Summary
Un protocole est décrit qui utilise la microdissection laser pour isoler des tissus de nématodes individuels pour le séquençage de l’ARN. Le protocole ne nécessite pas de boîtes à outils génétiques spécifiques à l’espèce, ce qui permet de comparer les profils d’expression génique entre différentes espèces au niveau d’échantillons de tissus uniques.
Abstract
Les méthodologies unicellulaires ont révolutionné l’analyse des transcriptomes de types cellulaires spécifiques. Cependant, ils nécessitent souvent des « boîtes à outils » génétiques spécifiques à l’espèce, telles que des promoteurs conduisant à l’expression tissulaire spécifique des protéines fluorescentes. De plus, les protocoles qui perturbent les tissus pour isoler les cellules individuelles éliminent les cellules de leur environnement natif (par exemple, la signalisation des voisins) et peuvent entraîner des réponses au stress ou d’autres différences par rapport aux états d’expression des gènes natifs. Dans le présent protocole, la microdissection laser (LMD) est optimisée pour isoler les extrémités individuelles de la queue des nématodes pour l’étude de l’expression génique au cours de la morphogenèse de la pointe de la queue mâle.
LMD permet l’isolement d’une partie de l’animal sans avoir besoin de perturbation cellulaire ou de boîtes à outils spécifiques à l’espèce et est donc applicable à toutes les espèces. Par la suite, des protocoles de préparation de bibliothèque d’ARN-seq unicellulaires tels que CEL-Seq2 peuvent être appliqués à des tissus uniques isolés de LMD et analysés à l’aide de pipelines standard, étant donné qu’un génome ou un transcriptome bien annoté est disponible pour l’espèce. Ces données peuvent être utilisées pour établir dans quelle mesure les transcriptomes sont conservés ou différents qui sous-tendent le développement de ce tissu chez différentes espèces.
Les limites comprennent la capacité de découper le tissu d’intérêt et la taille de l’échantillon. Une analyse de puissance montre qu’aussi peu que 70 embouts de queue par condition sont nécessaires pour une puissance de 80%. Une synchronisation étroite du développement est nécessaire pour obtenir ce nombre d’animaux au même stade de développement. Ainsi, une méthode de synchronisation des animaux à des intervalles de 1 heure est également décrite.
Introduction
Les nématodes, en particulier les nématodes rhabditidés liés au système modèle Caenorhabditis elegans, constituent un merveilleux groupe d’animaux pour la biologie évolutive du développement (EDB) pour de nombreuses raisons 1,2. Les avantages comprennent leur petit nombre de cellules, leurs lignées cellulaires définies et cohérentes, leur transparence et leur facilité de culture et d’élevage. Il existe également de nombreuses ressources disponibles, y compris des génomes de haute qualité pour plusieurs espèces, et pour C. elegans, des outils de génétique moléculaire étendus et des connaissances sur le développement, la génétique, l’anatomie et la physiologie 3,4,5,6.
Comme pour beaucoup d’autres organismes, la capacité de caractériser la dynamique du transcriptome dans des tissus uniques ou des cellules individuelles a révolutionné l’analyse du développement chez C. elegans 7,8,9,10. Être capable de comparer des transcriptomes unicellulaires à travers des nématodes transformerait de la même manière l’EDB en utilisant ces organismes. Par exemple, de telles comparaisons permettraient de mieux comprendre comment les réseaux de régulation des gènes ont évolué pour les caractères (traits) qui ont été conservés, pour les caractères qui ont divergé ou pour les caractères qui ont évolué indépendamment.
Cependant, isoler des tissus ou des cellules particuliers des nématodes est l’un des grands défis. Pour de nombreux organismes, les cellules individuelles peuvent être dissociées des tissus et récoltées de manière impartiale ou peuvent être marquées avec l’expression tissulaire spécifique d’une protéine fluorescente et triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)11. Chez C. elegans, l’isolement cellulaire à haut débit (HTP) a été limité principalement aux embryons parce que la cuticule externe dure (et le squelette hydrostatique) a entravé l’isolement cellulaire des larves et des adultes. Pour contourner ce défi, certaines méthodes ont utilisé des outils génétiques chez des vers C. elegans entiers, tels que le marquage de l’ARNm12 spécifique aux tissus et les comparaisons d’expression différentielle entre le type sauvage et les mutants affectant un type cellulaire13. Des méthodes plus récentes ont surmonté le défi en dissolvant la cuticule pour isoler les noyaux14 ou des cellules entières 8,9,15. L’isolement cellulaire et la culture cellulaire présentent toutefois des inconvénients évidents : les cellules sont retirées de leur contexte naturel de développement ou anatomique – par exemple, loin de la signalisation cellule-cellule et du contact avec la matrice extracellulaire – ce qui devrait avoir un impact sur le profil d’expression génique15. De plus, les outils génétiques et les marqueurs spécifiques aux tissus sont spécifiques à l’espèce (c’est-à-dire qu’ils ne peuvent être utilisés que chez C. elegans).
LMD fournit une méthode alternative pour isoler les tissus sans perturber le contexte naturel des cellules. De manière significative pour l’EDB, la LMD permet également de comparer les transcriptomes de tissus homologues de différentes espèces sans avoir besoin de boîtes à outils génétiques spécifiques à l’espèce si des séquences de génome ou de transcriptome entier de ces espèces sont disponibles. La LMD consiste à cibler les tissus par observation microscopique directe et à utiliser un microfaisceau laser – intégré à l’optique du microscope – pour découper et récolter (capturer) le tissu d’intérêt16. Les limites de la LMD sont qu’elle n’est pas propice aux approches très HTP (bien que les profils de transcription pour les pointes de queue, tels que décrits dans ce protocole, étaient robustes avec environ 70 échantillons), certains échantillons peuvent être difficiles à disséquer et les coupes sont limitées à la précision du laser et à ce qui peut être visualisé au microscope.
