Summary
증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.
Abstract
근막증으로 알려진 골격근 지질 침투는 비만과 노화에 따라 증가합니다. 근막증은 또한 최근에 심혈관 질환 및 암과 같은 여러 다른 장애에 대한 부정적인 예후 인자로 발견되었습니다. 과도한 지질 침투는 근육 질량과 힘을 감소시킵니다. 또한 총 교내 세포 지질 함량, 지질 액적 (LD) 형태 및 아세포 분포에 따라 지방 독성 및 인슐린 저항성을 초래합니다. 섬유 유형 (산화 대 글리콜 성)도 중요한데, 산화 섬유는 지질을 활용할 수있는 능력이 더 크기 때문입니다. 병태생리학에 중요한 영향을 미치기 때문에 LD 역학과 섬유 유형별 기능에 대한 심층적 인 연구가 보장됩니다.
본원에서, 섬유유형별 방식으로 교내 지질 함량의 정량화 및 LD 형태학 및 아세포 분포의 분석을 위한 완전한 프로토콜이 제시된다. 이를 위해, 직렬 근육 동결절편을 형광 염료 보디피 및 미오신 중쇄 이소형에 대한 항체로 염색하였다. 이 프로토콜은 서로 다른 근육을 동시에 처리하여 시간을 절약하고 가능한 아티팩트를 피할 수 있으며 피지에서 생성 된 개인화 된 매크로 덕분에 LD 분석의 자동화도 가능합니다.
Introduction
근막증으로 알려진 골격근 지질 침투는 비만과 노화에 따라 증가합니다. 근막증은 근육량과 강도 및 인슐린 민감성과 부정적인 상관 관계가 있습니다1. 더욱이, 최근의 연구들은 근막증의 정도가 심혈관 질환2, 비알콜성 지방간 질환3 또는 암4과 같은 다른 병태에 대한 예후 인자로서 사용될 수 있음을 나타낸다. 지질은 근세포 외 지질로서 또는 섬유 내에서, 근세포 내 지질(IMCLs)로서 근섬유 사이의 골격근에 축적될 수 있다. IMCL은 주로 신체 운동 5,6 동안 대사 연료로 사용되는 지질 방울 (LDs)의 트리글리 세라이드로 저장됩니다. 그러나 지질 공급이 수요를 초과하거나 미토콘드리아가 기능 장애가되면 IMCL은 대사 적으로 건강에 좋지 않은 비만인 개인 및 제 2 형 당뇨병 환자7에서 볼 수 있듯이 근육 인슐린 저항성에 연루됩니다. 흥미롭게도, 지구력 운동 선수는 높은 인슐린 민감성을 유지하면서 제 2 형 당뇨병을 앓고있는 비만 환자에서 발견되는 것과 비슷한 수준의 IMCL을 가지고 있습니다. 이 현상은 "운동 선수의 역설"8,9로 묘사되며, 크기, 밀도, 국소화, 역학 및 지질 종 구성과 관련된 근육 LDs에 대한보다 미묘한 평가에 의해 설명됩니다.
첫째, LD 크기는 인슐린 민감성 및 체력10,11과 반비례하여 상관관계가 있다. 실제로, 더 작은 LD는 리파아제 작용에 대해 상대적으로 더 큰 표면적을 나타내므로, 잠재적으로 지질(12)을 동원할 수 있는 더 큰 능력을 갖는다. 둘째, LD 밀도 (수 / 표면)는 인슐린 작용 8,10에서 논란의 여지가있는 역할을합니다. 그러나 운동 선수에서 증가한 것으로 보입니다. 셋째, LDs의 세포하 국소화는 중요한데, 이는 표면 막(아사르콜렘말 또는 주변부) 바로 아래에 위치한 LD가 중심 것들보다 인슐린 감수성에 더 해로운 영향을 미치기 때문이다(8,9,13). 후자는 호흡 활동이 더 크고 수축14에 필요한 높은 에너지 수요를 충족시키기 위해보다 전문화 된 중앙 미토콘드리아에 연료를 제공합니다. 대조적으로, 말초 LD는 막 관련 공정에 관여하는 아사르콜렘말 미토콘드리아를 공급한다8. 마지막으로, 트리글리세라이드 이외에도 근육 내의 특정 복합 지질은 다른 지질보다 더 해로울 수 있습니다. 예를 들어, 디아실글리세롤, 장쇄 아실-CoA, 및 세라마이드는 트리글리세리드 턴오버 속도가 낮을 때 근육에 축적되어 인슐린 신호전달 9,15를 손상시킬 수 있다. "운동 선수의 역설"로 돌아가서, 지구력 운동 선수는 유형 I (산화성) 섬유에서 높은 회전율을 가진 더 작은 중앙 LD의 수가 많은 반면, 비만 및 당뇨병 환자는 유형 II (글리콜 성) 섬유 8,15,16에서 낮은 회전율을 가진 더 큰 말초 LD를 가지고 있습니다. 에너지 저장 및 방출에서의 그들의 역할 외에도, 유도 지방산 (FA) 및 코트 단백질 (페리리핀 5)을 통한 LDs는 또한 FA 산화 및 미토콘드리아 생물 발생의 전사 조절에 관여하는 중요한 선수로서 기능 할 수 있습니다8. 생리학 및 병태생리학에 중요한 영향을 미치기 때문에 LD의 역학과 기능에 대한 심층적 인 연구가 보장됩니다.
IMCL을 연구하는 몇 가지 기술이 있지만, LD 크기, 밀도 및 분포를 섬유 특정 방식으로 정확하게 정량화하는 데 모두 적합한 것은 아닙니다. 예를 들어, 자기 공명 분광법에 의한 IMCL의 평가는 비침습적이지만 섬유 내의 LD의 크기와 정확한 위치를 연구하기에 충분하지 않은 수준의 분해능을 제공하며 섬유 유형 특이17,18이 아닙니다. 마찬가지로, 전체 근육 균질물(19)에 대해 수행된 생화학적 기술은 지질의 위치 및 크기를 평가할 수 없다. 결과적으로, LD 형태학 및 위치를 분석하는 가장 적절한 방법은 정량적 투과 전자 현미경(13)이지만, 이 기술은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요된다. 따라서 Oil Red O (ORO) 20,21, monodansylpentane (MDH) 22 또는 Bodipy 23,24,25와 같은 염료를 사용한 제제에 대한 공초점 형광 이미징이 이러한 연구에 가장 적합한 도구로 부상했습니다.
여기에서, 조직 샘플링 및 처리, 보디피 염색, 및 공초점 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜이 설명되어 마우스 근육 동결절편에서 LD 크기, 수 및 국소화를 정량화한다. IMCL은 산화 섬유와 글리콜 섬유간에 고르게 분포되어 있지 않으며 각 섬유 유형은 LD 역학을 다르게 조절하기 때문에 IMCL에 대한 연구는 섬유 유형 별 16,25,26,27이어야합니다. 따라서, 이 프로토콜은 각 섬유에 의해 발현되는 미오신 중쇄(MyHC) 이소형(들)을 확인하기 위해 직렬 절편에 면역형광을 사용한다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 동결 전에 나란히 놓인 글리콜 (신근 디지토럼 롱구스, EDL)과 산화 (단독) 근육을 동시에 처리하는 것입니다 (그림 1). 이 동시 처리는 시간을 절약 할뿐만 아니라 샘플의 개별 처리로 인한 변동성을 방지합니다.
