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Medicine

कंकाल की मांसपेशियों में लिपिड छोटी बूंद सामग्री का फाइबर प्रकार और उपकोशिकीय-विशिष्ट विश्लेषण

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63718
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

Summary

बढ़ते सबूत इंगित करते हैं कि कंकाल की मांसपेशियों के अंदर लिपिड की अत्यधिक घुसपैठ के परिणामस्वरूप लिपोटॉक्सिसिटी और मधुमेह होता है। यहां, हम फाइबर-प्रकार के विशिष्ट तरीके से लिपिड बूंदों के आकार, घनत्व और उपकोशिकीय वितरण को मापने के लिए ऊतक प्रसंस्करण, बोडिपी, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के साथ धुंधला होने सहित एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी लिपिड घुसपैठ, जिसे मायोस्टेटोसिस के रूप में जाना जाता है, मोटापे और उम्र बढ़ने के साथ बढ़ता है। मायोस्टेटोसिस को हाल ही में हृदय रोग और कैंसर जैसे कई अन्य विकारों के लिए एक नकारात्मक पूर्वानुमान कारक के रूप में भी खोजा गया है। अत्यधिक लिपिड घुसपैठ मांसपेशियों और ताकत को कम करता है। इसके परिणामस्वरूप कुल इंट्रामायोसेल्युलर लिपिड सामग्री, लिपिड ड्रॉपलेट (एलडी) आकृति विज्ञान और उपकोशिकीय वितरण के आधार पर लिपोटॉक्सिसिटी और इंसुलिन प्रतिरोध भी होता है। फाइबर प्रकार (ऑक्सीडेटिव बनाम ग्लाइकोलाइटिक) भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि ऑक्सीडेटिव फाइबर में लिपिड का उपयोग करने की अधिक क्षमता होती है। पैथोफिजियोलॉजी में उनके महत्वपूर्ण निहितार्थों के कारण, फाइबर प्रकार-विशिष्ट तरीके से एलडी गतिशीलता और कार्य पर गहन अध्ययन की आवश्यकता है।

इसमें, इंट्रामायोसेल्युलर लिपिड सामग्री की मात्रा का ठहराव और फाइबर प्रकार-विशिष्ट तरीके से एलडी आकृति विज्ञान और उपकोशिकीय वितरण के विश्लेषण के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह अंत करने के लिए, धारावाहिक मांसपेशी क्रायोसेक्शन फ्लोरोसेंट डाई बोडिपी और मायोसिन भारी श्रृंखला आइसोफॉर्म के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग थे। यह प्रोटोकॉल विभिन्न मांसपेशियों के एक साथ प्रसंस्करण को सक्षम बनाता है, समय की बचत करता है और संभावित कलाकृतियों से बचता है और फिजी में बनाए गए व्यक्तिगत मैक्रो के लिए धन्यवाद, एलडी विश्लेषण का स्वचालन भी संभव है।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी लिपिड घुसपैठ, जिसे मायोस्टेटोसिस के रूप में जाना जाता है, मोटापे और उम्र बढ़ने के साथ बढ़ता है। मायोस्टेटोसिस मांसपेशियों और ताकत के साथ और इंसुलिन संवेदनशीलता के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है1. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि मायोस्टेटोसिस की डिग्री का उपयोग अन्य स्थितियों जैसे हृदय रोग2, गैर-अल्कोहल फैटी यकृत रोग 3, या कैंसर4 के लिए पूर्वानुमान कारकके रूप में किया जा सकता है। लिपिड मांसपेशियों के तंतुओं के बीच कंकाल की मांसपेशियों में एक्स्ट्रामायोसेल्युलर लिपिड के रूप में या फाइबर के भीतर इंट्रामायोसेल्युलर लिपिड (आईएमसीएल) के रूप में जमा हो सकते हैं। आईएमसीएल मुख्य रूप से लिपिड बूंदों (एलडी) में ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में संग्रहीत होते हैं जो शारीरिक व्यायाम 5,6 के दौरान चयापचय ईंधनके रूप में उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, जब लिपिड की आपूर्ति मांग से अधिक हो जाती है, या जब माइटोकॉन्ड्रिया बेकार हो जाता है, तो आईएमसीएल को मांसपेशियों के इंसुलिन प्रतिरोध में फंसाया जाएगा, जैसा कि चयापचय रूप से अस्वास्थ्यकर, मोटापे से ग्रस्त व्यक्तियों और टाइप 2 मधुमेह रोगियों में देखाजाता है। दिलचस्प बात यह है कि धीरज एथलीटों में उच्च इंसुलिन संवेदनशीलता बनाए रखते हुए टाइप 2 मधुमेह मेलिटस वाले मोटापे से ग्रस्त रोगियों में पाए जाने वाले आईएमसीएल के स्तर समान हैं, यदि उच्च नहीं हैं। इस घटना को "एथलीट के विरोधाभास" 8,9 के रूप में वर्णित किया गया है, और मांसपेशियों के एलडी के अधिक सूक्ष्म मूल्यांकन द्वारा समझाया गया है, जो उनके आकार, घनत्व, स्थानीयकरण, गतिशीलता और लिपिड प्रजातियों की संरचना से संबंधित है।

सबसे पहले, एलडी आकार इंसुलिन संवेदनशीलता और शारीरिक फिटनेस10,11 से विपरीत रूप से सहसंबद्ध है। वास्तव में, छोटे एलडी लाइपेज कार्रवाई के लिए अपेक्षाकृत अधिक सतह क्षेत्र प्रदर्शित करते हैं और इस प्रकार, संभावित रूप से लिपिड12 को जुटाने की अधिक क्षमता रखते हैं। दूसरा, एलडी घनत्व (संख्या / सतह) इंसुलिन कार्रवाई 8,10 में एक विवादास्पद भूमिका निभाता है; फिर भी, यह एथलीटों में वृद्धि हुई प्रतीत होती है। तीसरा, एलडी का उपकोशिकीय स्थानीयकरण महत्वपूर्ण है, क्योंकि सतह झिल्ली (सबसरकोलेम्मल या परिधीय) के ठीक नीचे स्थित एलडी केंद्रीय लोगों 8,9,13 की तुलना में इंसुलिन संवेदनशीलता पर अधिक हानिकारक प्रभाव डालते हैं। उत्तरार्द्ध केंद्रीय माइटोकॉन्ड्रिया को ईंधन प्रदान करता है, जिसमें अधिक श्वसन गतिविधि होती है और संकुचन14 के लिए आवश्यक उच्च ऊर्जा मांग को पूरा करने के लिए अधिक विशिष्ट होते हैं। इसके विपरीत, परिधीय एलडी सबसरकोलेमल माइटोकॉन्ड्रिया की आपूर्ति करते हैं, जो झिल्ली से संबंधित प्रक्रियाओं में शामिलहोते हैं 8. अंत में, ट्राइग्लिसराइड्स से परे, मांसपेशियों के भीतर विशिष्ट जटिल लिपिड दूसरों की तुलना में अधिक हानिकारक हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, डायसिलग्लिसरॉल, लंबी श्रृंखला एसाइल-सीओए और सेरामाइड्स मांसपेशियों में जमा हो सकते हैं जब ट्राइग्लिसराइड टर्नओवर दर कम होती है, जिससे इंसुलिन सिग्नलिंग 9,15 खराब हो जाती है। "एथलीट के विरोधाभास" पर लौटते हुए, धीरज एथलीटों में टाइप I (ऑक्सीडेटिव) फाइबर में ऊंची टर्नओवर दर के साथ छोटे केंद्रीय एलडी की एक उच्च संख्या होती है, जबकि मोटापे से ग्रस्त और मधुमेह रोगियों में टाइप II (ग्लाइकोलाइटिक) फाइबर 8,15,16 में कम टर्नओवर दरके साथ बड़े परिधीय एलडी होते हैं। ऊर्जा भंडारण और रिलीज में उनकी भूमिका के अलावा, व्युत्पन्न फैटी एसिड (एफए) और एक कोट प्रोटीन (पेरिलिपिन 5) के माध्यम से एलडी एफए ऑक्सीकरण और माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस8 के ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन में शामिल महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में भी कार्य कर सकते हैं। शरीर विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी में उनके महत्वपूर्ण निहितार्थों के कारण, एलडी गतिशीलता और कार्यों पर गहन अध्ययन की आवश्यकता है।

यद्यपि आईएमसीएल का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकें हैं, वे फाइबर-विशिष्ट तरीके से एलडी आकार, घनत्व और वितरण को सटीक रूप से मापने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। उदाहरण के लिए, चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा आईएमसीएल का मूल्यांकन, गैर-आक्रामक होने के दौरान, रिज़ॉल्यूशन का एक स्तर प्रदान करता है जो फाइबर के भीतर एलडी के आकार और सटीक स्थान का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त नहीं है, और यह फाइबर-प्रकार विशिष्ट17,18 नहीं है। इसी तरह, पूरे मांसपेशी होमोजेनेट्स19 पर की गई जैव रासायनिक तकनीक लिपिड के स्थान और आकार का आकलन नहीं कर सकती है। नतीजतन, एलडी आकृति विज्ञान और स्थान का विश्लेषण करने का सबसे पर्याप्त तरीका मात्रात्मक संचरण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी13 है, लेकिन यह तकनीक महंगी और समय लेने वाली है। इसलिए, ऑयल रेड ओ (ओआरओ) 20,21, मोनोडैनसिलपेंटेन (एमडीएच) 22, या बोडिपी 23,24,25 जैसे रंगों के साथ तैयारी पर कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस इमेजिंग, इन अध्ययनों के लिए सबसे अच्छा उपकरण के रूप में उभरा है।