Le but du présent protocole est de décrire comment la LMD, suivie de l’ARN-Seq à tissu unique, peut être utilisée pour obtenir des données sur le transcriptome spécifiques au stade et aux tissus à partir de nématodes. Plus précisément, il démontre que la LMD isole les extrémités de la queue des larves du quatrième stade (L4) de C. elegans. Cependant, cette méthode peut être adaptée à d’autres tissus et, bien sûr, à différentes espèces.
Chez C. elegans, il y a 4 cellules qui font le bout de la queue chez les mâles et les hermaphrodites. Au cours du stade L4 chez les mâles, mais pas chez les hermaphrodites, les cellules de la pointe de la queue changent de forme et migrent vers l’avant et vers l’intérieur. Ce processus se produit également chez certaines espèces de nématodes rhabditidés, mais pas chez toutes. Par conséquent, l’extrémité de la queue est un bon modèle pour l’évolution de la morphogenèse dimorphique sexuelle. En raison de sa position, l’extrémité de la queue est également facile à isoler par LMD.
Pour obtenir des profils de transcriptome à partir des extrémités de la queue, le présent protocole utilise CEL-Seq2, une méthode ARN-seq développée pour les cellules individuelles17,18. Cette méthode présente plusieurs avantages pour les tissus dérivés de la LMD. CEL-Seq2 est très sensible et efficace, utilisant des identificateurs moléculaires uniques (UMI) pour permettre une quantification simple des lectures d’ARNm, une transcription in vitro pour assurer une amplification linéaire et un codage à barres qui permet le multiplexage d’échantillons de tissus individuels. La seule limite de CEL-Seq2 est que les lectures récupérées sont biaisées à l’extrémité 3' des ARNm, et la plupart des isoformes ne peuvent donc pas être distinguées.
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Protocol
1. Synchronisation des vers
REMARQUE: Deux méthodes sont décrites ci-dessous pour synchroniser le développement de C. elegans et d’autres espèces de rhabditidés.
- Synchroniser par arrêt au premier stade larvaire (L1) après un traitement à l’hypochlorite alcalin (eau de Javel).
REMARQUE : Cette méthode a été décrite précédemment en détail19. Cette méthode repose sur deux caractéristiques de C. elegans qui sont également vraies pour plusieurs autres espèces de rhabditidés: (1) La coquille d’œuf est résistante à l’eau de Javel, alors que la cuticule entourant les vers adultes et larvaires ne l’est pas. (2) Les larves de premier stade arrêtent le développement lorsqu’elles sont conservées sans nourriture20.- Traiter les hermaphrodites gravides (ou femelles) avec une solution d’eau de Javel diluée pour briser leur cuticule et libérer des embryons.
- Retirez les embryons de l’eau de Javel et conservez-les sans nourriture jusqu’à ce que tous les L1 aient éclos.
- Placez le L1 arrêté sur la nourriture, où tous reprennent le développement à peu près en même temps.
REMARQUE: La sortie de l’arrestation L1 peut se produire dans l’heure.
- Synchronisation avec la méthode « hatch-off » (utilisée ici; Figure 1 en haut) :
REMARQUE: La méthode d’éclosion permet une synchronisation étroite sans interruption du développement (l’arrêt L1 affecte le développement même des étapesultérieures 21). Le protocole est adapté de Pepper et al.22. L’objectif de cette méthode est de collecter les L1 qui ont éclos sur une période spécifique à partir d’une plaque qui ne contient que des embryons.- Choisissez les mères: La veille de l’éclosion, cueillez environ 30 hermaphrodites gravides sur une assiette ensemencée d’E. coli OP50.
- Incuber à 25 °C pour la ponte pendant la nuit.
REMARQUE: Choisissez une assiette sans fissures ni bulles où les vers pourraient rester coincés. Évitez les plaques avec une pelouse bactérienne très épaisse car il sera difficile d’enlever tous les vers plus tard. Si vous travaillez avec une souche sensible à la température, ajustez le temps de ponte pour tenir compte de l’embryogenèse plus longue. Cueillez les mères au stade maximal de la ponte. - Retirer les mères et les larves: le lendemain matin, sous le microscope à dissection (grossissement 20x), pipeter doucement 1-2 mL de tampon M9 contre la paroi de la plaque sans gicler; faire tourbillonner l’assiette pour déloger les vers.
- Retirez et jetez tout le liquide et les vers en plaçant la pointe de la pipette contre la paroi de la plaque au bord de la gélose pour éviter de percer des trous. Vérifiez qu’il ne reste aucun ver (et seulement des œufs/embryons) dans l’assiette, surtout pas des L1; sinon, répétez le lavage.
- Placez la plaque à 25 °C pendant 1 h et attendez que certains L1 éclosent.
- Collectez les L1 nouvellement éclos : déposez soigneusement 1 mL de tampon M9 sur la gélose. Faites tourbillonner la plaque pour déloger L1 mais pas les embryons. Pipettez doucement le tampon et les vers dans un tube de centrifugeuse de 1 mL.
- Centrifugez le tube pendant 1 min à ~18 000 × g. Retirez le surnageant.
- Pipette L1 directement sur la pelouse bactérienne d’une plaque ensemencée. Vérifiez au microscope à dissection qu’aucun ver ou embryon adulte n’est présent.
- Gardez les vers à 25 °C jusqu’à ce qu’ils se soient développés au stade souhaité.