그림 1: 절차의 개략적인 개요. 근육 해부 (1) 후, 유사한 크기의 선택된 근육이 준비되고 함께 얼어 붙습니다 (2). 10 μm의 직렬 횡단 절편은 냉동 장치를 사용하여 얻어지며 접착 슬라이드(3)에 직접 장착된다. 두 개의 연속 슬라이드에서, 첫 번째 (4A)는 라미닌에 대해 면역 표지되고 LD를 인식하기 위해 Bodipy로 염색되고 두 번째 (4B)는 근육 섬유 유형의 인식을 위해 MyHC에 대한 항체로 면역염색됩니다. 이미지는 Bodipy (5A)의 공초점 현미경과 근육 섬유 유형 (5B)에 대한 epifluorescence 현미경을 사용하여 획득됩니다. 이미지는 피지에서 역치 및 정량화 입자(6A)를 적용하여 LDs(7) 또는 카운팅 셀(6B)에 의해 점유된 전체 면적의 수, 평균 크기, 밀도 및 백분율을 구하여 섹션(7)에서 각 유형의 섬유의 백분율을 구함으로써 분석된다. 약어: LDs = 지질 방울; EDL = 신근 디지토럼 경도; MyHCs = 미오신 중쇄 이소형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
마우스에 대해 수행 된 모든 절차는 Université Catholique de Louvain (2019 / UCL / MD / 013)의 의료 부문의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동결을위한 샘플의 해부 및 준비
- 각 근육 쌍에 대해 3mm 두께의 코르크 조각에 라벨을 붙입니다.
- 코르크 중앙에 칼날로 만든 작은 절개를 통해 지지대 역할을 할 경질 플라스틱(0.5cm W, 1cm H)의 직사각형 조각을 수직으로 삽입합니다(그림 2B).
참고 : 직사각형 플라스틱 조각의 크기는 근육의 크기에 따라 다릅니다. 여기서, 설명된 치수는 3개월된 C57BL/6J 수컷 마우스의 단독(∼9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) 및 EDL(∼5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W)의 크기에 적응된다. - 해부시 마우스 뒷다리의 발바닥과 EDL을 제거하십시오. 해부 중에 샘플이 건조되는 것을 방지하려면 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 식염수로 가볍게 적신 압축 위에 놓습니다.
참고 :이 두 사지 근육을 해부하는 방법에 대한 설명은 Wang et al.28 을 참조하십시오. - 최적의 절삭 온도 화합물(OCT)을 코르크/플라스틱 접합부에 작은 방울씩 떨어뜨려 기포를 피하십시오.
- 종이 타월로 부드럽게 건조시켜 샘플에서 과도한 수분을 제거하고 (그림 2A) 코르크에 수직인 플라스틱에 두 근육을 놓습니다 (그림 2C).
- 스테레오 현미경으로 근섬유의 방향을 확인합니다(그림 2D).
참고 : 절연 효과가 빠른 동결을 방지하고 얼어 붙은 아티팩트를 생성하기 때문에 OCT로 근육을 덮지 않는 것이 중요합니다.
2. 냉동 절제를위한 골격근 샘플 냉동
주의: 근육의 동결은 화학 후드 아래에서 적절한 개인 보호 장비를 착용해야합니다 ( 자료 표 참조).
- 최소 25cm 길이의 두 개의 측면 스트랩이 부착된 스테인리스 스틸 텀블러(~8cm H, 6cm Ø)를 사용하고(그림 2F), 텀블러를 최대 용량의 2/3까지 이소펜탄으로 채웁니다.
- 텀블러를 스트랩으로 잡고 액체 질소로 채워진 폴리스티렌 상자에 부드럽게 담그면 용기 외부의 질소 수준이 내부 이소펜탄 수준보다 높습니다(그림 2F,G).
주의: 텀블러가 질소와 접촉하면 열 충격으로 인해 소용돌이가 발생할 수 있습니다. 텀블러가 충분히 침지되어 있는지 확인하되 이소펜탄 침전을 일으킬 수 있으므로 질소의 유입을 피하십시오. 이런 일이 발생하면 이소펜탄을 식히고 텀블러를 새로운 이소펜탄으로 채우고 다시 시작하십시오. - 텀블러 내부가 이소펜탄의 흰색 고체 층으로 완전히 덮여 있으면 액체 질소 상자에서 꺼내십시오 (그림 2H).
참고 : 이소 펜탄의 용융 온도는 -159 ° C이며, 텀블러의 가장자리는 충분히 추울 때 흰색으로 변합니다. - 전체 부피가 다시 액체가 될 때까지 나머지 액체 이소펜탄에 고체 이소펜탄 조각을 포셉으로 부드럽게 저어줍니다.
- 이소펜탄이 텀블러의 바닥과 가장자리 전체에 흰색 자갈을 형성할 때까지 텀블러를 액체 질소에 다시 담그십시오(그림 2G,H).
참고: 이 두 번째 냉각 단계는 이소펜탄의 적절한 동결 온도를 보장합니다. - 액체 질소에서 텀블러를 제거하고 텀블러 바닥에 근육을 빠르게 담그고 쥐 치아 핀셋으로 코르크를 잡으십시오. 코르크를 이소펜탄에서 15초 동안 소용돌이치고, 처리될 때까지 -80°C에서 보관한다(도 2I).
참고: 단기 보관을 위해 샘플은 -20°C 냉동고에서 유지될 수 있습니다. 골격근의 빠른 동결을위한 완전한 프로토콜은 이미 다른 곳에서 출판되었습니다. 자세한 참고 문헌 및 문제 해결은 Meng et al.29, Kumar et al.30 및 Leiva-Cepas et al.31을 참조하십시오.
3. 냉동 절제술
- 샘플을 -20°C로 이전에 냉각하고 블레이드 온도를 -25°C로 설정된 냉동 장치의 챔버 내로 가져온다.
참고: -20°C/-80°C 냉동고에서 드라이 아이스로 채워진 폴리스티렌 상자의 냉동 상태로 샘플을 운반하고 절단하기 전에 챔버 온도까지 최소 20-30분 동안 샘플을 평형화할 수 있도록 합니다. - 미세한 핀셋으로 코르크에서 플라스틱을 제거하고 냉동 시편 디스크를 빠른 동결 플레이트에 올려 냉각시킵니다. 플레이트가 -50 °C에 도달하면 디스크에 약간의 OCT를 놓고 코르크를 디스크 위에 빠르게 올려 놓고 단단히 누릅니다. OCT가 고형화되고 코르크가 디스크에 잘 고정될 때까지 기다리십시오.
- 원하는 절단 방향(그림 2J,K)으로 개체 헤드에 디스크를 놓고 근육 길이의 1/3 이상을 넘어 근육의 두 단면이 모두 보일 때까지 근육 블록을 트리밍합니다.
- 절단 두께를 10μm로 설정하고 접착 슬라이드에 한 섹션을 배치하여 밝은 필드 현미경에서 섬유의 올바른 방향을 확인합니다.
참고: 섬유의 가로 방향을 확인하는 것이 중요합니다. 섬유의 방향이 적절하지 않으면 개체 헤드의 각도를 조정하고 다른 부분을 잘라낸 다음 다시 확인하십시오. - 미리 라벨이 붙은 두 개의 접착 슬라이드에 두 개의 직렬 단면을 놓습니다: 하나는 섬유 유형을 결정하기 위한 슬라이드이고, 다른 하나는 지질 함량을 정량화하기 위한 슬라이드입니다(그림 2L).
참고: 추가적인 직렬 단면을 수득하고 다른 조직학적 연구를 위해 -80°C에서 유지할 수 있다. 그러나, 지질 함량 및 세포내 형태학(24)의 변화를 피하기 위해, 공기 건조를 방지하기 위해 절단 직후에 처음 두 슬라이드를 처리하는 것이 필수적이다. LD 정량화를 위해 슬라이드를 동결 및 해동하는 것은 동일한 효과를 가질 것이므로 매우 바람직하지 않습니다.
4. 섬유 타이핑 및 보디피 염색
- 근육 섬유 유형의 면역 조직 화학적 검출
참고: 다음 프로토콜의 경우, 250μL의 총 용액 부피는 소수성 펜으로 그려진 원으로 둘러싸인 전체 근육 부분을 1센트 동전의 대략적인 크기로 덮기에 충분합니다.- 소수성 펜으로 그려진 윤곽선으로 단면을 감싸고 실온에서 1분 동안 빙냉 0.1M 인산완충식염수(PBS)로 헹구십시오(RT). 슬라이드를 습한 챔버에 놓고 블로킹 용액 (PBS 중의 10% 정상 염소 혈청 (NGS) 및 1:30 마우스 (MOM) 블로킹 시약 상에서 37°C에서 90분 동안 차단한다.
