Summary
Toenemend bewijs geeft aan dat overmatige infiltratie van lipiden in de skeletspieren resulteert in lipotoxiciteit en diabetes. Hier presenteren we een compleet protocol, inclusief weefselverwerking, kleuring met Bodipy, beeldacquisitie en analyse, om de grootte, dichtheid en subcellulaire verdeling van lipidedruppels op een vezeltypespecifieke manier te kwantificeren.
Abstract
Skeletspier lipide-infiltratie, bekend als myosteatose, neemt toe met obesitas en veroudering. Myosteatose is onlangs ook ontdekt als een negatieve prognostische factor voor verschillende andere aandoeningen zoals hart- en vaatziekten en kanker. Overmatige lipide-infiltratie vermindert de spiermassa en kracht. Het resulteert ook in lipotoxiciteit en insulineresistentie, afhankelijk van het totale intramyocellulaire lipidengehalte, lipidedruppel (LD) morfologie en subcellulaire distributie. Vezeltype (oxidatieve versus glycolytische) is ook belangrijk, omdat oxidatieve vezels een grotere capaciteit hebben om lipiden te gebruiken. Vanwege hun cruciale implicaties in de pathofysiologie zijn diepgaande studies over LD-dynamica en -functie op een vezeltypespecifieke manier gerechtvaardigd.
Hierin wordt een compleet protocol gepresenteerd voor de kwantificering van het intramyocellulaire lipidengehalte en de analyse van LD-morfologie en subcellulaire distributie op een vezeltypespecifieke manier. Hiertoe werden seriële spier cryosecties gekleurd met de fluorescerende kleurstof Bodipy en antilichamen tegen myosine zware keten isovormen. Dit protocol maakt de gelijktijdige verwerking van verschillende spieren mogelijk, bespaart tijd en vermijdt mogelijke artefacten en dankzij een gepersonaliseerde macro die in Fiji is gemaakt, is de automatisering van LD-analyse ook mogelijk.
Introduction
Skeletspier lipide-infiltratie, bekend als myosteatose, neemt toe met obesitas en veroudering. Myosteatose is negatief gecorreleerd met spiermassa en kracht en met insulinegevoeligheid1. Bovendien geven recente studies aan dat de mate van myosteatose kan worden gebruikt als een prognostische factor voor andere aandoeningen zoals hart- en vaatziekten2, niet-alcoholische leververvetting3 of kanker4. Lipiden kunnen zich ophopen in skeletspieren tussen spiervezels als extramyocellulaire lipiden of in de vezels, als intramyocellulaire lipiden (IMCLs). IMCLs worden voornamelijk opgeslagen als triglyceriden in lipidedruppels (LD's) die worden gebruikt als metabole brandstof tijdens lichaamsbeweging 5,6. Wanneer het lipidenaanbod echter de vraag overtreft, of wanneer mitochondriën disfunctioneel worden, zullen IMCLs betrokken zijn bij spierinsulineresistentie, zoals gezien bij metabolisch ongezonde, zwaarlijvige personen en bij type 2 diabetespatiënten7. Intrigerend genoeg hebben duursporters vergelijkbare, zo niet hogere, niveaus van IMCLs als die gevonden bij zwaarlijvige patiënten met type 2 diabetes mellitus, met behoud van een hoge insulinegevoeligheid. Dit fenomeen wordt beschreven als de "atleetparadox"8,9 en wordt verklaard door een meer genuanceerde beoordeling van spier-LD's, gerelateerd aan hun grootte, dichtheid, lokalisatie, dynamiek en samenstelling van lipidesoorten.
Ten eerste is de LD-grootte omgekeerd gecorreleerd aan insulinegevoeligheid en fysieke fitheid10,11. In feite vertonen kleinere LD's een relatief groter oppervlak voor lipasewerking en hebben ze dus mogelijk een groter vermogen om lipiden te mobiliseren12. Ten tweede speelt LD-dichtheid (getal/oppervlak) een controversiële rol bij insulinewerking 8,10; toch lijkt het bij sporters toe te nemen. Ten derde is de subcellulaire lokalisatie van LD's belangrijk, omdat LD's net onder het oppervlaktemembraan (subsarcolemmaal of perifeer) een schadelijker effect uitoefenen op de insulinegevoeligheid dan centrale 8,9,13. Deze laatste leveren brandstof aan centrale mitochondriën, die een grotere ademhalingsactiviteit hebben en meer gespecialiseerd zijn om te voldoen aan de hoge energievraag die nodig is voor contractie14. Perifere LD's leveren daarentegen subsarcolemmale mitochondriën, die betrokken zijn bij membraangerelateerde processen8. Ten slotte kunnen, naast triglyceriden, specifieke complexe lipiden in de spier schadelijker zijn dan andere. Diacylglycerol, lange-keten acyl-CoA en ceramiden kunnen zich bijvoorbeeld ophopen in spieren wanneer de triglyceridenomloopsnelheid laag is, waardoor insuline wordt aangetast die 9,15 signaleert. Terugkerend naar de "paradox van de atleet", hebben duursporters een groot aantal kleinere centrale LD's met verhoogde omloopsnelheden in type I (oxidatieve) vezels, terwijl zwaarlijvige en diabetische patiënten grotere perifere LD's hebben met lage omloopsnelheden in type II (glycolytische) vezels 8,15,16. Naast hun rol in energieopslag en -afgifte, kunnen LDs via afgeleide vetzuren (FA) en een vachteiwit (perilipin 5) ook functioneren als kritische spelers die betrokken zijn bij de transcriptionele regulatie van FA-oxidatie en mitochondriale biogenese8. Vanwege hun cruciale implicaties in de fysiologie en pathofysiologie, zijn diepgaande studies over de dynamiek en functies van LDs gerechtvaardigd.
Hoewel er verschillende technieken zijn om IMCLs te bestuderen, zijn ze niet allemaal geschikt om de LD-grootte, -dichtheid en -distributie op een vezelspecifieke manier nauwkeurig te kwantificeren. Bijvoorbeeld, de beoordeling van IMCLs door magnetische resonantiespectroscopie, hoewel niet-invasief, biedt een resolutieniveau dat niet voldoende is om de grootte en precieze locatie van LDs in de vezel te bestuderen, en het is niet vezeltypespecifiek17,18. Evenzo kunnen biochemische technieken uitgevoerd op homogene homogenen van de hele spieren19 de locatie en grootte van lipiden niet beoordelen. Bijgevolg is de meest geschikte methode om LD-morfologie en locatie te analyseren kwantitatieve transmissie-elektronische microscopie13, maar deze techniek is duur en tijdrovend. Daarom is confocale fluorescentiebeeldvorming op preparaten met kleurstoffen zoals Oil Red O (ORO)20,21, monodansylpentane (MDH)22 of Bodipy 23,24,25 naar voren gekomen als het beste hulpmiddel voor deze studies.
Hier wordt een compleet protocol beschreven, inclusief weefselbemonstering en -verwerking, Bodipy-kleuring en confocale beeldacquisitie en -analyse om de LD-grootte, het aantal en de lokalisatie in cryosecties van muizenspieren te kwantificeren. Aangezien IMCLs niet gelijkmatig verdeeld zijn over oxidatieve en glycolytische vezels, en elk vezeltype de LD-dynamiek anders reguleert, moet de studie van IMCLs vezeltypespecifiekzijn 16,25,26,27. Daarom gebruikt dit protocol immunofluorescentie op seriële secties om myosine zware keten (MyHC) isovorm (en) uitgedrukt door elke vezel te identificeren. Een ander voordeel van dit protocol is de gelijktijdige verwerking van een glycolytische (extensor digitorum longus, EDL) en een oxidatieve (soleus) spier die naast elkaar worden geplaatst voor het bevriezen (figuur 1). Deze gelijktijdige verwerking bespaart niet alleen tijd, maar voorkomt ook variabiliteit door afzonderlijke verwerking van de monsters.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de procedure. Na spierdissectie (1) worden geselecteerde spieren van vergelijkbare grootte voorbereid en samen ingevroren (2). Seriële dwarsdoorsneden van 10 μm worden verkregen met behulp van een cryostaat en direct gemonteerd op adhesieglaasjes (3). Van twee seriële dia's is de eerste (4A) immunoactief gelabeld voor laminine en gekleurd met Bodipy om LDs te herkennen en de tweede (4B) is immunostained met antilichamen tegen MyHC's voor de herkenning van spiervezeltypen. Beelden worden verkregen met behulp van een confocale microscoop voor Bodipy (5A) en een epifluorescentiemicroscoop voor spiervezeltypen (5B). Afbeeldingen worden in Fiji geanalyseerd door een drempel toe te passen en deeltjes (6A) te kwantificeren om het aantal, de gemiddelde grootte, de dichtheid en het percentage van het totale gebied bezet door LDs (7) of telcellen (6B) te verkrijgen om het percentage vezels van elk type in de sectie (7) te verkrijgen. Afkortingen: LDs = lipidedruppels; EDL = extensor digitorum longus; MyHC's = myosine zware keten isovormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures uitgevoerd op muizen werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van de Medische Sector aan de Université Catholique de Louvain (2019/UCL/MD/013).