यहां, माउस मांसपेशी क्रायोसेक्शन में एलडी आकार, संख्या और स्थानीयकरण को मापने के लिए ऊतक नमूनाकरण और प्रसंस्करण, बोडिपी धुंधला, और कन्फोकल छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सहित एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। चूंकि आईएमसीएल ऑक्सीडेटिव और ग्लाइकोलाइटिक फाइबर के बीच समान रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं, और प्रत्येक फाइबर प्रकार एलडी गतिशीलता को अलग तरह से नियंत्रित करता है, आईएमसीएल का अध्ययन फाइबर-प्रकार विशिष्ट 16,25,26,27 होना चाहिए। इसलिए, यह प्रोटोकॉल प्रत्येक फाइबर द्वारा व्यक्त मायोसिन भारी श्रृंखला (एमवाईएचसी) आइसोफॉर्म (ओं) की पहचान करने के लिए धारावाहिक वर्गों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ एक ग्लाइकोलाइटिक (एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस, ईडीएल) और एक ऑक्सीडेटिव (एकमात्र) मांसपेशियों के एक साथ प्रसंस्करण ठंड (चित्रा 1) से पहले कंधे से कंधा मिलाकर रखा गया है। यह एक साथ प्रसंस्करण न केवल समय बचाता है बल्कि नमूनों के अलग-अलग प्रसंस्करण के कारण परिवर्तनशीलता से भी बचता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रिया का योजनाबद्ध अवलोकन। मांसपेशियों के विच्छेदन (1) के बाद, समान आकार की चयनित मांसपेशियों को तैयार किया जाता है और एक साथ जमे हुए होते हैं (2). 10 μm के सीरियल अनुप्रस्थ वर्गों को क्रायोस्टैट का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है और सीधे आसंजन स्लाइड (3) पर घुड़सवार किया जाता है। दो धारावाहिक स्लाइडों से, पहला (4 ए) लैमिनिन के लिए इम्यूनोलेबल किया जाता है और एलडी को पहचानने के लिए बोडिपी के साथ दाग दिया जाता है और दूसरा (4 बी) मांसपेशियों के फाइबर प्रकारों की पहचान के लिए माईएचसी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन किया जाता है। छवियों को बोडिपी (5 ए) के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और मांसपेशी फाइबर प्रकारों (5 बी) के लिए एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित किया जाता है। अनुभाग में प्रत्येक प्रकार के तंतुओं का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए एलडी (7) या गिनती कोशिकाओं (6 बी) द्वारा कब्जा किए गए कुल क्षेत्र की संख्या, औसत आकार, घनत्व और प्रतिशत प्राप्त करने के लिए एक थ्रेसहोल्ड और मात्रा निर्धारित कणों (6 ए) को लागू करके फिजी में छवियों का विश्लेषण किया जाता है। संक्षिप्त नाम: एलडी = लिपिड बूंदें; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; मायएचसी = मायोसिन भारी श्रृंखला आइसोफॉर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

चूहों पर आयोजित सभी प्रक्रियाओं को यूनिवर्सिट कैथोलिक डी लौवेन (2019 / यूसीएल / एमडी / 013) में चिकित्सा क्षेत्र से पशु प्रयोग के लिए नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. विच्छेदन और ठंड के लिए नमूनों की तैयारी

  1. मांसपेशियों की प्रत्येक जोड़ी के लिए कॉर्क के 3 मिमी मोटे टुकड़े को लेबल करें।
  2. कॉर्क के केंद्र पर एक ब्लेड के साथ किए गए एक छोटे चीरे के माध्यम से, कठोर प्लास्टिक (0.5 सेमी डब्ल्यू, 1 सेमी एच) का एक आयताकार टुकड़ा डालें जो समर्थन (चित्रा 2 बी) के रूप में काम करेगा।
    नोट: आयताकार प्लास्टिक के टुकड़े का आकार मांसपेशियों के आकार पर निर्भर करेगा। यहां, वर्णित आयाम 3 महीने के सी 57 बीएल / 6 जे पुरुष माउस के एकमात्र (~ 9 मिलीग्राम, 1 सेमी एल, 2-3 मिमी डब्ल्यू) और ईडीएल (~ 5 मिलीग्राम, 1 सेमी एल, 2-3 मिमी डब्ल्यू) के आकार के लिए अनुकूलित हैं।
  3. विच्छेदन के समय, माउस हिंद अंग के सोलस और ईडीएल को हटा दें। विच्छेदन के दौरान नमूनों को सूखने से रोकने के लिए, उन्हें बर्फ पर रखे पेट्री डिश में खारा समाधान के साथ हल्के से सिक्त एक संपीड़ित पर रखें।
    नोट: इन दो अंग की मांसपेशियों को विच्छेदित करने के तरीके पर स्पष्टीकरण के लिए वांग एट अल .28 देखें।
  4. प्लास्टिक जंक्शन पर इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) की एक छोटी बूंद रखें, हवा के बुलबुले से बचें।
  5. धीरे से उन्हें एक कागज तौलिया (चित्रा 2 ए) के साथ सुखाने से नमूनों से अतिरिक्त नमी को खत्म करें और कॉर्क (चित्रा 2 सी) के लंबवत प्लास्टिक पर दोनों मांसपेशियों को रखें।
  6. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 डी) के तहत मांसपेशी मायोफाइबर के अभिविन्यास की जाँच करें।
    नोट: ओसीटी के साथ मांसपेशियों को कवर नहीं करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि इसका इन्सुलेट प्रभाव तेजी से ठंड को रोक देगा और ठंड कलाकृतियों का उत्पादन करेगा।

2. क्रायोसेक्शनिंग के लिए कंकाल की मांसपेशियों के नमूने ठंड

सावधानी: मांसपेशियों की ठंड एक रासायनिक हुड के तहत की जानी चाहिए, उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहने हुए ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. कम से कम 25 सेमी लंबे (चित्रा 2 एफ) से जुड़े दो तरफ पट्टियों के साथ एक स्टेनलेस स्टील टम्बलर (~ 8 सेमी एच, 6 सेमी Ø) का उपयोग करें, और आइसोपेंटेन के साथ अपनी क्षमता के 2/3 तक गिलास भरें।
  2. पट्टियों द्वारा गिलास को पकड़ना, इसे तरल नाइट्रोजन से भरे पॉलीस्टाइनिन बॉक्स में धीरे से विसर्जित करें ताकि कंटेनर के बाहर नाइट्रोजन का स्तर अंदर आइसोपेंटेन के स्तर से ऊपर हो (चित्रा 2 एफ, जी)।
    सावधानी: जब टंबलर नाइट्रोजन के संपर्क में आता है, तो थर्मल शॉक घूमने का कारण बन सकता है। सुनिश्चित करें कि टम्बलर पर्याप्त रूप से डूबा हुआ है लेकिन नाइट्रोजन के प्रवेश से बचें क्योंकि इससे आइसोपेंटेन वर्षा होगी। यदि ऐसा होता है, तो आइसोपेंटेन को ठंडा होने दें, टंबलर को नए आइसोपेंटेन से भरें और शुरू करें।
  3. जब गिलास के अंदर पूरी तरह से आइसोपेंटेन की एक सफेद ठोस परत के साथ कवर किया जाता है, तो इसे तरल नाइट्रोजन बॉक्स (चित्रा 2 एच) से बाहर निकालें।
    नोट: आइसोपेंटेन का पिघलने का तापमान -159 डिग्री सेल्सियस होने के कारण, टंबलर के किनारे सफेद हो जाएंगे जब यह काफी ठंडा हो जाएगा।
  4. ठोस आइसोपेंटेन टुकड़ों को संदंश के साथ शेष तरल आइसोपेंटेन में धीरे-धीरे हिलाएं जब तक कि पूरी मात्रा फिर से तरल न हो जाए।
  5. तरल नाइट्रोजन में गिलास को फिर से विसर्जित करें जब तक कि आइसोपेंटेन टंबलर (चित्रा 2 जी, एच) के नीचे और किनारों पर सफेद कंकड़ नहीं बनाता है।
    नोट: यह दूसरा शीतलन चरण आइसोपेंटेन के उचित ठंड तापमान को सुनिश्चित करता है।
  6. तरल नाइट्रोजन से गिलास निकालें और जल्दी से मांसपेशियों को टंबलर के नीचे डुबोएं, चूहे के दांत चिमटी के साथ कॉर्क को पकड़ें। आइसोपेंटेन में 15 एस के लिए कॉर्क घुमाएं और प्रसंस्करण (चित्रा 2 आई) तक इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: अल्पकालिक भंडारण के लिए, नमूने एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में बनाए रखा जा सकता है। कंकाल की मांसपेशियों के तेजी से ठंड के लिए पूरा प्रोटोकॉल पहले से ही कहीं और प्रकाशित किया गया है। विस्तृत संदर्भ और समस्या निवारण के लिए, देखें: मेंग एट अल .29, कुमार एट अल .30, और लीवा-सेपस एट अल .31।

3. क्रायोसेक्शनिंग

  1. नमूनों को पहले -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने वाले क्रायोस्टैट के कक्ष में लाएं और ब्लेड तापमान -25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    नोट: सूखी बर्फ से भरे पॉलीस्टाइनिन बॉक्स में क्रायोस्टैट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस / -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से परिवहन नमूने और नमूनों को काटने से पहले कक्ष के तापमान पर कम से कम 20-30 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दें।
  2. ठीक चिमटी के साथ कॉर्क से प्लास्टिक निकालें और ठंडा करने के लिए त्वरित फ्रीज प्लेट पर क्रायोस्टैट नमूना डिस्क रखें। एक बार जब प्लेट -50 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाती है, तो डिस्क पर कुछ ओसीटी रखें और जल्दी से कॉर्क को डिस्क के शीर्ष पर रखें, दृढ़ता से दबाएं। ओसीटी जमने तक प्रतीक्षा करें और डिस्क पर कॉर्क अच्छी तरह से तय हो जाए।
  3. वांछित काटने अभिविन्यास (चित्रा 2 जे, के) में ऑब्जेक्ट सिर पर डिस्क रखें और मांसपेशियों की लंबाई के कम से कम 1/3 से परे मांसपेशियों के ब्लॉक को ट्रिम करें और जब तक मांसपेशियों के दोनों क्रॉस सेक्शन दिखाई न दें।
  4. काटने की मोटाई को 10 μm पर सेट करें और एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप पर फाइबर के सही अभिविन्यास की जांच करने के लिए आसंजन स्लाइड पर एक अनुभाग रखें।
    नोट: तंतुओं के अनुप्रस्थ अभिविन्यास की जाँच करना महत्वपूर्ण है। यदि फाइबर पर्याप्त रूप से उन्मुख नहीं हैं, तो ऑब्जेक्ट हेड के कोण को समायोजित करें, एक और अनुभाग काटें और फिर से जांचें।
  5. दो प्रीलेबल्ड आसंजन स्लाइड पर दो सीरियल क्रॉस-सेक्शन रखें: फाइबर प्रकार निर्धारित करने के लिए एक स्लाइड, लिपिड सामग्री (चित्रा 2 एल) को मापने के लिए दूसरा।
    नोट: अतिरिक्त सीरियल क्रॉस सेक्शन प्राप्त किए जा सकते हैं और अन्य हिस्टोलॉजिकल अध्ययनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। हालांकि, लिपिड सामग्री और इंट्रासेल्युलर आकृति विज्ञान24 को बदलने से बचने के लिए, हवा-सुखाने को रोकने के लिए काटने के तुरंत बाद पहली दो स्लाइडों को संसाधित करना आवश्यक है। एलडी परिमाणीकरण के लिए स्लाइड्स को ठंडा करना और पिघलना एक ही प्रभाव होगा और इस प्रकार अत्यधिक अनुचित है।