REMARQUE: Si les conditions sont optimales, deux autres lots de L1 peuvent être collectés sur la même plaque. Inspectez la plaque initiale pour vous assurer qu’aucun L1 n’est présent. Si nécessaire, lavez-vous à nouveau. Répétez les étapes 1.2.5 à 1.2.9. -
Vérifiez le moment du développement. Avant de passer à l’application en aval, inspectez certains vers sous un microscope composé à un grossissement de 400x pour confirmer qu’ils ont atteint le stade de développement souhaité, ici L3.
REMARQUE: La distance de migration des cellules de la pointe distale ou des cellules de liaison peut être utilisée comme guide, en plus du développement de la vulve. Pour le développement de la vulve, Mock et al.23 fournissent un guide utile, bien que le moment de cette étude ait été déterminé à 20 °C. À 25 °C, C. elegans de type sauvage subira la mue L3-L4 24 h après l’éclosion.
2. Collecte des mâles L4 et des hermaphrodites et fixation
- Préparer sans ARN, froid (-20 °C), 70% de méthanol avant la fixation.
- Sous un microscope à dissection à un grossissement de 30 à 50x, commencez à cueillir les mâles et les hermaphrodites des plaques de synchronisation sur des plaques séparées non ensemencées dès que les sexes peuvent être distingués (~ 21 h après l’éclosion, Figure 2), et continuez à cueillir pendant 1-2 h ou jusqu’à ce que 200 animaux soient collectés.
- Gardez les vers à 25 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade souhaité pour l’expérience.
- Lavez les vers de la plaque avec 1 à 2 mL de tampon M9 à l’aide d’une pointe de pipette prélavée avec un tampon M9 contenant 0,01% de détergent (pour empêcher les vers de coller à la pointe).
- Transférer les vers dans un tube de centrifugeuse de 1 mL.
- Tourner pendant 1 min à 21 000 × g pour granuler les vers. Retirez le surnageant.
- Ajouter 1 mL de tampon M9 et mélanger pour briser la pastille.
- Tourner pendant 1 min à 21 000 × g pour granuler les vers. Retirez le surnageant.
- Répétez le lavage.
- Ajouter 1 mL de méthanol glacé à 70 % et bien mélanger.
- Tourner pendant 1 min à 21 000 × g pour granuler les vers. Retirez le surnageant.
- Répétez les étapes 2.10 et 2.11.
- Ajouter 500 μL de méthanol à 70 %, mélanger et conserver à 4 °C pendant 1 h à toute la nuit.
3. Microdissection laser
REMARQUE: À partir de là, utilisez des réactifs et des consommables sans RNase; utilisez des conseils de filtre.
- Si la méthode CEL-Seq2 est utilisée pour traiter les échantillons, préparer un mélange maître pour chaque apprêt CEL-Seq2 (tableau supplémentaire S1) : pipette 2 μL d’apprêt CEL-Seq2, 1 μL de 10 mM dNTP et 9 μL de 1 % de β-mercaptoéthanol (dans de l’eau sans RNase) dans un tube étiqueté de 200 μL.
- Montage sur glissière
- Sous un microscope à dissection, pipettez 20 μL des vers fixes (20 à 40 vers à partir de l’étape 2.13) sur le côté mat d’une lame de verre à membrane de polyéthylène naphtalate (PEN) (où se trouve la membrane).
- Attendez que le méthanol s’évapore. Utilisez un chauffe-glissière pour accélérer l’évaporation.
REMARQUE: Des gouttes supplémentaires de méthanol peuvent être appliquées et une pointe de pipette peut être utilisée pour répandre les vers s’ils commencent à s’agglutiner lorsqu’ils sèchent. Lorsque les vers sont en touffes, ils peuvent être difficiles à disséquer.
- Mise en place du microscope
REMARQUE : Le protocole suivant est spécifique à l’instrument énuméré dans la Table des matières. Il doit être ajusté si un autre microscope LMD est utilisé.- Placez un humidificateur de bureau derrière la scène sur le côté du microscope LMD. Assurez-vous que la vapeur souffle directement sur la scène.
REMARQUE: L’humidificateur est utile pour réduire l’électricité statique, ce qui peut autrement empêcher la petite section de membrane de tomber dans le capuchon du tube. - Tournez la clé pour la puissance laser.
- Allumez la commande de la scène sous tension.
- Allumez le boîtier de commande du microscope.
- Ouvrez le logiciel Laser Microdissection .
- Retirez le bouclier en plastique au-dessus de la scène.
- Cliquez sur le bouton de déchargement avec la flèche vers le haut pour charger les glissières de membrane.
- Assurez-vous que la lame est complètement sèche, retournez pour que la membrane soit tournée vers le bas.
- Insérez la diapositive et cliquez sur Continuer dans la fenêtre Modifier l’échantillon .
- Remplacez le bouclier en plastique (plastic shield).
- En bas de l’écran, choisissez le support de diapositive contenant la diapositive.
- Pour charger les tubes, cliquez sur le bouton de déchargement avec la flèche vers le bas.
- Retirez le plateau et retirez le bloc de tube.
REMARQUE: Le bloc de tubes utilisé pour cette expérience est pour les tubes PCR de 500 μL. - Insérez les capuchons des tubes PCR de 500 μL dans le support et pliez le tube en dessous.
- Retournez le bloc dans le plateau et faites-le glisser dans l’étage du microscope.
- Dans la fenêtre contextuelle du périphérique collecteur de modifications , sélectionnez Tubes PCR et cliquez sur OK.
- Cliquez sur l’emplacement du tube vide en bas à gauche de l’écran sous les bouchons du tube du dispositif collecteur.
- Dans le panneau de commande du microscope , sélectionnez TL-BF pour l’éclairage en champ lumineux transmis.
- Placez un humidificateur de bureau derrière la scène sur le côté du microscope LMD. Assurez-vous que la vapeur souffle directement sur la scène.