1. Dissectie en voorbereiding van de monsters voor bevriezing
- Label een 3 mm dik stuk kurk voor elk paar spieren.
- Steek via een kleine incisie gemaakt met een mes op het midden van de kurk loodrecht een rechthoekig stuk stijf plastic (0,5 cm B, 1 cm H) in dat als ondersteuning zal dienen (figuur 2B).
OPMERKING: De grootte van het rechthoekige plastic stuk hangt af van de grootte van de spier. Hier worden de beschreven afmetingen aangepast aan de grootte van de soleus (~ 9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) en EDL (~ 5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) van een 3 maanden oude C57BL / 6J mannelijke muis. - Verwijder op het moment van dissectie de soleus en EDL van de achterpoot van de muis. Om te voorkomen dat de monsters tijdens de dissectie uitdrogen, plaatst u ze op een kompres dat licht bevochtigd is met een zoutoplossing in een petrischaaltje dat op ijs is geplaatst.
OPMERKING: Zie Wang et al.28 voor uitleg over hoe deze twee ledemaatspieren te ontleden. - Plaats een kleine druppel Optimal Cutting Temperature compound (OCT) op de kurk/plastic junctie en vermijd luchtbellen.
- Verwijder overtollig vocht uit de monsters door ze voorzichtig te drogen met een papieren handdoek (figuur 2A) en plaats beide spieren op het plastic loodrecht op de kurk (figuur 2C).
- Controleer de oriëntatie van de spiermyofibers onder een stereomicroscoop (figuur 2D).
OPMERKING: Het is belangrijk om de spier niet te bedekken met OCT, omdat het isolerende effect ervan snel bevriezen zou voorkomen en bevriezingsartefacten zal produceren.
2. Skeletspiermonsters invriezen voor cryosectie
LET OP: Het bevriezen van de spier moet gebeuren onder een chemische kap, met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (zie de tabel met materialen).
- Gebruik een roestvrijstalen beker (~ 8 cm H, 6 cm Ø) met twee zijbanden van ten minste 25 cm lang (figuur 2F) en vul de beker tot 2/3 van zijn capaciteit met isopentaan.
- Pak de beker bij de riemen en dompel deze voorzichtig onder in een polystyreendoos gevuld met vloeibare stikstof, zodat het stikstofgehalte buiten de container boven het niveau van isopentaan binnenin ligt (figuur 2F, G).
LET OP: Wanneer de beker in contact komt met de stikstof, kan de thermische schok wervelingen veroorzaken. Zorg ervoor dat de tumbler voldoende is ondergedompeld, maar vermijd het binnendringen van stikstof, omdat dit isopentane neerslag zou veroorzaken. Als dit gebeurt, laat de isopentane afkoelen, vul de tumbler met nieuwe isopentane en begin opnieuw. - Wanneer de binnenkant van de beker volledig bedekt is met een witte vaste laag isopentaan, haalt u deze uit de doos met vloeibare stikstof (figuur 2H).
OPMERKING: De smelttemperatuur van isopentaan is -159 °C, de randen van de beker worden wit als het koud genoeg is. - Roer de vaste stukjes isopentaan voorzichtig met een tang in de resterende vloeibare isopentaan totdat het hele volume weer vloeibaar wordt.
- Dompel de beker opnieuw onder in de vloeibare stikstof totdat isopentaan witte kiezels vormt over de bodem en randen van de beker (figuur 2G, H).
OPMERKING: Deze tweede koelstap zorgt voor de juiste vriestemperatuur van het isopentaan. - Verwijder de beker uit de vloeibare stikstof en dompel de spieren snel in de bodem van de beker, houd de kurk vast met een pincet met rattentanden. Draai de kurk gedurende 15 s in het isopentaan en bewaar deze bij -80 °C tot de verwerking (figuur 2I).
OPMERKING: Voor kortdurende opslag kunnen de monsters worden bewaard in een vriezer van -20 °C. Het volledige protocol voor het snel bevriezen van skeletspieren is al elders gepubliceerd. Voor gedetailleerde referenties en probleemoplossing, zie: Meng et al.29, Kumar et al.30 en Leiva-Cepas et al.31.
3. Cryosectie
- Breng de monsters in de kamer van een eerder afgekoelde cryostaat tot -20 °C en de bladtemperatuur ingesteld op -25 °C.
OPMERKING: Transporteer monsters van de vriezer van -20 °C/-80 °C naar de cryostaat in een polystyreendoos gevuld met droogijs en laat de monsters gedurende ten minste 20-30 minuten in evenwicht brengen tot de kamertemperatuur voordat ze worden gesneden. - Verwijder het plastic van de kurk met een fijn pincet en plaats de cryostat monsterschijf op de snelvriesplaat om af te koelen. Zodra de plaat -50 °C heeft bereikt, plaatst u wat OCT op de schijf en plaatst u de kurk snel op de schijf en drukt u stevig. Wacht tot de OCT stolt en de kurk goed op de schijf is bevestigd.
- Plaats de schijf op de objectkop in de gewenste snijoriëntatie (figuur 2J,K) en trim het spierblok verder dan ten minste 1/3 van de lengte van de spieren en totdat beide doorsneden van de spieren zichtbaar zijn.
- Stel de snijdikte in op 10 μm en plaats één sectie op een hechtingsschuif om de juiste oriëntatie van de vezels op een brightfieldmicroscoop te controleren.
OPMERKING: Het controleren van de transversale oriëntatie van de vezels is van cruciaal belang. Als de vezels niet voldoende zijn georiënteerd, pas dan de hoek van de objectkop aan, snijd een ander gedeelte en controleer opnieuw. - Plaats twee seriële doorsneden op twee vooraf gelabelde hechtingsdia's: één dia om vezeltypen te bepalen, de andere om het lipidengehalte te kwantificeren (figuur 2L).
OPMERKING: Aanvullende seriële doorsneden kunnen worden verkregen en bij -80 °C worden gehouden voor andere histologische onderzoeken. Om echter te voorkomen dat het lipidengehalte en de intracellulaire morfologie veranderen24, is het essentieel om de eerste twee dia's onmiddellijk na het snijden te verwerken om luchtdroging te voorkomen. Het invriezen en ontdooien van de dia's voor LD-kwantificering zou hetzelfde effect hebben en is dus zeer af te raden.
4. Vezeltypering en Bodipy-kleuring
- Immunohistochemische detectie van spiervezeltype
OPMERKING: Voor het volgende protocol is een totaal oplossingsvolume van 250 μL voldoende om het hele spiergedeelte te bedekken, omringd door een cirkel getekend met een hydrofobe pen ter grootte van een muntstuk van ongeveer 1 cent.- Omring de secties met een omtrek getekend met een hydrofobe pen en spoel af met ijskoude 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT). Plaats de schuif in een vochtige kamer en blok gedurende 90 minuten bij 37 °C in blokkerende oplossing (10% normaal geitenserum (NGS) en 1:30 muis op muis (MOM) blokkerend reagens in PBS).
- Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer de dia's gedurende 90 minuten bij 37 °C met de oplossing die de primaire antilichamen bevat (5% NGS, 1:30 MOM-blokkerend reagens, de primaire antilichamen van de muis om type I (IgG2b, 1:10), type IIa (IgG1, 1:10) en type IIx (IgM, 1:5) vezels en een rat anti-laminine (α2-keten) te herkennen, 1:1.000) in PBS.
- Was de dia's met PBS 3 x 5 min op RT.
- Incubeer de dia's in het donker gedurende 1 uur bij RT met de oplossing die de secundaire antilichamen bevat (geiten anti-IgG2b AF405 (1:500), geiten-anti-IgG1 AF488 (1:500), geiten-anti-IgM AF568 (1:1.000) en geiten-anti-laminine AF647 (1:500) in PBS).
LET OP: Voor de rest van het protocol, zorg ervoor dat u de dia's uit de buurt van licht houdt om de fluorescentie te behouden. - Was opnieuw 3 x 5 minuten in PBS, spoel af in dubbel gedestilleerd H2O, verwijder overtollig water en monteer met een antifade-reagens.
OPMERKING: Bewaar de dia's bij 4 °C, beschermd tegen licht om de fluorescentie te behouden tot de beeldacquisitie. Omdat de dia's niet vast zijn, wordt aanbevolen om voor elk experiment vers gemaakte oplossingen te gebruiken, de PBS te autoclaaf te maken en de beelden zo snel mogelijk te verkrijgen om besmetting van de secties te voorkomen.