4. फाइबर टाइपिंग और बोडिपी धुंधला

  1. मांसपेशी फाइबर प्रकार का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल पता लगाना
    नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए, 250 μL की कुल समाधान मात्रा एक हाइड्रोफोबिक कलम के साथ खींचे गए एक सर्कल से घिरे पूरे मांसपेशी अनुभाग को कवर करने के लिए पर्याप्त है जो 1 प्रतिशत सिक्के का अनुमानित आकार है।
    1. एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ खींची गई रूपरेखा के साथ वर्गों को घेरें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 मिनट के लिए बर्फ-ठंडा 0.1 एम फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ कुल्ला। समाधान को अवरुद्ध करने में 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए एक आर्द्र कक्ष और ब्लॉक में स्लाइड रखें (पीबीएस में 10% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) और माउस (एमओएम) अवरुद्ध अभिकर्मक पर 1:30 माउस)।
    2. अवरुद्ध समाधान निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी (5% एनजीएस, 1:30 एमओएम अवरुद्ध अभिकर्मक, माउस प्राथमिक एंटीबॉडी टाइप I (आईजीजी 2 बी, 1:10 पर), टाइप आईआईए (आईजीजी 1, 1:10 पर), और टाइप IIx (आईजीएम, 1: 5 पर) फाइबर और चूहे एंटी-लैमिनिन (α2 श्रृंखला) वाले समाधान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं 1: 1,000) पीबीएस में।
    3. आरटी पर पीबीएस 3 x 5 मिनट के साथ स्लाइड धो लें।
    4. माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी आईजीजी 2 बी एएफ 405 (1: 500), बकरी विरोधी आईजीजी 1 एएफ 488 (1: 500), बकरी विरोधी आईजीएम एएफ 568 (1: 1,000), और पीबीएस में बकरी विरोधी लेमिनिन एएफ 647 (1: 500) युक्त समाधान के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में स्लाइड सेते हैं।
      चेतावनी: प्रोटोकॉल के बाकी के लिए, प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए स्लाइड को प्रकाश से दूर रखना सुनिश्चित करें।
    5. पीबीएस में फिर से 3 x 5 मिनट धोएं, डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ में कुल्लाएं, अतिरिक्त पानी निकालें, और एंटीफेड अभिकर्मक के साथ माउंट करें।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर, छवि अधिग्रहण तक प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए प्रकाश से संरक्षित। चूंकि स्लाइड तय नहीं हैं, इसलिए प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा किए गए समाधानों का उपयोग करने, पीबीएस को आटोक्लेव करने और अनुभागों के संदूषण से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके छवियों को प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है।
  2. बोडिपी के साथ एलडी का धुंधला होना
    नोट: चरण 4.1 के समान, 250 μL की कुल समाधान मात्रा एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ खींचे गए सर्कल से घिरे पूरे मांसपेशी अनुभाग को कवर करने के लिए पर्याप्त है जो 1 प्रतिशत सिक्के का अनुमानित आकार है।
    1. एक हाइड्रोफोबिक पेन द्वारा खींची गई रूपरेखा के साथ वर्गों को घेरें और आरटी पर 10 मिनट के लिए बर्फ-ठंडा 0.1 एम पीबीएस के साथ कुल्ला।
    2. आरटी पर 10 मिनट के लिए मेथनॉल के बिना ठंडे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ ठीक करें। पहले त्वरित कुल्ला के बाद, आरटी पर पीबीएस 3 x 5 मिनट के साथ स्लाइड धो लें।
      सावधानी: एक रासायनिक हुड के तहत इस कदम को निष्पादित करें।
    3. पीबीएस में 5% एनजीएस के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष और ब्लॉक में स्लाइड रखें।
    4. प्राथमिक एंटीबॉडी (2% एनजीएस और चूहा विरोधी लेमिनिन (α2 श्रृंखला, 1: 1,000) पीबीएस में) के समाधान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं। आरटी पर पीबीएस 3 x 5 मिनट के साथ स्लाइड धो लें।
      चेतावनी: प्रोटोकॉल के बाकी के लिए, प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए स्लाइड को प्रकाश से दूर रखना सुनिश्चित करें।
    5. पीबीएस में बकरी विरोधी चूहा-एएफ 647 एंटीबॉडी (1: 500) युक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। आरटी पर पीबीएस 3 x 5 मिनट के साथ स्लाइड धो लें।
    6. पीबीएस में 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई, 0.5 μg / एमएल) और बीओडीआईपीवाई (1 μg / एमएल) के समाधान के साथ आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: बीओडीआईपीवाई स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, इसे डीएमएसओ में 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर भंग करें। एलडी धुंधला होने के लिए विभिन्न बोडिपी फॉर्मूलेशन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। किए गए विकल्प के आधार पर, धुंधला विधि समान है (समान चरण, एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय); हालाँकि, अधिग्रहण विधि थोड़ी अलग होगी।
    7. पहले त्वरित कुल्ला के बाद, आरटी पर पीबीएस 3 एक्स 5 मिनट के साथ स्लाइड धो लें, डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ में कुल्लाएं, अतिरिक्त पानी निकालें, और एंटीफेड अभिकर्मक के साथ माउंट करें।
      नोट: छवि अधिग्रहण तक प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर करें।

5. छवियों का अधिग्रहण

नोट: धुंधला प्रोटोकॉल पूरा हो जाने के बाद, छवि अधिग्रहण (निम्नलिखित 24 घंटे के भीतर) के लिए तुरंत आगे बढ़ना महत्वपूर्ण है, न केवल संदूषण से बचने के लिए बल्कि आकृति विज्ञान, आकार और एलडी की संख्या को संरक्षित करने के लिए भी।

  1. नमूने की गई प्रत्येक मांसपेशी के फाइबर-प्रकारों का आकलन करने के लिए छवियों का अधिग्रहण
    नोट: यह कदम एक पूरे स्लाइड प्रतिदीप्ति स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ या एक पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध के साथ, अनुभाग के पुनर्निर्माण के लिए छवियों की मैनुअल या स्वचालित सिलाई की जानी चाहिए।
    1. फाइबर-प्रकार की मान्यता के लिए, 10x / 0.3 उद्देश्य के साथ एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। क्रमशः टाइप I, IIa, IIx फाइबर और लैमिनिन का पता लगाने के लिए डीएपीआई (405 एनएम), एफआईटीसी, टीआरआईटीसी और सीवाई 5 के लिए उत्तेजना फिल्टर का चयन करें।
      नोट: टाइप आईआईबी फाइबर को इम्यूनोलेबल नहीं किया जाएगा। उन्हें काले सार्कोप्लाज्म के साथ सारकोलेम्मा की सीमाओं पर लैमिनिन द्वारा दाग वाले तंतुओं के रूप में पहचाना जाएगा।
    2. प्रत्येक चैनल के लिए उपयुक्त एक्सपोज़र समय समायोजित करें।
    3. पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय, मांसपेशियों के पुनर्निर्माण की सुविधा के लिए हमेशा एक ही क्रम का पालन करते हुए पूरी मांसपेशियों की छवियों को प्राप्त करें। सुनिश्चित करें कि एक छवि के दाहिने किनारे पर फाइबर भी निम्नलिखित छवि के बाएं किनारे पर दिखाई देते हैं। वही छवियों के ऊपर और नीचे के हिस्सों (चित्रा 3 ए) के लिए लागू होता है।
      नोट: एक संदर्भ के रूप में, ईडीएल के एक खंड या 3 महीने के माउस से विच्छेदित एकमात्र के लिए, क्रमशः छह और आठ छवियों का औसत, पूरे मांसपेशी क्रॉस-सेक्शन को कवर करेगा।
    4. मांसपेशियों को स्कैन करने के बाद, फाइबर आकृति विज्ञान (लैमिनिन) और मांसपेशी अनुभाग के ऊतक विज्ञान के आधार पर पुनर्निर्माण (सिलाई) के लिए किसी भी छवि-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में कैप्चर की गई डिजिटल छवियों को अपलोड करें, और इसे सभी चैनलों (रंग) विलय (चित्रा 3 ए) के साथ टीआईएफएफ, पीएनजी, या जेपीजी फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  2. लैमिनिन और बोडिपी सह-धुंधला के साथ छवियों का अधिग्रहण
    नोट: फाइबर प्रकार को पहचानने और कैप्चर किए गए प्रत्येक प्रकार के लिए फाइबर की संख्या का अनुमान लगाने के लिए, फाइबर-प्रकार अनुभाग को पहले से ही स्कैन करना आवश्यक है और बोडिपी-लैमिनिन (चित्रा 3 बी) की छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले मांसपेशियों का पुनर्निर्माण किया जाना आवश्यक है।
    1. बोडिपी छवि अवलोकन और अधिग्रहण के लिए, 1.4 के संख्यात्मक एपर्चर के साथ 40x तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    2. निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: 1 एयू पर पिनहोल, 2,048 पिक्सेल x 2,048 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन, 0.08 μm पर पिक्सेल आकार, यूनिडायरेक्शनल मोड, 4 (~ 4 μs / पिक्सेल) पर स्कैन गति, लाइन औसत 4x पर सेट, और डिजिटल ज़ूम 1 पर सेट है।
    3. बोडिपी -558/568 और लैमिनिन-एएफ 647 के बीच क्रॉस-टॉक से बचने के लिए, कॉन्फोकल सॉफ़्टवेयर पर अनुक्रमिक स्कैन मोड का उपयोग करें।
      नोट: जब चुना डाई बोडिपी -493/503 है, तो बोडिपी चैनल और लैमिनिन-एएफ 647 चैनल के बीच कोई क्रॉसस्टॉक के साथ एक साथ कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग संभव है। इससे छवियों के अधिग्रहण में तेजी आएगी।
    4. 488 एनएम लेजर लाइन या आर्गन लेजर लाइन का उपयोग करके बोडिपी -493/503 को उत्तेजित करें, और 561 एनएम डायोड लेजर लाइन का उपयोग करके बोडिपी -555/568 को उत्तेजित करें। अंत में, 640 एनएम डायोड लेजर लाइन के साथ लैमिनिन-एएफ 647 का पता लगाएं।
      सावधानी: ध्यान रखें कि बोडिपी अणु फोटोब्लीचिंग के प्रति बहुत संवेदनशील हैं, इसलिए अनावश्यक लेजर स्कैनिंग से बचें। फाइबर को पहचानने के लिए, लैमिनिन के लिए केवल लेजर का उपयोग करें।
    5. चुने गए डाई के आधार पर, बोडिपी -493/50324 के लिए 570-650 एनएम और बोडिपी -558/568 के लिए 565-620 एनएम पर उत्सर्जन पर्वतमाला सेट करें। 656-700 एनएम पर लेमिनिन के लिए उत्सर्जन सीमा निर्धारित करें।
    6. लाभ और डिजिटल लाभ को उचित रूप से सेट करें ताकि रेंज संकेतक पर कोई संतृप्त पिक्सेल न पाए जाएं। ऑफसेट समायोजित करके पृष्ठभूमि संकेत को सही करें।
      नोट: फ़िल्टर चयन और अन्य उपर्युक्त स्कैनिंग मापदंडों को प्रत्येक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों से कैप्चर की गई सभी छवियों की तुलना करने के लिए उपर्युक्त सभी सेटिंग्स को स्थिर रखा जाए।
    7. कन्फोकल माइक्रोस्कोप पर कल्पना किए गए लोगों के बीच फाइबर के प्रकार की पहचान करने के लिए, एक व्यक्तिगत लैपटॉप का उपयोग करें जिस पर फाइबर-प्रकार इम्यूनोडिटेक्शन के बाद पुनर्निर्मित अनुभाग की छवि की जांच की जाती है (चित्रा 3 बी)।
    8. एक बार फाइबर के एक समूह को सही ढंग से पहचानने के बाद, बोडिपी और लैमिनिन चैनलों के साथ छवि प्राप्त करें।
      नोट: मांसपेशियों के क्षेत्र पर बोडिपी-लैमिनिन छवि नाम को नोट करने की सिफारिश की जाती है जहां ये फाइबर एलडी के बाद के फाइबर-विशिष्ट विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए माईएचसी मान्यता के लिए अधिग्रहित छवि पर स्थित हैं।