- Découpage
REMARQUE : Ce protocole est spécifique à l’instrument énuméré dans la Table des matières.- À l’aide de la lentille 2,5x, ajustez la mise au point jusqu’à ce que les vers et la structure de la membrane soient visibles.
- Passez à l’objectif 20x.
- Déplacez la scène vers une région sans vers. Ajustez la mise au point de manière à ce que les structures en forme de bulles dans la membrane aient une couleur jaunâtre (Figure 3A, B) pour focaliser le laser sur le plan focal correct.
- Définissez les paramètres du laser; pour les pointes de queue, commencez par Power 45, aperture 30 et speed 20.
- Dans le panneau de commande laser , sélectionnez calibrer. Suivez les instructions.
REMARQUE: L’instrument effectuera cette étape automatiquement. Il garantira qu’une forme dessinée avec la souris sur l’écran est identique à la forme découpée par le laser. - En bas de l’écran, au niveau des bouchons de tube du dispositif collecteur, cliquez sur la position A.
- Sur le côté droit de l’écran, sélectionnez une forme unique | Dessiner + Couper. Sur le côté gauche de l’écran, sélectionnez PtoP.
- Tracez une ligne.
- Cliquez sur Démarrer la découpe pour que le laser coupe à travers la membrane.
REMARQUE: Il peut également graver une ligne dans le verre. - Si cette coupe d’essai a l’air bien (la membrane est coupée, les bords de coupe ont l’air lisses), passez à l’étape suivante. Sinon, ajustez la mise au point et coupez une autre ligne.
- Trouvez un ver. Basculez sur Déplacer + Couper et utilisez la souris pour couper à travers la queue.
REMARQUE: Si le laser ne coupe pas à travers la queue, ajustez la mise au point et augmentez la puissance du laser. Pour les tissus plus épais, la puissance du laser peut devoir être réglée sur 60. - Enregistrer les paramètres : onglet Fichier | Enregistrer la configuration de l’application; pour une récupération ultérieure, restaurez la configuration de l’application.
- Pour prélever l’échantillon, passez au réglage Dessiner + Couper avec la fonction PtoP et dessinez une forme pour terminer la coupe d’une section de membrane (Figure 3C).
REMARQUE: Les sections de membrane plus grandes et les sections en forme de rectangles ou de triangles plutôt que de cercles ou d’ovales sont plus faciles à localiser dans le capuchon du tube collecteur. - Sélectionnez le tube suivant au capuchon du tube du dispositif collecteur en bas de l’écran et coupez l’extrémité de queue suivante.
- Une fois que quatre queues sont coupées, déchargez le porte-tubes (cliquez sur Décharger avec la flèche vers le bas) et trouvez les sections de membrane sous un microscope à dissection (Figure 3D).
REMARQUE: Les sections peuvent être situées au milieu du capuchon du tube ou collées sur le côté du capuchon. - Poursuivez avec l’application en aval. Pour CEL-Seq2, pipette 1,2 μL d’un mélange maître d’apprêt CEL-Seq2 (à partir de l’étape 3.1) directement sur l’échantillon.
- Fermez le tube, étiquetez avec le numéro d’apprêt et placez immédiatement le bouchon du tube directement sur un morceau de glace carbonique pour congeler l’échantillon et empêcher la dégradation de l’ARN.
- Chargez plus de tubes, ramenez le bloc de tubes à la scène et coupez plus d’échantillons. Ajoutez un mélange d’apprêt CEL-Seq2 différent à chaque extrémité de queue.
- Conserver tous les tubes à -70 °C.
4. Séquençage de l’ARN à queue unique avec CEL-Seq2
REMARQUE: Pour plus de détails sur le protocole CEL-Seq2, voir Yanai et Hashimshony18.
- Nettoyez la zone du banc de laboratoire avec une solution de décontamination de la RNase pour éviter la dégradation de l’ARN.
- Préparez des mélanges maîtres et conservez-les sur la glace.
- Préparer le mélange maître de transcription inverse : 0,4 μL de tampon de premier brin, 0,1 μL de TNT de 0,1 M, 0,1 μL d’inhibiteur de la RNase et 0,1 μL de transcriptase inverse par échantillon.
- Préparer le mélange maître de réaction du deuxième brin : 7 μL d’eau, 2,31 μL de tampon de deuxième brin, 0,23 μL de dNTP, 0,08 μL d’E. coli ligase, 0,3 μL d’ADN polymérase d’E. coli , 0,08 μL de RNaseH par échantillon.
- Rupture des cellules ouvertes et recuit avec des amorces (voir le tableau supplémentaire S1 pour la liste complète des amorces) :
- Programmez le thermocycleur et son couvercle à 65 °C.
- Récupérez les échantillons à -70 °C et incubez-les dans le thermocycleur pendant 2,5 min.
- Tourner à 21 000 × g pendant 30 à 40 s.
- Incuber à 65 °C pendant 2,5 min.
- Déplacez-les immédiatement sur la glace.
- Tournez à 21 000 × g pendant 30 à 40 s et remettez-les sur la glace.
- Conversion de l’ARN en ADNc :
- Ajouter 0,8 μL du mélange de transcription inverse à chaque extrémité de la queue.
- Incuber à 42 °C pendant 1 h.
- Inactiver la chaleur à 70 °C Pendant 10 min.
- Déplacez-le immédiatement sur la glace.
- Ajouter 10 μL du deuxième mélange de brins à chaque extrémité de la queue.
- Faites glisser les échantillons.
- Tourner à 21 000 × g pendant 30 à 40 s.
- Incuber à 16 °C pendant 2 h.
- Nettoyage de l’ADNc :
- Préchauffer les perles de nettoyage de l’ADN à la température ambiante.
