Summary
Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.
Abstract
Como vertebrado, el pez cebra ha sido ampliamente utilizado en estudios biológicos. El pez cebra y los humanos comparten una alta homología genética, lo que permite su uso como modelo para enfermedades humanas. El estudio de la función génica se basa en la detección de patrones de expresión génica. Aunque la inmunohistoquímica ofrece una forma poderosa de evaluar la expresión de proteínas, el número limitado de anticuerpos disponibles comercialmente en el pez cebra restringe la aplicación de costaining. La hibridación in situ es ampliamente utilizada en embriones de pez cebra para detectar la expresión de ARNm. Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica para secciones de embriones de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. La inmunohistoquímica y la imagen de una sola criosección se realizaron después de la hibridación in situ . El protocolo es útil para desentrañar el patrón de expresión de dos genes, primero mediante la detección de transcripción in situ y luego mediante inmunohistoquímica contra una proteína en la misma sección.
Introduction
El pez cebra es un poderoso modelo vertebrado para estudios de desarrollo y genética 1,2. El pez cebra y los humanos comparten una alta homología genética (el 70% de los genes son compartidos con el genoma humano), lo que permite su uso como modelo para enfermedades humanas3. En el pez cebra, es bastante común detectar los patrones de expresión de dos genes y su relación espacial. La inmunohistoquímica se utilizó por primera vez en 1941 para detectar patógenos en tejidos infectados mediante la aplicación de anticuerpos marcados con FITC4. La proteína diana en la sección de tejido se marca primero con un anticuerpo primario, y la sección se marca con un anticuerpo secundario contra la inmunoglobulina de la especie huésped del anticuerpo primario. La tinción de anticuerpos es un enfoque robusto para detectar la localización de proteínas, que ofrece una alta resolución óptica a nivel intracelular. Sin embargo, el número de anticuerpos disponibles es muy limitado en el pez cebra. Un estudio reciente muestra que aproximadamente 112,000 anticuerpos están disponibles comercialmente para ratones; Sin embargo, se ha demostrado que muy pocos anticuerpos son confiables en el pez cebra5.
En cambio, en el pez cebra, la hibridación in situ se ha aplicado ampliamente para el análisis de patrones de expresión génica. Este método se utilizó por primera vez para evaluar la expresión génica en embriones de Drosophila en la década de 19806,7, y desde entonces, esta tecnología se ha desarrollado y mejorado continuamente. Inicialmente, se utilizaron sondas de ADN radiomarcadas para detectar transcripciones de ARNm; Sin embargo, la resolución espacial era relativamente baja y había riesgos potenciales para la salud causados por la radiactividad. Posteriormente, la hibridación in situ se basa en las sondas de ARN marcadas con digoxigenina (DIG) o fluoresceína (Fluo), que se conjugan con fosfatasa alcalina (AP) o se detectan mediante amplificación de señal de tiramida fluorescente (TSA)8,9. Aunque TSA se ha utilizado para detectar dos o tres genes, el marcado DIG de sondas de ARN y el anticuerpo conjugado antiDIG AP siguen siendo enfoques altamente sensibles, estables y ampliamente utilizados para la hibridación in situ. Por lo tanto, los anticuerpos comercializados combinados con sondas in situ marcadas con DIG son útiles para proporcionar información sobre la localización de proteínas y la expresión de un gen.
Los embriones de montaje entero no pueden revelar la relación espacial entre los genes debido a la baja resolución óptica, a pesar de que los embriones de pez cebra son pequeños y transparentes10. Por lo tanto, la sección es necesaria para analizar los patrones de expresión de los genes a nivel intracelular. La criosección ha sido ampliamente utilizada en el pez cebra, ya que es fácil de realizar y puede preservar eficazmente el antígeno. Por lo tanto, la hibridación in situ combinada con inmunohistoquímica en criosecciones de pez cebra ofrece una forma poderosa de analizar los patrones de expresión de dos genes. Se ha aplicado una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica al pez cebra11. Sin embargo, el tratamiento con proteinasa K se utilizó para mejorar la penetración de la sonda a expensas de la integridad del antígeno. Para superar esta limitación, este protocolo utiliza el calentamiento para inducir la recuperación de antígenos. Este protocolo no solo es aplicable a embriones de diferentes estadios y secciones de tejido de diversos grosores (secciones de cabeza de 14 μm y secciones de médula espinal de 20 μm), sino que también se ha verificado mediante el uso de genes expresados en dos órganos, incluyendo la cabeza y la médula espinal.