- 블로킹 용액을 제거하고 슬라이드를 37°C에서 90분 동안 인큐베이션하여 1차 항체(5% NGS, 1:30 MOM 차단 시약, 마우스 I형을 인식하는 1차 항체(IgG2b, 1:10), 유형 IIa(IgG1, 1:10), 및 IIx형(IgM, at 1:5) 섬유 및 래트 항-라미닌(α2 쇄, 1:1,000) PBS에서.
- 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척한다.
- 슬라이드를 2차 항체 (염소 항-IgG2b AF405 (1:500), 염소 항-IgG1 AF488 (1:500), 염소 항-IgM AF568 (1:1,000), 및 염소 항-라미닌 AF647 (1:500) PBS 중)을 함유하는 용액과 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
주의: 프로토콜의 나머지 부분에서는 형광을 보존하기 위해 슬라이드를 빛으로부터 멀리 떨어뜨려 두십시오. - PBS로 다시 3 x 5 분간 세척하고, 이중 증류H2O로 헹구고, 과량의 물을 제거하고, 안티페이드 시약으로 장착한다.
참고: 슬라이드를 4°C에 보관하고 빛으로부터 보호하여 이미지 획득까지 형광을 보존합니다. 슬라이드는 고정되어 있지 않으므로 각 실험에 대해 새로 만들어진 솔루션을 사용하고 PBS를 오토클레이브하고 가능한 한 빨리 이미지를 획득하여 섹션의 오염을 피하는 것이 좋습니다.
- 보디피로 LD의 염색
참고: 단계 4.1.과 유사하게, 250 μL의 총 용액 부피는 소수성 펜으로 그려진 원으로 둘러싸인 전체 근육 부분을 1 센트 동전의 대략적인 크기로 덮기에 충분하다.- 소수성 펜으로 그려진 윤곽선으로 섹션을 감싸고 RT에서 10분 동안 얼음처럼 차가운 0.1M PBS로 헹구십시오. 모든 헹굼 및 세척에 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하십시오.
- RT에서 10분 동안 메탄올 없이 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하십시오. 첫 번째 빠른 헹굼 후, 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척한다.
주의: 화학 후드 아래에서 이 단계를 수행하십시오. - 슬라이드를 습한 챔버에 놓고 PBS 중의 5% NGS로 RT에서 1시간 동안 차단한다.
- 슬라이드를 1차 항체(PBS 중의 2% NGS 및 래트 항라미닌(α2 쇄, 1:1,000))의 용액과 함께 37°C에서 90분 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척한다.
주의: 프로토콜의 나머지 부분에서는 형광을 보존하기 위해 슬라이드를 빛으로부터 멀리 떨어뜨려 두십시오. - PBS 중의 염소 항-AF647 항체 (1:500)를 함유하는 이차 항체 용액과 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척한다.
- PBS 중의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 0.5 μg/mL) 및 BODIPY(1 μg/mL)의 용액으로 RT에서 20분 동안 인큐베이션한다.
참고: BODIPY 원액을 준비하려면 1mg/mL의 농도로 DMSO에 녹입니다. 상이한 보디피 제형은 LD 염색을 위해 상업적으로 입수가능하다. 이루어진 선택에 따라, 염색 방법은 동일하다(동일한 단계, 농도 및 배양 시간); 그러나 획득 방법은 약간 다를 것입니다. - 첫 번째 빠른 헹굼 후, 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척하고, 이중 증류된H2O에서 헹구고, 과량의 물을 제거하고, 안티페이드 시약으로 장착한다.
참고: 슬라이드를 빛으로부터 보호하여 4°C에 보관하여 이미지 획득까지 형광을 보존합니다.
5. 이미지 획득
참고: 염색 프로토콜이 완료되면 오염을 피할 뿐만 아니라 LD의 형태, 크기 및 수를 보존하기 위해 즉시 이미지 수집(다음 24시간 이내)을 진행하는 것이 중요합니다.
- 샘플링된 각 근육의 섬유 유형을 평가하기 위한 이미지 획득
참고: 이 단계는 전체 슬라이드 형광 스캐닝 현미경 또는 기존의 에피형광 현미경을 사용하여 수행할 수 있습니다. 후자의 경우 섹션을 재구성하기 위해 이미지의 수동 또는 자동 스티칭을 수행해야합니다.- 섬유 유형 인식을 위해서는 10x/0.3 목표의 에피형광 현미경을 사용하십시오. DAPI(405nm), FITC, TRITC 및 Cy5용 여기 필터를 선택하여 각각 유형 I, IIa, IIx 섬유 및 라미닌을 검출합니다.
참고: IIb 타입 섬유는 면역표지가 부착되지 않습니다. 그들은 검은 사르코 플라스마 (sarcoplasm)가있는 사르콜레마의 한계에서 라미닌에 의해 염색 된 섬유로 인식 될 것입니다. - 각 채널에 대해 적절한 노출 시간을 조정합니다.
- 종래의 에피형광 현미경을 사용하는 경우, 항상 근육 재건을 용이하게 하기 위해 동일한 순서로 전체 근육의 이미지를 획득한다. 한 이미지의 오른쪽 가장자리에 있는 파이버가 다음 이미지의 왼쪽 가장자리에도 나타나는지 확인합니다. 이미지의 위쪽 부분과 아래쪽 부분에도 동일하게 적용됩니다(그림 3A).
참고 : 참고로, EDL의 한 부분 또는 3 개월 된 마우스에서 해부 된 발바닥의 경우 각각 평균 여섯 개와 여덟 개의 이미지가 전체 근육 단면을 덮을 것입니다. - 근육을 스캔한 후 캡처된 디지털 이미지를 섬유 형태학(라미닌) 및 근육 단면의 조직학을 기반으로 재구성(스티칭)을 위한 모든 이미지 처리 소프트웨어에 업로드하고 모든 채널(색상)이 병합된 TIFF, PNG 또는 JPG 파일로 저장합니다(그림 3A).
- 섬유 유형 인식을 위해서는 10x/0.3 목표의 에피형광 현미경을 사용하십시오. DAPI(405nm), FITC, TRITC 및 Cy5용 여기 필터를 선택하여 각각 유형 I, IIa, IIx 섬유 및 라미닌을 검출합니다.
- 라미닌과 보디피 공동 염색을 통한 이미지 획득
참고: 섬유 유형을 인식하고 캡처된 각 유형에 대한 섬유 수를 추정하려면 Bodipy-laminin의 이미지 수집을 시작하기 전에 섬유 유형 섹션을 이미 스캔하고 근육을 재구성해야 합니다(그림 3B).- Bodipy 이미지 관찰 및 수집을 위해 수치 조리개가 1.4인 40x 오일 침지 대물 렌즈가 있는 공초점 현미경을 사용하십시오.
- 1 AU의 핀홀, 2,048 픽셀 x 2,048 픽셀 해상도, 0.08 μm의 픽셀 크기, 단방향 모드, 4 (~ 4 μs / 픽셀)에서 스캔 속도, 4x로 설정된 라인 평균 및 1로 설정된 디지털 줌 설정을 사용하십시오.
- Bodipy-558/568과 laminin-AF647 간의 상호 대화를 방지하려면 공초점 소프트웨어에서 순차 스캔 모드를 사용하십시오.
참고: 선택한 염료가 Bodipy-493/503인 경우, Bodipy 채널과 laminin-AF647 채널 사이의 누화 없이 동시 공초점 레이저 스캐닝이 가능합니다. 이렇게하면 이미지 수집 속도가 빨라집니다. - 488nm 레이저 라인 또는 아르곤 레이저 라인을 사용하여 Bodipy-493/503을 여기시키고 561nm 다이오드 레이저 라인을 사용하여 Bodipy-555/568을 여기시킵니다. 마지막으로 640nm 다이오드 레이저 라인으로 라미닌-AF647을 감지합니다.