6. छवियों का विश्लेषण

  1. प्रत्येक मांसपेशी नमूने पर फाइबर-प्रकार का विश्लेषण
    1. फिजी (या इमेजजे) 32 में, फाइबर आइसोफॉर्म का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी चैनलों के विलय से प्राप्त पुनर्निर्मित मांसपेशियों के साथ टीआईएफएफ, पीएनजी, या जेपीजी फ़ाइल खोलें।
    2. सेल गिनती उपकरण शुरू करने के लिए, प्लगइन्स पर क्लिक करें | | का विश्लेषण करें सेल काउंटर | सेल काउंटर।
    3. सेल काउंटर विंडो पर, क्रियाएँ | पर क्लिक करें प्रारंभ करें.
    4. उसी विंडो में काउंटर के तहत, टाइप 1 का चयन करें।
    5. फिजी मुख्य विंडो पर, छड़ी उपकरण का चयन करें।
    6. प्रत्येक प्रकार के तंतुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, एक ही प्रकार के प्रत्येक फाइबर पर क्लिक करें, ताकि प्रोग्राम क्लिक किए गए फाइबर की संख्या रिकॉर्ड करे।
    7. एक बार समाप्त होने के बाद, अगले प्रकार के फाइबर का चयन करें और समान चरणों को दोहराएं।
    8. जब छवि के सभी तंतुओं को किसी दिए गए फाइबर प्रकार को सौंपा गया है, तो तालिका में परिणाम प्रदर्शित करने के लिए सेल काउंटर विंडो पर परिणाम पर क्लिक करें।
    9. फ़ाइल | पर क्लिक करके इस तालिका को स्प्रेडशीट तालिका के रूप में सहेजें परिणाम विंडो पर इस रूप में सहेजें।
    10. सेल गिनती विंडो पर क्रमशः सहेजें मार्कर या लोड मार्कर पर क्लिक करके किसी भी समय एक ही छवि पर चयन सहेजें और पुनः लोड करें।
  2. फाइबर-प्रकार-निर्भर तरीके से लिपिड बूंदों का विश्लेषण
    1. एलडी की मात्रा का ठहराव के लिए फिजी का उपयोग करके कंफोकल पर प्राप्त बोडिपी और लैमिनिन की छवियों का विश्लेषण करें।
      नोट: लेखकों ने विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए एक अनुकूलित मैक्रो डिज़ाइन किया है। यह मैक्रो, इसका उपयोग करने के तरीके पर चरण-दर-चरण स्पष्टीकरण के साथ, क्रमशः पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 के रूप में उपलब्ध है।
    2. फिजी से बायो-फॉर्मेट आयातक की सहायता से प्रत्येक छवि खोलें। इसके साथ स्टैक देखें विकल्प के तहत, हाइपरस्टैक | रंग मोड, डिफ़ॉल्ट. सुनिश्चित करें कि ऑटोस्केल विंडो चयनित है।
      नोट: निम्नलिखित चरण छवि पर एक फाइबर के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे, लेकिन इसे छवि पर पूरे फाइबर की संख्या के रूप में कई बार दोहराया जाना चाहिए।
    3. लैमिनिन चैनल (चित्रा 4 ए) के आधार पर फाइबर के सारकोलेम्मा का मैन्युअल रूप से चयन करने के लिए फ्रीहैंड चयन टूल का उपयोग करें और आरओआई विंडो पर चयन या रुचि के क्षेत्र (आरओआई) को रिकॉर्ड करने के लिए कीबोर्ड पर टी दबाएं।
    4. फिजी की मुख्य विंडो पर जाएं और विश्लेषण | पर क्लिक करें माप सेट करें, और पॉप-अप विंडो पर, क्षेत्र और फेरेट के व्यास का चयन करें। शेष बक्से को अनियंत्रित और अन्य पैरामीटर छोड़ दें क्योंकि वे डिफ़ॉल्ट रूप से दिखाई देते हैं।
    5. चयनित फाइबर के क्षेत्र और न्यूनतम फेरेट व्यास (एमएफ) प्राप्त करने के लिए आरओआई विंडो पर माप पर क्लिक करें, और बाद में उपयोग के लिए उन्हें नोट करें।
      नोट: एलडी का विश्लेषण करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि उनका आकार और घनत्व फाइबर के केंद्र और परिधि (सबसरकोलेमल क्षेत्र-एसएस) के बीच भिन्न होता है। इसलिए, विश्लेषण अलग से किया जाना चाहिए।
    6. फाइबर के मध्य भाग को सीमांकित करने के लिए एमएफ के 1/6 के मूल्य की गणना करें।
      नोट: मैक्रो में, डिफ़ॉल्ट एमएफ मान 6 पर सेट है, जिसका अर्थ है कि लागू की गई कमी को एमएफ के 1/6 के रूप में सेट किया जाएगा। यह मूल्य उच्च वसा वाले आहार को खिलाए गए जानवरों के एकमात्र से प्राप्त अनुभवजन्य आंकड़ों के आधार पर चुना गया था। हालांकि, प्रत्येक शोधकर्ता को अनुभवजन्य डेटा और विश्लेषण की गई मांसपेशियों, फाइबर के प्रकार और पशु की स्थिति के आधार पर इस संख्या को बदलना चाहिए।
    7. आरओआई विंडो पर, पहले आरओआई का डुप्लिकेट रखने के लिए जोड़ें पर क्लिक करें और विंडो पर दिखाई देने वाले दूसरे आरओआई का चयन करें।
    8. फिजी की मुख्य विंडो पर, संपादित करें पर क्लिक करें | चयन | संख्या से पहले माइनस साइन के साथ पहले गणना किए गए मान (चरण 6.2.6.) को बढ़ाएं और पेश करें और ओके पर क्लिक करें। आरओआई विंडो पर, दूसरे आरओआई को हटाने के लिए जोड़ें [टी] (एक तीसरा आरओआई दिखाई देना चाहिए) और हटाएं पर क्लिक करें।
      नोट: शोधकर्ता आरओआई विंडो पर सभी दिखाएँ बॉक्स पर क्लिक करके परिणामों की जांच कर सकता है। इस बिंदु पर, दो आरओआई दिखाई देने चाहिए, एक जो फाइबर (चित्रा 4 बी) की पूरी परिधि को घेरता है और दूसरा जो केंद्र (चित्रा 4 सी) में रखा जाता है।
    9. आरओआई विंडो पर दोनों आरओआई का चयन करें और अधिक | पर क्लिक करें एक्सओआर | जोड़ें[टी]. एक तीसरे आरओआई के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें, जो फाइबर (चित्रा 4 डी) की परिधि से मेल खाती है।
    10. अधिक | पर क्लिक करके आरओआई सहेजें आरओआई को बचाने के लिए सहेजें यदि उसी फाइबर के बाद के पुनर्विश्लेषण की आवश्यकता होती है।
    11. बोडिपी चैनल का चयन करें और छवि | पर क्लिक करके थ्रेसहोल्ड टूल खोलें | समायोजित करें फिजी की मुख्य खिड़की पर थ्रेसहोल्ड।
    12. थ्रेशोल्ड पॉप-अप विंडो पर, मानों को 70/255 पर सेट करें, येन | बी एंड डब्ल्यू विधि, और डार्क पृष्ठभूमि पर क्लिक करें | लागू करें।
      नोट: थ्रेशोल्ड पर लागू मान प्रयोग की शर्तों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और विश्लेषण को अनुकूलित करने के लिए थ्रेशोल्ड को उचित रूप से सेट किया जाना चाहिए। सफेद रंग में दिखाए गए थ्रेसहोल्ड सीमा से ऊपर बोडिपी सिग्नल के साथ एक बी एंड डब्ल्यू विंडो और काले रंग में पृष्ठभूमि दिखाई देनी चाहिए (चित्रा 4 एफ में एक के साथ चित्रा 4 ई में मूल बोडिपी छवि की तुलना करें)।
    13. फिजी की मुख्य विंडो पर जाएं और विश्लेषण | पर क्लिक करें माप सेट करें और पॉप-अप विंडो पर, क्षेत्र, क्षेत्र अंश और थ्रेशोल्ड तक सीमित करें का चयन करें। शेष बक्से को अनियंत्रित और अन्य पैरामीटर छोड़ दें क्योंकि वे डिफ़ॉल्ट रूप से दिखाई देते हैं।
      नोट: यदि शोधकर्ता एलडी की "परिपत्रता" का विश्लेषण करना चाहता है, जो गोलाकार आकृति विज्ञान का एक सूचकांक है जो एक पंक्ति के लिए 0 तक एक आदर्श क्षेत्र के लिए 1 से लेकर है, तो सेट माप पॉप-अप विंडो के आकार वर्णनकर्ता बॉक्स पर क्लिक करें।
    14. आरओआई विंडो पर जाएं और पहले आरओआई का चयन करें। फिजी की मुख्य विंडो पर, विश्लेषण | पर क्लिक करें कणों उपकरण का विश्लेषण करें।
      नोट: यह उपकरण प्रत्येक चयन पर कणों द्वारा कवर किए गए कुल क्षेत्र की संख्या, आकार, क्षेत्र और प्रतिशत को मापता है और परिणामों को स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजता है।
    15. कणों का विश्लेषण विंडो पर 2 से इन्फिनिटी (2-इन्फिनिटी) तक मान सेट करें, पिक्सेल बॉक्स की जांच करें, डिफ़ॉल्ट परिपत्रता मान बनाए रखें, सारांशित करें का चयन करें, और ठीक पर क्लिक करें।
      नोट: फाइबर पर परिणामों की जांच करने के लिए, दिखाएँ विकल्प के तहत, उपलब्ध विकल्पों में से किसी का चयन करें। तालिका में चयन पर पहचाने गए प्रत्येक LD की जानकारी प्राप्त करने के लिए, कणों का विश्लेषण करें विंडो पर प्रदर्शन परिणाम विकल्प की जाँच करें। फाइबर के कुल क्षेत्रफल के विश्लेषण के परिणामों को कई स्तंभों (गिनती, कुल क्षेत्रफल, औसत आकार, % क्षेत्र; ये कणों की संख्या [एलडी] के अनुरूप हैं, इन कणों द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र, उनके औसत आकार और कणों द्वारा कब्जा किए गए चयन के कुल क्षेत्र का प्रतिशत, के साथ एक तालिका में औसत और संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है, क्रमशः)। घनत्व की गणना करने के लिए, प्रत्येक चयन के कुल क्षेत्रफल से कणों की संख्या को विभाजित करें।
    16. केंद्र और फाइबर की परिधि के मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, हर बार दूसरे (केंद्र) और तीसरे आरओआई (परिधि) का चयन करते हुए चरण 6.2.14 और 6.2.15 दोहराएं।
    17. फ़ाइल | पर क्लिक करके परिणाम सहेजें सारांश विंडो पर के रूप में सहेजें।
      नोट: डेटा के बाद के एकीकरण और सांख्यिकीय विश्लेषण की सुविधा के लिए परिणामों के असाइन किए गए नाम पर फाइबर के प्रकार, स्थिति और छवि नाम शामिल करें। एक ही छवि में फाइबर के बाकी का विश्लेषण करने के लिए, चरण 6.2.3 से 6.2.17 दोहराएँ। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, प्रत्येक प्रकार के कम से कम 10-15 फाइबर प्रति जानवर का विश्लेषण किया जाना चाहिए।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल फाइबर प्रकार और उपकोशिकीय-विशिष्ट तरीके से एलडी को आसानी से मापने के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है। यह दिखाता है कि कैसे, समान आकार की दो मांसपेशियों को एक साथ ठंडा करके, जैसे कि ईडीएल और सोलस, निम्नलिखित चरणों पर खर्च किए गए समय और संसाधन आधे से कम हो जाते हैं।