- Regroupez jusqu’à 40 échantillons dans un tube centrifuge de 1,5 mL (jusqu’à 480 μL).
- Mélanger les billes jusqu’à ce qu’elles soient bien dispersées et ajouter 20 μL de billes et 100 μL de tampon de liaison des billes pour chaque 100 μL de l’échantillon regroupé (pour 480 μL d’échantillon, ajouter 480 μL de tampon de perles et 96 μL de perles jusqu’à un volume final jusqu’à 1 056 μL). Bien mélanger par pipetage.
- Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Placer sur un support magnétique pendant au moins 5 minutes jusqu’à ce que le liquide semble clair.
- Retirer et jeter tout sauf 20 μL du surnageant.
- Ajouter 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé.
- Incuber pendant au moins 30 s, retirer le surnageant en le pipetant sans déranger les perles. Jetez le surnageant.
- Répétez les étapes 4.5.7 et 4.5.8 une fois.
- Séchez les perles à l’air libre pendant 15 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches.
- Remettre en suspension les billes (~6,4 μL) avec 6,4 μL d’eau. Mélangez bien en pipetant tout le volume vers le haut et vers le bas dix fois.
- Incuber à température ambiante pendant 2 min.
- Passez directement à la transcription in vitro (TVI).
- Transcription et fragmentation in vitro :
- Au tube contenant 6,4 μL d’échantillon et les billes, ajouter le mélange suivant (9,6 μL au total) : 1,6 μL de tampon T7 10x, 1,6 μL d’ATP, 1,6 μL d’UTP, 1,6 μL de CTP et 1,6 μL de GTP (chaque dNTP à une concentration de 75 mM) 1,6 μL d’enzyme T7.
- Incuber pendant 13 h à 37 °C avec une retenue de 4 °C.
- Ajouter 6 μL de solution d’exonucléase (le volume final doit être de 22 μL).
- Incuber pendant 15 min à 37 °C.
- Replacez le tube sur la glace et ajoutez 5,5 μL de tampon de fragmentation (0,25 × volume de réaction).
- Incuber pendant 3 min à 94 °C.
- Déplacez immédiatement le tube sur la glace et ajoutez 2,75 μL de tampon d’arrêt de fragmentation (0,5 × volume de tampon de fragmentation ajouté).
- Retirez les billes en plaçant le tube sur le support magnétique pendant au moins 5 minutes jusqu’à ce que le liquide apparaisse clair.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
- Nettoyage de l’ARN amplifié (ARNa) :
- Préchauffer les billes de nettoyage de l’ARN à la température ambiante.
- Mélanger les perles jusqu’à ce qu’elles soient bien dispersées.
- Pipette 55 μL de billes (1,8 × volume de réaction).
- Incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Placez le tube sur le support magnétique pendant au moins 5 minutes jusqu’à ce que le liquide semble clair.
- Retirer et jeter 80 μL du surnageant.
- Ajouter 200 μL d’éthanol à 70 % fraîchement préparé.
- Incuber pendant au moins 30 s, retirer le surnageant en pipetant sans déranger les perles. Jetez le surnageant.
- Répétez le lavage à l’éthanol deux fois de plus.
- Séchez les perles à l’air libre pendant 15 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches.
- Remettre en suspension les billes avec 7 μL d’eau. Pipettez tout le volume vers le haut et vers le bas 10 fois pour bien mélanger.
- Incuber à température ambiante pendant 2 min.
- Placez le tube avec les perles sur le support magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que le liquide apparaisse clair.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
NOTE: Point d’arrêt: les échantillons peuvent être conservés à -70 °C.
- Facultatif : Vérifiez la quantité et la qualité de l’ARNa à l’aide d’un système d’électrophorèse automatisé suivant le protocole du fabricant.
- Préparation de la bibliothèque :
- À 5 μL d’ARN, ajouter 1 μL d’amorce RT hexamère aléatoire de 100 μM (voir le tableau des matériaux) et 0,5 μL de 10 mM dNTP.
- Incuber à 65 °C pendant 5 min.
- Ajouter 4 μL du mélange suivant à température ambiante : 2 μL de tampon First Strand, 1 μL de DDT 0,1 M, 0,5 μL d’inhibiteur de la RNase, 0,5 μL de transcriptase inverse.
- Incuber à 25 °C pendant 10 min.
- Incuber à 42 °C pendant 1 h (dans un four d’hybridation ou un cycleur thermique préchauffé avec le couvercle réglé sur 50 °C).
- Incuber à 70 °C pendant 10 min.
- Transférer 5 μL dans un nouveau tube (maintenir le reste de la réaction à -20 °C). Ajouter 5,5 μL d’eau ultrapure, 1 μL d’amorce PCR à ARN (RP1), 1 μL d’amorce PCR à ARN indexée (RPIX) et 12,5 μL de mélange PCR.
- Utilisez le programme suivant sur le thermocycleur : 30 s à 98 °C, 11 cycles de : (10 s à 98 °C, 30 s à 60 °C, 30 s à 72 °C), 10 min à 72 °C, maintenir à 4 °C.
REMARQUE: Point d’arrêt: les échantillons peuvent être conservés à -20 °C.
- Nettoyage de la bibliothèque :
- Préchauffer les perles de nettoyage de l’ADN à la température ambiante.
- Mélanger les perles jusqu’à ce qu’elles soient bien dispersées.
- Ajouter 25 μL de billes à la réaction PCR. Bien mélanger par pipetage.
- Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Placez le tube sur le support magnétique pendant au moins 5 minutes jusqu’à ce que le liquide semble clair.
- Retirer et jeter 45 μL du surnageant.
- Ajouter 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé.
- Incuber pendant au moins 30 s, retirer et jeter le surnageant sans déranger les perles.