- Kleuring van LDs met Bodipy
OPMERKING: Net als bij stap 4.1 is een totaal oplossingsvolume van 250 μL voldoende om het hele spiergedeelte te bedekken, omringd door een cirkel getekend met een hydrofobe pen ter grootte van een muntstuk van ongeveer 1 cent.- Omring de secties met een omtrek getekend door een hydrofobe pen en spoel met ijskoude 0,1 M PBS gedurende 10 minuten bij RT. Gebruik ijskoude PBS voor alle spoelingen en wasbeurten.
- Fixeren met koud 4% paraformaldehyde (PFA) zonder methanol gedurende 10 minuten bij RT. Na een eerste snelle spoeling, was de dia's met PBS 3 x 5 min op RT.
LET OP: Voer deze stap uit onder een chemische kap. - Plaats de glijbaan in een vochtige kamer en blok gedurende 1 uur op RT met 5% NGS in PBS.
- Incubeer de dia's gedurende 90 minuten bij 37 °C met de oplossing van het primaire antilichaam (2% NGS en rattenantamine (α2-keten, 1:1.000) in PBS). Was de dia's met PBS 3 x 5 min op RT.
LET OP: Voor de rest van het protocol, zorg ervoor dat u de dia's uit de buurt van licht houdt om de fluorescentie te behouden. - Incubeer gedurende 1 uur bij RT met de secundaire antilichaamoplossing die geiten anti-rat-AF647-antilichaam (1:500) in PBS bevat. Was de dia's met PBS 3 x 5 min op RT.
- Incubeer gedurende 20 minuten bij RT met een oplossing van 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 0,5 μg/ml) en BODIPY (1 μg/ml) in PBS.
OPMERKING: Om BODIPY-stamoplossing te bereiden, lost u deze op in DMSO in een concentratie van 1 mg / ml. Verschillende Bodipy-formuleringen zijn in de handel verkrijgbaar voor LD-kleuring. Afhankelijk van de gemaakte keuze is de kleuringsmethode hetzelfde (dezelfde stappen, concentratie en incubatietijd); de acquisitiemethode zal echter iets anders zijn. - Was na een eerste snelle spoeling de dia's met PBS 3 x 5 min op RT, spoel in dubbel gedestilleerd H2O, verwijder overtollig water en monteer met een antifade-reagens.
OPMERKING: Bewaar de dia's bij 4 °C, beschermd tegen licht, om de fluorescentie te behouden tot de beeldacquisitie.
5. Verwerving van afbeeldingen
OPMERKING: Zodra de kleuringsprotocollen zijn voltooid, is het belangrijk om onmiddellijk over te gaan tot beeldacquisitie (binnen de volgende 24 uur), niet alleen om besmetting te voorkomen, maar ook om de morfologie, grootte en het aantal LDs te behouden.
- Verwerving van beelden om de vezeltypen van elke bemonsterde spier te beoordelen
OPMERKING: Deze stap kan worden bereikt met een fluorescentiescanmicroscoop met hele dia's of met een conventionele epifluorescentiemicroscoop. Bij dit laatste moet handmatig of geautomatiseerd naaien van de afbeeldingen worden gedaan om de sectie te reconstrueren.- Gebruik voor vezelherkenning een epifluorescentiemicroscoop met een 10x/0.3-objectief. Selecteer excitatiefilters voor DAPI (405 nm), FITC, TRITC en Cy5 om respectievelijk type I, IIa, IIx-vezels en laminine te detecteren.
OPMERKING: Type IIb-vezels worden niet immuungelabeld. Ze zullen worden herkend als vezels gekleurd door laminine op de grenzen van het sarcolemma met een zwart sarcoplasma. - Pas de juiste belichtingstijd voor elk kanaal aan.
- Wanneer u een conventionele epifluorescentiemicroscoop gebruikt, verwerf dan altijd de beelden van de hele spier volgens dezelfde volgorde om spierreconstructie te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat de vezels aan de rechterrand van de ene afbeelding ook aan de linkerkant van de volgende afbeelding worden weergegeven. Hetzelfde geldt voor het bovenste en onderste deel van de afbeeldingen (figuur 3A).
OPMERKING: Ter referentie, voor een sectie van de EDL of de soleus ontleed van een muis van 3 maanden oud, zullen gemiddeld zes en acht afbeeldingen, respectievelijk, de hele spierdoorsnede bedekken. - Nadat de spier is gescand, uploadt u de vastgelegde digitale afbeeldingen naar elke beeldverwerkingssoftware voor reconstructie (stitching), op basis van de vezelmorfologie (laminine) en de histologie van de spiersectie, en slaat u deze op als een TIFF-, PNG- of JPG-bestand met alle kanalen (kleuren) samengevoegd (figuur 3A).
- Gebruik voor vezelherkenning een epifluorescentiemicroscoop met een 10x/0.3-objectief. Selecteer excitatiefilters voor DAPI (405 nm), FITC, TRITC en Cy5 om respectievelijk type I, IIa, IIx-vezels en laminine te detecteren.
- Verwerving van afbeeldingen met laminine en Bodipy co-kleuring
OPMERKING: Om het vezeltype te herkennen en een schatting te hebben van het aantal vezels voor elk type vastgelegd, is het essentieel om het vezeltypegedeelte al te laten scannen en de spieren te reconstrueren voordat de beeldacquisitie van Bodipy-laminin wordt gestart (figuur 3B).- Gebruik voor Bodipy-beeldobservatie en -acquisitie een confocale microscoop met een 40x olie-immersieobjectieflens met een numeriek diafragma van 1,4.
- Gebruik de volgende instellingen: pinhole bij 1 AU, 2.048 pixel x 2.048 pixel resolutie, pixelgrootte bij 0,08 μm, unidirectionele modus, scansnelheid bij 4 (~4 μs/pixel), lijngemiddelde ingesteld op 4x en digitale zoom ingesteld op 1.
- Om cross-talk tussen Bodipy-558/568 en laminine-AF647 te voorkomen, gebruikt u de sequentiële scanmodus op de confocale software.
OPMERKING: Wanneer de gekozen kleurstof Bodipy-493/503 is, is gelijktijdig confocale laserscanning mogelijk zonder overspraak tussen het Bodipy-kanaal en het laminine-AF647-kanaal. Dit zal de verwerving van beelden versnellen. - Prikkel Bodipy-493/503 met behulp van de 488 nm laserlijn of argonlaserlijn en prikkel Bodipy-555/568 met behulp van de 561 nm diodelaserlijn. Detecteer ten slotte laminine-AF647 met een 640 nm diodelaserlijn.
LET OP: Houd er rekening mee dat Bodipy-moleculen erg gevoelig zijn voor fotobleaching, dus vermijd onnodig laserscannen. Om vezels te herkennen, gebruikt u alleen de laser voor laminine. - Afhankelijk van de gekozen kleurstof, stelt u de emissiebereiken in op 570-650 nm voor Bodipy-493/50324 en op 565-620 nm voor Bodipy-558/568. Stel het emissiebereik voor laminine in op 656-700 nm.
- Stel de versterking en digitale versterking op de juiste manier in, zodat er geen verzadigde pixels worden gedetecteerd op de bereikindicator. Corrigeer het achtergrondsignaal door de offset aan te passen.
OPMERKING: Filterselectie en andere bovengenoemde scanparameters moeten worden geoptimaliseerd voor elke confocale microscoop. Het is belangrijk dat alle bovengenoemde instellingen constant worden gehouden om alle beelden die zijn vastgelegd uit monsters te vergelijken. - Om het type vezel te identificeren onder degenen die op de confocale microscoop worden gevisualiseerd, gebruikt u een persoonlijke laptop waarop het beeld van de sectie gereconstrueerd na vezeltype immunodetectie wordt gecontroleerd (figuur 3B).
- Zodra een groep vezels correct is geïdentificeerd, verwerft u het beeld met de Bodipy- en lamininekanalen.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de Bodipy-laminin-afbeeldingsnaam te noteren op het gebied van de spier waar deze vezels zich bevinden op het beeld dat is verkregen voor MyHC-herkenning om de latere vezelspecifieke analyse van LDs te vergemakkelijken.
6. Analyse van afbeeldingen
- Analyse van de vezeltypen op elk spiermonster
- Open in Fiji (of ImageJ)32 het TIFF-, PNG- of JPG-bestand met de gereconstrueerde spier die is verkregen uit de samenvoeging van alle kanalen die worden gebruikt om de vezelisovormen te detecteren.
- Om de cell counting tool te starten, klik op Plugins | Analyseer | Celteller | Celteller.
- Klik in het venster Celteller op Acties | Initialiseren.
- Selecteer onder Tellers in hetzelfde venster de optie Type 1.
- Selecteer in het hoofdvenster van Fiji het gereedschap Wand .
- Om het aantal vezels van elk type te kwantificeren, klikt u op elke vezel van hetzelfde type, zodat het programma het aantal aangeklikte vezels registreert.
- Als u klaar bent, selecteert u het volgende type vezel en herhaalt u dezelfde stappen.
- Wanneer alle vezels van de afbeelding zijn toegewezen aan een bepaald vezeltype, klikt u op Resultaten in het venster Celteller om de resultaten in een tabel weer te geven.
