור ישר לתעתיק במבחנה (IVT).
  6. תעתיק ופיצול במבחנה:
    1. לצינור המכיל 6.4 μL של דגימה והחרוזים, הוסף את התערובת הבאה (9.6 μL בסך הכל): 1.6 μL של 10x T7 Buffer, 1.6 μL של ATP, 1.6 μL של UTP, 1.6 μL של CTP, ו-1.6 μL של GTP (כל dNTP בריכוז של 75 mM) אנזים 1.6 μLof T7.
    2. דגירה למשך 13 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אחיזה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף 6 μL של תמיסת אקסונוקלאז (הנפח הסופי צריך להיות 22 μL).
    4. דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    5. הניחו את הצינור בחזרה על הקרח והוסיפו 5.5 μL של מאגר פיצול (0.25 × נפח התגובה).
    6. אינקובציה למשך 3 דקות בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס.
    7. העבירו מיד את הצינור לקרח והוסיפו 2.75 μL של חיץ עצירת פיצול (0.5 × תוספת נפח של מאגר פיצול).
    8. הסר את החרוזים על ידי הנחת הצינור על המעמד המגנטי למשך 5 דקות לפחות עד שהנוזל נראה צלול.
    9. מעבירים את ה-supernatant לצינור חדש.
  7. ניקוי RNA מוגבר (aRNA):
    1. לפני חימום חרוזי ניקוי הרנ"א לטמפרטורת החדר.
    2. מערבבים את החרוזים עד שהם מתפזרים היטב.
    3. פיפטה 55 μL של חרוזים (1.8 × נפח תגובה).
    4. דגירו אותם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    5. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי לפחות 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    6. הסר והשליכו 80 μL של ה-supernatant.
    7. הוסף 200 μL של 70% אתנול מוכן טרי.
    8. דגירה במשך 30 שניות לפחות, הסר את הסופרנאטנט על ידי צנרת מבלי להפריע לחרוזים. השליכו את הסופרנאטנט.
    9. חזור על שטיפת האתנול פעמיים נוספות.
    10. מייבשים את החרוזים באוויר למשך 15 דקות או עד שהם יבשים לחלוטין.
    11. החייאת החרוזים עם 7 μL של מים. פיפט את כל עוצמת הקול למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב ביסודיות.
    12. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    13. מניחים את הצינור עם החרוזים על המעמד המגנטי למשך 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    14. מעבירים את ה-supernatant לצינור חדש.
      הערה: נקודת עצירה: ניתן לשמור דגימות בטמפרטורה של -70 °C (70 °F).
  8. אופציונלי: בדוק את כמות ואיכות ה- aRNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  9. הכנת הספרייה:
    1. ל-5 μL של RNA, הוסיפו 1 μL של פריימר הקספר RT אקראי של 100 μM (ראו טבלת החומרים) ו-0.5 μL של 10 mM dNTP.
    2. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הוסף 4 μL של התערובת הבאה בטמפרטורת החדר: 2 μL של מאגר גדיל ראשון, 1 μL של 0.1 M DDT, 0.5 μL של מעכב RNase, 0.5 μL של תעתיק הפוך.
    4. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    5. דגירה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת (בתנור הכלאה או במחזור תרמי שחומם מראש כאשר המכסה מוגדר ל-50 מעלות צלזיוס).
    6. דגירה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    7. העבר 5 μL לצינור חדש (שמור את שאר התגובה ב -20 °C ). הוסף 5.5 μL של מים אולטרה-אפורים, 1 μL של פריימר RNA PCR (RP1), 1 μL של פריימר RNA PCR (RPIX) באינדקס, ו-12.5 μL של תערובת PCR.
    8. השתמש בתוכנית הבאה על thermocycler: 30 s ב 98 ° C, 11 מחזורים של: (10 s ב 98 ° C, 30 s ב 60 ° C, 30 s ב 72 ° C), 10 דקות ב 72 ° C, להחזיק ב 4 ° C.
      הערה: נקודת עצירה: ניתן לשמור דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  10. ניקוי הספרייה:
    1. לפני המלחמה את חרוזי ניקוי הדנ"א לטמפרטורת החדר.
    2. מערבבים את החרוזים עד שהם מתפזרים היטב.
    3. הוסף 25 μL של החרוזים לתגובת ה- PCR. מערבבים היטב על ידי צנרת.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    5. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי לפחות 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    6. הסר והשליך 45 μL של ה-supernatant.
    7. הוסיפו 200 μL של 80% אתנול שהוכן זה עתה.
    8. דגירה למשך 30 שניות לפחות, הסרה והשלכה של ה-supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
    9. חזור על שטיפת האתנול פעם אחת.
    10. חרוזים יבשים באוויר במשך 15 דקות או עד שהם יבשים לחלוטין.
    11. שחזרו אותם עם 25 μL של מים. מערבבים היטב על ידי צנרת.
    12. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    13. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי במשך 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    14. העברת 25 μL של סופרנאטנט לצינור חדש.
    15. חזור על שלבים 4.10.2-4.10.10 פעם אחת.
    16. Resuspend עם 10.5 μL של מים. מערבבים היטב על ידי צנרת.
    17. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    18. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי במשך 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    19. מעבירים 10 μL של ה-supernatant לצינור חדש ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  11. הערך את איכות וכמות הספרייה בהתאם לדרישת מתקן הריצוף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר, קצות זנב בודדים של זכרים והרמפרודיטים ב-4 נקודות זמן (L3 22 שעות לאחר הבקיעה; L4 24, 26 ו-28 שעות לאחר הבקיעה) הוכנו לריצוף RNA באמצעות פרוטוקול CEL-Seq2. פריימרים CEL-Seq2 מכילים ברקודים ייחודיים המאפשרים לזהות קריאות ריצוף מדגימה מסוימת (במקרה זה קצה זנב בודד) באופן ביואינפורמטי. נתוני ריצוף נוצרו בשיטה זו עבור סך של 557 קצוות זנב (266 הרמפרודיטים ו-291 זכרים על פני 4 נקודות זמן התפתחותיות, 59-78 זנבות לכל מין ונקודת זמן). ברקודים CEL-Seq2 שוחזרו עבור 97% (כלומר, 543) מקצות הזנב הללו (טבלה משלימה S2). עבור רוב הספריות, שיעור ההתאוששות היה 99-100%; עם זאת, זה היה 88% עבור נקודת זמן גברית אחת. ראוי לציין כי כמחצית מקצות הזנב הזכרים מנקודות הזמן של 22, 24 ו -28 שעות אוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס במשך כ -4 חודשים עקב עיכובים הקשורים ל- COVID-19. זה מדגים כי בעוד שזה אידיאלי להכין ספריות ריצוף זמן קצר לאחר הדגימה, ניתן לאחסן דוגמאות מנותחות במשך זמן רב יותר לפני הכנת הספרייה.