- Répétez le lavage à l’éthanol une fois.
- Sécher les billes à l’air libre pendant 15 min ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches.
- Remettez-les en suspension avec 25 μL d’eau. Bien mélanger par pipetage.
- Incuber à température ambiante pendant 2 min.
- Placez le tube sur le support magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que le liquide semble clair.
- Transférer 25 μL de surnageant dans un nouveau tube.
- Répétez les étapes 4.10.2 à 4.10.10 une fois.
- Remettre en suspension avec 10,5 μL d’eau. Bien mélanger par pipetage.
- Incuber à température ambiante pendant 2 min.
- Placez le tube sur le support magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que le liquide semble clair.
- Transférer 10 μL du surnageant dans un nouveau tube et conserver à -20 °C.
- Évaluer la qualité et la quantité de la bibliothèque en fonction des exigences de l’installation de séquençage.
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Representative Results
Après la microdissection par capture laser, les extrémités individuelles de la queue des mâles et des hermaphrodites à 4 points temporels (L3 22 h après l’éclosion; L4 24, 26 et 28 h après l’éclosion) ont été préparés pour le séquençage de l’ARN à l’aide du protocole CEL-Seq2. Les amorces CEL-Seq2 contiennent des codes-barres uniques qui permettent d’identifier bioinformatiquement les lectures de séquençage d’un échantillon particulier (dans ce cas, une pointe de queue individuelle). Des données de séquençage ont été générées avec cette méthode pour un total de 557 extrémités de queue (266 hermaphrodites et 291 mâles sur 4 points temporels de développement, 59 à 78 queues par sexe et point temporel). Les codes-barres CEL-Seq2 ont été récupérés pour 97 % (c.-à-d. 543) de ces embouts de queue (tableau supplémentaire S2). Pour la plupart des bibliothèques, le taux de récupération était de 99 à 100 %; cependant, il était de 88 % pour un point temporel masculin. Il convient de noter qu’environ la moitié des pointes de queue mâles des points de temps de 22, 24 et 28 h ont été stockées à -80 ° C pendant environ 4 mois en raison de retards liés à la COVID-19. Cela démontre que, bien qu’il soit idéal de préparer les bibliothèques de séquençage peu de temps après l’échantillonnage, il est possible de stocker les échantillons disséqués plus longtemps avant la préparation de la bibliothèque.
Les amorces CEL-Seq2 ajoutent également un UMI à chaque transcription d’ARNm. Cela permet l’élimination des doublons par PCR et la quantification précise de l’expression des gènes dans l’échantillon. Le nombre d’UMI variait considérablement d’un bout de queue à l’autre (figure 4; moyenne masculine = 92 560; mâle min. = 155; mâle max. = 1 183 998; moyenne hermaphrodites = 67 597; hermaphrodites min. = 132; hermaphrodites max. = 630 427). Pour le nombre d’UMI par extrémité de queue, voir le tableau supplémentaire S3. En raison de la faible quantité d’ARN d’entrée pour la préparation d’une bibliothèque unicellulaire, les données de séquençage unicellulaire sont connues pour avoir une grande quantité de bruit technique. Par conséquent, il est recommandé de filtrer les échantillons qui ont un nombre d’UMI très faible ou très élevé avant l’analyse24.
Le paquet R powsimR25 a été utilisé pour évaluer la puissance statistique et les exigences de taille d’échantillon pour détecter de manière fiable les gènes exprimés différentiellement (DE) dans des expériences de séquençage d’ARN unicellulaires ou en vrac. Les paramètres des simulations étaient basés sur un ensemble de données de séquençage de 70 extrémités individuelles de la queue mâle (au point de temps de 24 heures) obtenues avec la méthode décrite ici. Les changements de pli logarithmiques attendus étaient basés sur les résultats d’une expérience distincte de séquençage de l’ARN qui a regroupé 80 à 100 extrémités de queue. Les simulations ont déterminé que les données à extrémité unique ont une puissance suffisante (taux positif réel = TPR) pour détecter les gènes DE, à l’exception des gènes qui ont une valeur d’expression moyenne très faible (en haut de la figure 5; la ligne pointillée représente 80% TPR). L’ajout de plus d’embouts de queue simulés par point temporel a quelque peu augmenté la puissance pour les gènes faiblement exprimés. Une tendance similaire est observée pour le taux de fausses découvertes (FDR). Le FDR est élevé (>0,10) pour les gènes faiblement exprimés; toutefois, pour les gènes plus fortement exprimés, il se situe au niveau ou en dessous du seuil nominal de 0,10 (ligne pointillée pour FDR au bas de la figure 5). En résumé, augmenter le nombre de queues échantillonnées par point temporel au-dessus de 70 ne ferait pas grand-chose pour réduire le FDR ou augmenter la puissance. Cependant, 70 embouts de queue fournissent un FDR beaucoup plus faible et une puissance plus forte que 30 embouts de queue.