वयस्क माउस की मांसपेशियों में व्यक्त विभिन्न माईएचसी आइसोफॉर्म के इम्यूनोस्टेनिंग, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। यह प्रोटोकॉल पहली बार 19893 3 में शियाफिनो एट अल द्वारा डिजाइन किए गए एक पर आधारित है, कुछ समायोजन जैसे कि लैमिनिन लेबल करने के लिए एक अतिरिक्त एंटीबॉडी का उपयोग। यह बाद का संशोधन टाइप आईआईबी फाइबर के स्थान के लिए महत्वपूर्ण है, जो काला होगा क्योंकि वे किसी भी एंटीबॉडी के साथ दाग नहीं हैं। जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, यह इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रोटोकॉल न केवल माउस धीमी-ऑक्सीडेटिव (प्रकार मैं और आईआईए) और तेजी से ग्लाइकोलाइटिक (प्रकार आईआईएक्स और आईआईबी) फाइबर की मान्यता की अनुमति देता है, बल्कि हाइब्रिड फाइबर की उपस्थिति भी (चित्रा 5 डी में तारांकन देखें)। इसके अलावा, एक ही स्लाइड पर दोनों मांसपेशियों के क्रॉस सेक्शन होने से दो चयनित मांसपेशियों के बीच प्रत्येक फाइबर-प्रकार के अनुपात की तुलना करने की अनुमति मिलती है, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रयोगात्मक स्थितियां दोनों वर्गों पर समान थीं।

एलडी लेबलिंग के लिए, यहां प्रस्तुत परिणाम लिपिड डाई के रूप में बोडिपी -558/568 सी12 के उपयोग पर आधारित हैं; हालांकि, पाठक को मांसपेशियों के वर्गों23 पर शास्त्रीय डाई बोडिपी -493/503 के उपयोग का विवरण देने वाले एक उत्कृष्ट प्रोटोकॉल पेपर को संदर्भित किया जाता है। प्रोटोकॉल फाइबर सारकोलेम्मा को अलग करने के लिए α2-लैमिनिन के खिलाफ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के आधार पर एलडी के धुंधला संयुक्त प्रस्तुत किया। फाइबर-प्रकार के प्रयोग के साथ, यह कदम आवश्यक है, न केवल व्यक्तिगत फाइबर की मान्यता के लिए, बल्कि फाइबर के केंद्रीय और परिधीय दोनों क्षेत्रों (चित्रा 4) में लिपिड के बाद के विश्लेषण के लिए भी। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में से एक दो स्लाइड पर एक ही फाइबर की पहचान और टैगिंग है। जैसा कि पहले बताया गया है, फाइबर प्रकारों के साथ स्लाइड को स्कैन करना और एलडी (चित्रा 3 बी) के लिए छवियों के अधिग्रहण से पहले विलय किए गए रंगों के साथ मांसपेशियों के क्रॉस-सेक्शन का पुनर्निर्माण करना महत्वपूर्ण है। प्रत्येक मांसपेशी अनुभाग की उल्लेखनीय संरचनाएं, जैसे अक्षतंतु टहनियाँ या मांसपेशी स्पिंडल, अच्छे स्थल हैं जो शोधकर्ता को दोनों स्लाइड्स (चित्रा 6) पर समान फाइबर का पता लगाने में मदद कर सकते हैं। याद रखें कि क्योंकि स्लाइड को अधिकांश कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर उल्टा रखा जाता है, इसलिए स्थान कार्य को सुविधाजनक बनाने के लिए व्यक्तिगत कंप्यूटर पर फाइबर-प्रकार-पुनर्निर्मित छवि को उलटने की सिफारिश की जाती है।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा बोडिपी-लैमिनिन धुंधला के अधिग्रहण के लिए वर्णित सेटिंग्स एक साथ तीन से छह फाइबर (चित्रा 6 और चित्रा 7) से एलडी के आकार, संख्या और वितरण के दृश्य और बाद के विश्लेषण की अनुमति देती हैं। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर फिजी के साथ एलडी का विश्लेषण करने के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल भी यहां प्रदान किया गया है। जैसा कि प्रोटोकॉल में दिखाया गया है, एक छवि पर मौजूद प्रत्येक फाइबर का पूर्ण विश्लेषण लंबा और थकाऊ है। हालांकि, फिजी को जावा भाषा के आधार पर मैक्रोज़ नामक अनुकूलित कार्यक्रमों के डिजाइन की अनुमति देने का लाभ है। लेखकों ने एक मैक्रो डिज़ाइन किया है जो ऊपर वर्णित व्यक्तिगत आदेशों की श्रृंखला के स्वचालन को सक्षम बनाता है जो स्वचालित रूप से कुछ मिनटों में विश्लेषण करने के लिए लूप में चलाया जाता है-न केवल एक छवि पर मौजूद प्रत्येक फाइबर बल्कि छवियों का एक बड़ा सेट भी। शोधकर्ता से एकमात्र इनपुट हर बार विश्लेषण किए जाने वाले फाइबर की परिधि का मैनुअल चयन, फाइबर प्रकार का चयन, और थ्रेसहोल्ड को लागू करने और कणों को मापने के बाद परिणामी छवि का दृश्य निरीक्षण है।

यहां, स्थान-निर्भर तरीके से एलडी का विश्लेषण लागू किया जाता है। पहले फाइबर के क्षेत्र और एमएफ व्यास को मापने से, प्रत्येक फाइबर (चित्रा 4 और चित्रा 7) के केंद्रीय और परिधीय क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए एक आकार-निर्भर (स्ट्रॉस एट अल .25 द्वारा वर्णित गैर-फिक्स्ड) कमी लागू की जाती है। जैसा कि चित्रा 7 के हिस्टोग्राम में देखा गया है, यह विधि तीन महत्वपूर्ण मापदंडों की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देती है: एलडी (चित्रा 7 ई) द्वारा कब्जा किए गए फाइबर क्षेत्र का प्रतिशत, एलडी का घनत्व- प्रति μm2 (चित्रा 7 एफ) एलडी की संख्या, और एलडी का औसत आकार (चित्रा 7 जी)। नतीजतन, 3 महीने के चूहों (एन = 5) में, टाइप आईआईए (हरी रूपरेखा) और टाइप आईआईएक्स (लाल रूपरेखा) फाइबर परिधि (चित्रा 7 ई) में एलडी द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र का सबसे बड़ा अनुपात प्रस्तुत करते हैं। कणों के घनत्व के संबंध में, ईडीएल फाइबर हमेशा उपकोशिकीय स्थान (चित्रा 7 एफ) से स्वतंत्र रूप से एकमात्र फाइबर की तुलना में उच्च घनत्व दिखाते हैं। अंत में, उन एलडी का औसत आकार केंद्र (चित्रा 7 जी) की तुलना में परिधि में हमेशा बड़ा होता है।