פריימרי CEL-Seq2 מוסיפים גם UMI לכל תעתיק mRNA. זה מאפשר הסרה כפולה של PCR וכימות מדויק של ביטוי גנים בדגימה. מספר ה-UMIs השתנה באופן דרמטי על פני קצות הזנב (איור 4; ממוצע זכר = 92,560; מינימום זכר = 155; מקסימום זכר = 1,183,998; הרמפרודיטים ממוצעים = 67,597; הרמפרודיטים מינימום = 132; הרמפרודיטים מקסימום = 630,427). עבור ספירת UMI לכל קצה זנב, ראה טבלה משלימה S3. בשל הכמות הנמוכה של RNA קלט להכנת ספרייה של תא יחיד, נתוני ריצוף חד-תאיים ידועים כבעלי כמות גדולה של רעש טכני. לפיכך, מומלץ לסנן דגימות שיש להן ספירות UMI נמוכות מאוד או גבוהות מאוד לפני ניתוח24.

חבילת R powsimR25 שימשה להערכת העוצמה הסטטיסטית ודרישות גודל המדגם לאיתור אמין של גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DE) בניסויי RNA-seq חד-תאיים או בתפזורת. הפרמטרים להדמיות התבססו על מערך נתוני ריצוף של 70 קצות זנב זכר בודדים (בנקודת הזמן של 24 שעות) שהתקבלו בשיטה המתוארת כאן. השינויים הצפויים בקיפול הלוג התבססו על תוצאות מניסוי נפרד של RNA-seq שאיגד 80-100 קצוות זנב. ההדמיות קבעו כי לנתונים בעלי קצה זנב יחיד יש מספיק כוח (True Positive Rate = TPR) כדי לזהות גנים של DE, למעט גנים בעלי ערך ביטוי ממוצע נמוך מאוד (החלק העליון של איור 5; קו מקווקו מייצג 80% TPR). הוספת קצוות זנב מדומים יותר לכל נקודת זמן הגדילה במקצת את ההספק עבור גנים בעלי ביטוי נמוך. דפוס דומה נראה עבור שיעור גילוי שווא (FDR). FDR הוא גבוה (>0.10) עבור הגנים המתבטאים נמוך; עם זאת, עבור גנים בעלי ביטוי גבוה יותר, הוא נופל על הניתוק הנומינלי של 0.10 או מתחתיו (קו מקווקו עבור FDR בתחתית איור 5). לסיכום, הגדלת מספר הזנבות שנדגמו לכל נקודת זמן מעל 70 תעשה מעט כדי להוריד את ה-FDR או להגדיל את ההספק. עם זאת, 70 קצות זנב מספקים FDR נמוך בהרבה וכוח חזק יותר מ-30 קצות זנב.