Figure 1 : Vue d’ensemble de la procédure de synchronisation de Caenorhabditis elegans avec la méthode de l’éclosion et la microdissection laser des extrémités de queue. Abréviations : L1-L4 = stades larvaires 1 à 4; PEN = polyéthylène naphtalate; LMD = microdissection laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Apparition d’hermaphrodites et de mâles de C. elegans L3 sous un microscope à dissection. Les hermaphrodites (A, B) et les mâles (C, D) à 21-23 h après l’éclosion peuvent être distingués au microscope à dissection (grossissement ~50x) par la morphologie de leur queue (flèches). La queue des hermaphrodites est étroite, tandis que celle des mâles est enflée et semble claire. Barres d’échelle = 0,1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Apparence de la structure de la glissière de la membrane PEN et de la queue du ver. La mise au point est correcte pour la dissection du tissu visualisé avec la lentille 20x (A) et 40x (B) au microscope. (C) Queue disséquée et membrane PEN partiellement découpée. Après avoir comblé l’espace dans la coupe, la pièce de membrane tombera dans le capuchon du tube sous la glissière. (D) Capuchon du tube avec une section de membrane PEN contenant une extrémité de queue disséquée. Barres d’échelle = 0,1 mm (A-C), 1 mm (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Nombre d’UMI naturels transformés en logarithme par extrémité de queue individuelle pour différents points temporels et sexes. L’ARN de queues individuelles a été préparé pour le séquençage à l’aide de la méthode CEL-Seq2; 557 queues ont été séquencées au total, avec 59 à 78 queues par sexe et par point temporel. Les valeurs aberrantes UMI extrêmement faibles et élevées seraient supprimées des données avant l’analyse. Abréviation : UMI = identifiant moléculaire unique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résultats d’une analyse de puissance a posteriori à l’aide de simulations avec powsimR. Le logiciel powsimR détermine le nombre d’échantillons indépendants nécessaires pour détecter les gènes DE à différents niveaux d’expression. Les gènes sont regroupés par expression moyenne transformée en tant que logarithme naturel des comptes UMI. (A) Puissance (TPR) pour détecter les gènes DE entre deux conditions (ici, mâle vs hermaphrodite) pour quatre simulations différentes (graphiques de couleurs différentes) incorporant différentes tailles d’échantillons (nombre de queues individuelles) par condition. La ligne pointillée indique un TPR à 80 %. (B) FDR dans les quatre mêmes simulations que dans (A), ligne pointillée indiquant 10% FDR. Les graphiques montrent qu’une taille d’échantillon de 70 extrémités de queue (vert) par condition est suffisante pour détecter les gènes DE, à l’exception des gènes avec de très faibles niveaux d’expression. C’est-à-dire que la puissance et le taux de fausse découverte de ces gènes ne peuvent pas être grandement améliorés en augmentant la taille de l’échantillon au-delà de 70. Abréviations: DE = exprimé différemment; UMI = identifiant moléculaire unique; TPR = taux positif réel; FDR = taux de fausses découvertes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire S1 : Séquences d’amorces utilisées dans le protocole CEL-Seq2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S2 : Embouts de queue individuels échantillonnés ou récupérés. Les amorces CEL-Seq2 contiennent des codes-barres uniques qui permettent d’identifier les lectures de séquençage de chaque échantillon de manière bioinformatique. Les lectures ont été récupérées à partir de 97 % des échantillons de la pointe de la queue préparés pour le séquençage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S3 : UMI compte tous les échantillons avec des codes-barres récupérés, comme indiqué dans le tableau supplémentaire S2. Abréviation : UMI = identifiant moléculaire unique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Étapes critiques de la méthode
Si elle est effectuée correctement, la méthode décrite ici permettra d’obtenir des profils d’ARN robustes avec un nombre relativement faible d’échantillons disséqués au laser (70 pointes de queue dans cet exemple). Cependant, pour les échantillons provenant d’animaux en développement, une synchronisation étroite est essentielle pour réduire la variabilité entre les échantillons. Pour cette raison, le protocole recommande la méthode hatch-off pour la synchronisation des vers. Ici, le chercheur peut déterminer et contrôler avec précision la différence d’âge entre les individus (1 h dans le présent protocole). De plus, la méthode de l’éclosion est applicable à toutes les espèces, même si les embryons sont sensibles à l’eau de Javel, si L1 ne s’arrête pas ou si la récupération après l’arrêt L1 est variable. Pour une synchronisation réussie par éclosion, les étapes de lavage sont cruciales: tous les adultes et les larves doivent être retirés au début de la période d’éclosion et aucun embryon ne doit être lavé avec le L1 nouvellement éclos à la fin de la période d’éclosion. Cela ne réussit que si la surface de la gélose de la plaque n’est pas endommagée par des fissures, des trous ou des bulles, si la pelouse bactérienne sur la plaque est fraîche et pas trop épaisse et si le liquide n’est ajouté et agité que très doucement.
Si les données doivent être obtenues séparément pour les mâles et les hermaphrodites/femelles, une identification fiable des sexes est également importante. Distinguer les larves de L3 par sexe (voir la figure 2) nécessite de l’expérience. Il est recommandé de s’entraîner à cueillir des mâles L3 et des hermaphrodites / femelles et de vérifier le taux de réussite une fois que les animaux sont devenus adultes et que les sexes sont facilement distingués. Après l’ARN-Seq à tissu unique, les valeurs aberrantes peuvent également être identifiées par analyse en composantes principales et éliminées, si nécessaire.
Pour une récupération réussie des échantillons découpés au laser, il est important de réduire autant que possible l’électricité statique. Les pièces de membrane PEN chargées ne tombent souvent pas dans le capuchon du tube, mais collent à la lame ou à toute autre partie du microscope. Un remède consiste à augmenter l’humidité dans la pièce et plus particulièrement autour du microscope en plaçant un petit humidificateur à côté de la scène. De plus, les lames de membrane peuvent être traitées avec de la lumière UV. Pour ce faire, incuber les lames dans une chambre de réticulation UV-C (254 nm) et délivrer au moins 1 joule d’énergie, ou exposer les lames à la lumière UV dans un banc à flux d’air laminaire pendant 30 min.
Étant donné que l’objectif du protocole est RNA-Seq, il est essentiel de conserver un environnement de travail sans RNase. En commençant par la solution de fixation, les réactifs, les récipients et les consommables doivent être exempts de RNase, la surface de travail doit être décontaminée et les chercheurs doivent porter des gants propres. Les échantillons disséqués doivent être congelés dès que possible et conservés à -70 °C jusqu’à la suite du traitement. Il est également recommandé d’utiliser des tubes et des embouts à faible rétention pour la partie CEL-Seq2 du protocole.