- Sla deze tabel op als spreadsheettabel door te klikken op Bestand | Opslaan als in het venster Resultaten .
- Sla de selecties op dezelfde afbeelding op elk gewenst moment op en herlaad ze opnieuw door te klikken op respectievelijk Markers opslaan of Markers laden in het venster Celtelling .
- Analyse van lipidedruppels op een vezeltype-afhankelijke manier
- Analyseer de afbeeldingen van Bodipy en laminine verkregen op de confocal met behulp van Fiji voor de kwantificering van LDs.
OPMERKING: De auteurs hebben een aangepaste macro ontworpen om de analyse te automatiseren. Deze macro, samen met een stapsgewijze uitleg over het gebruik ervan, is beschikbaar als respectievelijk Aanvullend bestand 1 en Aanvullend bestand 2. - Open elke afbeelding met behulp van de Bio-Formats Importer uit Fiji. Selecteer onder de optie Stack weergeven met de optie Hyperstack | Kleurmodus, Standaard. Zorg ervoor dat het venster Automatisch schalen is geselecteerd.
OPMERKING: De volgende stappen beschrijven het protocol voor de analyse van één vezel op de afbeelding, maar het moet zo vaak worden herhaald als het aantal volledige vezels op de afbeelding verschijnt. - Gebruik de selectietool uit de vrije hand om handmatig het sarcolemma van de vezel te selecteren op basis van het lamininekanaal (figuur 4A) en druk op T op het toetsenbord om de selectie of regio van belang (ROI) in het ROI-venster vast te leggen.
- Ga naar het hoofdvenster van Fiji en klik op Analyseren | Stel Metingen in en selecteer in het pop-upvenster Gebied en feretdiameter. Laat de resterende vakjes uitgeschakeld en andere parameters zoals ze standaard worden weergegeven.
- Klik op Meten in het ROI-venster om het gebied en de minimale diameter van Feret (MF) van de geselecteerde vezel te verkrijgen en noteer ze voor later gebruik.
OPMERKING: Bij het analyseren van LD's is het belangrijk om in gedachten te houden dat hun grootte en dichtheid variëren tussen het centrum en de periferie (subsarcolemmale regio-SS) van de vezel. Daarom moet de analyse afzonderlijk worden uitgevoerd. - Bereken de waarde van 1/6 van de MF om het centrale deel van de vezel af te bakenen.
OPMERKING: In de macro is de standaard MF-waarde ingesteld op 6, wat betekent dat de toegepaste reductie wordt ingesteld op 1/6 van de MF. Deze waarde werd gekozen op basis van de empirische gegevens verkregen van de soleus van dieren die een vetrijk dieet kregen. Elke onderzoeker moet dit aantal echter wijzigen op basis van de empirische gegevens en de geanalyseerde spier, het type vezel en de toestand van het dier. - Klik in het ROI-venster op Toevoegen om een duplicaat van de eerste ROI te hebben en selecteer de tweede ROI die in het venster verschijnt.
- Klik in het hoofdvenster van Fiji op Bewerken | Selectie | Vergroot en introduceer de eerder berekende waarde (uit stap 6.2.6.) met een minteken voor het getal en klik op OK. Klik in het ROI-venster op Add[t] (een derde ROI moet verschijnen) en Delete om de tweede ROI te verwijderen.
OPMERKING: De onderzoeker kan de resultaten controleren door op het vak Alles weergeven in het ROI-venster te klikken. Op dit punt moeten twee ROI's verschijnen, een die de hele omtrek van de vezel omringt (figuur 4B) en een andere die in het midden is geplaatst (figuur 4C). - Selecteer beide ROI's in het ROI-venster en klik op Meer | XOR | Voeg[t]. Wacht tot er een derde ROI verschijnt, die overeenkomt met de periferie van de vezel (figuur 4D).
- Sla de ROI's op door te klikken op Meer | Opslaan om de ROI's te bewaren voor het geval een latere heranalyse van dezelfde vezels nodig is.
- Selecteer het Bodipy-kanaal en open het gereedschap Drempel door op Afbeelding | | aanpassen Drempel op fiji's hoofdvenster .
- Stel in het pop-upvenster Drempel de waarden in op 70/255, selecteer Yen | B &W-methode en klik op Donkere achtergrond | Solliciteren.
OPMERKING: De waarden die op de drempelwaarde worden toegepast, kunnen variëren afhankelijk van de omstandigheden van het experiment en de drempel moet op de juiste manier worden ingesteld om de analyse te optimaliseren. Er moet een ZWART-witvenster verschijnen met het Bodipy-signaal boven de drempellimiet in wit en de achtergrond in zwart (vergelijk de oorspronkelijke Bodipy-afbeelding in figuur 4E met die in figuur 4F). - Ga naar het hoofdvenster van Fiji en klik op Analyseren | Stel Metingen in en selecteer in het pop-upvenster Gebied, Gebiedsfractie en Beperken tot drempel. Laat de resterende vakjes uitgeschakeld en andere parameters zoals ze standaard worden weergegeven.
OPMERKING: Als de onderzoeker de "circulariteit" van LD's wil analyseren, wat een index is van de bolvormige morfologie die varieert van 1 voor een perfecte bol tot 0 voor een lijn, klikt u op het vak Vormbeschrijvingen van het pop-upvenster Metingen instellen . - Ga naar het ROI-venster en selecteer de eerste ROI. Klik in het hoofdvenster van Fiji op Analyseren | Gereedschap Deeltjes analyseren.
OPMERKING: Deze tool kwantificeert het aantal, de grootte, het bestreken gebied en het percentage van het totale gebied dat wordt bedekt door deeltjes op elke selectie en slaat de resultaten op als een spreadsheetbestand. - Stel de waarden in van 2 tot Oneindig (2-Oneindig) in het venster Deeltjes analyseren , vink het vakje Pixels aan, behoud de standaard circulariteitswaarden, selecteer Samenvatten en klik op OK.
OPMERKING: Als u de resultaten op de vezel wilt controleren, selecteert u onder de optie Weergeven een van de beschikbare opties. Als u de informatie van elke LD wilt laten herkennen op de selectie in een tabel, vinkt u de optie Resultaten weergeven aan in het venster Deeltjes analyseren . De resultaten van de analyse van de totale oppervlakte van de vezel worden gemiddeld en samengevat in een tabel met verschillende kolommen (aantal, totale oppervlakte, gemiddelde grootte, % oppervlakte; deze komen overeen met het aantal deeltjes [LDs], de oppervlakte die door deze deeltjes wordt ingenomen, hun gemiddelde grootte en het percentage van de totale oppervlakte van de selectie bezet door deeltjes, respectievelijk). Om de dichtheid te berekenen, deelt u het aantal deeltjes door de totale oppervlakte van elke selectie. - Om de waarden van het centrum en de periferie van de vezel te verkrijgen, herhaalt u stap 6.2.14 en 6.2.15, waarbij u telkens de tweede (midden) en de derde ROI (periferie) selecteert.
- Sla de resultaten op door op Bestand | Opslaan als in het venster Samenvatting .
OPMERKING: Vermeld het type vezel, de voorwaarde en de afbeeldingsnaam op de toegewezen naam van de resultaten om latere eenwording en statistische analyse van de gegevens te vergemakkelijken. Om de rest van de vezels in dezelfde afbeelding te analyseren, herhaalt u stap 6.2.3 tot en met 6.2.17. Voor de statistische analyse moeten per dier minstens 10-15 vezels van elk type worden geanalyseerd.
- Analyseer de afbeeldingen van Bodipy en laminine verkregen op de confocal met behulp van Fiji voor de kwantificering van LDs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hierin beschreven protocol biedt een efficiënte methode om LD's eenvoudig te kwantificeren op een vezeltype en subcellulair-specifieke manier. Het laat zien hoe, door twee spieren van vergelijkbare grootte, zoals de EDL en de soleus, samen te vriezen, de tijd en middelen die aan de volgende stappen worden besteed, met de helft worden verminderd.
Een compleet protocol wordt verstrekt voor immunostaining, beeldacquisitie en analyse van de verschillende MyHC-isovormen die tot expressie komen in volwassen muisspieren. Dit protocol is gebaseerd op het protocol dat voor het eerst werd ontworpen door Schiaffino et al. in 198933, met enkele aanpassingen zoals het gebruik van een extra antilichaam om laminine te labelen. Deze latere wijziging is van cruciaal belang voor de locatie van type IIb-vezels, die zwart zullen zijn omdat ze niet zijn gekleurd met een antilichaam. Zoals te zien is in figuur 5, maakt dit immunohistochemische protocol niet alleen de herkenning van langzaam-oxidatieve (type I en IIa) en snel-glycolytische (type IIx en IIb) vezels mogelijk, maar ook de aanwezigheid van hybride vezels (zie asterisk in figuur 5D). Bovendien maakt het hebben van de doorsneden van beide spieren op dezelfde dia de vergelijking van de verhoudingen van elk vezeltype tussen de twee geselecteerde spieren mogelijk, zodat de experimentele omstandigheden op beide secties identiek waren.