Figure 1
איור 1: סקירת פרוצדורה לסנכרון של קאנורהבדיטיס אלגנס עם שיטת הבקיעה ומיקרו-הבחנה בלייזר של קצות הזנב. קיצורים: L1-L4 = שלבי הזחל 1 עד 4; PEN = פוליאתילן נפטלט; LMD = מיקרו-דיסקציה של לייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הופעתם של הרמפרודיטים וזכרים מסוג C. elegans L3 תחת מיקרוסקופ דיסקציה. ניתן להבחין בהרמפרודיטים (A, B) ובזכרים (C, D) בשעה 21-23 שעות לאחר הבקיעה תחת מיקרוסקופ דיסקציה (הגדלה של פי 50~ ) על ידי המורפולוגיה של זנבותיהם (חצים). זנב ההרמפרודיטים צר, ואילו זה של הזכרים נפוח ונראה צלול. סרגלי קנה מידה = 0.1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מראה מבנה ההחלקה של ממברנת PEN וזנב התולעת. המיקוד נכון לניתוח הרקמה הנצפית בעדשת 20x (A) ו-40x (B) במיקרוסקופ. (C) זנב מנותק וחתך חלקית את קרום PEN. לאחר סגירת הפער בחתך, חתיכת הממברנה תצנח לתוך מכסה הצינור שמתחת למגלשה. (D) מכסה צינור עם מקטע ממברנת PEN המכיל קצה זנב מנותח. סרגלי קנה מידה = 0.1 מ"מ (A-C), 1 מ"מ (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: ספירת UMI טבעית שעברה טרנספורמציה ביומן לכל קצה זנב בודד עבור נקודות זמן ומינים שונים. RNA מזנבות בודדים הוכן לריצוף בשיטת CEL-Seq2; 557 זנבות רוצפו בסך הכל, עם 59-78 זנבות לכל מין ונקודת זמן. חריגות UMI נמוכות וגבוהות במיוחד יוסרו מהנתונים לפני הניתוח. קיצור: UMI = מזהה מולקולרי ייחודי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות של ניתוח כוח אחורי באמצעות סימולציות עם powsimR. תוכנת powsimR קובעת את מספר הדגימות הבלתי תלויות הנדרשות לאיתור גנים של DE ברמות ביטוי שונות. גנים נקשרים על ידי ביטוי ממוצע המומר כיומן הטבעי של ספירת UMI. (A) כוח (TPR) לזהות גנים של DE בין שני מצבים (כאן, זכר לעומת הרמפרודיט) עבור ארבע סימולציות שונות (גרפים בצבעים שונים) המשלבות גדלי מדגם שונים (מספרים של קצות זנב בודדים) לכל מצב. קו מקווקו מציין 80% TPR. (B) FDR באותן ארבע סימולציות כמו ב-(A), קו מקווקו המציין 10% FDR. הגרפים מראים כי גודל מדגם של 70 קצות זנב (ירוק) לכל מצב מספיק לאיתור גנים של DE, למעט גנים עם רמות ביטוי נמוכות מאוד. כלומר, לא ניתן לשפר מאוד את העוצמה ואת קצב הגילוי הכוזב של גנים כאלה על ידי הגדלת גודל המדגם מעבר ל-70. קיצורים: DE = מבוטא באופן דיפרנציאלי; UMI = מזהה מולקולרי ייחודי; TPR = שיעור חיובי אמיתי; FDR = שיעור גילוי שווא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה S1: רצפים של פריימרים המשמשים בפרוטוקול CEL-Seq2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S2: טיפים זנב בודדים שנדגמו לעומת התאוששו. פריימרים CEL-Seq2 מכילים ברקודים ייחודיים המאפשרים זיהוי של קריאות ריצוף מכל דגימה לזיהוי ביואינפורמטי. הקריאות נמצאו מ-97% מדגימות קצה הזנב שהוכנו לריצוף. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S3: UMI סופר את כל הדגימות עם ברקודים משוחזרים, כפי שצוין בטבלה משלימה S2. קיצור: UMI = מזהה מולקולרי ייחודי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים של השיטה
אם תבוצע כראוי, השיטה המתוארת כאן תשיג פרופילי RNA חזקים עם מספר קטן יחסית של דגימות שנותחו בלייזר (70 קצות זנב בדוגמה זו). עם זאת, עבור דגימות מבעלי חיים מתפתחים, סנכרון הדוק הוא קריטי לצמצום השונות בין הדגימות. מסיבה זו, הפרוטוקול ממליץ על שיטת הבקיעה לסנכרון תולעים. כאן, החוקר יכול לקבוע ולשלוט במדויק על הפרש הגילאים בין אנשים (1 שעה בפרוטוקול הנוכחי). בנוסף, שיטת הבקיעה חלה על כל מין, גם אם העוברים רגישים להלבנה, L1 אינם נעצרים, או שההחלמה ממעצר L1 משתנה. לצורך סנכרון מוצלח על ידי הבקיעה, שלבי הכביסה הם קריטיים: יש להסיר את כל הבוגרים והזחלים בתחילת תקופת הבקיעה, ואין לשטוף עוברים יחד עם L1 שזה עתה בקע בסוף תקופת הבקיעה. זה מצליח רק אם משטח האגר של הצלחת אינו ניזוק על ידי סדקים, חורים או בועות, מדשאת החיידקים בצלחת טרייה ולא עבה מדי, והנוזל מתווסף ומתסיס רק בעדינות רבה.

אם יש לקבל נתונים בנפרד עבור זכרים והרמפרודיטים/נקבות, חשוב גם זיהוי אמין של המינים. הבחנה בין זחלי L3 לפי מין (ראו איור 2) דורשת ניסיון. מומלץ לתרגל בחירת זכרי L3 והרמפרודיטים/נקבות ולבדוק את אחוזי ההצלחה לאחר שהחיות התפתחו לבוגרים והמינים נבדלים בקלות. לאחר RNA-Seq של רקמה בודדת, ניתן לזהות את החריגים גם על ידי ניתוח רכיבים עיקריים ולהסירם, במידת הצורך.

להתאוששות מוצלחת של דגימות שנחתכו בלייזר, חשוב להפחית את החשמל הסטטי ככל האפשר. חתיכות ממברנה PEN טעונות לרוב אינן נופלות לתוך מכסה הצינור אלא נדבקות למגלשה או לכל חלק אחר של המיקרוסקופ. תרופה אחת היא העלאת הלחות בחדר ובמיוחד סביב המיקרוסקופ על ידי הנחת מכשיר אדים קטן ליד הבמה. בנוסף, ניתן לטפל במגלשות הממברנה באמצעות אור UV. כדי לעשות זאת, דגירה מחליקה בתא CROSSLINK UV-C (254 ננומטר) ומספקת לפחות ג'אול אחד של אנרגיה, או חושפים את השקופיות לאור ה- UV בספסל זרימת אוויר למינרי למשך 30 דקות.