कृंतक कंकाल की मांसपेशी34,35 में एलडी के संचय का आकलन करने के लिए अन्य समूहों द्वारा उपयोग किए जाने वाले विभिन्न तरीकों से पिछले अध्ययनों के साथ इन परिणामों की तुलना करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, कोमिया एट अल .34 के परिणामों के अनुरूप, एलडी द्वारा कब्जा किए गए फाइबर क्षेत्र का प्रतिशत एकमात्र प्रकार आईआईए और ईडीएल प्रकार आईआईएक्स फाइबर में अधिक है। सबसे महत्वपूर्ण बात, टाइप आईआईबी फाइबर ने एलडी (चित्रा 7 ई, ग्रे हिस्टोग्राम) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र का सबसे कम प्रतिशत प्रस्तुत किया। चूंकि फाइबर प्रकार आईआईबी ईडीएल (75%, चित्रा 5 ई) का सबसे प्रमुख फाइबर प्रकार है, इसलिए ये परिणाम पुष्टि करते हैं कि अन्य समूहों ने पहले क्या वर्णित किया है: लिपिड का समग्र संचय एकमात्र34,35 की तुलना में ईडीएल में कम है।

मनुष्यों में वर्णित25 के विपरीत, और कोमिया एट अल .34 के परिणामों के अनुरूप, यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि एकमात्र प्रकार I फाइबर में एलडी का संचय अपेक्षाकृत कम है। यह चूहों और मनुष्यों के बीच फाइबर-प्रकार के अंतर-प्रजातियों के अंतर से समझाया जा सकताहै 36, क्योंकि मानव प्रकार के मैं फाइबर के चयापचय गुण कृंतक प्रकार आईआईए और आईआईएक्स के समान हैं, जबकि मानव प्रकार के आईआईएक्स फाइबर कृंतक प्रकार आईआईबी37 के करीब हैं। संक्षेप में, यहां वर्णित विभिन्न तकनीकें फाइबर प्रकार-निर्भर तरीके से एलडी और सेल के भीतर उनके वितरण से संबंधित कई मापदंडों का अध्ययन और तुलना करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, विश्वसनीय और समय-कुशल विधि प्रदान करती हैं।

उप-इष्टतम प्रयोग
यदि ठंड प्रक्रिया सही ढंग से नहीं की जाती है और आइसोपेंटेन सही तापमान पर नहीं है, तो फाइबर (चित्रा 8 ए) के अंदर बर्फ के क्रिस्टल बनेंगे। ये ठंड कलाकृतियां नमूने की हिस्टोलॉजिकल तैयारी के बाद ही पता लगाने योग्य हैं और फाइबर में छेद के रूप में पहचानी जा सकती हैं। एलडी के उचित परिमाणीकरण के लिए, इन कलाकृतियों से बचा जाना चाहिए। यह प्रदर्शित किया गया है कि मांसपेशियों के ब्लॉक को उचित रूप से पिघलने और फिर से फ्रीज करने से इन कलाकृतियों को काफी कम किया जा सकता है29.

एक और समस्या का सामना करना पड़ता है जब फाइबर अनुदैर्ध्य अक्ष (चित्रा 8 बी) के लंबवत कटौती नहीं कर रहे हैं। फाइबर, मांसपेशियों या जानवरों के बीच एलडी परिमाणीकरण और तुलना नहीं की जा सकती है जब अनुभाग अनुप्रस्थ नहीं होते हैं। इस कारण से, ठंड से पहले स्टीरियो माइक्रोस्कोप की सहायता से कॉर्क पर मांसपेशियों को सही ढंग से रखना आवश्यक है और क्रायोस्टैट के करीब एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप है। उत्तरार्द्ध शोधकर्ता को क्रायोस्टैट पर नमूने के सही संरेखण को खोजने की अनुमति देगा।

कुछ दुर्लभ अवसरों में, माईएचसी आइसोफॉर्म की लेबलिंग एक या एक से अधिक फाइबर प्रकारों (चित्रा 8 सी) पर बहुत कमजोर है। यदि ऐसा होता है, तो एलडी का विश्लेषण अधूरा होगा। इस मामले में, प्रयोग को मांसपेशियों के काटने से शुरू करके दोहराया जाना चाहिए। अंत में, बोडिपी मांसपेशी क्रॉस सेक्शन (चित्रा 8 डी) की परिधि में जमा हो सकता है। यदि ऐसा होता है, तो धुंधला उन तंतुओं पर बहुत मजबूत होगा जो एक कृत्रिम परिणाम उत्पन्न करते हैं। इन तंतुओं से छवियों के अधिग्रहण से बचें।