주의: Bodipy 분자는 광표백에 매우 민감하므로 불필요한 레이저 스캐닝을 피하십시오. 섬유를 인식하려면 라미닌 용 레이저 만 사용하십시오. - 선택한 염료에 따라 Bodipy-493/50324 의 경우 570-650nm, Bodipy-558/568의 경우 565-620nm에서 방출 범위를 설정합니다. 라미닌의 방출 범위를 656-700 nm로 설정하십시오.
- 게인과 디지털 게인을 적절하게 설정하여 범위 표시기에서 포화 픽셀이 감지되지 않도록 합니다. 오프셋을 조정하여 배경 신호를 수정합니다.
참고: 필터 선택 및 위에서 언급한 기타 스캐닝 파라미터는 각 공초점 현미경에 대해 최적화되어야 합니다. 위에서 언급 한 모든 설정이 샘플에서 캡처 된 모든 이미지를 비교할 수 있도록 일정하게 유지되는 것이 중요합니다. - 공초점 현미경으로 시각화 된 사람들 중 섬유의 유형을 식별하려면 섬유 형 면역 검출 후 재구성 된 섹션의 이미지가 확인되는 개인용 노트북을 사용하십시오 (그림 3B).
- 섬유 그룹이 올바르게 식별되면 Bodipy 및 laminin 채널로 이미지를 획득하십시오.
참고: LD의 나중에 섬유별 분석을 용이하게 하기 위해 MyHC 인식을 위해 획득한 이미지에 이러한 섬유가 있는 근육 부위의 Bodipy-laminin 이미지 이름을 기록해 두는 것이 좋습니다.
6. 이미지 분석
- 각 근육 샘플에 대한 섬유 유형의 분석
- 피지(또는 ImageJ)32에서 섬유 이소폼을 감지하는 데 사용되는 모든 채널의 병합에서 얻은 재구성된 근육으로 TIFF, PNG 또는 JPG 파일을 엽니다.
- 셀 카운팅 도구를 시작하려면 플러그인을 클릭하십| | 분석 셀 카운터 | 셀 카운터.
- 셀 카운터 창에서 작업 |를 클릭하십시오. 초기화합니다.
- 같은 창 의 카운터 에서 유형 1을 선택합니다.
- 피지 주 창에서 지팡이 도구를 선택합니다.
- 각 유형의 섬유 수를 정량화하려면 동일한 유형의 각 섬유를 클릭하여 프로그램이 클릭 한 섬유 수를 기록하도록하십시오.
- 완료되면 다음 유형의 광섬유를 선택하고 동일한 단계를 반복하십시오.
- 이미지의 모든 파이버가 지정된 파이버 유형에 지정되면 셀 카운터 창에서 결과를 클릭하여 결과를 테이블에 표시합니다.
- 파일 |를 클릭하여 이 테이블을 스프레드시트 테이블로 저장합니다. 결과 창에서 다른 이름으로 저장합니다.
- 셀 카운팅 창에서 마커 저장 또는 마커 로드를 클릭하여 언제든지 동일한 이미지에 선택 항목을 저장하고 다시 로드합니다.
- 섬유 유형 의존적 방식으로 지질 액적의 분석
- LDs의 정량화를 위해 피지를 사용하여 공초점에서 얻은 Bodipy 및 laminin의 이미지를 분석하십시오.
참고: 작성자는 분석을 자동화하기 위해 사용자 지정된 매크로를 설계했습니다. 이 매크로는 사용 방법에 대한 단계별 설명과 함께 각각 보충 파일 1 및 보조 파일 2로 사용할 수 있습니다. - 피지에서 바이오 포맷 가져 오기의 도움으로 각 이미지를 엽니 다. 스택 보기 옵션에서 하이퍼스택을 선택합| 색상 모드, 기본값. 자동 크기 조정 창이 선택되어 있는지 확인합니다.
참고: 다음 단계는 이미지에서 하나의 파이버를 분석하기 위한 프로토콜을 설명하지만 이미지에 나타나는 전체 파이버 수만큼 반복해야 합니다. - 자유형 선택 도구를 사용하여 라미닌 채널을 기반으로 섬유의 사르콜레마를 수동으로 선택하고(그림 4A) 키보드의 T를 눌러 ROI 창에 선택 또는 관심 영역(ROI)을 기록합니다.
- 피지의 메인 창으로 이동하여 | 분석을 클릭하십시오. 측정을 설정하고 팝업 창에서 영역 및 Feret의 지름을 선택합니다. 나머지 상자는 선택하지 않고 다른 매개 변수는 기본적으로 나타나는 대로 그대로 둡니다.
- ROI 창에서 측정을 클릭하여 선택한 섬유의 면적 및 최소 페렛 직경(MF)을 구하고 나중에 사용할 수 있도록 기록해 둡니다.
참고: LD를 분석할 때, 크기와 밀도는 섬유의 중심과 주변부(subsarcolemmal region-SS) 사이에서 다양하다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 따라서 분석은 별도로 수행되어야합니다. - MF의 1/6 값을 계산하여 섬유의 중앙 부분을 구분합니다.
참고: 매크로에서 기본 MF 값은 6으로 설정되며, 이는 적용된 축소가 MF의 1/6으로 설정됨을 의미합니다. 이 값은 고지방 식단을 먹인 동물의 발바닥에서 얻은 경험적 데이터를 기반으로 선택되었습니다. 그러나 각 연구원은 경험적 데이터와 분석 된 근육, 섬유의 유형 및 동물 상태에 따라이 숫자를 변경해야합니다. - ROI 창에서 추가를 클릭하여 첫 번째 ROI를 복제하고 창에 나타나는 두 번째 ROI를 선택합니다.
- 피지의 메인 창에서 | 편집을 클릭하십시오. 선택 | 이전에 계산된 값(6.2.6단계부터)을 숫자 앞에 빼기 기호로 확대하고 도입한 다음 확인을 클릭합니다. ROI 창에서 Add[t] (세 번째 ROI가 나타나야 함)와 삭제를 클릭하여 두 번째 ROI를 삭제합니다.
참고: 연구원은 ROI 창에서 모두 표시 상자를 클릭하여 결과를 확인할 수 있습니다. 이 시점에서 두 개의 ROI가 나타나야 하는데, 하나는 광섬유의 전체 둘레를 둘러싸는 것(그림 4B)이고 다른 하나는 중앙에 배치됩니다(그림 4C). - ROI 창에서 두 ROI 를 모두 선택하고 자세히|를 클릭하십시오. XOR | 추가[t]. 파이버의 주변부에 해당하는 세 번째 ROI가 나타날 때까지 기다립니다(그림 4D).
- 추가 |을 클릭하여 ROI를 저장하십시오 . 나중에 동일한 섬유를 다시 분석해야 하는 경우에 대비하여 ROI를 절약하기 위해 저장합니다.
- Bodipy 채널을 선택하고 이미지 |를 클릭하여 임계 값 도구를 엽니 다. | 조정 피지의 주 창의 임계값입니다.
- 임계값 팝업 창에서 값을 70/255로 설정하고 임계값을 선택합| B & W 방법, 어두운 배경 |를 클릭하십시오. 적용하십시오.
참고: 임계값에 적용되는 값은 실험 조건에 따라 달라질 수 있으며 분석을 최적화하기 위해 임계값 을 적절하게 설정해야 합니다. Bodipy 신호가 임계치 한계 이상인 B&W 윈도우는 흰색으로 표시되고 배경은 검은색으로 나타나야 합니다(그림 4E 의 원본 Bodipy 이미지와 그림 4F의 Bodipy 이미지를 비교). - 피지의 메인 창으로 이동하여 | 분석을 클릭하십시오. 측정값을 설정하고 팝업 창에서 영역, 영역 분수 및 임계값으로 제한을 선택합니다. 나머지 상자는 선택하지 않고 다른 매개 변수는 기본적으로 나타나는 대로 그대로 둡니다.