Este artículo describirá cómo combinar la hibridación in situ y la tinción de anticuerpos en embriones de pez cebra en criosecciones. La versatilidad de este protocolo se demuestra mediante el uso de una serie de combinaciones de hibridación-inmunohistoquímica in situ, incluidas las sondas de hibridación in situ para dos neuronas diferentes. Este método es adecuado para detectar ARNm y proteínas en diferentes regiones y embriones de diferentes edades, así como los patrones de expresión de dos genes.
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Protocol
Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nantong (No. S20191210-402).
1. Recolección de embriones de pez cebra
- Coloque un par de peces cebra en tanques de reproducción la noche antes de que se recolecten los huevos, uno un pez cebra transgénico y el otro un pez cebra de tipo salvaje AB (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB tipo salvaje o Tg (hb9: egfp) X AB tipo salvaje) (consulte la Tabla de materiales). Use un divisor de plástico diagonal para separar al macho y a la hembra para impedir el acceso físico. Al día siguiente, coloque la parte superior del tanque de cría en una parte inferior limpia llena de agua dulce y retire el divisor del tanque de reproducción. Deje que los peces se apareen durante 10-20 minutos y recoja los huevos después de que se hayan hundido en el fondo del tanque de reproducción.
- Cultivar los embriones en medio embrionario E3 (véase la Tabla de materiales) que contengan azul de metileno (1 ml de azul de metileno al 0,05% en 1 L de medio embrionario E3) a 28,5 °C.
- Tratar los embriones a las 24 h después de la fertilización (hpf) con feniltiourea (PTU, consulte la Tabla de materiales) para prevenir la formación de pigmento.
NOTA: Los animales de ambos sexos se utilizan en experimentos.
2. Hibridación in situ
NOTA: El agua utilizada para los pasos 2.1-2.11 es agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) (consulte la Tabla de materiales).
- Fijar ~10 embriones con 0.5-1 ml de paraformaldehído fresco al 4% (PFA, ver la Tabla de materiales) en un tubo de microfuga de 1.5 ml a 4 °C durante la noche durante 12-14 h.
NOTA: El protocolo para la hibridación in situ se modifica ligeramente de la literatura publicada anteriormente12. El PFA debe prepararse y almacenarse a 4 °C en el plazo de una semana de uso o durante un mes a -20 °C. Todos los siguientes pasos en la hibridación in situ se realizaron utilizando tubos de microfuga de 1,5 ml. - Use pinzas para eliminar la piel de embriones mayores de 48 hpf.
NOTA: La piel se extrae para facilitar la penetración de sondas de ARN en la región del tronco de embriones mayores de 48 hpf. - Deshidratar gradualmente los embriones lavándolos con metanol al 25%, 50% y 75% en 1x solución salina tamponada con fosfato que contenga 0,1% de Tween-20 sucesivamente (PBST, consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente. Luego, lave los embriones durante 5 minutos en metanol 100% a temperatura ambiente. Incubar los embriones en metanol al 100% a -20 °C durante al menos toda la noche durante 12-14 h.
NOTA: Los embriones deshidratados se pueden almacenar en 100% de metanol a -20 °C durante 6 meses. - Rehidratar gradualmente los embriones lavando con 75%, 50% y 25% de metanol en PBST sucesivamente durante 5 min cada uno a temperatura ambiente. Lave el embrión tres veces con PBST durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente.
- Digerir los embriones con 10 μg/ml de proteinasa K (ver la Tabla de materiales) en PBST a temperatura ambiente (ver Tabla 1).