Figure 2
चित्रा 2: ठंड और क्रायोसेक्शनिंग के लिए नमूनों की तैयारी माउस सोलस और ईडीएल मांसपेशियों को विच्छेदित किया जाता है और ओसीटी की एक बूंद के साथ एक कठोर प्लास्टिक द्वारा आयोजित कॉर्क पर रखा जाता है। (ई-जी) एक स्टेनलेस स्टील टंबलर आइसोपेंटेन से भरा होता है और तरल नाइट्रोजन में इसके पिघलने के तापमान तक ठंडा होता है। (एच, आई) ठंडे आइसोपेंटेन के साथ गिलास को तरल नाइट्रोजन से बाहर निकाला जाता है, और नमूना टंबलर के नीचे तक डूब जाता है, 15 एस (जे-एल) के लिए घूमता है नमूनों के साथ कॉर्क को प्लास्टिक के समर्थन के बिना क्रायोस्टैट धारक डिस्क पर रखा जाता है, और 10 μm के धारावाहिक अनुप्रस्थ वर्गों को सीधे आसंजन स्लाइड पर रखा जाता है। एलडी के धुंधला होने और माईएचसी का पता लगाने के लिए दो आसन्न सीरियल क्रॉस-सेक्शन तुरंत संसाधित किए जाते हैं। संक्षिप्त नाम: एलडी = लिपिड बूंदें; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; मायएचसी = मायोसिन भारी श्रृंखला आइसोफॉर्म; ओसीटी = इष्टतम काटने का तापमान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: किसी अन्य कंप्यूटर पर देखी गई पुनर्निर्मित समग्र छवि से फाइबर के प्रकार की पहचान करने के बाद बोडिपी छवि अधिग्रहण। (ए) छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक साथ सिले गए सात स्वतंत्र मर्ज किए गए छवियों (धराशायी आयतों) से फाइबर प्रकार (माईएचसी) के लिए पूरे सोलस सेक्शन का पुनर्निर्माण। सफेद तीर और संख्याएं पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि अधिग्रहण के दौरान पीछा किए गए क्रम का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) बोडिपी छवि अधिग्रहण के लिए, (1) लेमिनिन-एएफ 647 और बोडिपी -555/568 के साथ मांसपेशी अनुभाग युक्त एक क्षेत्र को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप से जुड़े कंप्यूटर की स्क्रीन पर कल्पना की जाती है। (2) वे फाइबर (माईएचसी) के प्रकार का पता लगाने के लिए मांसपेशी अनुभाग की पुनर्निर्मित छवि पर स्थित हैं। (3) छवि को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित किया जाता है। संक्षिप्त नाम: एलडी = लिपिड बूंदें; डीएपीआई = 4 ',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; मायएचसी = मायोसिन भारी श्रृंखला आइसोफॉर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: फिजी के साथ लिपिड बूंदों का विश्लेषण (ए, बी) फाइबर के सारकोलेम्मा को लैमिनिन छवि के आधार पर पहचाना जाता है और आरओआई के रूप में चुना जाता है। कुल क्षेत्रफल और एमएफ मापा जाता है। (सी) फाइबर के मध्य भाग को पहचानने के लिए, चयन एमएफ के मूल्य के 1/6 से कम हो जाता है। (डी) केंद्रीय और कुल चयन के बीच का क्षेत्र परिधि या उपसरकोलेमल क्षेत्र के रूप में सेट किया गया है। (ई) बोडिपी के साथ दाग वाले एलडी के विश्लेषण के लिए, एक थ्रेसहोल्ड लागू किया जाता है, (एफ) और विश्लेषण कण उपकरण का उपयोग एलडी से संबंधित विभिन्न मापदंडों को मापने के लिए किया जाता है (तालिका देखें)। ये मान पूर्ण फाइबर (सभी), मध्य भाग (केंद्र) के लिए, और उपसरकोलेम्मल क्षेत्र (परिधि) के लिए स्वतंत्र रूप से प्राप्त किए जाते हैं। स्केल सलाखों = 12 μm। संक्षिप्त नाम: एलडी = लिपिड बूंदें; आरओआई = ब्याज का क्षेत्र; एमएफ = न्यूनतम फेरेट का व्यास। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ईडीएल (ग्लाइकोलाइटिक) और सोलस (ऑक्सीडेटिव) माउस मांसपेशियों में फाइबर प्रकारों के प्रतिनिधि इम्यूनोस्टेनिंग। एक डिजिटल, पूरे स्लाइड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त ईडीएल (ए, बी) और सोलस (सी, डी) की मर्ज प्रतिदीप्ति छवियां। टाइप I (ब्लू-एएफ 405), टाइप आईआईए (ग्रीन-एएफ 488), टाइप आईआईएक्स (रेड-एएफ 568), और लैमिनिन (व्हाइट-एएफ 647) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। काले फाइबर फाइबर प्रकार आईआईबी के अनुरूप होते हैं। बी और डी क्रमशः पैनल ए और सी के सफेद आयतों के अंदर तंतुओं का विवरण दिखाते हैं। पैनल डी में तारांकन चिह्न (*) एक आईआईए / आईआईएक्स हाइब्रिड फाइबर दिखाता है। (ई, एफ) ईडीएल में फाइबर प्रकार वितरण का प्रतिनिधि परिमाणीकरण और 3 महीने के चूहों (एन = 5) से एकमात्र। ईडीएल मुख्य रूप से टाइप आईआईबी, फिर आईआईएक्स, और आईआईए फाइबर (~ 75%, 15%, और 5%, क्रमशः) से बना था। इसके विपरीत, सोलस मुख्य रूप से टाइप आईआईए (>50%) और टाइप I फाइबर (30%) से बना था। टाइप आईआईएक्स फाइबर का अनुपात दोनों मांसपेशियों में समान था, जबकि हाइब्रिड फाइबर के अनुपात बहुत कम थे। स्केल सलाखों = 200 μm (ए, सी), 100 μm (बी, डी)। संक्षिप्त नाम: ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: सीरियल क्रॉस सेक्शन पर बोडिपी के साथ एलडी के प्रतिनिधि धुंधला पहले माईएचसी आइसोफॉर्म के लिए इम्यूनोलेबल किया गया था। माउस ईडीएल (ए) और सोलस (बी) की प्रतिदीप्ति विलय छवियां टाइप I (नीला), आईआईए (हरा), आईआईएक्स (लाल), आईआईबी (काला) फाइबर, और लैमिनिन (फाइबर के आसपास सफेद संकेत) दिखाते हुए एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित की जाती हैं। (सी-एफ) ईडीएल (सी, डी) और सोलस (ई, एफ) से कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति छवियां लैमिनिन (सियान) और बोडिपी (लाल) के साथ सह-लेबल की गईं। ध्यान दें कि सी-एफ में दिखाए गए फाइबर पैनल ए और बी पर सफेद आयतों के अंदर के समान हैं। ए में सफेद आयत के दाहिने कोने पर, एक अक्षतंतु टहनी को प्रतिष्ठित किया जा सकता है (सफेद तीरहेड)। स्केल सलाखों = 200 μm (ए, बी), 20 μm (सी-एफ)। संक्षिप्त नाम: एलडी = लिपिड बूंदें; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; मायएचसी = मायोसिन भारी श्रृंखला आइसोफॉर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: फाइबर-प्रकार- और उपकोशिकीय-विशिष्ट तरीके से एलडी का परिमाणीकरण। बोडिपी (लाल) और α2-लैमिनिन (नहीं दिखाया गया) के साथ सह-लेबलिंग के बाद प्राप्त ईडीएल (सी, डी) से टाइप 1 और टाइप आईआईए फाइबर से टाइप आईएक्स और टाइप आईआईए फाइबर की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल छवियां। एलडी सामग्री (बोडिपी और घनत्व के कब्जे वाले क्षेत्र का%) और आकृति विज्ञान (आकार) का विश्लेषण उपकोशिकीय-विशिष्ट तरीके से किया गया था। फाइबर परिधि को लैमिनिन धुंधला द्वारा परिभाषित किया गया था और केंद्रीय या परिधीय क्षेत्रों को एमएफ व्यास के आधार पर सेट किया गया था। प्रत्येक फाइबर प्रकार के लिए केंद्रीय या परिधीय क्षेत्रों में बोडिपी (एलडी) (ई), एलडी घनत्व (संख्या / μm2) (एफ), या औसत एलडी आकार (जी) द्वारा कब्जा किए गए फाइबर क्षेत्र का प्रतिशत। परिणाम एसईएम ± माध्य के रूप में दर्शाए जाते हैं स्केल बार = 10 μm। संक्षिप्त नाम: एलडी = लिपिड बूंदें; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; सी = केंद्रीय; पी = परिधीय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: उप-इष्टतम परिणामों के अनुरूप छवियां ( ए ) ठंड प्रक्रिया के दौरान गठित बर्फ के क्रिस्टल दिखाते हुए हेमटॉक्सिलिन-ईओसिन के लिए दाग वाली मांसपेशियों के क्रॉस-सेक्शन की ब्राइटफील्ड छवि। (बी) मायएचसी और लैमिनिन के लिए एक सोलस सेक्शन की प्रतिदीप्ति विलय छवि, यह दर्शाती है कि अधिकांश फाइबर अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ काट दिए जाते हैं। (सी) माईएचसी और लैमिनिन के लिए एक ईडीएल अनुभाग की प्रतिदीप्ति छवि। फाइबर प्रकार आईआईए (हरा) का कमजोर धुंधला प्रत्येक फाइबर प्रकार के सही परिमाणीकरण में बाधा डालता है। (डी) मांसपेशियों के क्रॉस सेक्शन की परिधि में स्थित तंतुओं पर बोडिपी (लाल) के एक मजबूत कलात्मक धुंधला दिखा कॉन्फोकल छवि। स्केल सलाखों = 50 μm (ए, बी), 200 μm (सी, डी)। संक्षिप्त नाम: ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; मायएचसी = मायोसिन भारी श्रृंखला आइसोफॉर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: मांसपेशी क्रॉस सेक्शन पर तेल लाल ओ के साथ एलडी धुंधला हो जाना। (ए, बी) कन्फोकल छवियां क्रमशः सोलस और ईडीएल में ऑयल रेड ओ के साथ प्राप्त धुंधला होने के पैटर्न को दिखाती हैं। इस धुंधला के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल को प्रैट्स एट अल .24 द्वारा विस्तार से वर्णित किया गया है। ध्यान दें कि मायोफाइबर के सबसरकोलेमल क्षेत्र में एलडी का संचय अधिक है, जैसा कि पहले बोडिपी के लिए वर्णित है। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षिप्त नाम: एलडी = लिपिड छोटी बूंद; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: एकमात्र मांसपेशी में एलडी और माइटोकॉन्ड्रिया का सह-धुंधला होना। (ए) कॉन्फोकल मर्ज की गई छवि टॉम 20 के इम्यूनोलेबलिंग को दिखाती है, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (हरा), डीएपीआई (नीला), और बोडिपी -558/568 लेबल एलडी (लाल) पर मौजूद प्रोटीन। ए में इनसेट एलडी (लाल) से बंधे कई माइटोकॉन्ड्रिया (हरा) दिखाता है। यह छवि एयरिस्कैन कॉन्फोकल सुपररिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को लागू करके प्राप्त की गई थी। (बी, सी) क्रमशः एलडी और माइटोकॉन्ड्रिया की संबंधित एकल-चैनल छवियां। स्केल बार = 10 μm (ए-सी), 5 μm (ए, इनसेट)। संक्षिप्त नाम: एलडी = लिपिड बूंदें; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: "कई लैमिनिन + बोडिपी छवियों पर एलडी के स्वचालित विश्लेषण के लिए फिजी मैक्रो". कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: मैक्रो Bodipy_JoVE.आईजेएम के साथ काम करने के तरीके का चरण-दर-चरण स्पष्टीकरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां विस्तृत प्रोटोकॉल फाइबर-प्रकार- और उपकोशिकीय-विशिष्ट आधार पर बोडिपी के साथ टैग किए गए एलडी को मापने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। हाल के वर्षों में, शास्त्रीय लिपिड रंग, जैसे कि ओआरओ या सूडान ब्लैक बी, को सेल-पारगम्य, लिपोफिलिक, फ्लोरोसेंट रंगों की एक नई सरणी के साथ प्रतिस्थापित किया गया है जो तटस्थ लिपिड (जैसे, बोडिपी) से बंधते हैं। विभिन्न संयुग्मों के रूप में उपलब्ध, बोडिपी न केवल विभिन्न निश्चित ऊतकों और कोशिकाओं 23,38,39,40 में बल्कि जीवित कोशिकाओं 41,42 में उनकी आकृति विज्ञान, गतिशीलता और अन्य ऑर्गेनेल के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए एलडी को टैग करने में बहुत प्रभावी साबित हुआ है।

प्रोटोकॉल के भीतर, कई महत्वपूर्ण पहलू हैं जो शोधकर्ता को इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए विचार करना चाहिए। मांसपेशियों के मायोफाइबर के सही संरेखण और अभिविन्यास को सुनिश्चित करने के लिए कॉर्क पर चुनी गई मांसपेशियों को सही ढंग से रखना आवश्यक है, क्योंकि एक बार जमे हुए होने के बाद, क्रायोस्टैट पर धारक का केवल मामूली पुन: समायोजन किया जा सकता है। इसके अलावा, अनुभागों में कटौती के तुरंत बाद इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल शुरू करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वायु-सुखाने वाले क्रायोसेक्शन (केवल 15 मिनट के लिए) का एलडी पर गंभीर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप एलडी घनत्व में 66% की कमी और औसत आकार24 में 37% की कमी होती है। इसी तरह, स्लाइड्स को ठंडा करने और पिघलने से प्रतिकूल प्रभाव पड़ेगा और इसलिए इसकी सिफारिश नहीं की जाती है। इस प्रोटोकॉल की एक तीसरी महत्वपूर्ण विशेषता नमूनों के निर्धारण से संबंधित है। यहां उद्धृत एंटीबॉडी के साथ विभिन्न माईएचसी आइसोफॉर्म की पहचान के लिए, ऊतक निर्धारण से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह चुने हुए एंटीबॉडी के बंधन को उनके एपिटोप में बाधित करता है। यदि मांसपेशियों के नमूने पहले तय किए गए हैं, तो पाठक को विभिन्न एंटीबॉडी43 का उपयोग करके हाल ही में प्रकाशित पेपर में संदर्भित किया जाता है। मेथनॉल के बिना केवल पीएफए को एलडी के लेबलिंग और मात्रा का ठहराव के लिए अनुशंसित किया जाता है, क्योंकि मेथनॉल या एसीटोन का उपयोग एलडी23,44 की आकृति विज्ञान को बाधित करता है। इसके अलावा, लैमिनिन के साथ इम्यूनोलेबल्ड स्लाइड्स पर एलडी की मात्रा का ठहराव के लिए एक पारगम्यीकरण कदम आवश्यक नहीं है। चूंकि कुछ समूहों ने दिखाया है कि ट्राइटनएक्स -100, सैपोनिन या ग्लाइसिन जैसे डिटर्जेंट के साथ पारगम्यीकरण एलडी44,45 के आकार या संख्या को कम कर सकता है, पारगम्यीकरण अत्यधिक हतोत्साहित है। अंत में, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सेटिंग्स की ठीक-ट्यूनिंग केवल एलडी में मौजूद तटस्थ लिपिड को पहचानने के लिए महत्वपूर्ण है, न कि अन्य ऑर्गेनेल24 की झिल्ली में।