참고: 연구원이 완벽한 구의 경우 1에서 선의 경우 0 사이의 구형 형태의 인덱스인 LD의 "원형도"를 분석하려면 측정 설정 팝업 창의 모양 설명자 상자를 클릭합니다. - ROI 창으로 이동하여 첫 번째 ROI 를 선택합니다. 피지의 메인 창에서 | 분석을 클릭하십시오. 파티클 분석 도구.
참고: 이 도구는 각 선택 항목에서 파티클로 덮인 전체 영역의 수, 크기, 커버 영역 및 백분율을 정량화하고 결과를 스프레드시트 파일로 저장합니다. - 파티클 분석 창에서 2에서 무한대(2-Infinity)로 값을 설정하고, 픽셀 상자를 선택하고, 기본 원형도 값을 유지하고, 요약을 선택한 다음, 확인을 클릭합니다.
참고: 광섬유의 결과를 확인하려면 표시 옵션에서 사용 가능한 옵션 중 하나를 선택합니다. 테이블의 선택 항목에서 각 LD의 정보를 인식하려면 입자 분석 창에서 결과 표시 옵션을 선택합니다. 섬유의 전체 면적에 대한 분석의 결과는 여러 컬럼 (카운트, 총 면적, 평균 크기, % 면적; 이들은 입자 수 [LDs], 이들 입자가 차지하는 면적, 평균 크기 및 입자가 차지하는 선택의 총 면적의 백분율에 해당하며, 각각). 밀도를 계산하려면 입자 수를 각 선택 항목의 전체 영역으로 나눕니다. - 섬유의 중심과 둘레의 값을 얻으려면 6.2.14 및 6.2.15단계를 반복하여 매번 두 번째(중앙) 및 세 번째 ROI(주변)를 선택합니다.
- 파일 |을 클릭하여 결과를 저장하십시오 . 요약 창에 그대로 저장합니다.
참고: 나중에 데이터의 통합 및 통계 분석을 용이하게 하기 위해 결과의 지정된 이름에 광섬유 유형, 조건 및 이미지 이름을 포함시키십시오. 동일한 이미지에서 나머지 파이버를 분석하려면 6.2.3~6.2.17단계를 반복합니다. 통계 분석을 위해서는 각 유형의 섬유를 동물 당 적어도 10-15 개 분석해야합니다.
- LDs의 정량화를 위해 피지를 사용하여 공초점에서 얻은 Bodipy 및 laminin의 이미지를 분석하십시오.
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Representative Results
본원에 기재된 프로토콜은 섬유 유형 및 아세포-특이적 방식으로 LDs를 용이하게 정량화하는 효율적인 방법을 제공한다. EDL과 발바닥과 같이 비슷한 크기의 두 근육을 함께 얼림으로써 다음 단계에 소요되는 시간과 자원이 어떻게 절반으로 감소하는지 보여줍니다.
성인 마우스 근육에서 발현된 상이한 MyHC 이소형의 면역염색, 이미지 획득 및 분석을 위한 완전한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 1989 년 Schiaffino et al. 3 3에 의해 처음 설계된 것을 기반으로하며, 라미닌을 표지하기 위해 추가 항체를 사용하는 것과 같은 일부 조정이 있습니다. 이러한 나중의 변형은 IIb 타입 섬유의 위치에 매우 중요하며, 이는 어떠한 항체로도 염색되지 않기 때문에 검정될 것이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 이러한 면역조직화학 프로토콜은 마우스의 느린 산화성(타입 I 및 IIa) 및 패스트-글리콜리시스(타입 IIx 및 IIb) 섬유의 인식을 허용할 뿐만 아니라, 하이브리드 섬유의 존재(도 5D의 별표 참조)도 허용한다. 또한, 동일한 슬라이드에 두 근육의 횡단면을 갖는 것은 두 개의 선택된 근육 사이의 각 섬유 유형의 비율을 비교할 수있게하여 실험 조건이 두 섹션 모두에서 동일하다는 것을 보장합니다.
LD 표지를 위해, 여기에 제시된 결과는 지질 염료로서 Bodipy-558/568C12 의 사용에 기초한다; 그러나, 독자는 근육 섹션23에서 고전적인 염료 Bodipy-493/503의 사용을 상세히 설명하는 우수한 프로토콜 논문으로 언급된다. 제시된 프로토콜은 섬유 사르콜레마를 구별하기 위해 α2-라미닌에 대한 면역조직화학에 기초한 LDs의 염색을 결합하였다. 섬유형 실험과 마찬가지로 이 단계는 개별 섬유의 인식뿐만 아니라 섬유의 중앙 및 주변 영역 모두에서 지질의 후속 분석에도 필수적입니다(그림 4). 이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 두 슬라이드에서 동일한 파이버를 식별하고 태그를 지정하는 것입니다. 앞에서 설명한 것처럼 LD에 대한 이미지를 획득하기 전에 섬유 유형으로 슬라이드를 스캔하고 병합된 색상으로 근육 단면을 재구성하는 것이 중요합니다(그림 3B). 축삭 나뭇 가지나 근육 스핀들과 같은 각 근육 부분의 놀라운 구조는 연구자가 두 슬라이드에서 동일한 섬유를 찾는 데 도움이 될 수 있는 좋은 랜드마크입니다(그림 6). 슬라이드는 대부분의 공초점 현미경에 거꾸로 배치되므로 위치 작업을 용이하게하기 위해 개인용 컴퓨터에서 섬유 유형 재구성 이미지를 반전시키는 것이 좋습니다.
공초점 현미경에 의한 Bodipy-laminin 염색의 획득에 대해 설명된 설정은 세 개에서 6개의 섬유에서 LD의 크기, 수 및 분포를 동시에 시각화하고 나중에 분석할 수 있게 해줍니다(그림 6 및 그림 7). 이미지 분석 소프트웨어 피지로 LD를 분석하기위한 상세한 단계별 프로토콜도 여기에 제공됩니다. 프로토콜에서 볼 수 있듯이 이미지에 존재하는 각 섬유의 전체 분석은 길고 지루합니다. 그러나 피지는 Java 언어를 기반으로 매크로라는 사용자 정의 프로그램의 설계를 허용하는 장점이 있습니다. 저자는 위에서 설명한 일련의 개별 명령을 자동화하여 루프에서 자동으로 실행되어 이미지에 존재하는 각 파이버뿐만 아니라 큰 이미지 세트도 몇 분 안에 분석 할 수있는 매크로를 설계했습니다. 연구원의 유일한 입력은 매번 분석 할 섬유의 둘레를 수동으로 선택하고, 섬유 유형을 선택하고, 임계 값을 적용하고 입자를 정량화 한 후 결과 이미지의 육안 검사입니다.
여기서, LDs의 분석이 위치-의존적 방식으로 구현된다. 섬유의 면적 및 MF 직경을 이전에 측정함으로써, 크기-의존적(Strauss et al.25에 의해 기술된 바와 같이 고정되지 않은) 감소가 각 섬유의 중앙 및 주변 영역을 얻기 위해 적용된다(도 4 및 도 7). 그림 7의 히스토그램에서 볼 수 있듯이, 이 방법은 세 가지 중요한 파라미터, 즉 LD가 차지하는 섬유 면적의 백분율(그림 7E), LD의 밀도-μm2 당 LD의 수(그림 7F) 및 LD의 평균 크기(그림 7G)를 정량화할 수 있습니다. 그 결과, 3개월된 마우스(N=5)에서, IIa형(녹색 윤곽선) 및 IIx형(적색 윤곽선) 섬유는 주변부에서 LD가 차지하는 면적의 가장 큰 비율을 나타낸다(도 7E). 입자의 밀도에 대하여, EDL 섬유는 항상 세포내 위치와 독립적으로 단독 섬유보다 더 높은 밀도를 나타낸다(도 7F). 마지막으로, LD의 평균 크기는 중앙보다 주변에서 항상 더 큽니다(그림 7G).