- Lavar los embriones con PBST durante 5 min. Realice este paso de lavado tres veces.
- Vuelva a fijar los embriones lavados en PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Este paso detiene la digestión porque la PFA inactiva la proteinasa K. Asegúrese de que la muestra se mezcle suavemente para exponer todos los embriones a PFA; Los tubos se pueden colocar de lado para distribuir uniformemente los embriones en la solución. Este PFA no tiene que ser fresco (se puede refrigerar hasta por 2 semanas). - Lave el embrión tres veces con PBST, incubando durante 5 minutos durante cada lavado.
- Realizar la prehibridación de los embriones incubando con solución de prehibridación (preHYB, ver la Tabla de materiales) a 65 °C durante 5 min. Reemplace preHYB con solución de hibridación (HYB, consulte la Tabla de materiales) y prehibridar durante al menos 4 h en HYB.
NOTA: Antes de proceder con la prehibridación, precaliente las soluciones a 65 °C. La formamida (ver la Tabla de materiales) se utiliza para mantener la forma y la estructura del tejido. La formamida también evita la unión de fragmentos no homólogos a bajas temperaturas. - Calentar la sonda (Insm1a o 5-HT2C) en HYB durante 5 min a 95 °C antes de añadirla a los embriones. Utilice la sonda a 1 μg/ml HYB. Retire la mayor cantidad posible de preHYB sin dejar que los embriones entren en contacto con el aire, y agregue una sonda precalentada en HYB al tubo que contiene los embriones.
NOTA: Se puede utilizar una sonda de ARN marcada para hibridar con una secuencia de ARNm objetivo en los embriones. Por lo tanto, la sonda se puede utilizar para detectar la expresión de un gen de interés y la ubicación del ARNm. - Dejar que la sonda se hibridue durante la noche (12-14 h) a 50-70 °C.
NOTA: La temperatura de hibridación difiere para diferentes sondas. - Al día siguiente, aspire la solución de la sonda con una pipeta y guárdela en un tubo a -20 °C para que pueda reutilizarse muchas veces.
- Lave los embriones de la siguiente manera:
- Lavar los embriones durante 15 min con 100% HYB a 65 °C.
- Lave los embriones secuencialmente con 75%, 50% y 25% de HYB en 2x citrato salino estándar que contenga 0,1% de Tween-20 (SSCT, consulte la Tabla de materiales) durante 15 minutos cada uno a 65 °C.
- Lavar los embriones durante 15 min en 2x SSCT a 65 °C.
- Lavar los embriones durante 15 min en 0,2x SSCT a 65 °C.
- Lave los embriones dos veces durante 10 minutos en tampón de ácido maleico que contenga 0.02% de Tween-20 (MABT, consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente.
- Bloquear los embriones hibridados y lavados durante al menos 2 h a temperatura ambiente con una solución bloqueante al 2%-1 (ver la Tabla de materiales).
- Reemplace la solución bloqueante-1 con antidigoxigenina AP (dilución 1:4,000, ver la Tabla de materiales) en una solución de bloqueo fresca al 2%-1 y agite durante la noche durante 12-14 h a 4 °C.
- Lave los embriones cuatro veces durante 30 minutos en MABT a temperatura ambiente.
NOTA: Retire el BM púrpura (consulte la Tabla de materiales) del refrigerador durante el tercer lavado y agítelo ocasionalmente durante los lavados posteriores. - Lave los embriones dos veces durante 10 minutos en NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, consulte la Tabla de materiales).
- Use una pipeta para eliminar la mayor cantidad posible de NTMT de los embriones. Reemplácelo con sustrato AP púrpura BM y tiñe los embriones a temperatura ambiente en la oscuridad. Controle los cambios de color cada 30 minutos para controlar el grado de teñido.