Voor LD-etikettering zijn de hier gepresenteerde resultaten gebaseerd op het gebruik van Bodipy-558/568 C12 als lipidekleurstof; de lezer wordt echter verwezen naar een uitstekend protocolartikel waarin het gebruik van de klassieke kleurstof Bodipy-493/503 op spiersecties23 wordt beschreven. Het gepresenteerde protocol combineerde de kleuring van LDs op basis van immunohistochemie tegen α2-laminine om het vezelsarcolemma te onderscheiden. Net als bij het vezeltype-experiment is deze stap essentieel, niet alleen voor de herkenning van individuele vezels, maar ook voor de daaropvolgende analyse van lipiden in zowel de centrale als perifere regio's van vezels (figuur 4). Een van de kritieke stappen van dit protocol is de identificatie en tagging van dezelfde vezels op de twee dia's. Zoals eerder uitgelegd, is het belangrijk om de dia te scannen met vezeltypen en de reconstructie van spierdoorsneden met de samengevoegde kleuren te hebben voordat beelden voor LDs worden verkregen (figuur 3B). Opmerkelijke structuren van elk spiergedeelte, zoals axontakjes of spierspillen, zijn goede oriëntatiepunten die de onderzoeker kunnen helpen dezelfde vezels op beide dia's te lokaliseren (figuur 6). Vergeet niet dat omdat de dia ondersteboven op de meeste confocale microscopen wordt geplaatst, het wordt aanbevolen om het vezeltype gereconstrueerde beeld op de pc om te keren om de locatietaak te vergemakkelijken.
De beschreven instellingen voor de verwerving van Bodipy-lamininekleuring door confocale microscopie maken de visualisatie en latere analyse mogelijk van de grootte, het aantal en de verdeling van LDs van drie tot zes vezels tegelijkertijd (figuur 6 en figuur 7). Een gedetailleerd stapsgewijs protocol om LD's te analyseren met de beeldanalysesoftware Fiji wordt hier ook verstrekt. Zoals weergegeven in het protocol, is de volledige analyse van elk van de vezels die op een afbeelding aanwezig zijn lang en vervelend. Fiji heeft echter het voordeel dat het ontwerp van aangepaste programma's, macro's genaamd, op basis van de Java-taal mogelijk is. De auteurs hebben een macro ontworpen die de automatisering van de hierboven beschreven reeks individuele opdrachten mogelijk maakt die automatisch in een lus wordt uitgevoerd om in een paar minuten te analyseren - niet alleen elk van de vezels die op een afbeelding aanwezig zijn, maar ook een grote reeks afbeeldingen. De enige input van de onderzoeker is de handmatige selectie van de omtrek van de vezel die elke keer moet worden geanalyseerd, de selectie van het vezeltype en de visuele inspectie van het resulterende beeld na het toepassen van de drempel en het kwantificeren van de deeltjes.
Hier wordt de analyse van LD's op een locatieafhankelijke manier geïmplementeerd. Door eerder het oppervlak en de MF-diameter van de vezel te meten, wordt een grootteafhankelijke (niet-vaste zoals beschreven door Strauss et al.25) reductie toegepast om de centrale en perifere gebieden van elke vezel te verkrijgen (figuur 4 en figuur 7). Zoals te zien is in de histogrammen van figuur 7, maakt deze methode de kwantificering mogelijk van drie belangrijke parameters: het percentage van het vezeloppervlak bezet door LDs (figuur 7E), de dichtheid van LDs - het aantal LDs per μm2 (figuur 7F) en de gemiddelde grootte van LDs (figuur 7G). Als gevolg hiervan presenteren bij muizen van 3 maanden oud (N = 5), type IIa (groene omtrek) en type IIx (rode omtrek) vezels het grootste deel van het gebied bezet door LDs in de periferie (figuur 7E). Met betrekking tot de dichtheid van deeltjes vertonen EDL-vezels altijd een hogere dichtheid dan soleusvezels, onafhankelijk van de subcellulaire locatie (figuur 7F). Ten slotte is de gemiddelde grootte van die LDs altijd groter in de periferie dan in het midden (figuur 7G).
De verschillende methoden die door andere groepen worden gebruikt om de accumulatie van LD's in knaagdierskeletspieren te beoordelen34,35 maken het moeilijk om deze resultaten te vergelijken met die van eerdere studies. In overeenstemming met de resultaten van Komiya et al.34 is het percentage vezeloppervlak dat door LD's wordt ingenomen echter hoger in soleus type IIa en EDL type IIx-vezels. Het belangrijkste is dat type IIb-vezels het laagste percentage van het gebied dat door LD's wordt ingenomen het laagst laten zien (figuur 7E, grijze histogrammen). Aangezien vezeltype IIb het meest overheersende vezeltype van de EDL is (75%, figuur 5E), bevestigen deze resultaten wat andere groepen eerder hebben beschreven: de algehele accumulatie van lipiden is lager in EDL dan in de soleus34,35.
In tegenstelling tot wat is beschreven bij mensen25, en ook in overeenstemming met de resultaten van Komiya et al.34, laten de hier gepresenteerde resultaten zien dat de accumulatie van LDs in soleus type I-vezels relatief laag is. Dit kan worden verklaard door verschillen tussen soorten vezels tussen muizen en mensen36, omdat de metabole eigenschappen van menselijke type I-vezels meer lijken op die van knaagdiertype IIa en IIx, terwijl die van menselijke type IIx-vezels dicht bij knaagdiertype IIb37 liggen. Samenvattend bieden de verschillende technieken die hier worden beschreven een reproduceerbare, betrouwbare en tijdsefficiënte methode om verschillende parameters met betrekking tot LDs en hun distributie binnen de cel op een vezeltypeafhankelijke manier te bestuderen en te vergelijken.
Suboptimale experimenten
Als de vriesprocedure niet correct wordt uitgevoerd en isopentaan niet op de juiste temperatuur is, zullen zich ijskristallen in de vezels vormen (figuur 8A). Deze bevriezingsartefacten zijn pas detecteerbaar na de histologische voorbereiding van het monster en kunnen worden herkend als gaten in de vezels. Voor een goede kwantificering van LDs moeten deze artefacten worden vermeden. Het is aangetoond dat het ontdooien en opnieuw invriezen van het spierblok op de juiste manier deze artefacten aanzienlijk kan verminderen29.
Een ander probleem doet zich voor wanneer vezels niet loodrecht op de lengteas worden gesneden (figuur 8B). LD-kwantificering en vergelijking tussen vezels, spieren of dieren kan niet worden gedaan wanneer secties niet transversaal zijn. Om deze reden is het essentieel om de spieren correct op de kurk te plaatsen met behulp van een stereomicroscoop voor het invriezen en een brightfieldmicroscoop dicht bij de cryostaat te hebben. Dit laatste stelt de onderzoeker in staat om de juiste uitlijning van het monster op de cryostaat te vinden.
In sommige zeldzame gevallen is de etikettering van MyHC-isovormen erg zwak op een of meer vezeltypen (figuur 8C). Als dit gebeurt, zal de analyse van LDs onvolledig zijn. In dit geval moet het experiment worden herhaald vanaf het snijden van de spieren. Ten slotte zou Bodipy zich kunnen ophopen in de periferie van de spierdoorsnede (figuur 8D). Als dit gebeurt, zal de kleuring zeer sterk zijn op die vezels, wat een artefactueel resultaat oplevert. Vermijd het verkrijgen van afbeeldingen van deze vezels.