설치류 골격근34,35에서 LDs의 축적을 평가하기 위해 다른 그룹에 의해 사용 된 다른 방법은 이러한 결과를 이전 연구의 결과와 비교하는 것을 어렵게 만듭니다. 그러나, Komiya et al.34의 결과와 일치하여, LDs가 차지하는 섬유 면적의 비율은 단독형 IIa 및 EDL 유형 IIx 섬유에서 더 높다. 가장 중요한 것은, IIb 타입 섬유는 LD가 차지하는 면적의 가장 낮은 비율을 나타냈다는 것이다(그림 7E, 회색 히스토그램). 섬유 유형 IIb가 EDL의 가장 우세한 섬유 유형이기 때문에 (75%, 그림 5E), 이러한 결과는 다른 그룹이 이전에 기술한 것을 확인시켜준다: 지질의 전반적인 축적은 단독34,35에서보다 EDL에서 더 낮다.
인간25에서 기술된 것과는 달리, 또한 Komiya et al.34의 결과와 일치하여, 여기에 제시된 결과는 단독형 I 섬유에서의 LDs의 축적이 상대적으로 낮다는 것을 보여준다. 이것은 인간 유형 I 섬유의 대사 특성이 설치류 유형 IIa 및 IIx의 대사 특성과 더 유사하기 때문에 마우스와 인간 유형36 사이의 섬유 유형 종 간 차이에 의해 설명 될 수 있지만 인간 유형 IIx 섬유의 대사 특성은 설치류 유형 IIb37에 가깝습니다. 요약하면, 여기에 기술된 상이한 기술들은 섬유 유형 의존적 방식으로 세포 내에서 LD 및 이들의 분포와 관련된 몇몇 파라미터들을 연구 및 비교하기 위한 재현성, 신뢰성, 시간-효율적인 방법을 제공한다.
차선책의 실험
동결 절차가 올바르게 수행되지 않고 이소펜탄이 적절한 온도에 있지 않으면 섬유 내부에 얼음 결정이 형성됩니다 (그림 8A). 이러한 동결 아티팩트는 샘플의 조직학적 준비 후에만 검출할 수 있으며 섬유의 구멍으로 인식될 수 있다. LD의 적절한 정량화를 위해서는 이러한 아티팩트를 피해야 합니다. 근육 블록을 적절하게 해동 및 재동결시키는 것이 이러한 아티팩트(29)를 상당히 감소시킬 수 있다는 것이 입증되었다.
섬유가 세로 축에 수직으로 절단되지 않을 때 또 다른 문제가 발생합니다(그림 8B). 섬유, 근육 또는 동물 간의 LD 정량화 및 비교는 절편이 횡단하지 않을 때 수행 할 수 없습니다. 이러한 이유로 동결하기 전에 스테레오 현미경을 사용하여 코르크에 근육을 올바르게 배치하고 cryostat에 가까운 밝은 필드 현미경을 가져야합니다. 후자는 연구원이 냉동 스탯에서 샘플의 올바른 정렬을 찾을 수있게합니다.
드문 경우지만, MyHC 이소형의 표지는 하나 이상의 섬유 유형에서 매우 약하다(도 8C). 이 경우 LD의 분석이 완료되지 않습니다. 이 경우 실험은 근육의 절단부터 시작하여 반복되어야합니다. 마지막으로, Bodipy는 근육 단면의 주변에 축적 될 수 있습니다 (그림 8D). 이런 일이 발생하면 염색은 인공적인 결과를 생성하는 섬유에 매우 강할 것입니다. 이러한 섬유에서 이미지를 획득하지 마십시오.
그림 2: 동결 및 냉동 절제용 샘플의 제조. (A-D) 마우스 밑창 및 EDL 근육을 해부하고 OCT 한 방울로 단단한 플라스틱으로 고정된 코르크 위에 놓습니다. (E-G) 스테인레스 스틸 텀블러가 이소펜탄으로 채워지고 액체 질소에서 용융 온도로 냉각됩니다. (H,I) 차가운 이소펜탄을 가진 텀블러는 액체 질소에서 꺼내어지고, 샘플은 텀블러의 바닥까지 침지되고, 15초 동안 소용돌이치게 된다.(J-L) 샘플과 함께 코르크는 플라스틱 지지대 없이 냉동 홀더 디스크에 놓이고, 10μm의 연속 횡단 섹션은 접착 슬라이드에 직접 장착된다. 두 개의 인접한 직렬 횡단면은 LD의 염색 및 MyHC의 검출을 위해 즉시 처리된다. 약어: LDs = 지질 방울; EDL = 신근 디지토럼 경도; MyHCs = 미오신 중쇄 이소형; OCT = 최적의 절삭 온도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다른 컴퓨터에서 본 재구성된 복합 이미지로부터 섬유의 유형을 확인한 후 Bodipy 이미지 획득. (A) 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 함께 꿰매어 진 일곱 개의 독립적 인 병합 이미지 (점선 사각형)에서 섬유 유형 (MyHCs)에 대해 면역 표지 된 전체 솔러스 섹션의 재구성. 백색 화살표 및 숫자는 종래의 에피형광 현미경을 이용한 이미지 획득 동안 뒤따르는 순서를 나타낸다. (B) 보디피 이미지 획득을 위해, (1) 라미닌-AF647 및 Bodipy-555/568로 면역염색된 근육 섹션을 포함하는 필드를 공초점 현미경에 연결된 컴퓨터의 스크린에 시각화한다. (2) 이러한 섬유는 섬유의 종류(MyHCs)를 검출하기 위해 면역염색된 근육 부분의 재구성된 이미지 상에 위치한다. (3) 영상은 공초점 현미경을 이용하여 획득한다. 약어: LDs = 지질 방울; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; MyHCs = 미오신 중쇄 이소형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 피지로 지질 방울의 분석. (A, B) 섬유의 사르콜레마는 라미닌 이미지를 기반으로 인식되고 ROI로 선택됩니다. 전체 면적과 MF가 측정됩니다. (C) 섬유의 중앙 부분을 인식하기 위해, 선택은 MF의 값의 1/6만큼 감소된다. (D) 중앙과 전체 선택 사이의 영역은 주변 또는 아사르콜렘말 영역으로 설정된다. (E) Bodipy로 염색된 LD의 분석을 위해, 역치가 적용되고, (F) 입자 분석 도구가 LD와 관련된 상이한 파라미터를 정량화하는데 사용된다(표 참조). 이들 값은 완전한 섬유(모두), 중앙 부분(중심), 및 아사르콜렘성 영역(주변부)에 대해, 독립적으로 얻어진다. 스케일 바 = 12 μm. 약어: LDs = 지질 방울; ROI = 관심 지역; MF = 최소 페렛의 직경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: EDL(glycolytic) 및 솔레우스(산화성) 마우스 근육에서 섬유 유형의 대표적인 면역염색. EDL (A, B) 및 솔레우스 (C, D)의 병합 형광 이미지를 디지털, 전체 슬라이드 형광 현미경으로 얻었습니다. I형(청색-AF405), II형(녹색-AF488), II형(적색-AF568) 및 라미닌(백색-AF647)에 대한 항체가 사용되었다. 검은 색 섬유는 섬유 유형 IIb에 해당합니다. B 와 D는 각각 패널 A 와 C의 흰색 사각형 내부의 섬유의 세부 사항을 보여줍니다. 패널 D 의 별표(*)는 IIa/IIx 하이브리드 섬유를 보여줍니다. (E, F) 3개월령 마우스로부터의 EDL 및 발바닥에서의 섬유유형 분포의 대표적인 정량화(N=5). EDL은 주로 IIb 형, IIx 및 IIa 섬유 (각각 ~ 75 %, 15 % 및 5 %)로 구성되었습니다. 대조적으로, 발바닥은 주로 IIa 형 (>50 %)과 유형 I 섬유 (30 %)로 구성되었습니다. IIx 타입 섬유의 비율은 두 근육에서 다소 유사했지만, 하이브리드 섬유의 비율은 매우 낮았다. 스케일 바 = 200 μm (A,C), 100 μm (B,D). 약어: EDL = 신전 디지토럼 경도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: MyHC 이소형에 대해 이전에 면역표지된 직렬 단면에서 보디피를 사용한 LDs의 대표적인 염색. 