NOTA: El tiempo de teñido específico es diferente y debe ajustarse de acuerdo con cada sonda. La incubación de los embriones a 37 °C puede acelerar la reacción. La incubación de los embriones a 4 °C puede aumentar el tiempo de reacción y se puede hacer durante la noche. - Una vez que se desarrolle en la medida deseada, detenga la reacción enjuagando brevemente con NTMT dos veces. Después de la hibridación in situ , enjuague los embriones con PBST tres veces durante 20 min.
3. Incrustación
- Sumerja los embriones en sacarosa al 5% en 1x PBS (consulte la Tabla de materiales) durante la noche durante 12-14 h a 4 °C.
- Cambiar la solución que cubre los embriones al 15% de sacarosa en 1x PBS e incubar durante la noche durante 12-16 h a 4 °C.
- Cambiar la solución que cubre los embriones al 30% de sacarosa en 1x PBS e incubar durante 1-2 días a 4 °C.
NOTA: Incubar en esta solución hasta que los embriones se hundan hasta el fondo del tubo. - Llene un criomold con un medio de temperatura de corte óptima (OCT) (consulte la Tabla de materiales). Transferir los embriones en sacarosa al 30% al criomold con medio OCT. Revuélvalos para eliminar la sacarosa de los embriones.
- Transfiera los embriones a un nuevo criomold para tejido y llénelo suavemente con medio OCT, evitando la formación de burbujas.
- Sumerge cada embrión, empujándolo hacia el fondo del criomolde, y coloca cada embrión en la orientación deseada (ya sea dorsal-ventral o lateral). Mantenga los embriones en línea recta.
NOTA: Se recomienda encarecidamente colocar solo un embrión en cada criomold (consulte la Tabla de materiales). - Coloque los embriones incrustados en criomoldes en un baño de etanol de hielo seco.
- Conservar a -80 °C al menos durante la noche durante 12-14 h.
NOTA: Los criomoldes se pueden mantener a -80 °C durante al menos un mes.
4. Criosección
- Ajuste las criosecciones con un criostato a -20 °C.
- Retire el bloque de muestras del criomold y colóquelo en el criostato. Coloque el medio OCT en la base del mandril refrigerado y coloque el bloque encima.
- Asegúrese de que el bloque de muestras esté paralelo a la hoja de afeitar. Recorte cuidadosamente el exceso de medio OCT alrededor de la muestra.
- Cortar en secciones de 12-20 μm de espesor utilizando un criostato. Transfiera rápidamente las secciones a diapositivas de vidrio para que cada diapositiva tenga 3-4 secciones. Deje que las muestras alcancen la temperatura ambiente y guarde las secciones en una caja portaobjetos sellada a -80 °C para su uso posterior.
5. Inmunotinción
NOTA: La tinción GFP se realiza en las secciones.
- Lave las diapositivas que contienen las secciones con PBS durante 5 minutos.
- Calentar el tampón de citrato a ebullición en un microondas.
- Coloque los portaobjetos en el tampón y continúe calentando para mantener la solución cerca de ebullición durante aproximadamente 20 minutos.
NOTA: Este paso ayuda en la recuperación de antígenos. El tejido permanece intacto incluso a altas temperaturas, lo que mejora la calidad de la tinción al evitar el plegamiento, el daño o el desprendimiento de los tejidos. - Deje que las muestras se enfríen lentamente a temperatura ambiente antes del siguiente paso. Drene el exceso de solución, seque cuidadosamente el área alrededor de cada sección con un trozo de tejido y dibuje un círculo alrededor de la sección con una pluma repelente al agua (consulte la Tabla de materiales) para formar una barrera hidrófoba. Tenga cuidado de no secar las secciones de tejido.
- Lave los portaobjetos dos veces con PBS, incubando durante 10 minutos durante cada lavado.
- Bloquear durante 2 h en solución de bloqueo-2 (ver la Tabla de materiales) a temperatura ambiente.
- Pipetear solución de anticuerpos primarios (α-GFP monoclonal de ratón, 1:250, véase la tabla de materiales) por portaobjetos e incubar los portaobjetos en una caja húmeda inmunohistoquímica a 4 °C durante la noche.
- Lave los portaobjetos tres veces con PBS, incubando durante 10 minutos durante cada lavado.