Figuur 2: Voorbereiding van de monsters voor bevriezing en cryosectie. (A-D) Muis soleus en EDL spieren worden ontleed en geplaatst op een kurk vastgehouden door een stijve kunststof met een druppel OCT. (E-G) Een roestvrijstalen tumbler wordt gevuld met isopentane en gekoeld tot zijn smelttemperatuur in vloeibare stikstof. (H,I) De beker met de koude isopentaan wordt uit de vloeibare stikstof gehaald en het monster wordt ondergedompeld tot de bodem van de beker, wervelend gedurende 15 s. (J-L) De kurk met de monsters wordt op de cryostaathouderschijf geplaatst zonder de plastic ondersteuning en seriële dwarssecties van 10 μm worden direct op adhesieglaasjes gemonteerd. Twee aangrenzende seriële doorsneden worden onmiddellijk verwerkt voor het kleuren van LD's en de detectie van MyHC's. Afkortingen: LDs = lipidedruppels; EDL = extensor digitorum longus; MyHC's = myosine zware keten isovormen; OCT = optimale snijtemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bodipy-beeldacquisitie na het identificeren van het type vezel uit het gereconstrueerde samengestelde beeld dat op een andere computer wordt gezien. (A) Reconstructie van de gehele soleussectie immunoactief gelabeld voor vezeltype (MyHC's) van zeven onafhankelijke samengevoegde afbeeldingen (onderbroken rechthoeken) die aan elkaar zijn genaaid met behulp van beeldverwerkingssoftware. De witte pijlen en de cijfers geven de volgorde weer die tijdens de beeldacquisitie is gevolgd met behulp van een conventionele epifluorescentiemicroscoop. (B) Voor Bodipy-beeldacquisitie wordt (1) een veld met de spiersectie immunostained met laminine-AF647 en Bodipy-555/568 gevisualiseerd op het scherm van een computer die is aangesloten op de confocale microscoop. (2) Die vezels bevinden zich op het gereconstrueerde beeld van het spiergedeelte dat immunostained is om het type vezels (MyHC's) te detecteren. (3) Het beeld wordt verkregen met behulp van een confocale microscoop. Afkortingen: LDs = lipidedruppels; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; MyHC's = myosine zware keten isovormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van lipidedruppels met Fiji. (A,B) Het sarcolemma van de vezel wordt herkend op basis van het lamininebeeld en geselecteerd als de ROI. Totale oppervlakte en MF worden gemeten. (C) Om het centrale deel van de vezel te herkennen, wordt de selectie verminderd met 1/6 van de waarde van de MF. (D) Het gebied tussen de centrale en de totale selectie wordt ingesteld als de periferie of het subsarcolemmale gebied. (E) Voor de analyse van LD's gekleurd met Bodipy wordt een drempel toegepast, (F) en de Analyze Particles tool wordt gebruikt om verschillende parameters met betrekking tot de LDs te kwantificeren (zie tabel). Deze waarden worden onafhankelijk verkregen voor de volledige vezel (Alle), voor het centrale deel (Centrum) en voor het subsarcolemmale gebied (Periferie). Schaalstaven = 12 μm. Afkortingen: LDs = lipidedruppels; ROI = regio van belang; MF = Minimale diameter van Feret. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve immunostaining van vezeltypen in EDL (glycolytisch) en soleus (oxidatieve) muizenspier. Samengevoegde fluorescentiebeelden van EDL (A,B) en soleus (C,D) verkregen met een digitale fluorescentiemicroscoop van hele dia's. Antilichamen tegen type I (blauw-AF405), type IIa (groen-AF488), type IIx (rood-AF568) en laminine (wit-AF647) werden gebruikt. Zwarte vezels komen overeen met vezeltype IIb. B en D tonen details van de vezels in de witte rechthoeken van respectievelijk de panelen A en C. Het sterretje (*) in paneel D toont een IIa/IIx hybride vezel. (E,F) Representatieve kwantificering van vezeltypeverdeling in EDL en soleus van 3 maanden oude muizen (N = 5). EDL bestond voornamelijk uit type IIb, vervolgens IIx en IIa-vezels (respectievelijk ~ 75%, 15% en 5%). Soleus bestond daarentegen voornamelijk uit type IIa (>50%) en type I vezels (30%). De verhoudingen van type IIx-vezels waren vrij gelijkaardig in beide spieren, terwijl die van hybride vezels erg laag waren. Schaalstaven = 200 μm (A,C), 100 μm (B,D). Afkorting: EDL = extensor digitorum longus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatieve kleuring van LD's met Bodipy op seriële doorsneden die eerder immuungelabeld waren voor MyHC-isovormen. Fluorescentie samengevoegde beelden van muis EDL (A) en soleus (B) verkregen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met type I (blauw), IIa (groen), IIx (rood), IIb (zwart) vezels en laminine (wit signaal rond de vezels). (C-F) Confocale fluorescentiebeelden van de EDL (C,D) en de soleus (E,F) samen gelabeld met laminine (cyaan) en Bodipy (rood). Merk op dat de vezels die in C-F worden weergegeven, dezelfde zijn als die in de witte rechthoeken op de panelen A en B. Op de rechterhoek van de witte rechthoek in A is een axontakje te onderscheiden (witte pijlpunt). Schaalstaven = 200 μm (A,B), 20 μm (C-F). Afkortingen: LDs = lipidedruppels; EDL = extensor digitorum longus; MyHC's = myosine zware keten isovormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Kwantificering van LDs op een vezeltype- en subcellulair-specifieke manier. Representatieve fluorescentie confocale beelden van type I en type IIa vezels van soleus (A,B) en type IIx en type IIb vezels van EDL (C,D) verkregen na co-labeling met Bodipy (rood) en α2-laminine (niet getoond). LD-gehalte (% van het gebied bezet door Bodipy en dichtheid) en morfologie (grootte) werden geanalyseerd op een subcellulair-specifieke manier. Vezelomtrek werd gedefinieerd door lamininekleuring en de centrale of perifere gebieden werden ingesteld op basis van de MF-diameter. Percentage vezeloppervlak bezet door Bodipy (LDs) (E), LD-dichtheid (aantal / μm2) (F) of gemiddelde LD-grootte (G) in centrale of perifere regio's voor elk vezeltype. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Schaalbalken = 10 μm. Afkortingen: LDs = lipidedruppels; EDL = extensor digitorum longus; C = centraal; P = perifeer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Beelden die overeenkomen met suboptimale resultaten. (A) Brightfield-afbeelding van spierdoorsnede gekleurd voor hematoxyline-eosine met ijskristallen gevormd tijdens het bevriezingsproces. (B) Fluorescentie samengevoegd beeld van een soleus sectie immunostained voor MyHC's en laminine, waaruit blijkt dat de meerderheid van de vezels worden gesneden langs de lengteas. (C) Fluorescentiebeeld van een EDL-sectie die immuun gekleurd is voor MyHC's en laminine. De zwakke kleuring van vezeltype IIa (groen) belemmert de juiste kwantificering van elk vezeltype. (D) Confocale afbeelding met een sterke artefactuele kleuring van Bodipy (rood) op vezels aan de rand van de spierdoorsnede. Schaalstaven = 50 μm (A,B), 200 μm (C,D). Afkortingen: EDL = extensor digitorum longus; MyHC's = myosine zware keten isovormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: LD-kleuring met Olierood O op spierdoorsneden. (A,B) Confocale afbeeldingen die het patroon van kleuring laten zien dat is verkregen met Oil Red O in respectievelijk de soleus en EDL. Het protocol dat voor deze kleuring wordt gebruikt, wordt in detail beschreven door Prats et al.24. Merk op dat de accumulatie van LDs hoger is in het subsarcolemmale gebied van de myofibers, zoals eerder beschreven voor Bodipy. Schaalstaven = 20 μm. Afkortingen: LD = lipidedruppel; EDL = extensor digitorum longus. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Co-kleuring van LDs en mitochondriën in de soleusspier. (A) Confocale samengevoegde afbeelding met de immunolabeling van Tomm20, een eiwit dat aanwezig is op het mitochondriale membraan (groen), DAPI (blauw) en Bodipy-558/568 gelabelde LDs (rood). De inzet in A toont verschillende mitochondriën (groen) gebonden aan LD's (rood). Dit beeld is verkregen door toepassing van Airyscan confocale superresolutiemicroscopie. (B,C) Overeenkomstige eenkanaalsbeelden van respectievelijk LD's en mitochondriën. Schaalstaven = 10 μm (A-C), 5 μm (A, inzet). Afkortingen: LDs = lipidedruppels; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Fiji macro voor de geautomatiseerde analyse van LDs op meerdere laminine +Bodipy beelden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Stap-voor-stap uitleg over hoe te werken met de macro Bodipy_JoVE.ijm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een efficiënte methode om LD's te kwantificeren die zijn getagd met Bodipy op een vezeltype- en subcellulair-specifieke basis. In de afgelopen jaren zijn klassieke lipidekleurstoffen, zoals ORO of Sudan Black B, vervangen door een nieuwe reeks celdoorlatende, lipofiele, fluorescerende kleurstoffen die binden aan neutrale lipiden (bijv. Bodipy). Bodipy is verkrijgbaar als verschillende conjugaten en is zeer effectief gebleken in het taggen van LD's om hun morfologie, dynamiek en interactie met andere organellen te bestuderen, niet alleen in verschillende vaste weefsels en cellen 23,38,39,40 maar ook in levende cellen 41,42.