마우스 EDL(A) 및 단독(B)의 형광 병합 이미지는 유형 I(파란색), IIa(녹색), IIx(적색), IIb(검정) 섬유, 및 라미닌(섬유를 둘러싸는 백색 신호)을 나타내는 epifluorescence 현미경을 사용하여 획득하였다. (C-F) EDL (C,D) 및 단독 (E,F)으로부터의 공초점 형광 이미지는 라미닌 (시안) 및 보디피 (적색)로 공동-표지되었다. C-F로 표시된 섬유는 패널 A 및 B의 흰색 사각형 내부의 섬유와 동일합니다. A의 흰색 사각형의 오른쪽 모서리에서 축삭 나뭇 가지를 구별 할 수 있습니다 (흰색 화살표 헤드). 스케일 바 = 200 μm (A,B), 20 μm (C-F). 약어: LDs = 지질 방울; EDL = 신근 디지토럼 경도; MyHCs = 미오신 중쇄 이소형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 섬유형 및 아세포-특이적 방식으로 LDs의 정량화. 보디피(적색) 및 α2-라미닌(도시되지 않음)과 공동 표지한 후 얻은 EDL(C,D)로부터의 단창(A,B) 및 유형 IIx 및 유형 IIb 섬유로부터의 유형 I 및 유형 IIa 섬유의 대표적인 형광 공초점 이미지. LD 함량 (보디피가 차지하는 면적의 % 및 밀도) 및 형태학 (크기)을 아세포 특이적 방식으로 분석하였다. 섬유 둘레는 라미닌 염색에 의해 정의되었고, 중앙 또는 주변 영역은 MF 직경에 기초하여 설정되었다. 각 섬유 유형에 대한 중앙 또는 주변 영역에서 Bodipy (LD) (E), LD 밀도 (수 / μm2) (F) 또는 평균 LD 크기 (G)가 차지하는 섬유 면적의 백분율. 결과는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 스케일 막대 = 10 μm. 약어: LDs = 지질 방울; EDL = 신근 디지토럼 경도; C = 중앙; P = 주변 장치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 차선책의 결과에 상응하는 이미지 . (A) 동결 과정 동안 형성된 얼음 결정을 보여주는 헤마톡실린-에오신에 대해 염색된 근육 단면의 브라이트필드 이미지. (B) MyHCs 및 라미닌에 대해 면역염색된 단독 절편의 형광 병합 이미지로서, 대부분의 섬유가 세로축을 따라 절단되었음을 보여준다. (c) MyHCs 및 라미닌에 대해 면역염색된 EDL 섹션의 형광 이미지. 섬유 유형 IIa (녹색)의 약한 염색은 각 섬유 유형의 정확한 정량화를 방해합니다. (d) 근육 단면의 주변에 위치한 섬유상의 Bodipy (적색)의 강력한 인공물 염색을 보여주는 공초점 이미지. 스케일 막대 = 50 μm (A,B), 200 μm (C,D). 약어: EDL = 신전 디지토럼 경도; MyHCs = 미오신 중쇄 이소형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 근육 단면에 오일 레드 O로 LD 염색. (A, B) 솔러스 및 EDL에서 Oil Red O로 얻어진 염색 패턴을 각각 나타낸 공초점 이미지. 이러한 염색에 사용된 프로토콜은 Prats et al.24에 의해 상세히 기술되어 있다. LDs의 축적은 Bodipy에 대해 이전에 기술된 바와 같이, 근섬유의 아사르콜렘말 영역에서 더 높다는 것을 주목하라. 스케일 바 = 20 μm. 약어: LD = 지질 액적; EDL = 신전 디지토럼 경도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2 : 발바닥 근육에서 LDs와 미토콘드리아의 공동 염색. (A) 미토콘드리아 막에 존재하는 단백질인 Tomm20(녹색), DAPI(파란색) 및 LDs(적색)로 표지된 Bodipy-558/568의 면역표지를 보여주는 공초점 병합 이미지. A의 삽입은 LD (빨간색)에 결합 된 여러 미토콘드리아 (녹색)를 보여줍니다. 이 이미지는 Airyscan 공초점 초해상도 현미경을 적용하여 얻어졌습니다. (B,C) 각각 LDs 및 미토콘드리아의 대응하는 단일 채널 이미지. 스케일 막대 = 10 μm (A-C), 5 μm (A, inset). 약어: LDs = 지질 방울; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 여러 라미닌 + Bodipy 이미지에서 LD의 자동 분석을위한 피지 매크로. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 매크로 Bodipy_JoVE.ijm으로 작업하는 방법에 대한 단계별 설명입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 자세히 설명된 프로토콜은 Bodipy로 태그가 지정된 LD를 섬유형 및 아세포별 기준으로 정량화하는 효율적인 방법을 설명합니다. 최근 몇 년 동안, ORO 또는 수단 블랙 B와 같은 고전적 지질 염료는 중성 지질 (예를 들어, Bodipy)에 결합하는 세포 투과성, 친유성, 형광 염료의 새로운 어레이로 치환되었다. 다른 컨쥬게이트로서 이용 가능한 Bodipy는 LDs를 태깅하여 다른 고정 조직 및 세포23,38,39,40뿐만 아니라 살아있는 세포 41,42에서도 다른 소기관과의 형태, 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 매우 효과적임이 입증되었습니다.
프로토콜 내에는 연구자가 최적의 결과를 얻기 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 근육 근섬유의 완벽한 정렬과 방향을 보장하기 위해 선택한 근육을 코르크에 올바르게 배치하는 것이 필수적이며, 일단 얼어 붙으면 홀더를 약간 다시 조정할 수 있기 때문에 냉동 스탯에서 할 수 있습니다. 또한, 절편이 절단된 직후에 면역염색 프로토콜을 시작하는 것이 중요한데, 이는 공기 건조 냉동 절편(단 15분 동안)이 LD에 심각한 악영향을 미쳐 LD 밀도가 66% 감소하고 평균 크기24가 37% 감소하기 때문입니다. 마찬가지로 슬라이드를 동결 및 해동하면 부작용이 발생할 수 있으므로 권장하지 않습니다. 이 프로토콜의 세 번째 중요한 특징은 샘플의 고정과 관련이 있습니다. 여기에 인용된 항체와 상이한 MyHC 이소형의 동정을 위해, 조직 고정은 그들의 에피토프에 대한 선택된 항체의 결합을 방해하기 때문에 피해야 한다. 근육 샘플이 이전에 고정된 경우, 독자는 상이한 항체(43)를 사용하여 최근에 발표된 논문으로 언급된다. 메탄올 또는 아세톤의 사용은 LD23,44의 형태를 방해하기 때문에 LDs의 라벨링 및 정량화를 위해 메탄올이없는 PFA 만 권장됩니다. 또한, 라미닌으로 면역표지된 슬라이드 상의 LDs의 정량화를 위해 투과화 단계가 필요하지 않다. 일부 그룹은 TritonX-100, 사포닌 또는 글리신과 같은 세제를 사용한 투과가 LDs44,45의 크기 또는 수를 감소시킬 수 있음을 보여 주었기 때문에 투과는 매우 권장되지 않습니다. 마지막으로, 공초점 현미경 설정의 미세 조정은 LDs에 존재하는 중성 지질만을 인식하는 데 중요하며 다른 소기관(24)의 막에 있는 지질은 인식하지 못한다.