- Drenar el exceso de PBS. Incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario apropiado (1:400, ver la Tabla de materiales) durante 1 h a temperatura ambiente en PBS.
- Lave los portaobjetos tres veces con PBS, incubando durante 10 minutos durante cada lavado.
- Drene el exceso de PBS, pipete el medio de montaje en la corredera y monte con un cubreobjetos deslizante.
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Representative Results
Este protocolo se puede utilizar para examinar simultáneamente el patrón de expresión de un ARNm y una proteína. La figura 1 muestra el flujo de trabajo experimental. El receptor 5-HT2C es un subtipo del receptor 5-HT unido por el neurotransmisor serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT). Está ampliamente distribuida en el sistema nervioso central (SNC) y puede regular significativamente una variedad de funciones cerebrales, incluyendo el apetito, el estado de ánimo, la ansiedad y el comportamiento reproductivo13. La expresión de 5-HT2C en el SNC fue detectada por la línea transgénica Tg (foxp2:egfp-caax), en la que las neuronas foxP2 son marcadas por la proteína fluorescente verde fluoresceína (GFP). La GFP no se expresó en el pez cebra de tipo salvaje, sino solo en la línea transgénica. La detección simultánea de la expresión de ARN (5-HT2C, la sonda para htr2c, Figura 2A) y proteína (GFP, antiGFP, Figura 2B) se puede utilizar para el análisis de colocalización de proteínas y ARNm.
El 1a asociado a insulinoma (insm1a), un factor de transcripción de dedos de zinc, se identificó por primera vez a partir de la biblioteca de reducción tumoral y desempeñó varias funciones en la formación y diferenciación del sistema nervioso central y periférico de los vertebrados y el sistema neuroendocrino. Estudios recientes han demostrado que insm1a es un importante regulador del desarrollo de las neuronas motoras. La expresión de insm1a en la médula espinal y las neuronas motoras del pez cebra fue detectada por la línea transgénica Tg (hb9: egfp), en la que las neuronas hb9 están marcadas por fluoresceína GFP. La GFP no se expresó en el pez cebra de tipo salvaje, sino solo en la línea transgénica. La detección simultánea de la expresión de ARN (insm1a, la sonda para insm1a, Figura 3A) y proteína (GFP, antiGFP, Figura 3B) se puede utilizar para el análisis de colocalización de proteínas y ARNm. Este protocolo se aplicó con éxito para detectar la colocalización de proteínas y ARN para comprender su relación espacial.
Figura 1: Esquema del método. Este diagrama de flujo muestra un flujo de trabajo experimental. El flujo de trabajo se puede completar en un mínimo de 9 días (consulte el número de días en la esquina superior derecha de cada fase del flujo de trabajo), aunque algunos pasos se pueden completar en un período más largo, como se describe en el protocolo. Abreviaturas: PFA = paraformaldehído; O/N = durante la noche; RT = temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Embriones de montaje entero teñidos con sonda 5-HT2C y anticuerpo GFP en Tg (foxP2:egfp-caax). Las imágenes de campo claro (A), fluorescentes (B) y combinadas (C) muestran la expresión de 5-HT2C (la sonda para htr2c, A) y GFP (antiGFP, B) en neuronas foxP2 y tractos axónicos. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Embriones de montaje entero teñidos con sonda insm1a y anticuerpo GFP en Tg (hb9:egfp). Las imágenes de campo claro (A), fluorescentes (B) y combinadas (C) muestran la expresión de insm1a (la sonda para insm1a, A) y GFP (anti-GFP, B) en neuronas hb9. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Embriones | Hora |
| 24 hpf | 2 minutos |
| 30 hpf | 3 minutos |
| 36 hpf | 5 minutos |
| 48 hpf | 10 minutos |
| 72 hpf | 15 minutos |
| 96 hpf | 45 minutos |
| 4-5 dpf | 60 minutos |
Tabla 1: Tiempo de digestión de la proteinasa K para embriones de pez cebra. Abreviaturas: hpf = horas después de la fertilización; DPF = días después de la fertilización.