Le présent article ne fournit qu’un aperçu de base du protocole CEL-Seq2, qui a déjà été publié par ses développeurs avec des notes et des conseils utiles17,18. Il est recommandé de consulter ces publications avant d’utiliser la méthode CEL-Seq2.
Les données LMD-ARN-Seq peuvent être validées par hybridation in situ fluorescente à molécule unique-ARN (smRNA FISH)26,27,28. smRNA FISH a été largement utilisé chez C. elegans et se prête à d’autres espèces de nématodes, différente de l’immunocoloration avec des anticorps existants (qui peuvent ne pas réagir de manière croisée) ou de l’introduction de rapporteurs transcriptionnels par transgénèse. Ce dernier fonctionne bien chez C. elegans et certaines espèces apparentées de Caenorhabditis 29, mais la transgénèse peut être plus difficile chez d’autres espèces de nématodes30,31.
Limites de la méthode
La méthode décrite ici fonctionne très bien pour collecter les pointes de queue, un tissu mince à l’extrémité d’un ver. Il est plus difficile de disséquer les tissus au milieu plus épais des larves plus âgées ou des adultes. Le logiciel de l’instrument utilisé ici comprend un réglage pour plusieurs coupes placées à des niveaux plus profonds dans le tissu. Ce réglage peut être utilisé pour couper des zones plus épaisses de l’animal. Parce que les vers doivent être fixés avant la dissection, les détails structurels sont difficiles à voir, ce qui empêche la dissection précise de petites structures spécifiques. Comme mentionné ci-dessus, LMD-RNA-Seq n’est pas une méthode HTP. Cependant, 50 à 70 échantillons peuvent être disséqués en un après-midi.
Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes/alternatives
LMD-ARN-Seq peut être utilisé dans n’importe quelle espèce même si aucun outil transgénique n’est disponible. D’autres méthodes reposent sur le tri FACS des cellules marquées par fluorescence 8,9,32 ou l’isolement des noyaux marqués33,34 et nécessitent donc des animaux transgéniques. Les méthodes qui dissocient et isolent les cellules de C. elegans postmbryonique ont tendance à manquer les tissus aux deux extrémités du ver (Dylan Rahe, communication personnelle). Ces mises en garde sont surmontées en combinant l’ARN unicellulaire Seq avec la cryosection de vers entiers (tomographie à ARN)35. Cette méthode a été utilisée pour comparer l’expression spatiale des gènes entre C. elegans et un autre nématode rhabditidé, Pristionchus pacificus36. Alternativement, on peut expérimenter avec des vers incorporés à la paraffine fixée au formol (FFPE). Ce matériel a été utilisé avec succès pour le séquençage de l’ARN à la suite de LMD d’échantillons de tissus de mammifères37. Cependant, la tomographie à ARN et la LMD des vers FFPE se limitent à l’analyse d’une poignée d’animaux. Ils ne sont donc pas aussi bien adaptés à l’étude de l’expression dynamique des gènes dans les tissus en développement que LMD-ARN-Seq.
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Disclosures
Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les subventions des NIH (R01GM141395) et de la NSF (1656736) à DF et des bourses NIH (F32GM136170) à AW. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free | Leica | 11600288 | for LMD |
| 500 µL PCR tubes (nuclease-free) | Axygen | 732-0675 | to cut the tail tips into |
| Compound microscope with 40x objective and DIC | any | to check age of worms | |
| Desktop humidifier | any | ||
| Dissection microscope with transmitted light base | any | for all worm work | |
| glass pasteur pipets | any | handle of worm pick | |
| glass slides and coverslips | any | to check age of worms | |
| LMD6 microdissection system | Leica | multiple | to cut tail tips |
| LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf | 22431005 | |
| M9 Buffer | Recipe in WormBook | ||
| Methanol 99.8% | Sigma | 322415 | to fix worms |
| NGM growth medium | US Biological | N1000 | Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook |
| P10 pipette variablle volume | e.g. Gilson | ||
| P1000 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| P2 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| Pipette tips 1,000 µL | any | ||
| Pipette tips 1-10 µL filtered | any | ||
| platinum iridium wire | Tritech | PT-9010 | to make worm pick |
| sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes | any | ||
| Tween 20 | Sigma | P9416 | Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips |
| vented 6 mm plastic Petri dishes | any | ||
| For CEL-Seq2 | |||
| 4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection | Aligent | automated electrophoresis system | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA cleanup beads |
| Bead binding buffer 20% PEG8000, 2.5 M NaCl | |||
| CEL-Seq2 primers (see Table S1) | Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf | 6335000020 | Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes. |
| DNA Polymerase I (E. coli) | Invitrogen | 18052-025 | |
| dNTP mix 10 mM | any | ||
| E. coli DNA ligase | Invitrogen | 18052-019 | |
| Ethanol | |||
| ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up | Affymetrix | 78200 | exonuclease solution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | For step 4.6.1 |
| Nuclease-free water | any | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531 | PCR mix step 4.9.7 |
| random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN |
IDT | a primer with 6 nucleotides that are random | |
| RNA Fragmentation buffer | NEB | E6150S | |
| RNA Fragmentation stop buffer | NEB | E6150S | |
| RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) | Illumina, NEB, or IDT | RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina | |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Scientific | 7000TS1 | or any other similar product |
| RNaseH (E. coli) | Invitrogen | 18021-071 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | |
| Second strand buffer | Invitrogen | 10812-014 | |
| Superscripit II | Invitrogen | 18064-014 | reverse transcriptase |
References
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