여기서, Bodipy-558/568C12를 LD 마커로서 사용하였다. 그러나 LD에 태그를 지정하고 골격근 근섬유 내의 형태와 위치를 연구하는 데 가장 자주 사용되는 Bodipy는 Bodipy-493/503입니다. 두 염료 모두 배양 시간, 작업 농도 및 좁은 방출 스펙트럼에서 유사하지만 여기 및 방출 범위는 약간 다릅니다. Bodipy-493/503의 사용에 대한 완전한 프로토콜을 위해, 독자는 Listenberger and Brown46 또는 Spangenburg et al.23의 작업을 참조한다. Bodipy-558/568C12는 지방 조직(47), 퇴행성 망막(48), 섬유성 신장(49), 또는 섬유아세포(50)와 같은 다른 조직에서 LDs를 염색하는데 사용되어 왔다. 이 Bodipy는 ORO로 얻은 것과 유사한 염색을 산출하지만 (보충 그림 S1 참조) 기술적 부담이 상당히 적고 특이성이24,51입니다. 더욱이, Bodipy-558/568C12는 녹색 스펙트럼 2차 항체 (보충도 S2 및 Yan et al.49 참조) 또는 GFP-유전자 변형 모델52로 태그된 단백질 또는 소기관의 검출과 조합하여 LDs의 정량화를 가능하게 하는 이점을 갖는다. 이 두 가지 응용 프로그램은 LD와 다른 세포 소기관 및 단백질의 역학 및 상호 작용을 푸는 매우 강력한 도구입니다. 그럼에도 불구하고, 세포 내에서 단백질의 공동 표지가 의도되지 않았을 때, 저자들은 가장 잘 특성화 된 LD 염료 Bodipy-493/503의 사용을 권장합니다.
이 프로토콜의 한계 중 하나는 이미지의 획득 및 LD 형태학적 특성의 정량화와 관련이 있다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 기술 발전은 광역 현미경에 비해 평면 해상도를 크게 향상 시켰으며 Z 평면에서 샘플을 스캔 할 때 물체를 3D 재구성 할 수있게했습니다. 이것은 LD 형태학(24) 및 골격 근섬유(38,53)에서 다른 단백질과의 상호작용에 대한 연구에 매우 유용하지만, 각각의 3D-재구성된 이미지가 여러 개의 독립적인2D 이미지들로 구성되기 때문에 이미지 획득 및 처리 시간을 증가시켰다. 위의 프로토콜에서 공초점 이미지는 40x 대물 렌즈로 획득되었으며 2D에서만 획득되었습니다. 이 방법을 사용하면 63x 목표를 사용할 때와 같이 이미지 당 하나만 아닌 이미지 당 세 ~ 6 개의 근섬유를 얻을 수 있습니다. 이로 인해 분해능이 낮아지고 LD 크기 및 형태학이 완전히 정확하지 않은 전반적인 추정치가 생성됩니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 샘플 당 더 많은 수의 섬유의 분석을 허용하며, 이는 특히 많은 수의 근육과 조건을 비교해야하는 동물 실험에서 고려해야 할 중요한 사실입니다.
여기서, 서로 인접한 유사한 크기의 두 근육(34)을 동결시킴으로써, 샘플의 처리 시간이 상당히 감소되고, 이들의 독립적인 처리로부터 도출될 수 있는 인공물 차이가 감소된다는 것이 도시된다. 더욱이, LD를 분석하는이 방법은 섬유 유형54 내와 섬유 유형 사이의 LD의 세포 내 분포 사이의 차이를 고려합니다. 근섬유의 둘레를 선택하고 섬유의 최소 Feret의 직경과 관련하여이 선택을 줄이면 중앙 및 주변 (subsarcolemmal) LD의 크기와 밀도에 대한 연구가 독립적으로 용이합니다. 이 방법을 적용하는 것은 LDs의 아사르콜렘말 축적이 인슐린 저항성에 직접적으로 기여한다는 것이 입증되었기 때문에 매우 중요하다. 인간의 일부 보고서는 섬유 유형 및 위치 의존적 인 방식으로 LD를 연구했지만11,16,25,25,이 방법이 설치류의 근육에 적용되었다는 것은 이번이 처음입니다. 또한, 피지를 위한 자체 설계 매크로의 도움으로 LD의 정량화는 이미지 분석 시간을 크게 줄이고 단순화했습니다. 매크로와 매크로 사용 방법에 대한 단계별 설명은 각각 보충 파일 1 및 보조 파일 2로 사용할 수 있습니다.
전반적으로, 저자들은 여기에 설명 된 프로토콜이 골격근의 지질 대사를 연구하는 다른 연구자들에게 유용한 도구가 될 수 있다고 생각합니다. 설명 된 기술은 다른 근육과 별개의 조건 (금식 / 과식, 훈련 / 좌식, 젊은 / 노인, 마른 / 비만)에 적용될 수 있으며 LD의 역학, 세포의 다른 구성 요소와의 상호 작용의 중요성, 글리콜 및 산화 섬유에서 지질이 어떻게 저장되고 대사되는지, 제 2 형 당뇨병에서 인슐린 저항성의 발병에서의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이되기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20)와 Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S.의 보조금으로 지원되었습니다. M.A.D.-L.d.C.는 Wallonie-Bruxelles International Excellence Program으로부터 펠로우십을 받았습니다.
저자는이 프로토콜 개발에 기여한 Alice Monnier와 이미지 수집 프로세스에 대한 전문 지식과 기술적 도움을 주신 Caroline Bouzin에게 감사드립니다. 우리는 또한 냉동 및 현미경 (2IP-IREC 이미징 플랫폼, 실험 및 임상 연구 연구소, Université Catholique de Louvain, 1200 브뤼셀, 벨기에)에 액세스 할 수있는 2IP-IREC 이미징 플랫폼에 감사드립니다. 마지막으로, 저자는 원고에 대한 건설적인 비판에 대해 Nicolas Dubuisson, Romain Versele 및 Michel Abou-Samra에게 감사하고 싶습니다. 이 기사의 인물 중 일부는 BioRender.com 로 작성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AxioCam 506 mono 6 Mpix camera | Zeiss | ||
| AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera | Zeiss | ||
| Chemical hood | Potteau Labo | EN-14175 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM800 | |
| Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Cryo-Gloves | Tempshield | 16072252 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm Cryo Star HM 560 | |
| Dissecting Stereo Microscope SMZ745 | Nikon | ||
| Dry Ice | |||
| Dumont Forceps | F.S.T | 11295-10 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T | 14084-08 | |
| FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) | ThermoFisher | 22-363-552 | Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing |
| Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | BRAND Petri dish, MERK | BR455751 | Used to place the muscles on ice during dissection |
| ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen | Vector Labs | H-4000 | Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections |
| Incubator | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
| Microscope Cover Glasses (24x50 mm) | Assistent | 40990151 | |
| Microscope Slide Boxes | Kartell | 278 | Used as humid chambers for immunohistochemistry |
| Neck holder | Linie zwo | SB-035X-02 | Used as strap to hold the stainless steel tumbler |
| No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade | Swann-Morton | 0205 | |
| Paint brushes | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections |
| Permanent Marker Pen Black | Klinipath/VWR | 98307-R | Used to label slides |
| Pierce Fixation Forceps | F.S.T | 18155-13 | |
| Polystyrene Box | H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat | ||
| Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 | Aesculap | BB073R | |
| Stainless Steel Cup 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing |
| Superfrost Ultra Plus slides | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
| Surgical tweezers 1/2 teeth | Medische Vakhandel | 1303152 | Also called "Rat teeth tweezers" |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | F.S.T | 15000-00 | |
| Weighing boats | VWR international | 611-2249 | |
| Whole-Slide Scanner for Fluorescence | Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM | Abcam | ab175702 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher | A-21247 | Used at a final concentration of 1:500 |
| BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) | ThermoFisher | D3922 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) | ThermoFisher | D3835 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFisher | D1306 | Used at a final concentration of 0.5 µg/mL |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8418 | Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1004969011 | CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Isopentane GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. |
| Liquid Nitrogen | CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids. | ||
| Mouse on mouse Blocking Reagent | Vector Labs | MKB-2213-1 | Used at concentration of 1:30 |
| Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b | DSHB University of Iowa | BA-D5-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 | DSHB University of Iowa | SC-71-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | 6H1-supernatant | Used at a final concentration of 1:5 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Vector Labs | S-1000 | |
| PBS 0.1 M | Commonly used on histology laboratories | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) | Sigma-Aldrich | L0663 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | Confocal software | |
| BioRender | https://biorender.com/ | Used to design the figures | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | Used to analyse the acquired images | |
| Microsoft PowerPoint | Microsoft | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types | |
| Zen Blue 2.6 | Zeiss | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types |
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