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Discussion
Este protocolo propone una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica, un paso importante en los experimentos de colocalización en embriones de pez cebra. Este método sirve como una forma fácil y eficiente de analizar simultáneamente un ARNm y una proteína. La hibridación in situ y la tinción de anticuerpos se realizaron en embriones de pez cebra. En contraste con varios protocolos publicados anteriormente14,15,16, se utilizó inmunofluorescencia e inmunohistoquímica para explorar la expresión de proteínas. Pocos anticuerpos específicos del pez cebra han sido validados adecuadamente para su uso en las secciones17. Estudios previos han utilizado una sola técnica: inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o hibridación in situ. La combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica para analizar ARN y proteínas supera las limitaciones de cualquier técnica. El primer paso fue la hibridación in situ, que protege en gran medida el ARNm de la degradación. La recuperación del antígeno se indujo por calentamiento para evitar la interrupción por el tratamiento con proteinasa K de la unión de anticuerpos durante la tinción inmunohistoquímica. Si este enfoque funciona para todos los antígenos requerirá más pruebas. Las imágenes de las secciones mostraron que el receptor 5-HT2C estaba coexpresado en las neuronas foxP2 y que el receptor insm1a estaba coexpresado en las neuronas hb9.
La hibridación in situ de montaje completo preserva en gran medida la integridad de las muestras. La hibridación in situ seguida de seccionamiento puede disminuir el tiempo de incubación para la tinción de anticuerpos. Además, la tinción de anticuerpos después de la hibridación in situ puede ayudar a evitar el enfriamiento de la fluorescencia.
Los siguientes pasos específicos son esenciales para el éxito del experimento. El primer paso crítico es refijar el embrión en 4% PFA. Este paso detiene la reacción de la proteinasa K porque la PFA inactiva la proteinasa K. Las muestras deben mezclarse suavemente para exponer todos los embriones a PFA; El tubo también se puede colocar de lado para que los embriones se distribuyan uniformemente en la solución. El segundo paso crítico es el tratamiento del embrión durante la implantación de OCT. Los embriones deben estar dispuestos en una dirección específica (ya sea dorsal-ventral o lateral), manteniéndolos rectos para que puedan cortarse en secciones desde aproximadamente la misma área para todos los embriones. Se utiliza una aguja pequeña para hacer movimientos pequeños y conscientes en el medio viscoso de OCT para localizar el embrión y eliminar las burbujas.
Hay varias modificaciones potenciales que se pueden aplicar al escenario descrito. El tiempo de digestión de la proteinasa K en la hibridación in situ se puede determinar de acuerdo con las diferentes etapas de desarrollo de los embriones de pez cebra (Tabla 1). Además, el grosor de las criosecciones es muy flexible y se puede determinar de acuerdo con los requisitos experimentales. Si bien se predice que este enfoque será adecuado para una amplia gama de experimentos, tiene algunas limitaciones potenciales. La ejecución exitosa de este procedimiento depende de mantener una muestra completa a través de dos experimentos sucesivos. Hay varios puntos de pausa posibles en este protocolo. Los embriones deshidratados pueden almacenarse en solución de sacarosa al 30% a -20 °C durante varios meses14. Del mismo modo, las diapositivas preparadas se pueden almacenar en una caja de diapositivas a -20 °C durante más de 1 año14. Los bloques congelados se pueden almacenar a -80 °C durante tres meses.
Este protocolo para la hibridación in situ combinado con inmunohistoquímica ha demostrado ser exitoso en la detección de la expresión de 5-HT2C e insm1a en embriones de pez cebra y se puede aplicar fácilmente a una variedad de tejidos en diferentes etapas de desarrollo. Además, este protocolo se puede aplicar a neuronas o células gliales, proporcionando un enfoque de investigación robusto para los neurocientíficos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencia y Tecnología de Nantong de China (MS12019011), la Fundación de Ciencia y Tecnología de Nantong de China (JC2021058) y la Fundación de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
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