Binnen het protocol zijn er verschillende kritische aspecten waarmee de onderzoeker rekening moet houden om optimale resultaten te verkrijgen. Het is essentieel om de gekozen spieren correct op de kurk te plaatsen om een perfecte uitlijning en oriëntatie van spiermyofibers te garanderen, omdat eenmaal bevroren, slechts kleine aanpassingen van de houder op de cryostaat kunnen worden aangebracht. Bovendien is het van cruciaal belang om het immunostaining-protocol onmiddellijk te starten nadat de secties zijn gesneden, omdat luchtdrogende cryosecties (gedurende slechts 15 minuten) ernstige nadelige effecten hebben op LDs, wat resulteert in een afname van 66% in LD-dichtheid en een afname van 37% in de gemiddelde grootte24. Evenzo zou het invriezen en ontdooien van de dia's nadelige effecten hebben en daarom niet worden aanbevolen. Een derde belangrijk kenmerk van dit protocol is gerelateerd aan de fixatie van monsters. Voor de identificatie van de verschillende MyHC-isovormen met de hier genoemde antilichamen moet weefselfixatie worden vermeden omdat het de binding van de gekozen antilichamen aan hun epitopen verstoort. Als de spiermonsters eerder zijn gefixeerd, wordt de lezer verwezen naar een recent gepubliceerd artikel met verschillende antilichamen43. Alleen PFA zonder methanol wordt aanbevolen voor de etikettering en kwantificering van LD's, omdat het gebruik van methanol of aceton de morfologie van LDs 23,44 verstoort. Bovendien is een permeabilisatiestap niet nodig voor de kwantificering van LD's op dia's die immunoactief zijn gelabeld met laminine. Aangezien sommige groepen hebben aangetoond dat permeabilisatie met detergentia zoals TritonX-100, saponine of glycine de grootte of het aantal LDs44,45 kan verminderen, wordt permeabilisatie sterk afgeraden. Ten slotte is de fijnafstemming van de confocale microscoopinstellingen cruciaal om alleen de neutrale lipiden in LD's te herkennen en niet die in membranen van andere organellen24.
Hier werd Bodipy-558/568 C12 gebruikt als LD-marker. De meest gebruikte Bodipy voor het taggen van LD's en het bestuderen van hun morfologie en locatie binnen de skeletspiermyofibers is Bodipy-493/503. Beide kleurstoffen zijn vergelijkbaar in hun incubatietijd, werkconcentratie en hun smalle emissiespectra, hoewel hun excitatie- en emissiebereiken enigszins verschillen. Voor een volledig protocol over het gebruik van Bodipy-493/503 wordt de lezer verwezen naar het werk van Listenberger en Brown46 of Spangenburg et al.23. Bodipy-558/568 C12 is gebruikt voor het kleuren van LD's in andere weefsels zoals vetweefsel47, degenererend netvlies48, fibrotische nieren49 of fibroblasten50. Deze Bodipy levert een vergelijkbare kleuring op als die verkregen met ORO (zie aanvullende figuur S1), maar met aanzienlijk minder technische belasting en meer specificiteit24,51. Bovendien heeft Bodipy-558/568 C12 het voordeel dat het de kwantificering van LD's mogelijk maakt in combinatie met de detectie van eiwitten of organellen die zijn gelabeld met een secundair antilichaam met groen spectrum (zie aanvullende figuur S2 en Yan et al.49) of met GFP-genetisch gemodificeerde modellen52. Deze twee toepassingen zijn zeer krachtige hulpmiddelen om de dynamiek en interacties van LDs met andere celorganellen en eiwitten te ontrafelen. Niettemin, wanneer er geen colabeling van eiwitten in de cellen is bedoeld, bevelen de auteurs het gebruik van de best gekarakteriseerde LD-kleurstof Bodipy-493/503 aan.
Een van de beperkingen van dit protocol heeft betrekking op het verkrijgen van beelden en het kwantificeren van morfologische kenmerken van LD. Technologische vooruitgang in confocale laserscanmicroscopie heeft de vliegtuigresolutie sterk verbeterd in vergelijking met breedveldmicroscopen en maakt 3D-reconstructie van objecten mogelijk bij het scannen van het monster in het Z-vlak. Dit is zeer nuttig geweest voor de studie van LD-morfologie24 en interactie met andere eiwitten in skeletmyofibers 38,53, maar heeft de beeldacquisitie- en verwerkingstijd verhoogd, omdat elk 3D-gereconstrueerd beeld is samengesteld uit verschillende onafhankelijke 2D-afbeeldingen. In het bovenstaande protocol werden confocale beelden verkregen met een 40x objectieflens en alleen in 2D. Deze methode maakt het mogelijk om drie tot zes myofibers per afbeelding te verkrijgen in plaats van slechts één zoals het zou zijn bij het gebruik van een 63x-objectief. Dit resulteert in een lagere resolutie en een algemene schatting van de LD-grootte en morfologie die niet volledig nauwkeurig is. Niettemin maakt het de analyse van een groter aantal vezels per monster mogelijk, wat ook een belangrijk feit is om te overwegen, vooral in dierproeven, waarin een groot aantal spieren en aandoeningen moet worden vergeleken.
Hier wordt aangetoond dat, door het bevriezen van twee spieren van vergelijkbare grootte die naast elkaarliggen 34, de verwerkingstijd van de monsters aanzienlijk wordt verminderd en mogelijke artefactuele verschillen die zijn afgeleid van hun onafhankelijke verwerking worden verminderd. Bovendien houdt deze methode voor het analyseren van LDs rekening met de verschillen tussen de subcellulaire verdeling van LD's binnen en tussen vezeltypen54. Het selecteren van de omtrek van de myofiber en het verminderen van deze selectie in relatie tot de minimale diameter van de vezel Feret vergemakkelijkt de studie van de grootte en dichtheid van centrale en perifere (subsarcolemmale) LD's onafhankelijk. Het toepassen van deze methode is uiterst belangrijk omdat is aangetoond dat de subsarcolemmale accumulatie van LDs direct bijdraagt aan insulineresistentie. Hoewel sommige rapporten bij mensen LDs hebben bestudeerd op een vezeltype- en locatieafhankelijke manier 11,16,25, is dit de eerste keer, voor zover wij weten, dat deze methode is toegepast op spieren van knaagdieren. Bovendien heeft de kwantificering van LD's met behulp van een zelfontworpen macro voor Fiji de beeldanalysetijd aanzienlijk verkort en vereenvoudigd. Zowel de macro als een stapsgewijze uitleg over het gebruik ervan zijn respectievelijk beschikbaar als aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2.
Over het algemeen zijn de auteurs van mening dat het hierin beschreven protocol een nuttig hulpmiddel kan zijn voor andere onderzoekers die het lipidenmetabolisme in de skeletspieren bestuderen. De uitgelegde technieken kunnen worden toegepast op verschillende spieren en onder verschillende omstandigheden (nuchter / overvoed, getraind / sedentair, jong / oud, mager / zwaarlijvig) en zullen hopelijk helpen om de dynamiek van LDs beter te begrijpen, het belang van hun interacties met andere componenten van de cel, hoe lipiden worden opgeslagen en gemetaboliseerd in glycolytische en oxidatieve vezels, en hun rol bij het ontstaan van insulineresistentie bij type 2 diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) en de Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. is de ontvanger van een Ph.D. fellowship van de FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. ontving een fellowship van het Wallonie-Bruxelles International Excellence Program.
De auteurs bedanken Alice Monnier voor haar bijdrage aan de ontwikkeling van dit protocol en Caroline Bouzin voor haar expertise en technische hulp bij het beeldverwervingsproces. We danken ook het 2IP-IREC beeldvormingsplatform voor de toegang tot de cryostaat en de microscopen (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Brussel, België). Tot slot willen de auteurs Nicolas Dubuisson, Romain Versele en Michel Abou-Samra bedanken voor de opbouwende kritiek op het manuscript. Sommige van de figuren van dit artikel zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AxioCam 506 mono 6 Mpix camera | Zeiss | ||
| AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera | Zeiss | ||
| Chemical hood | Potteau Labo | EN-14175 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM800 | |
| Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Cryo-Gloves | Tempshield | 16072252 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm Cryo Star HM 560 | |
| Dissecting Stereo Microscope SMZ745 | Nikon | ||
| Dry Ice | |||
| Dumont Forceps | F.S.T | 11295-10 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T | 14084-08 | |
| FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) | ThermoFisher | 22-363-552 | Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing |
| Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | BRAND Petri dish, MERK | BR455751 | Used to place the muscles on ice during dissection |
| ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen | Vector Labs | H-4000 | Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections |
| Incubator | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
| Microscope Cover Glasses (24x50 mm) | Assistent | 40990151 | |
| Microscope Slide Boxes | Kartell | 278 | Used as humid chambers for immunohistochemistry |
| Neck holder | Linie zwo | SB-035X-02 | Used as strap to hold the stainless steel tumbler |
| No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade | Swann-Morton | 0205 | |
| Paint brushes | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections |
| Permanent Marker Pen Black | Klinipath/VWR | 98307-R | Used to label slides |
| Pierce Fixation Forceps | F.S.T | 18155-13 | |
| Polystyrene Box | H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat | ||
| Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 | Aesculap | BB073R | |
| Stainless Steel Cup 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing |
| Superfrost Ultra Plus slides | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
| Surgical tweezers 1/2 teeth | Medische Vakhandel | 1303152 | Also called "Rat teeth tweezers" |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | F.S.T | 15000-00 | |
| Weighing boats | VWR international | 611-2249 | |
| Whole-Slide Scanner for Fluorescence | Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM | Abcam | ab175702 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher | A-21247 | Used at a final concentration of 1:500 |
| BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) | ThermoFisher | D3922 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) | ThermoFisher | D3835 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFisher | D1306 | Used at a final concentration of 0.5 µg/mL |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8418 | Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1004969011 | CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Isopentane GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. |
| Liquid Nitrogen | CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids. | ||
| Mouse on mouse Blocking Reagent | Vector Labs | MKB-2213-1 | Used at concentration of 1:30 |
| Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b | DSHB University of Iowa | BA-D5-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 | DSHB University of Iowa | SC-71-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | 6H1-supernatant | Used at a final concentration of 1:5 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Vector Labs | S-1000 | |
| PBS 0.1 M | Commonly used on histology laboratories | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) | Sigma-Aldrich | L0663 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | Confocal software | |
| BioRender | https://biorender.com/ | Used to design the figures | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | Used to analyse the acquired images | |
| Microsoft PowerPoint | Microsoft | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types | |
| Zen Blue 2.6 | Zeiss | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types |
References
- Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963 (2020).
- Miljkovic, I., et al. Greater skeletal muscle fat infiltration is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality in older men. Journals of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (9), 1133-1140 (2015).
- Nachit, M., et al. Myosteatosis rather than sarcopenia associates with non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease preclinical models. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 12 (1), 144-158 (2021).
- Aleixo, G. F. P., et al. Myosteatosis and prognosis in cancer: Systematic review and meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematolgoy. 145, 102839 (2020).
- Gemmink, A., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Exercising your fat (metabolism) into shape: a muscle-centred view. Diabetologia. 63 (8), 1453-1463 (2020).
- van Loon, L. J. Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 97 (4), 1170-1187 (2004).
- Coen, P. M., Goodpaster, B. H. Role of intramyocelluar lipids in human health. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23 (8), 391-398 (2012).
- Seibert, J. T., Najt, C. P., Heden, T. D., Mashek, D. G., Chow, L. S. Muscle lipid droplets: cellular signaling to exercise physiology and beyond. Trends in Endocrinology and Metabolism. 31 (12), 928-938 (2020).
- Bergman, B. C., Goodpaster, B. H. Exercise and muscle lipid content, composition, and localization: influence on muscle insulin sensitivity. Diabetes. 69 (5), 848-858 (2020).
- Nielsen, J., Christensen, A. E., Nellemann, B., Christensen, B. Lipid droplet size and location in human skeletal muscle fibers are associated with insulin sensitivity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 313 (6), 721-730 (2017).
- Covington, J. D., et al. Intramyocellular lipid droplet size rather than total lipid content is related to insulin sensitivity after 8 weeks of overfeeding. Obesity (Silver Spring). 25 (12), 2079-2087 (2017).
- Bosma, M. Lipid droplet dynamics in skeletal muscle). Experimental Cell Research. 340 (2), 180-186 (2016).
- Nielsen, J., et al. Increased subsarcolemmal lipids in type 2 diabetes: effect of training on localization of lipids, mitochondria, and glycogen in sedentary human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 298 (3), 706-713 (2010).
- Ferreira, R., et al. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria proteome differences disclose functional specializations in skeletal muscle. Proteomics. 10 (17), 3142-3154 (2010).
- Barrett, J. S., Whytock, K. L., Strauss, J. A., Wagenmakers, A. J. M., Shepherd, S. O. High intramuscular triglyceride turnover rates and the link to insulin sensitivity: influence of obesity, type 2 diabetes and physical activity. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism. , 1-14 (2022).
- Daemen, S., et al. Distinct lipid droplet characteristics and distribution unmask the apparent contradiction of the athlete's paradox. Molecular Metabolism. 17, 71-81 (2018).
- Bredella, M. A., Ghomi, R. H., Thomas, B. J., Miller, K. K., Torriani, M. Comparison of 3.0 T proton magnetic resonance spectroscopy short and long echo-time measures of intramyocellular lipids in obese and normal-weight women. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 32 (2), 388-393 (2010).
- Schrauwen-Hinderling, V. B., Hesselink, M. K., Schrauwen, P., Kooi, M. E. Intramyocellular lipid content in human skeletal muscle. Obesity (Silver Spring). 14 (3), 357-367 (2006).
- De Bock, K., et al. Evaluation of intramyocellular lipid breakdown during exercise by biochemical assay, NMR spectroscopy, and Oil Red O staining. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (1), 428-434 (2007).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochemistry and Cell Biology. 116 (1), 63-68 (2001).
- Gueugneau, M., et al. Skeletal muscle lipid content and oxidative activity in relation to muscle fiber type in aging and metabolic syndrome. Journal of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (5), 566-576 (2015).
- Gemmink, A., et al. Super-resolution microscopy localizes perilipin 5 at lipid droplet-mitochondria interaction sites and at lipid droplets juxtaposing to perilipin 2. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (11), 1423-1432 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 598358, (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), 77774 (2013).
- Strauss, J. A., Shepherd, D. A., Macey, M., Jevons, E. F. P., Shepherd, S. O. Divergence exists in the subcellular distribution of intramuscular triglyceride in human skeletal muscle dependent on the choice of lipid dye. Histochemistry and Cell Biology. 154 (4), 369-382 (2020).
- Shepherd, S. O., et al. Sprint interval and traditional endurance training increase net intramuscular triglyceride breakdown and expression of perilipin 2 and 5. Journal of Physiology. 591 (3), 657-675 (2013).
- Whytock, K. L., et al. A 7-day high-fat, high-calorie diet induces fibre-specific increases in intramuscular triglyceride and perilipin protein expression in human skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (6), 1151-1167 (2020).
- Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using h&e staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), (2017).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51586 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52793 (2015).
- Leiva-Cepas, F., et al. Laboratory methodology for the histological study of skeletal muscle. Archivos de Medicina del Deporte. 35 (186), 254-262 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 10 (3), 197-205 (1989).
- Komiya, Y., et al. Mouse soleus (slow) muscle shows greater intramyocellular lipid droplet accumulation than EDL (fast) muscle: fiber type-specific analysis. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 38 (2), 163-173 (2017).
- Andrich, D. E., et al. Altered lipid metabolism impairs skeletal muscle force in young rats submitted to a short-term high-fat diet. Frontiers in Physiology. 9, 1327 (2018).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiologica. 199 (4), 451-463 (2010).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Gemmink, A., et al. Decoration of intramyocellular lipid droplets with PLIN5 modulates fasting-induced insulin resistance and lipotoxicity in humans. Diabetologia. 59 (5), 1040-1048 (2016).
- Askinas, C., et al. Biophotonics Congress: Biomedical Optics Congress 2018 (Microscopy/Translational/Brain/OTS). , JTu3A.4 (Optical Society of America) (2018).
- Morén, B., et al. EHD2 regulates adipocyte function and is enriched at cell surface-associated lipid droplets in primary human adipocytes. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1147-1159 (2019).
- Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
- de la Rosa Rodriguez, M. A., et al. Hypoxia-inducible lipid droplet-associated induces DGAT1 and promotes lipid storage in hepatocytes. Molecular Metabolism. 47, 101168 (2021).
- Jevons, E. F. P., Gejl, K. D., Strauss, J. A., Ørtenblad, N., Shepherd, S. O. Skeletal muscle lipid droplets are resynthesized before being coated with perilipin proteins following prolonged exercise in elite male triathletes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 318 (3), 357-370 (2020).
- Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochemistry and Cell Biology. 124 (5), 445-452 (2005).
- Prats, C., et al. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine. Journal of Lipid Research. 47 (11), 2392-2399 (2006).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24 (Unit 24.22) (2007).
- Xue, Y., Lim, S., Bråkenhielm, E., Cao, Y. Adipose angiogenesis: quantitative methods to study microvessel growth, regression and remodeling in vivo. Nature Protocols. 5 (5), 912-920 (2010).
- Muliyil, S., et al. ADAM17-triggered TNF signalling protects the ageing Drosophila retina from lipid droplet-mediated degeneration. The EMBO Journal. 39 (17), 104415 (2020).
- Yan, Q., et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis. Cell Death Discovery. 4, 2 (2018).
- Coassin, S., et al. Investigation and functional characterization of rare genetic variants in the adipose triglyceride lipase in a large healthy working population. PLoS Genetics. 6 (12), 1001239 (2010).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Chen, Q., et al. Rab8a deficiency in skeletal muscle causes hyperlipidemia and hepatosteatosis by impairing muscle lipid uptake and storage. Diabetes. 66 (9), 2387-2399 (2017).
- Gemmink, A., et al. Decoration of myocellular lipid droplets with perilipins as a marker for in vivo lipid droplet dynamics: A super-resolution microscopy study in trained athletes and insulin resistant individuals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (2), 158852 (2021).
- Bergman, B. C., Hunerdosse, D. M., Kerege, A., Playdon, M. C., Perreault, L. Localisation and composition of skeletal muscle diacylglycerol predicts insulin resistance in humans. Diabetologia. 55 (4), 1140-1150 (2012).