מכיוון שמטרת הפרוטוקול היא RNA-Seq, שמירה על סביבת עבודה ללא RNase היא קריטית. החל מפתרון הקיבעון, ריאגנטים, מיכלים וחומרים מתכלים צריכים להיות נטולי RNase, משטח העבודה צריך להיות מפורק, והחוקרים צריכים ללבוש כפפות נקיות. יש להקפיא את הדגימות המנותחות בהקדם האפשרי ולשמור אותן בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. מומלץ גם להשתמש בצינורות שמירה נמוכים וטיפים עבור החלק CEL-Seq2 של הפרוטוקול.

המאמר הנוכחי מספק רק מתווה בסיסי של פרוטוקול CEL-Seq2, שפורסם בעבר על ידי מפתחיו עם הערות מועילות וטיפים17,18. מומלץ להתייעץ עם פרסומים אלה לפני השימוש בשיטת CEL-Seq2.

ניתן לאמת את נתוני LMD-RNA-Seq על ידי הכלאה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת-RNA באתרה (smRNA FISH)26,27,28. smRNA FISH נמצא בשימוש נרחב ב- C. elegans והוא מקובל על מינים אחרים של נמטודות, בשונה מ- immunostaining עם נוגדנים קיימים (אשר עשויים שלא להצליב) או הכנסת כתבים שעתוק באמצעות טרנסגנזה. זה האחרון עובד היטב ב- C. elegans ובכמה מינים קשורים של Caenorhabditis 29, אך טרנסגנזה יכולה להיות מאתגרת יותר במינים אחרים של נמטודות30,31.

מגבלות השיטה
השיטה המתוארת כאן פועלת היטב לאיסוף קצות הזנב, רקמה דקה בקצה התולעת. ניתוח רקמות באמצע העבה יותר של זחלים מבוגרים או מבוגרים הוא מאתגר יותר. התוכנה של המכשיר המשמש כאן כוללת הגדרה עבור חתכים מרובים הממוקמים ברמות עמוקות יותר לאחר מכן ברקמה. הגדרה זו יכולה לשמש לחיתוך אזורים עבים יותר של החיה. מכיוון שיש לתקן את התולעים לפני הנתיחה, קשה לראות פרטים מבניים, מה שמונע כריתה מדויקת של מבנים קטנים ספציפיים. כאמור, LMD-RNA-Seq אינה שיטת HTP. עם זאת, 50-70 דגימות ניתן לנתח אחר הצהריים אחד.

משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות
ניתן להשתמש ב-LMD-RNA-Seq בכל מין גם אם אין כלים מהונדסים זמינים. שיטות אחרות מסתמכות על מיון FACS של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי 8,9,32 או בידוד של גרעינים מסומנים33,34 ולכן דורשות בעלי חיים מהונדסים. שיטות המנתקות ומבודדות תאים ב- C. elegans פוסט-אמבריוניים נוטות לפספס את הרקמות בשני הקצוות של התולעת (דילן רהה, תקשורת אישית). על אזהרות אלה מתגברים על ידי שילוב של RNA-Seq חד-תאי עם קריוזקטיזציה של תולעים שלמות (טומוגרפיה של RNA)35. שיטה זו שימשה להשוואת ביטוי גנים מרחבי בין C. elegans לבין נמטודה רבדיטית אחרת, Pristionchus pacificus36. לחלופין, ניתן להתנסות בתולעים משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). חומר כזה שימש בהצלחה עבור RNA-Seq בעקבות LMD של דגימות רקמת יונקים37. עם זאת, טומוגרפיה RNA ו- LMD של תולעי FFPE מוגבלים לניתוח של קומץ בעלי חיים בלבד. הם, אם כן, אינם מתאימים למחקר של ביטוי גנים דינמי ברקמות מתפתחות כמו LMD-RNA-Seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי NIH (R01GM141395) ומענקי NSF (1656736) למלגת DF ו- NIH (F32GM136170) ל- AW. איור 1 נוצר בעזרת BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free Leica 11600288 for LMD
500 µL PCR tubes (nuclease-free) Axygen 732-0675 to cut the tail tips into
Compound microscope with 40x objective and DIC any to check age of worms
Desktop humidifier any
Dissection microscope with transmitted light base any for all worm work
glass pasteur pipets any handle of worm pick
glass slides and coverslips any to check age of worms
LMD6 microdissection system Leica multiple to cut tail tips
LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf 22431005
M9 Buffer Recipe in WormBook
Methanol 99.8% Sigma 322415 to fix worms
NGM growth medium US Biological N1000 Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook
P10 pipette variablle volume e.g. Gilson
P1000 pipette variable volume e.g. Gilson
P2 pipette variable volume e.g. Gilson
Pipette tips 1,000 µL any
Pipette tips 1-10 µL filtered any
platinum iridium wire Tritech PT-9010 to make worm pick
sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes any
Tween 20 Sigma P9416 Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips
vented 6 mm plastic Petri dishes any
For CEL-Seq2
4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection Aligent automated electrophoresis system
AMPure XP beads Beckman Coulter A63880 DNA cleanup beads
Bead binding buffer  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (see Table S1) Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf 6335000020 Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes.
DNA Polymerase I (E. coli) Invitrogen 18052-025
dNTP mix 10 mM any
E. coli DNA ligase Invitrogen 18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up Affymetrix 78200 exonuclease solution
MEGAscript T7 Transcription Kit Ambion AM1334 For step 4.6.1
Nuclease-free water any
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531 PCR mix step 4.9.7
random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
NNNNNN		 IDT a primer with 6 nucleotides that are random
RNA Fragmentation buffer NEB E6150S
RNA Fragmentation stop buffer NEB E6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) Illumina, NEB, or IDT RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina
RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant Thermo Scientific 7000TS1 or any other similar product
RNaseH (E. coli) Invitrogen 18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 10777-019
Second strand buffer Invitrogen 10812-014
Superscripit II Invitrogen 18064-014 reverse transcriptase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).
  2. Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. Nematode model systems in evolution and development. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).
  3. WormBase. , Available from: https://wormbase.org/#012-3-6 (2022).
  4. WormAtlas. , Available from: https://wormatlas.org (2022).
  5. WormBook. , Available from: http://wormbook.org (2022).
  6. WormBook in Genetics. , Available from: https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook (2022).
  7. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  8. Kaletsky, R., Murphy, C. T. Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age. Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).
  9. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  10. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
  11. Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications. Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).
  12. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome Biology. 8 (7), 135 (2007).
  13. Baugh, L. R., et al. The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo. Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).
  14. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).
  15. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505 (2011).
  16. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  17. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  18. Yanai, I., Hashimshony, T. CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification. Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).
  19. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
  20. Baugh, L. R. To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest. Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).
  21. Baugh, L. R., Hu, P. J. Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle. Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).
  22. Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).
  23. Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage. BMC Developmental Biology. 15, 26 (2015).
  24. Lytal, N., Ran, D., An, L. Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey. Frontiers in Genetics. 11, 41 (2020).
  25. Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).
  26. Bolkova, J., Lanctot, C. Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH. Methods. 98, 42-49 (2016).
  27. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  28. Lee, C., et al. Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (12), 2357 (2017).
  29. Baird, S. E., Chamberlin, H. M. Caenorhabditis briggsae methods. WormBook. , 1-9 (2006).
  30. Felix, M. A. Oscheius tipulae. WormBook. , 1-8 (2006).
  31. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  32. Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae. MethodsX. 7, 100922 (2020).
  33. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
  34. Steiner, F. A., Henikoff, S. Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals. Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).
  35. Ebbing, A. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).
  36. Rödelsperger, C., et al. Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).
  37. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).

Tags

ביולוגיה גיליון 181
מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. … More

Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. S., Herrera, R. A., Fitch, D. H. A. Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications. J. Vis. Exp. (181), e63666, doi:10.3791/63666 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter