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Biology

प्रजातियों-अज्ञेयवादी एकल-ऊतक अनुप्रयोगों के लिए लेजर माइक्रोडिसेक्शन

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63666
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Center for Developmental Genetics, New York University, 2Sacred Heart University, 3Baylor School

Summary

एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो आरएनए-अनुक्रमण के लिए व्यक्तिगत सूत्रकृमि ऊतकों को अलग करने के लिए लेजर माइक्रोडिसेक्शन का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल को प्रजाति-विशिष्ट आनुवंशिक टूलकिट की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की तुलना एकल-ऊतक नमूनों के स्तर पर विभिन्न प्रजातियों के बीच की जा सकती है।

Abstract

एकल-कोशिका पद्धतियों ने विशिष्ट सेल प्रकारों के ट्रांसक्रिप्टोम के विश्लेषण में क्रांति ला दी है। हालांकि, उन्हें अक्सर प्रजाति-विशिष्ट आनुवंशिक "टूलकिट" की आवश्यकता होती है, जैसे कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन की ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति चलाने वाले प्रमोटर। इसके अलावा, प्रोटोकॉल जो व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करने के लिए ऊतकों को बाधित करते हैं, अपने मूल वातावरण (जैसे, पड़ोसियों से सिग्नलिंग) से कोशिकाओं को हटाते हैं और इसके परिणामस्वरूप तनाव प्रतिक्रियाएं या देशी जीन अभिव्यक्ति राज्यों से अन्य अंतर हो सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) को पुरुष पूंछ टिप मॉर्फोजेनेसिस के दौरान जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए व्यक्तिगत सूत्रकृमि पूंछ युक्तियों को अलग करने के लिए अनुकूलित किया गया है।

एलएमडी सेलुलर व्यवधान या प्रजाति-विशिष्ट टूलकिट की आवश्यकता के बिना जानवर के एक हिस्से के अलगाव की अनुमति देता है और इस प्रकार किसी भी प्रजाति पर लागू होता है। इसके बाद, एकल-कोशिका आरएनए-सेक लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल जैसे कि सीईएल-सेक्यू 2 को एलएमडी-पृथक एकल ऊतकों पर लागू किया जा सकता है और मानक पाइपलाइनों का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है, यह देखते हुए कि प्रजातियों के लिए एक अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम उपलब्ध है। इस तरह के डेटा का उपयोग यह स्थापित करने के लिए किया जा सकता है कि ट्रांसक्रिप्टोम कितने संरक्षित या अलग हैं जो विभिन्न प्रजातियों में उस ऊतक के विकास को रेखांकित करते हैं।

सीमाओं में ब्याज के ऊतक और नमूना आकार को काटने की क्षमता शामिल है। एक शक्ति विश्लेषण से पता चलता है कि 80% शक्ति के लिए प्रति स्थिति 70 पूंछ युक्तियों की आवश्यकता होती है। एक ही विकास चरण में जानवरों की इस संख्या को प्राप्त करने के लिए विकास के तंग सिंक्रनाइज़ेशन की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, 1 घंटे के अंतराल पर जानवरों को सिंक्रनाइज़ करने की एक विधि का भी वर्णन किया गया है।

Introduction

नेमाटोड- विशेष रूप से मॉडल सिस्टम कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस से संबंधित रैबडिटिड नेमाटोड- कई कारणों से विकासवादी विकासात्मक जीव विज्ञान (ईडीबी) के लिए जानवरों का एक अद्भुत समूह है 1,2. लाभ में उनकी छोटी संख्या में कोशिकाएं, परिभाषित और सुसंगत सेल वंश, पारदर्शिता और संस्कृति और पालन में आसानी शामिल है। कई संसाधन भी उपलब्ध हैं, जिनमें कई प्रजातियों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले जीनोम शामिल हैं, और सी एलिगेंस के लिए, व्यापक आणविक आनुवंशिक उपकरण और विकास, आनुवंशिकी, शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान के बारे में ज्ञान 3,4,5,6।

कई अन्य जीवों की तरह, एकल ऊतकों या एकल कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्टोम गतिशीलता को चिह्नित करने की क्षमता ने सी एलिगेंस 7,8,9,10 में विकास के विश्लेषण में क्रांति ला दी है। नेमाटोड में एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोम की तुलना करने में सक्षम होने के नाते इन जीवों का उपयोग करके ईडीबी को इसी तरह बदल दिया जाएगा। उदाहरण के लिए, इस तरह की तुलना इस बात की अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी कि जीन नियामक नेटवर्क उन पात्रों (लक्षणों) के लिए कैसे विकसित हुए हैं जिन्हें संरक्षित किया गया है, उन पात्रों के लिए जो अलग हो गए हैं, या उन पात्रों के लिए जो स्वतंत्र रूप से विकसित हुए हैं।

हालांकि, नेमाटोड से विशेष ऊतकों या कोशिकाओं को अलग करना बड़ी चुनौतियों में से एक है। कई जीवों के लिए, एकल कोशिकाओं को ऊतकों से अलग किया जा सकता है और निष्पक्ष तरीके से काटा जा सकता है या फ्लोरोसेंट प्रोटीन की ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ लेबल किया जा सकता है और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 11 द्वारा क्रमबद्ध किया जा सकता है। एलिगेंस में, कोशिकाओं के उच्च-थ्रूपुट (एचटीपी) अलगाव को ज्यादातर भ्रूण तक सीमित कर दिया गया है क्योंकि कठिन बाहरी छल्ली (और हाइड्रोस्टैटिक कंकाल) ने लार्वा और वयस्कों से सेल अलगाव में बाधा डाली है। इस चुनौती को पाने के लिए, कुछ तरीकों ने पूरे सी एलिगेंस कीड़े में आनुवंशिक उपकरण नियोजित किए हैं, जैसे ऊतक-विशिष्ट एमआरएनए-टैगिंग12, और सेल प्रकार13 को प्रभावित करने वाले जंगली प्रकार और म्यूटेंट के बीच अंतर अभिव्यक्ति तुलना। अधिक हाल के तरीकों ने नाभिक14 या पूरी कोशिकाओं 8,9,15 को अलग करने के लिए छल्ली को भंग करके चुनौती को दूर किया है। सेल अलगाव और सेल संस्कृति के स्पष्ट नुकसान हैं, हालांकि, कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक विकास या शारीरिक संदर्भ से हटा दिया जाता है- उदाहरण के लिए, सेल-सेल सिग्नलिंग से दूर और बाह्य मैट्रिक्स के साथ संपर्क- जो जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल15 को प्रभावित करने की उम्मीद है। इसके अलावा, आनुवंशिक उपकरण और ऊतक-विशिष्ट मार्कर प्रजाति-विशिष्ट हैं (यानी, उनका उपयोग केवल सी एलिगेंस में किया जा सकता है)।

एलएमडी कोशिकाओं के प्राकृतिक संदर्भ को बाधित किए बिना ऊतकों को अलग करने के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करता है। ईडीबी के लिए महत्वपूर्ण रूप से, एलएमडी विभिन्न प्रजातियों के समरूप ऊतकों से ट्रांसक्रिप्टोम की तुलना प्रजाति-विशिष्ट आनुवंशिक टूलकिट की आवश्यकता के बिना करने की अनुमति देता है यदि इन प्रजातियों के जीनोम या पूरे ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रम उपलब्ध हैं। एलएमडी में प्रत्यक्ष माइक्रोस्कोपिकल अवलोकन द्वारा ऊतकों को लक्षित करना और माइक्रोस्कोप के प्रकाशिकी में एकीकृत लेजर माइक्रोबीम का उपयोग करना शामिल है- ब्याज के ऊतक को काटने और फसल (कैप्चर) करने के लिए16. एलएमडी की सीमाएं हैं कि यह बहुत एचटीपी दृष्टिकोण के लिए अनुकूल नहीं है (हालांकि पूंछ युक्तियों के लिए प्रतिलेखन प्रोफाइल, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, ~ 70 नमूनों के साथ मजबूत थे), कुछ नमूनों को विच्छेदन करना मुश्किल हो सकता है, और कटौती लेजर की सटीकता तक सीमित है और माइक्रोस्कोप में क्या कल्पना की जा सकती है।

वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह वर्णन करना है कि एलएमडी, एकल-ऊतक आरएनए-सेक के बाद, नेमाटोड से चरण- और ऊतक-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोम डेटा प्राप्त करने के लिए कैसे इस्तेमाल किया जा सकता है। विशेष रूप से, यह चौथे चरण के लार्वा (एल 4) से पूंछ युक्तियों को अलग करने के लिए एलएमडी को प्रदर्शित करता है सी। हालांकि, इस विधि को अन्य ऊतकों और निश्चित रूप से, विभिन्न प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

एलिगेंस में, 4 कोशिकाएं होती हैं जो पुरुषों और हेर्मैफ्रोडाइट्स दोनों में पूंछ टिप बनाती हैं। पुरुषों में एल 4 चरण के दौरान- लेकिन हेर्मैफ्रोडाइट्स में नहीं- पूंछ टिप कोशिकाएं अपना आकार बदलती हैं और पूर्वकाल और अंदर की ओर पलायन करती हैं। यह प्रक्रिया कुछ में भी होती है लेकिन अन्य सभी रैबडिटिड नेमाटोड प्रजातियों में नहीं। इसलिए, पूंछ टिप यौन द्विरूपी मॉर्फोजेनेसिस के विकास के लिए एक अच्छा मॉडल है। इसकी स्थिति के कारण, पूंछ की नोक को एलएमडी द्वारा अलग करना भी आसान है।

पूंछ युक्तियों से ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल सीईएल-सेक्यू 2 का उपयोग करता है, एकल कोशिकाओं17,18 के लिए विकसित एक आरएनए-सेक विधि। इस विधि में एलएमडी-व्युत्पन्न ऊतकों के लिए कई फायदे हैं। सीईएल-सेक्यू 2 अत्यधिक संवेदनशील और कुशल है, अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं (यूएमआई) का उपयोग करके एमआरएनए पढ़ने के सरल परिमाणीकरण की अनुमति देने के लिए, रैखिक प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में, और बारकोडिंग जो व्यक्तिगत ऊतक नमूनों के मल्टीप्लेक्सिंग की अनुमति देता है। सीईएल-सेक्यू 2 की एकमात्र सीमा यह है कि पुनर्प्राप्त रीड एमआरएनए के 3 'अंत के पक्षपाती हैं, और इस प्रकार अधिकांश आइसोफॉर्म को प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है।

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Protocol

1. कृमि सिंक्रनाइज़ेशन

नोट: सी एलिगेंस और अन्य रैबडिटिड प्रजातियों के विकास को सिंक्रनाइज़ करने के लिए नीचे दो तरीकों का वर्णन किया गया है।

  1. क्षारीय हाइपोक्लोराइट (ब्लीच) उपचार के बाद पहले लार्वा चरण (एल 1) गिरफ्तारी द्वारा सिंक्रनाइज़ करें।
    नोट: इस विधि को पहले विस्तार से19 में वर्णित किया गया था। यह विधि सी एलिगेंस की दो विशेषताओं पर निर्भर करती है जो कई अन्य रैबडिटिड प्रजातियों के लिए भी सच हैं: (1) अंडे का छिलका ब्लीच के लिए प्रतिरोधी है, जबकि वयस्क और लार्वा कीड़े के आसपास का छल्ली नहींहै।
    1. ग्रेविड हेर्मैफ्रोडाइट्स (या मादाओं) को उनके छल्ली को तोड़ने और भ्रूण जारी करने के लिए एक पतला ब्लीच समाधान के साथ इलाज करें।
    2. भ्रूण को ब्लीच से निकालें और उन्हें भोजन के बिना रखें जब तक कि सभी एल 1 नहीं निकल जाते।
    3. गिरफ्तार एल 1 को भोजन पर रखें, जहां सभी एक ही समय में विकास को फिर से शुरू करते हैं।
      नोट: L1 गिरफ्तारी से बाहर निकलें एक घंटे के भीतर हो सकता है।
  2. "हैच-ऑफ" विधि के साथ सिंक्रनाइज़ेशन (यहां उपयोग किया जाता है; चित्र 1 शीर्ष):
    नोट: हैच-ऑफ विधि विकास के व्यवधान के बिना तंग सिंक्रनाइज़ेशन की अनुमति देती है (एल 1 गिरफ्तारी बाद के चरणों21 के विकास को भी प्रभावित करती है)। प्रोटोकॉल काली मिर्च एट अल 22 से अनुकूलित है। इस पद्धति का उद्देश्य एल 1 को इकट्ठा करना है जो एक प्लेट से एक विशिष्ट अवधि में रचा गया है जिसमें केवल भ्रूण होते हैं।
    1. माताओं को चुनें: हैच-ऑफ करने से पहले शाम को, ई कोलाई ओपी 50 के साथ वरीयता प्राप्त प्लेट पर ~ 30 ग्रेविड हेर्मैफ्रोडाइट्स चुनें।
    2. रात भर अंडे देने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: दरारें या बुलबुले के बिना एक प्लेट चुनें जहां कीड़े अटक सकते हैं। बहुत मोटी बैक्टीरिया लॉन वाली प्लेटों से बचें क्योंकि बाद में सभी कीड़े को हटाना मुश्किल होगा। यदि तापमान-संवेदनशील तनाव के साथ काम कर रहे हैं, तो लंबे भ्रूणजनन के लिए अंडे देने के समय को समायोजित करें। अधिकतम अंडे देने के चरण में माताओं को चुनें।
    3. माताओं और लार्वा निकालें: अगली सुबह, विदारक माइक्रोस्कोप (20x आवर्धन) के तहत, धीरे विभुक 1-2 एमएल एम 9 बफर बिना फुहार के बिना प्लेट की दीवार के खिलाफ; कीड़े को हटाने के लिए प्लेट को घुमाएं।
    4. पोकिंग छेद से बचने के लिए अगर के किनारे पर प्लेट की दीवार के खिलाफ पिपेट टिप रखकर सभी तरल और कीड़े निकालें और त्यागें। जांचें कि प्लेट पर कोई कीड़े (और केवल अंडे / भ्रूण) नहीं बचे हैं, विशेष रूप से एल 1 नहीं; अन्यथा, धोने को दोहराएं।
    5. प्लेट को 1 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें और कुछ एल 1 एस हैच करने की प्रतीक्षा करें।
    6. नए रचे हुए एल 1 एस लीजिए: ध्यान से अगर पर 1 एमएल एम 9 बफर ड्रॉप करें। एल 1 को हटाने के लिए प्लेट को घुमाएं लेकिन भ्रूण नहीं। धीरे पिपेट बफर और कीड़े एक 1 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में।
    7. ~ 18,000 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    8. पिपेट एल 1 सीधे एक वरीयता प्राप्त प्लेट के जीवाणु लॉन पर। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सत्यापित करें कि कोई वयस्क कीड़े या भ्रूण मौजूद नहीं हैं।
    9. कीड़े को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि वे वांछित चरण में विकसित न हो जाएं।
      नोट: यदि स्थितियां इष्टतम हैं, तो एल 1 के दो और बैचों को एक ही प्लेट से एकत्र किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रारंभिक प्लेट का निरीक्षण करें कि कोई एल 1 मौजूद नहीं है। यदि आवश्यक हो, तो फिर से धो लें। चरण 1.2.5-1.2.9 दोहराएँ।
    10. विकास के समय की जाँच करें। डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन पर आगे बढ़ने से पहले, 400x आवर्धन पर एक यौगिक माइक्रोस्कोप के तहत कुछ कीड़े का निरीक्षण करें ताकि यह पुष्टि हो सके कि वे वांछित विकास चरण तक पहुंच गए हैं, यहां एल 3।
      नोट: डिस्टल टिप कोशिकाओं या लिंकर कोशिकाओं की माइग्रेशन दूरी का उपयोग वल्वा विकास के अलावा एक गाइड के रूप में किया जा सकता है। वल्वा विकास के लिए, मॉक एट अल .23 एक उपयोगी मार्गदर्शिका प्रदान करता है, हालांकि उस अध्ययन में समय 20 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित किया गया था। 25 डिग्री सेल्सियस पर, जंगली प्रकार के सी एलिगेंस हैचिंग के बाद एल 3-एल 4 मोल्ट 24 घंटे से गुजरेंगे।

2. एल 4 पुरुषों और हेर्मैफ्रोडाइट्स और निर्धारण को इकट्ठा करना

  1. निर्धारण से पहले आरएनएएसई मुक्त, ठंडा (-20 डिग्री सेल्सियस), 70% मेथनॉल तैयार करें।
  2. 30-50x आवर्धन पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, अलग-अलग अनदेखी प्लेटों पर सिंक्रनाइज़ेशन प्लेटों से पुरुषों और हेर्मैफ्रोडाइट्स को चुनना शुरू करें जैसे ही लिंगों को प्रतिष्ठित किया जा सकता है (~ 21 घंटे हैचिंग के बाद, चित्रा 2), और 1-2 घंटे के लिए या 200 जानवरों को एकत्र करने तक चुनना जारी रखें।
  3. कीड़े को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि वे प्रयोग के लिए वांछित चरण तक न पहुंच जाएं।
  4. 0.01% डिटर्जेंट युक्त एम 9 बफर के साथ पहले से धोए गए एक पिपेट टिप का उपयोग करके एम 9 बफर के 1-2 एमएल के साथ प्लेट से कीड़े धो लें (कीड़े को टिप से चिपकने से रोकने के लिए)।
  5. कीड़े को 1 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. कीड़े गोली करने के लिए 21,000 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए स्पिन। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  7. एम 9 बफर के 1 एमएल जोड़ें और गोली को तोड़ने के लिए मिश्रण करें।
  8. कीड़े गोली करने के लिए 21,000 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए स्पिन। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  9. धोने को दोहराएं।
  10. बर्फ-ठंडा 70% मेथनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  11. कीड़े गोली करने के लिए 21,000 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए स्पिन। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  12. चरण 2.10 और 2.11 दोहराएँ।
  13. 70% मेथनॉल के 500 μL जोड़ें, मिश्रण, और रात भर के लिए 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. लेजर माइक्रोडिसेक्शन

नोट: यहां से, आरएनएएसई मुक्त अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग करें; फ़िल्टर युक्तियों का उपयोग करें।

  1. यदि नमूनों को संसाधित करने के लिए सीईएल-सेक्यू 2 विधि का उपयोग किया जाता है, तो प्रत्येक सीईएल-सेक्यू 2 प्राइमर (पूरक तालिका एस 1) के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें: सीईएल-सेक्यू 2 प्राइमर के पिपेट 2 μL, 10 एमएम डीएनटीपी के 1 μL, और 1% β-मर्काप्टोएथेनॉल (आरएनएएसई-मुक्त पानी में) के 9 μL एक लेबल 200 μL ट्यूब में।
  2. स्लाइड पर माउंट करना
    1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक पॉलीथीन नेफ्थेलेट (पेन) -झिल्ली ग्लास स्लाइड (जहां झिल्ली है) के मैट पक्ष पर निश्चित कीड़े (चरण 2.13 से 20-40 कीड़े) के पिपेट 20 μL।
    2. मेथनॉल के वाष्पित होने की प्रतीक्षा करें। वाष्पीकरण को गति देने के लिए स्लाइड वार्मर का उपयोग करें।
      नोट: मेथनॉल की अतिरिक्त बूंदों को लागू किया जा सकता है, और एक पिपेट टिप का उपयोग कीड़े को फैलाने के लिए किया जाता है यदि वे सूखने के रूप में क्लंप करना शुरू करते हैं। जब कीड़े गुच्छों में होते हैं, तो उन्हें विच्छेदन करना मुश्किल हो सकता है।
  3. माइक्रोस्कोप की स्थापना
    नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध साधन के लिए विशिष्ट है। यदि एक अलग एलएमडी माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है तो इसे समायोजित करने की आवश्यकता होती है।
    1. एलएमडी माइक्रोस्कोप के किनारे मंच के पीछे एक डेस्कटॉप ह्यूमिडिफायर रखें। सुनिश्चित करें कि वाष्प सीधे मंच पर उड़ रहा है।
      नोट: ह्यूमिडिफायर स्थैतिक बिजली को कम करने में सहायक है, जो अन्यथा छोटे झिल्ली अनुभाग को ट्यूब कैप में गिरने से रोक सकता है।
    2. लेजर शक्ति के लिए कुंजी बारी।
    3. स्टेज कंट्रोल पावर चालू करें।
    4. माइक्रोस्कोप नियंत्रण बॉक्स चालू करें।
    5. ओपन लेजर माइक्रोडिसेक्शन सॉफ्टवेयर।
    6. मंच पर प्लास्टिक की ढाल निकालें।
    7. झिल्ली स्लाइड लोड करने के लिए ऊपर की ओर तीर के साथ अनलोड बटन पर क्लिक करें।
    8. सुनिश्चित करें कि स्लाइड पूरी तरह से सूखी है, फ्लिप करें ताकि झिल्ली नीचे की ओर हो।
    9. स्लाइड सम्मिलित करें और परिवर्तन नमूना विंडो में जारी रखें क्लिक करें.
    10. प्लास्टिक शील्ड को बदलें।
    11. स्क्रीन के निचले भाग पर, चुनें कि किस स्लाइड धारक में स्लाइड है।
    12. ट्यूबलोड करने के लिए, नीचे तीर के साथ अनलोड बटन पर क्लिक करें।
    13. ट्रे को बाहर निकालें और ट्यूब ब्लॉक को हटा दें।
      नोट: इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल ट्यूब ब्लॉक 500 μL पीसीआर ट्यूबों के लिए है।
    14. धारक में 500 μL पीसीआर ट्यूबों की ट्यूब टोपी डालें और ट्यूब के नीचे गुना।
    15. ट्रे के लिए ब्लॉक वापसी और माइक्रोस्कोप चरण में ट्रे वापस स्लाइड।
    16. परिवर्तन कलेक्टर डिवाइस पॉपअप विंडो में, पीसीआर ट्यूबों का चयन करें और ठीक क्लिक करें।
    17. कलेक्टर डिवाइस ट्यूब कैप्स के तहत स्क्रीन के निचले बाईं ओर खाली ट्यूब स्थान पर क्लिक करें।
    18. माइक्रोस्कोप नियंत्रण कक्ष में, प्रेषित प्रकाश ब्राइटफील्ड रोशनी के लिए टीएल-बीएफ का चयन करें।
  4. कलम
    नोट: यह प्रोटोकॉल सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध साधन के लिए विशिष्ट है।
    1. 2.5x लेंस का उपयोग करके, कीड़े और झिल्ली की संरचना दिखाई देने तक फोकस समायोजित करें।
    2. 20x लेंस पर स्विच करें।
    3. कीड़े के बिना एक क्षेत्र में मंच ले जाएँ। फोकस को समायोजित करें जैसे कि झिल्ली में बुलबुले जैसी संरचनाओं में सही फोकल विमान पर लेजर पर ध्यान केंद्रित करने के लिए पीले रंग का रंग (चित्रा 3 ए, बी) होता है।
    4. लेजर पैरामीटर सेट करें; पूंछ युक्तियों के लिए, पावर 45, एपर्चर 30 और स्पीड 20 से शुरू करें।
    5. लेजर नियंत्रण कक्ष में, कैलिब्रेट का चयन करें। निर्देशों का पालन करें।
      नोट: साधन स्वचालित रूप से इस चरण का प्रदर्शन करेगा। यह सुनिश्चित करेगा कि स्क्रीन पर माउस के साथ खींचा गया आकार लेजर द्वारा काटे गए आकार के समान है।
    6. कलेक्टर डिवाइस ट्यूब कैप्स पर स्क्रीन के नीचे, स्थिति ए पर क्लिक करें।
    7. स्क्रीन के दाईं ओर, एकल आकृति का चयन करें | ड्रा + कट। स्क्रीन के बाईं ओर, पीटीओपी का चयन करें।
    8. एक रेखा खींचें।
    9. क्लिक करें कटौती प्रारंभ करें ताकि लेजर झिल्ली के माध्यम से कटौती।
      नोट: यह ग्लास में एक लाइन भी खोद सकता है।
    10. यदि यह परीक्षण-कट अच्छा दिखता है (झिल्ली काट दी जाती है, कट के किनारे चिकनी दिखते हैं), तो अगले चरण के साथ जारी रखें। अन्यथा, फोकस समायोजित करें और एक और लाइन काट लें।
    11. एक कीड़ा खोजें। ले जाएँ + कट करने के लिए स्विच और पूंछ के माध्यम से कटौती करने के लिए माउस का उपयोग करें।
      नोट: यदि लेजर पूंछ के माध्यम से कटौती नहीं करता है, तो फोकस समायोजित करें और लेजर शक्ति बढ़ाएं। मोटे ऊतकों के लिए, लेजर शक्ति को 60 पर सेट करना पड़ सकता है।
    12. पैरामीटर सहेजें: फ़ाइल टैब | अनुप्रयोग कॉन्फ़िगरेशन सहेजें; बाद में पुनर्प्राप्ति के लिए, अनुप्रयोग कॉन्फ़िगरेशन पुनर्स्थापित करें।
    13. नमूना इकट्ठा करने के लिए, पीटीओपी फ़ंक्शन के साथ ड्रा + कट सेटिंग पर स्विच करें और झिल्ली अनुभाग (चित्रा 3 सी) के कट को पूरा करने के लिए एक आकार खींचें।
      नोट: हलकों या अंडाकार के बजाय आयतों या त्रिकोणों के आकार के बड़े झिल्ली वर्गों और वर्गों को कलेक्टर ट्यूब कैप में ढूंढना आसान है।
    14. स्क्रीन के तल पर कलेक्टर डिवाइस ट्यूब कैप पर अगली ट्यूब का चयन करें और अगली पूंछ टिप काट लें।
    15. एक बार चार पूंछ काट रहे हैं, ट्यूब रैक अनलोड (नीचे तीर के साथ अनलोड पर क्लिक करें) और एक विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 डी) के तहत झिल्ली वर्गों को खोजने।
      नोट: अनुभाग ट्यूब टोपी के बीच में स्थित हो सकते हैं या टोपी के किनारे पर फंस सकते हैं।
    16. डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के साथ जारी रखें। सीईएल-Seq2 के लिए, नमूने के शीर्ष पर सीधे एक सीईएल-Seq2 प्राइमर मास्टर मिश्रण (चरण 3.1 से) के पिपेट 1.2 μL।
    17. ट्यूब बंद करें, प्राइमर नंबर के साथ लेबल करें, और तुरंत नमूने को फ्लैश-फ्रीज करने और आरएनए गिरावट को रोकने के लिए ट्यूब कैप को सीधे सूखी बर्फ के टुकड़े पर रखें।
    18. अधिक ट्यूब लोड करें, ट्यूब ब्लॉक को चरण में वापस लाएं, और अधिक नमूने काट लें। प्रत्येक पूंछ टिप के लिए एक अलग सीईएल-सेक्यू 2 प्राइमर मिश्रण जोड़ें।
    19. -70 डिग्री सेल्सियस पर सभी ट्यूबों की दुकान।

4. सीईएल-सेक्यू 2 के साथ सिंगल-टेल आरएनए अनुक्रमण

नोट: सीईएल-सेक्यू 2 प्रोटोकॉल के बारे में पूर्ण विवरण के लिए, यानाई और हाशिमशोनी18 देखें।

  1. आरएनए गिरावट को रोकने के लिए आरएनएएसई परिशोधन समाधान के साथ प्रयोगशाला बेंच क्षेत्र को साफ करें।
  2. मास्टर मिक्स तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    1. रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन मास्टर मिश्रण तैयार करें: पहले स्ट्रैंड बफर के 0.4 μL, 0.1M डीटीटी के 0.1 μL, आरएनएएसई अवरोधक के 0.1 μL, और नमूना प्रति रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के 0.1 μL।
    2. दूसरा स्ट्रैंड रिएक्शन मास्टर मिक्स तैयार करें: पानी के 7 μL, दूसरे स्ट्रैंड बफर के 2.31 μL, डीएनटीपी के 0.23 μL, ई कोलाई लिगेज के 0.08 μL, ई कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ के 0.3 μL, प्रति नमूना आरएनएएसईएच के 0.08 μL।
  3. प्राइमरों के साथ खुली कोशिकाओं और एनीलिंग को तोड़ना (प्राइमरों की पूरी सूची के लिए पूरक तालिका एस 1 देखें):
    1. थर्मोसाइक्लर और उसके ढक्कन को 65 डिग्री सेल्सियस तक प्रोग्राम करें।
    2. -70 डिग्री सेल्सियस से नमूने पुनः प्राप्त करें और उन्हें 2.5 मिनट के लिए थर्मोसाइक्लर में सेते हैं।
    3. 30-40 एस के लिए 21,000 × ग्राम पर स्पिन करें।
    4. 2.5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. उन्हें तुरंत बर्फ पर ले जाएं।
    6. 30-40 एस के लिए 21,000 × ग्राम पर स्पिन करें और उन्हें बर्फ पर वापस कर दें।
  4. आरएनए को सीडीएनए में परिवर्तित करना:
    1. प्रत्येक पूंछ टिप करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन मिश्रण के 0.8 μL जोड़ें।
    2. 1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी निष्क्रिय।
    4. इसे तुरंत बर्फ पर ले जाएं।
    5. प्रत्येक पूंछ टिप करने के लिए दूसरे स्ट्रैंड मिश्रण के 10 μL जोड़ें।
    6. नमूने झटका.
    7. 30-40 एस के लिए 21,000 × ग्राम पर स्पिन करें।
    8. 2 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. सीडीएनए सफाई:
    1. कमरे के तापमान पर डीएनए सफाई मोतियों को प्रीवॉर्म करें।
    2. एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब (अप करने के लिए 480 μL) में 40 नमूने पूल।
    3. मोती मिश्रण जब तक वे अच्छी तरह से बिखरे हुए हैं और मोती के 20 μL और मनका बाध्यकारी बफर के 100 μL पूल नमूना के हर 100 μL के लिए जोड़ें (नमूना के 480 μL के लिए मनका बफर के 480 μL और मोती के 96 μL 1,056 μL तक एक अंतिम मात्रा के लिए जोड़ें)। पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
    4. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. तरल स्पष्ट दिखाई देता है जब तक कम से कम 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर रखें।
    6. सतह पर तैरनेवाला के सभी लेकिन 20 μL निकालें और त्यागें।
    7. ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 200 μL जोड़ें।
    8. कम से कम 30 एस के लिए सेते हैं, मोती परेशान किए बिना इसे बंद पाइपिंग द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    9. चरण 4.5.7 और 4.5.8 को एक बार दोहराएँ।
    10. 15 मिनट के लिए या जब तक वे पूरी तरह से सूख नहीं जाते तब तक मोतियों को हवा से सुखाएं।
    11. पानी के 6.4 μL के साथ मोती (~ 6.4 μL) को फिर से निलंबित करें। पूरी मात्रा को दस बार ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    12. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    13. सीधे इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) पर जाएं।
  6. इन विट्रो प्रतिलेखन और विखंडन में:
    1. नमूना और मोती के 6.4 μL युक्त ट्यूब में, निम्नलिखित मिश्रण (9.6 μL कुल) जोड़ें: 10x T7 बफर का 1.6 μL, एटीपी का 1.6 μL, UTP का 1.6 μL, CTP का 1.6 μL, और जीटीपी का 1.6 μL (75 एमएम एकाग्रता पर प्रत्येक dNTP) टी 7 एंजाइम का 1.6 μL।
    2. एक 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 13 घंटे के लिए सेते हैं।
    3. एक्सोन्यूक्लिज समाधान के 6 μL जोड़ें (अंतिम मात्रा 22 μL होनी चाहिए)।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. ट्यूब को बर्फ पर वापस रखें और विखंडन बफर (0.25 × प्रतिक्रिया मात्रा) के 5.5 μL जोड़ें।
    6. 94 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
    7. तुरंत बर्फ के लिए ट्यूब ले जाएँ और विखंडन बंद बफर के 2.75 μL जोड़ने (विखंडन बफर की मात्रा 0.5 × मात्रा जोड़ा).
    8. तरल स्पष्ट दिखाई देता है जब तक कम से कम 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखकर मोती निकालें।
    9. सतह पर तैरनेवाला एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. प्रवर्धित आरएनए (एआरएनए) सफाई:
    1. कमरे के तापमान पर आरएनए सफाई मोतियों को प्रीवॉर्म करें।
    2. मोतियों को तब तक मिलाएं जब तक कि वे अच्छी तरह से बिखर न जाएं।
    3. मोती के पिपेट 55 μL (प्रतिक्रिया मात्रा × 1.8).
    4. उन्हें 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. तरल स्पष्ट दिखाई देता है जब तक कम से कम 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें।
    6. सतह पर तैरनेवाला के 80 μL निकालें और त्यागें।
    7. ताजा तैयार 70% इथेनॉल के 200 μL जोड़ें।
    8. कम से कम 30 एस के लिए सेते हैं, मोती परेशान किए बिना पाइपिंग द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    9. इथेनॉल धोने को दो बार दोहराएं।
    10. 15 मिनट के लिए या जब तक वे पूरी तरह से सूख नहीं जाते तब तक मोतियों को हवा से सुखाएं।
    11. पानी के 7 μL के साथ मोतियों को फिर से निलंबित करें। पिपेट पूरी मात्रा ऊपर और नीचे 10 बार अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
    12. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    13. तरल स्पष्ट दिखाई देता है जब तक 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती के साथ ट्यूब रखें।
    14. सतह पर तैरनेवाला एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: रोक बिंदु: नमूने -70 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  8. वैकल्पिक: निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली के साथ एआरएनए राशि और गुणवत्ता की जांच करें।
  9. पुस्तकालय की तैयारी:
    1. आरएनए के 5 μL करने के लिए, 100 μM यादृच्छिक हेक्सामर आरटी प्राइमर के 1 μL ( सामग्री की तालिका देखें) और 10 एमएम dNP के 0.5 μL जोड़ें।
    2. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. कमरे के तापमान पर निम्नलिखित मिश्रण के 4 μL जोड़ें: पहले स्ट्रैंड बफर के 2 μL, 0.1 M डीडीटी के 1 μL, आरएनएएसई अवरोधक के 0.5 μL, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के 0.5 μL।
    4. 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. 1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं (एक संकरण ओवन में या 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट ढक्कन के साथ एक पहले से गरम थर्मल साइक्लर में)।
    6. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. एक नई ट्यूब के लिए 5 μL स्थानांतरण (प्रतिक्रिया के बाकी -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें)। अल्ट्राप्योर पानी के 5.5 μL, आरएनए पीसीआर प्राइमर (RP1) के 1 μL, अनुक्रमित आरएनए पीसीआर प्राइमर (RPIX) के 1 μL, और पीसीआर मिश्रण के 12.5 μL जोड़ें।
    8. थर्मोसाइक्लर पर निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 11 चक्र: (98 डिग्री सेल्सियस पर 10 एस, 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस), 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
      नोट: रोक बिंदु: नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  10. लाइब्रेरी क्लीनअप:
    1. कमरे के तापमान पर डीएनए सफाई मोतियों को प्रीवॉर्म करें।
    2. मोतियों को तब तक मिलाएं जब तक कि वे अच्छी तरह से बिखर न जाएं।
    3. पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए मोती के 25 μL जोड़ें। पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
    4. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. तरल स्पष्ट दिखाई देता है जब तक कम से कम 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें।
    6. सतह पर तैरनेवाला के 45 μL निकालें और त्यागें।
    7. ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 200 μL जोड़ें।
    8. कम से कम 30 एस के लिए सेते हैं, निकालें, और मोती परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    9. इथेनॉल धोने को एक बार दोहराएं।
    10. 15 मिनट के लिए या जब तक वे पूरी तरह से सूखी नहीं हैं तब तक हवा-सूखे मोती।
    11. उन्हें 25 μL पानी के साथ पुन: निलंबित करें। पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
    12. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    13. तरल स्पष्ट दिखाई देता है जब तक 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें।
    14. एक नई ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला के 25 μL स्थानांतरण।
    15. चरण 4.10.2-4.10.10 एक बार दोहराएँ।
    16. 10.5 μL पानी के साथ पुन: निलंबित। पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
    17. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    18. तरल स्पष्ट दिखाई देता है जब तक 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें।
    19. सतह पर तैरनेवाला के 10 μL एक नई ट्यूब में स्थानांतरण और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  11. अनुक्रमण सुविधा की आवश्यकता के अनुसार पुस्तकालय की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करें।

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Representative Results

लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के बाद, 4 समय बिंदुओं पर पुरुषों और हेर्मैफ्रोडाइट्स की व्यक्तिगत पूंछ युक्तियाँ (हैच के बाद एल 3 22 घंटे; एल 4 24, 26, और हैच के बाद 28 घंटे) सीईएल-सेक्यू 2 प्रोटोकॉल का उपयोग करके आरएनए अनुक्रमण के लिए तैयार किए गए थे। सीईएल-सेक्यू 2 प्राइमरों में अद्वितीय बारकोड होते हैं जो किसी विशेष नमूने (इस मामले में एक व्यक्तिगत पूंछ टिप) से अनुक्रमण पढ़ने को जैव सूचनात्मक रूप से पहचाने जाने में सक्षम बनाते हैं। अनुक्रमण डेटा कुल 557 पूंछ युक्तियों (4 विकासात्मक समय बिंदुओं में 266 हर्मैफ्रोडाइट्स और 291 पुरुषों, 59-78 पूंछ प्रति सेक्स और समय बिंदु) के लिए इस विधि के साथ उत्पन्न किया गया था। सीईएल-सेक्यू 2 बारकोड इन पूंछ युक्तियों (पूरक तालिका एस 2) के 97% (यानी, 543) के लिए बरामद किए गए थे। अधिकांश पुस्तकालयों के लिए, वसूली दर 99-100% थी; हालाँकि, यह एक पुरुष समय बिंदु के लिए 88% था। यह ध्यान देने योग्य है कि कोविड-19 से संबंधित देरी के कारण 22, 24 और 28 घंटे के समय बिंदुओं से लगभग आधे पुरुष पूंछ युक्तियों को ~ 4 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। यह दर्शाता है कि, जबकि नमूनाकरण के तुरंत बाद अनुक्रमण पुस्तकालयों को तैयार करना आदर्श है, पुस्तकालय की तैयारी से पहले लंबे समय तक विच्छेदित नमूनों को संग्रहीत करना संभव है।

सीईएल-सेक्यू 2 प्राइमर प्रत्येक एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट में एक यूएमआई भी जोड़ते हैं। यह पीसीआर डुप्लिकेट हटाने और नमूने में जीन अभिव्यक्ति की सटीक मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। यूएमआई की संख्या पूंछ युक्तियों में नाटकीय रूप से भिन्न थी (चित्रा 4; पुरुष माध्य = 92,560; पुरुष मिनट = 155; पुरुष अधिकतम = 1,183,998; हेर्मैफ्रोडाइट्स का मतलब = 67,597; हेर्मैफ्रोडाइट्स मिनट = 132; हेर्मैफ्रोडाइट्स अधिकतम = 630,427)। पूंछ टिप प्रति यूएमआई मायने रखता है के लिए, पूरक तालिका S3 देखें। सिंगल-सेल लाइब्रेरी तैयारी के लिए इनपुट आरएनए की कम मात्रा के कारण, सिंगल-सेल सीक्वेंसिंग डेटा को बड़ी मात्रा में तकनीकी शोर के लिए जाना जाता है। इसलिए, विश्लेषण24 से पहले बहुत कम या बहुत अधिक यूएमआई मायने रखता है कि नमूनों को फ़िल्टर करने की सिफारिश की जाती है।

आर पैकेज पॉसिमआर25 का उपयोग एकल-कोशिका या थोक आरएनए-सेक प्रयोगों में अलग-अलग व्यक्त (डीई) जीन का मज़बूती से पता लगाने के लिए सांख्यिकीय शक्ति और नमूना आकार आवश्यकताओं का आकलन करने के लिए किया गया था। सिमुलेशन के लिए पैरामीटर यहां वर्णित विधि के साथ प्राप्त 70 व्यक्तिगत पुरुष पूंछ युक्तियों (24 घंटे के समय बिंदु पर) के अनुक्रमण डेटासेट पर आधारित थे। अपेक्षित लॉग-फोल्ड परिवर्तन एक अलग आरएनए-सेक प्रयोग के परिणामों पर आधारित थे जो 80-100 पूंछ युक्तियों को पूल करते थे। सिमुलेशन ने निर्धारित किया कि एकल-पूंछ-टिप डेटा में डीई जीन का पता लगाने के लिए पर्याप्त शक्ति (ट्रू पॉजिटिव रेट = टीपीआर) है, जीन को छोड़कर जिनके पास बहुत कम औसत अभिव्यक्ति मूल्य है ( चित्रा 5 के शीर्ष; धराशायी रेखा 80% टीपीआर का प्रतिनिधित्व करती है)। समय बिंदु प्रति अधिक नकली पूंछ युक्तियों को जोड़ने से कम व्यक्त जीन के लिए शक्ति में कुछ हद तक वृद्धि हुई। इसी तरह का पैटर्न फॉल्स डिस्कवरी रेट (एफडीआर) के लिए देखा जाता है। एफडीआर निम्न व्यक्त जीन के लिए उच्च (>0.10) है; हालांकि, अधिक अत्यधिक व्यक्त जीन के लिए, यह नाममात्र 0.10 कटऑफ (चित्रा 5 के नीचे एफडीआर के लिए धराशायी रेखा) पर या उससे नीचे गिरता है। संक्षेप में, 70 से ऊपर प्रति समय बिंदु पर नमूने की पूंछ की संख्या बढ़ाने से एफडीआर को कम करने या शक्ति बढ़ाने के लिए बहुत कम होगा। हालांकि, 70 पूंछ युक्तियां 30 पूंछ युक्तियों की तुलना में बहुत कम एफडीआर और मजबूत शक्ति प्रदान करती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: हैच-ऑफ विधि और पूंछ युक्तियों के लेजर माइक्रोडिसेक्शन के साथ कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस के सिंक्रनाइज़ेशन के लिए प्रक्रिया अवलोकन। संक्षिप्त नाम: एल 1-एल 4 = लार्वा चरण 1 से 4; पेन = पॉलीथीन नेफ्थेलेट; एलएमडी = लेजर माइक्रोडिसेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सी एलिगेंस एल 3 हेर्मैफ्रोडाइट्स और पुरुषों की उपस्थिति। हैच के बाद 21-23 घंटे में हर्माफ्रोडाइट्स (ए, बी) और नर (सी, डी) को उनकी पूंछ (तीर) की आकृति विज्ञान द्वारा विच्छेदन माइक्रोस्कोप (~ 50 एक्स आवर्धन) के तहत प्रतिष्ठित किया जा सकता है। हेर्मैफ्रोडाइट्स की पूंछ संकीर्ण होती है, जबकि पुरुषों की पूंछ सूजी हुई होती है और स्पष्ट दिखाई देती है। स्केल बार = 0.1 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पेन झिल्ली स्लाइड संरचना और कृमि पूंछ की उपस्थिति। माइक्रोस्कोप पर 20x (A) और 40x (B) लेंस के साथ देखे गए ऊतक के विच्छेदन के लिए फ़ोकस सही है। (सी) विच्छेदित पूंछ और आंशिक रूप से कलम झिल्ली काट दिया। कट में अंतर को बंद करने के बाद, झिल्ली टुकड़ा स्लाइड के नीचे ट्यूब कैप में गिर जाएगा। (डी) एक विच्छेदित पूंछ टिप युक्त एक पेन झिल्ली अनुभाग के साथ ट्यूब टोपी। स्केल बार = 0.1 मिमी (ए-सी), 1 मिमी (डी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्राकृतिक लॉग-रूपांतरित यूएमआई अलग-अलग समय बिंदुओं और लिंगों के लिए व्यक्तिगत पूंछ टिप प्रति मायने रखता है। व्यक्तिगत पूंछ से आरएनए सीईएल-सेक्यू 2 विधि का उपयोग करके अनुक्रमण के लिए तैयार किया गया था; कुल मिलाकर 557 पूंछ अनुक्रमित किए गए थे, जिसमें प्रति सेक्स और समय बिंदु 59-78 पूंछ थीं। विश्लेषण से पहले डेटा से बेहद कम और उच्च यूएमआई आउटलाइर्स को हटा दिया जाएगा। संक्षिप्त नाम: यूएमआई = अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पाउसिमआर के साथ सिमुलेशन का उपयोग करके एक पश्चवर्ती शक्ति विश्लेषण के परिणाम। पाउसिमआर सॉफ्टवेयर विभिन्न अभिव्यक्ति स्तरों पर डीई जीन का पता लगाने के लिए आवश्यक स्वतंत्र नमूनों की संख्या निर्धारित करता है। जीन को यूएमआई मायने रखता है के प्राकृतिक लॉग के रूप में परिवर्तित औसत अभिव्यक्ति द्वारा बिन किया जाता है। (ए) पावर (टीपीआर) चार अलग-अलग सिमुलेशन (विभिन्न रंगीन रेखांकन) के लिए दो स्थितियों (यहां, पुरुष बनाम हेर्मैफ्रोडाइट) के बीच डीई जीन का पता लगाने के लिए, जिसमें प्रति स्थिति विभिन्न नमूना आकार (व्यक्तिगत पूंछ-युक्तियों की संख्या) शामिल है। धराशायी लाइन 80% टीपीआर इंगित करती है। (बी) (ए) के रूप में एक ही चार सिमुलेशन में एफडीआर, धराशायी लाइन 10% एफडीआर का संकेत देती है। रेखांकन से पता चलता है कि प्रति स्थिति 70 पूंछ युक्तियों (हरे) का एक नमूना आकार डीई जीन का पता लगाने के लिए पर्याप्त है, बहुत कम अभिव्यक्ति स्तर वाले जीन को छोड़कर। यही है, ऐसे जीनों के लिए शक्ति और झूठी खोज दर को 70 से अधिक नमूना आकार बढ़ाकर बहुत सुधार नहीं किया जा सकता है। संक्षिप्त नाम: डीई = अलग-अलग व्यक्त; यूएमआई = अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता; टीपीआर = सही सकारात्मक दर; एफडीआर = झूठी खोज दर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका एस 1: सीईएल-सेक्यू 2 प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों के अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: नमूना बनाम बरामद व्यक्तिगत पूंछ युक्तियाँ। सीईएल-सेक्यू 2 प्राइमरों में अद्वितीय बारकोड होते हैं जो प्रत्येक नमूने से अनुक्रमण पढ़ने की पहचान को जैव सूचनात्मक रूप से पहचाने जाने में सक्षम बनाते हैं। अनुक्रमण के लिए तैयार पूंछ टिप नमूनों के 97% से रीड बरामद किए गए थे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 3: यूएमआई बरामद बारकोड के साथ सभी नमूनों की गिनती करता है, जैसा कि पूरक तालिका एस 2 में उल्लेख किया गया है। संक्षिप्त नाम: यूएमआई = अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

विधि के महत्वपूर्ण चरण
यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो यहां वर्णित विधि अपेक्षाकृत कम संख्या में लेजर-विच्छेदित नमूनों (इस उदाहरण में 70 पूंछ युक्तियों) के साथ मजबूत आरएनए प्रोफाइल प्राप्त करेगी। हालांकि, विकासशील जानवरों के नमूनों के लिए, नमूनों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए तंग सिंक्रनाइज़ेशन महत्वपूर्ण है। इस कारण से, प्रोटोकॉल वर्म-सिंक्रनाइज़ेशन के लिए हैच-ऑफ विधि की सिफारिश करता है। यहां, शोधकर्ता व्यक्तियों (वर्तमान प्रोटोकॉल में 1 घंटे) के बीच उम्र के अंतर को निर्धारित और ठीक से नियंत्रित कर सकता है। इसके अलावा, हैच-ऑफ विधि किसी भी प्रजाति पर लागू होती है, भले ही भ्रूण ब्लीच के प्रति संवेदनशील हों, एल 1 गिरफ्तारी नहीं करता है, या एल 1 गिरफ्तारी से वसूली परिवर्तनशील है। हैच-ऑफ द्वारा एक सफल सिंक्रनाइज़ेशन के लिए, धोने के कदम महत्वपूर्ण हैं: सभी वयस्कों और लार्वा को हैचिंग अवधि की शुरुआत में हटा दिया जाना चाहिए, और हैचिंग अवधि के अंत में नए रचे गए एल 1 के साथ कोई भ्रूण नहीं धोया जाना चाहिए। यह केवल तभी सफल होता है जब प्लेट की अगर सतह दरारें, छेद या बुलबुले से क्षतिग्रस्त नहीं होती है, प्लेट पर जीवाणु लॉन ताजा होता है और बहुत मोटा नहीं होता है, और तरल जोड़ा जाता है और केवल बहुत धीरे से उत्तेजित होता है।

यदि पुरुषों और हेर्मैफ्रोडाइट्स / महिलाओं के लिए अलग-अलग डेटा प्राप्त किया जाना है, तो लिंगों की विश्वसनीय पहचान भी महत्वपूर्ण है। सेक्स द्वारा एल 3 लार्वा को अलग करना ( चित्र 2 देखें) अनुभव की आवश्यकता होती है। एल 3 नर और हेर्मैफ्रोडाइट्स / मादाओं को चुनने का अभ्यास करने और जानवरों के वयस्कों में विकसित होने और लिंगों को आसानी से प्रतिष्ठित करने के बाद सफलता दर की जांच करने की सिफारिश की जाती है। एकल-ऊतक आरएनए-सेक के बाद, आउटलायर्स को प्रमुख घटक विश्लेषण द्वारा भी पहचाना जा सकता है और यदि आवश्यक हो तो हटा दिया जा सकता है।

लेजर-कट नमूनों की सफल वसूली के लिए, यथासंभव स्थैतिक बिजली को कम करना महत्वपूर्ण है। चार्ज पेन-झिल्ली के टुकड़े अक्सर ट्यूब कैप में नहीं गिरते हैं, लेकिन स्लाइड या माइक्रोस्कोप के किसी अन्य हिस्से से चिपके रहते हैं। एक उपाय कमरे में और विशेष रूप से माइक्रोस्कोप के चारों ओर आर्द्रता को बढ़ा रहा है, चरण के बगल में एक छोटा सा ह्यूमिडिफायर रखकर। इसके अतिरिक्त, झिल्ली स्लाइड यूवी प्रकाश के साथ इलाज किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, यूवी-सी (254 एनएम) क्रॉसलिंक चैंबर में स्लाइड सेते हैं और कम से कम 1 जूल ऊर्जा प्रदान करते हैं, या 30 मिनट के लिए लामिना वायु प्रवाह बेंच में यूवी प्रकाश में स्लाइड को उजागर करते हैं।

चूंकि प्रोटोकॉल का लक्ष्य आरएनए-सेक है, इसलिए आरएनए-मुक्त कामकाजी माहौल रखना महत्वपूर्ण है। निर्धारण समाधान के साथ शुरुआत, अभिकर्मकों, कंटेनरों और उपभोग्य सामग्रियों को आरएनएएसई मुक्त होना चाहिए, काम की सतह को दूषित किया जाना चाहिए, और शोधकर्ताओं को साफ दस्ताने पहनने चाहिए। विच्छेदित नमूनों को जितनी जल्दी हो सके जमे हुए होना चाहिए और आगे की प्रक्रिया तक -70 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए। प्रोटोकॉल के सीईएल-सेक्यू 2 भाग के लिए कम प्रतिधारण ट्यूबों और युक्तियों का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है।

वर्तमान लेख सीईएल-सेक्यू 2 प्रोटोकॉल की केवल एक बुनियादी रूपरेखा प्रदान करता है, जिसे पहले इसके डेवलपर्स द्वारा उपयोगी नोट्स और टिप्स17,18 के साथ प्रकाशित किया गया था। यह अनुशंसा की जाती है कि सीईएल-सेक्यू 2 विधि का उपयोग करने से पहले इन प्रकाशनों से परामर्श किया जाए।

एलएमडी-आरएनए-सेक डेटा को एकल-अणु-आरएनए फ्लोरोसेंट इन-सीटू संकरण (एसएमआरएनए फिश) 26,27,28 द्वारा मान्य किया जा सकता है। एलिगेंस में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है और अन्य नेमाटोड प्रजातियों के लिए उत्तरदायी है, जो मौजूदा एंटीबॉडी (जो क्रॉसरिएक्ट नहीं कर सकता है) के साथ इम्यूनोस्टेनिंग या ट्रांसजेनेसिस के माध्यम से ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टरों की शुरूआत से अलग है। एलिगेंस और कुछ संबंधित कैनोरहाब्डिटिस प्रजातियों29 में अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन ट्रांसजेनेसिस अन्य नेमाटोड प्रजातियों30,31 में अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

विधि की सीमाएँ
यहां वर्णित विधि पूंछ युक्तियों को इकट्ठा करने के लिए बहुत अच्छी तरह से काम करती है, एक कीड़े के अंत में एक पतली ऊतक। पुराने लार्वा या वयस्कों के मोटे बीच में ऊतकों को विच्छेदन करना अधिक चुनौतीपूर्ण है। यहां उपयोग किए जाने वाले उपकरण के सॉफ्टवेयर में ऊतक में बाद में गहरे स्तर पर रखे गए कई कटौती के लिए एक सेटिंग शामिल है। इस सेटिंग का उपयोग जानवर के मोटे क्षेत्रों को काटने के लिए किया जा सकता है। क्योंकि कीड़े को विच्छेदन से पहले ठीक करने की आवश्यकता होती है, संरचनात्मक विवरण देखना मुश्किल होता है, जो विशिष्ट छोटी संरचनाओं के सटीक विच्छेदन को रोकता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, एलएमडी-आरएनए-सेक एक एचटीपी विधि नहीं है। हालांकि, एक दोपहर में 50-70 नमूनों को विच्छेदित किया जा सकता है।

मौजूदा/वैकल्पिक विधियों के संबंध में विधि का महत्व
एलएमडी-आरएनए-सेक का उपयोग किसी भी प्रजाति में किया जा सकता है, भले ही कोई ट्रांसजेनिक उपकरण उपलब्ध न हो। अन्य विधियां फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाओं 8,9,32 या लेबल वाले नाभिक 33,34 के अलगाव के एफएसीएस सॉर्टिंग पर भरोसा करती हैं और इस प्रकार ट्रांसजेनिक जानवरों की आवश्यकता होती है। एलिगेंस में कोशिकाओं को अलग करने और अलग करने वाले तरीके कृमि के दो सिरों (डायलन राहे, व्यक्तिगत संचार) पर ऊतकों को याद करते हैं। इन चेतावनियों को पूरे कीड़े (आरएनए टोमोग्राफी) 35 के क्रायोसेक्शनिंग के साथ एकल-कोशिका आरएनए-सेक के संयोजन से दूर किया जाता है। इस विधि का उपयोग सी एलिगेंस और एक अन्य रैबडिटिड नेमाटोड, प्रिस्टियनकस पैसिफिकस36 के बीच स्थानिक जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए किया गया था। वैकल्पिक रूप से, कोई फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) कीड़े के साथ प्रयोग कर सकता है। स्तनधारी ऊतक नमूनों के एलएमडी के बाद आरएनए-सेक के लिए ऐसी सामग्री का सफलतापूर्वक उपयोग किया गयाहै 37. हालांकि, एफएफपीई कीड़े की आरएनए टोमोग्राफी और एलएमडी केवल मुट्ठी भर जानवरों के विश्लेषण तक सीमित हैं। इसलिए, वे एलएमडी-आरएनए-सेक के रूप में विकासशील ऊतकों में गतिशील जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं।

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Disclosures

सभी लेखकों ने घोषणा की कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को एनआईएच (आर 01 जीएम 141395) और एनएसएफ (1656736) डीएफ और एनआईएच फैलोशिप (एफ 32 जीएम 136170) को एडब्ल्यू को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। चित्रा 1 BioRender.com की मदद से बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free Leica 11600288 for LMD
500 µL PCR tubes (nuclease-free) Axygen 732-0675 to cut the tail tips into
Compound microscope with 40x objective and DIC any to check age of worms
Desktop humidifier any
Dissection microscope with transmitted light base any for all worm work
glass pasteur pipets any handle of worm pick
glass slides and coverslips any to check age of worms
LMD6 microdissection system Leica multiple to cut tail tips
LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf 22431005
M9 Buffer Recipe in WormBook
Methanol 99.8% Sigma 322415 to fix worms
NGM growth medium US Biological N1000 Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook
P10 pipette variablle volume e.g. Gilson
P1000 pipette variable volume e.g. Gilson
P2 pipette variable volume e.g. Gilson
Pipette tips 1,000 µL any
Pipette tips 1-10 µL filtered any
platinum iridium wire Tritech PT-9010 to make worm pick
sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes any
Tween 20 Sigma P9416 Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips
vented 6 mm plastic Petri dishes any
For CEL-Seq2
4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection Aligent automated electrophoresis system
AMPure XP beads Beckman Coulter A63880 DNA cleanup beads
Bead binding buffer  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (see Table S1) Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf 6335000020 Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes.
DNA Polymerase I (E. coli) Invitrogen 18052-025
dNTP mix 10 mM any
E. coli DNA ligase Invitrogen 18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up Affymetrix 78200 exonuclease solution
MEGAscript T7 Transcription Kit Ambion AM1334 For step 4.6.1
Nuclease-free water any
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531 PCR mix step 4.9.7
random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
NNNNNN		 IDT a primer with 6 nucleotides that are random
RNA Fragmentation buffer NEB E6150S
RNA Fragmentation stop buffer NEB E6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) Illumina, NEB, or IDT RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina
RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant Thermo Scientific 7000TS1 or any other similar product
RNaseH (E. coli) Invitrogen 18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 10777-019
Second strand buffer Invitrogen 10812-014
Superscripit II Invitrogen 18064-014 reverse transcriptase

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References

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जीव विज्ञान अंक 181
प्रजातियों-अज्ञेयवादी एकल-ऊतक अनुप्रयोगों के लिए लेजर माइक्रोडिसेक्शन
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Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. … More

Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. S., Herrera, R. A., Fitch, D. H. A. Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications. J. Vis. Exp. (181), e63666, doi:10.3791/63666 (2022).

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