यहां, बोडिपी -558/568 सी12 का उपयोग एलडी मार्कर के रूप में किया गया था। हालांकि, एलडी को टैग करने और कंकाल की मांसपेशी मायोफाइबर के भीतर उनकी आकृति विज्ञान और स्थान का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे अधिक बार बोडिपी बोडिपी -493/503 है। दोनों रंग अपने इनक्यूबेशन समय, कामकाजी एकाग्रता और उनके संकीर्ण उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में समान हैं, हालांकि उनकी उत्तेजना और उत्सर्जन पर्वतमाला थोड़ी अलग हैं। बोडिपी -493/503 के उपयोग पर एक पूर्ण प्रोटोकॉल के लिए, पाठक को लिसनबर्गर और ब्राउन46 या स्पैन्जेनबर्ग एट अल .23 के काम के लिए संदर्भित किया जाता है। बोडिपी -558/568 सी12 का उपयोग अन्य ऊतकों जैसे वसा ऊतक47, रेटिना48, फाइब्रोटिक गुर्दे49, या फाइब्रोब्लास्ट50 में एलडी को धुंधला करने के लिए किया गया है। यह बोडिपी ओआरओ के साथ प्राप्त एक समान धुंधला पैदावार करता है (पूरक चित्रा एस 1 देखें) लेकिन काफी कम तकनीकी बोझ और अधिक विशिष्टता24,51 के साथ। इसके अलावा, बोडिपी -558/568 सी12 में ग्रीन-स्पेक्ट्रम माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ टैग किए गए प्रोटीन या ऑर्गेनेल का पता लगाने के साथ संयोजन में एलडी की मात्रा का ठहराव सक्षम करने का लाभ है (पूरक चित्रा एस 2 और यान एट अल 49 देखें) या जीएफपी-आनुवंशिक रूप से संशोधित मॉडल52 के साथ। ये दो अनुप्रयोग अन्य सेल ऑर्गेनेल और प्रोटीन के साथ एलडी की गतिशीलता और बातचीत को उजागर करने के लिए बहुत शक्तिशाली उपकरण हैं। फिर भी, जब कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन का कोई कोलाबेलिंग का इरादा नहीं होता है, तो लेखक सबसे अच्छी विशेषता वाले एलडी डाई बोडिपी -493/503 के उपयोग की सलाह देते हैं।

इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक छवियों के अधिग्रहण और एलडी रूपात्मक विशेषताओं की मात्रा का ठहराव से संबंधित है। कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी में तकनीकी प्रगति ने व्यापक क्षेत्र के माइक्रोस्कोप की तुलना में विमान रिज़ॉल्यूशन में काफी सुधार किया है और जेड विमान में नमूने को स्कैन करते समय वस्तुओं के 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति दी है। यह एलडी आकृति विज्ञान24 के अध्ययन और कंकाल मायोफाइबर38,53 में अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत के लिए बहुत उपयोगी रहा है, लेकिन छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण समय में वृद्धि हुई है, क्योंकि प्रत्येक 3 डी-पुनर्निर्मित छवि कई स्वतंत्र 2 डी छवियों से बना है। उपरोक्त प्रोटोकॉल में, कॉन्फोकल छवियों को 40x उद्देश्य लेंस के साथ और केवल 2 डी में अधिग्रहित किया गया था। यह विधि केवल एक के बजाय प्रति छवि तीन से छह मायोफाइबर के अधिग्रहण की अनुमति देती है क्योंकि यह 63x उद्देश्य का उपयोग करते समय होगा। इसके परिणामस्वरूप कम रिज़ॉल्यूशन और एलडी आकार और आकृति विज्ञान का समग्र अनुमान होता है जो पूरी तरह से सटीक नहीं है। फिर भी, यह प्रति नमूना अधिक संख्या में फाइबर के विश्लेषण की अनुमति देता है, जो विशेष रूप से पशु प्रयोगों में विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण तथ्य है, जिसमें मांसपेशियों और स्थितियों की एक उच्च संख्या की तुलना की जानी चाहिए।

यहां, यह दिखाया गया है कि, समान आकार की दो मांसपेशियों को ठंडा करके जो एक दूसरेसे सटे हुए हैं 34, नमूनों का प्रसंस्करण समय काफी कम हो जाता है, और उनके स्वतंत्र प्रसंस्करण से प्राप्त संभावित कृत्रिम अंतर कम हो जाते हैं। इसके अलावा, एलडी का विश्लेषण करने की यह विधि फाइबर प्रकार54 के भीतर और बीच एलडी के उपकोशिकीय वितरण के बीच अंतर को ध्यान में रखती है। मायोफाइबर की परिधि का चयन करना और फाइबर के न्यूनतम फेरेट के व्यास के संबंध में इस चयन को कम करना स्वतंत्र रूप से केंद्रीय और परिधीय (सबसरकोलेमल) एलडी के आकार और घनत्व के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। इस विधि को लागू करना अत्यंत महत्वपूर्ण है क्योंकि यह प्रदर्शित किया गया है कि एलडी का उपसरकोलेमल संचय सीधे इंसुलिन प्रतिरोध में योगदान देता है। जबकि मनुष्यों में कुछ रिपोर्टों ने फाइबर प्रकार- और स्थान-निर्भर फैशन11,16,25 में एलडी का अध्ययन किया है, यह पहली बार है, हमारे ज्ञान के लिए, कि इस विधि को कृन्तकों से मांसपेशियों पर लागू किया गया है। इसके अलावा, फिजी के लिए स्व-डिज़ाइन किए गए मैक्रो की सहायता से एलडी की मात्रा का ठहराव छवि विश्लेषण समय को काफी कम और सरल बनाता है। इसका उपयोग करने के तरीके पर मैक्रो और चरण-दर-चरण स्पष्टीकरण दोनों क्रमशः पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 के रूप में उपलब्ध हैं।

कुल मिलाकर, लेखकों का मानना है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशियों में लिपिड चयापचय का अध्ययन करने वाले अन्य शोधकर्ताओं के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। समझाई गई तकनीकों को विभिन्न मांसपेशियों पर और अलग-अलग परिस्थितियों में लागू किया जा सकता है (उपवास / ओवरफेड, प्रशिक्षित / गतिहीन, युवा / वृद्ध, दुबला / मोटापे से ग्रस्त) और उम्मीद है कि एलडी की गतिशीलता को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी, सेल के अन्य घटकों के साथ उनकी बातचीत का महत्व, लिपिड कैसे संग्रहीत और ग्लाइकोलाइटिक और ऑक्सीडेटिव फाइबर में चयापचय किया जाता है, और टाइप 2 मधुमेह में इंसुलिन प्रतिरोध की शुरुआत में उनकी भूमिका।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को फोंड्स नेशनल डे ला रेचेर्चे साइंटिफिक (एफएनआरएस-क्रेडिट डी रेचेर्चे जे.0022.20) और सोसाइटी फ्रैंकोफोन डु डायबेट (एसएफडी-रोश डायबिटीज केयर) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एमएडी-एलडीसी को वालोनी-ब्रुक्सेल्स इंटरनेशनल एक्सीलेंस प्रोग्राम से फैलोशिप मिली।

लेखकइस प्रोटोकॉल के विकास में उनके योगदान के लिए एलिस मोनियर और छवि अधिग्रहण प्रक्रिया में उनकी विशेषज्ञता और तकनीकी सहायता के लिए कैरोलीन बाउजिन को धन्यवाद देते हैं। हम क्रायोस्टैट और माइक्रोस्कोप (2 आईपी-आईआरईसी इमेजिंग प्लेटफॉर्म, प्रायोगिक और नैदानिक अनुसंधान संस्थान, यूनिवर्सिट कैथोलिक डी लौवेन, 1200 ब्रसेल्स, बेल्जियम) तक पहुंच के लिए 2 आईपी-आईआरईसी इमेजिंग प्लेटफॉर्म का भी धन्यवाद करते हैं। अंत में, लेखक पांडुलिपि की रचनात्मक आलोचना के लिए निकोलस डब्यूसन, रोमेन वर्सेल और मिशेल अबू-सामरा को धन्यवाद देना चाहते हैं। इन लेखों के कुछ आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix camera Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera  Zeiss
Chemical hood Potteau Labo EN-14175
Confocal microscope Zeiss LSM800
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick)  Electron Microscopy Sciences 63305
Cryo-Gloves Tempshield 16072252
Cryostat  Thermo Scientific  Microm Cryo Star HM 560
Dissecting Stereo Microscope SMZ745 Nikon
Dry Ice
Dumont Forceps F.S.T 11295-10
Epifluorescence microscope Zeiss AxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn Scissors F.S.T 14084-08
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) ThermoFisher 22-363-552 Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) BRAND Petri dish, MERK BR455751 Used to place the muscles on ice during dissection
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen Vector Labs H-4000 Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections
Incubator MMM Medcenter Incucell 707 
Microscope Cover Glasses (24x50 mm) Assistent  40990151
Microscope Slide Boxes  Kartell 278 Used as humid chambers for immunohistochemistry
Neck holder Linie zwo SB-035X-02 Used as strap to hold the stainless steel tumbler
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade Swann-Morton 0205
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X Used to handle cryosections
Permanent Marker Pen Black Klinipath/VWR 98307-R Used to label slides
Pierce Fixation Forceps F.S.T 18155-13
Polystyrene Box  H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 Aesculap BB073R
Stainless Steel Cup 10oz  Eboxer B07GFCBPFH Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing
Superfrost Ultra Plus slides ThermoFisher J1800AMNZ
Surgical tweezers 1/2 teeth Medische Vakhandel 1303152 Also called "Rat teeth tweezers"
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge F.S.T 15000-00
Weighing boats VWR international 611-2249
Whole-Slide Scanner for Fluorescence Zeiss Axio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b Sigma-Aldrich SAB4600477 Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 ThermoFisher A-21121 Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM Abcam ab175702 Used at a final concentration of 1:1,000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody ThermoFisher A-21247 Used at a final concentration of 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) ThermoFisher D3922 Used at a final concentration of 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) ThermoFisher D3835 Used at a final concentration of 1 µg/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) ThermoFisher D1306 Used at a final concentration of 0.5 µg/mL
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D-8418 Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 1004969011 CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Isopentane GPR RectaPur VWR international 24872.298 CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.
Liquid Nitrogen CAUTION:  Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids.
Mouse on mouse Blocking Reagent  Vector Labs MKB-2213-1 Used at concentration of 1:30
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b DSHB University of Iowa BA-D5-supernatant Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene:  MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 DSHB University of Iowa SC-71-supernatant Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene:  MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa 6H1-supernatant Used at a final concentration of 1:5
Normal Goat Serum (NGS) Vector Labs S-1000
PBS 0.1 M Commonly used on histology laboratories
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen  P36930
Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) Sigma-Aldrich L0663 Used at a final concentration of 1:1,000
Tissue-Tek O.C.T compound Sakura  4583
Software
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Adobe Photoshop Adobe Inc. Confocal software
BioRender https://biorender.com/ Used to design the figures
Fiji/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ Used to analyse the acquired images
Microsoft PowerPoint Microsoft Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types
Zen Blue 2.6 Zeiss Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types

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चिकित्सा अंक 184
कंकाल की मांसपेशियों में लिपिड छोटी बूंद सामग्री का फाइबर प्रकार और उपकोशिकीय-विशिष्ट विश्लेषण
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Selvais, C. M., De Cock, L. L.,… More

Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-López de Carrizosa, M. A. Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63718, doi:10.3791/63718 (2022).

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