Summary
越来越多的证据表明，脂质在骨骼肌内的过度浸润会导致脂毒性和糖尿病。在这里，我们提出了一个完整的方案，包括组织处理，使用Bodypy染色，图像采集和分析，以纤维型特定方式量化脂质液滴的大小，密度和亚细胞分布。
Abstract
骨骼肌脂质浸润，称为肌质变性，随着肥胖和衰老而增加。肌层沉积症最近也被发现是心血管疾病和癌症等其他几种疾病的阴性预后因素。过量的脂质浸润会降低肌肉质量和力量。它还会导致脂毒性和胰岛素抵抗，这取决于总肌细胞内脂质含量，脂质液滴（LD）形态和亚细胞分布。纤维类型（氧化性与糖酵解）也很重要，因为氧化纤维具有更大的利用脂质的能力。由于它们在病理生理学中的重要意义，有必要以纤维类型特异性方式对LD动力学和功能进行深入研究。
本文提出了一个完整的方案，用于以纤维类型特异性方式定量肌细胞内脂质含量并分析LD形态和亚细胞分布。为此，用荧光染料Bodypy和针对肌球蛋白重链亚型的抗体染色连续肌肉冷冻切片。该协议可以同时处理不同的肌肉，节省时间并避免可能的伪影，并且由于在斐济创建的个性化宏，LD分析的自动化也是可能的。
Introduction
骨骼肌脂质浸润，称为肌质变性，随着肥胖和衰老而增加。肌层沉积与肌肉质量和力量以及胰岛素敏感性1呈负相关。此外，最近的研究表明，肌层沉积的程度可用作其他疾病的预后因素，如心血管疾病2，非酒精性脂肪性肝病3或癌症4。脂质可以作为肌细胞外脂质积聚在肌肉纤维之间的骨骼肌中，也可以作为肌细胞内脂质（IMCLs）积聚在纤维内。IMCL主要作为甘油三酯储存在脂质飞沫（LD）中，在体育锻炼期间用作代谢燃料5，6。然而，当脂质供应超过需求时，或当线粒体变得功能失调时，IMCLs将与肌肉胰岛素抵抗有关，如代谢不健康的个体，肥胖的个体和2型糖尿病患者7所示。有趣的是，耐力运动员的IMCL水平与肥胖的2型糖尿病患者相似，如果不是更高，同时保持高胰岛素敏感性。这种现象被描述为“运动员悖论”8，9，并通过对肌肉LD的更细致入微的评估来解释，这些评估与它们的大小，密度，定位，动力学和脂质物种组成有关。
首先，LD大小与胰岛素敏感性和体能10，11成反比。事实上，较小的LD表现出相对较大的脂肪酶作用表面积，因此可能具有更大的动员脂质12的能力。其次，LD密度（数/表面）在胰岛素作用8，10中起着有争议的作用;然而，它似乎在运动员中有所增加。第三，LD的亚细胞定位很重要，因为位于表面膜（肌层下或外周）正下方的LD对胰岛素敏感性的危害性比中心膜8，9，13更有害。后者为中枢线粒体提供燃料，中枢线粒体具有更大的呼吸活动，并且更专门地满足收缩14所需的高能量需求。相比之下，外周LD提供肌肉下线粒体，其参与膜相关过程8。最后，除了甘油三酯之外，肌肉内的特定复杂脂质可能比其他脂质更有害。例如，当甘油三酯周转率低时，二酰基甘油，长链酰基辅酶A和神经酰胺可能积聚在肌肉中，从而损害胰岛素信号传导9，15。回到“运动员悖论”，耐力运动员有大量较小的中央LD，I型（氧化性）纤维的周转率较高，而肥胖和糖尿病患者具有较大的外周LD，II型（糖酵解）纤维的周转率低8，15，16。除了在能量储存和释放中的作用外， 通过 衍生脂肪酸（FA）和涂层蛋白（周蛋白5）的LD还可以作为参与FA氧化和线粒体生物发生的转录调节的关键参与者8。由于它们在生理学和病理生理学中的关键意义，因此有必要对LD的动力学和功能进行深入研究。
虽然有几种技术可以研究IMCL，但它们并不适合以纤维特异性方式准确量化LD尺寸，密度和分布。例如，通过磁共振波谱对IMCL的评估虽然是非侵入性的，但提供的分辨率水平不足以研究光纤中LD的大小和精确位置，并且它不是光纤类型特异性的17，18。同样，在全肌肉匀浆19上进行的生化技术不能评估脂质的位置和大小。因此，分析LD形态和位置的最适当方法是定量透射电子显微镜13，但这种技术昂贵且耗时。因此，与油红O（ORO）20，21，单单苯基戊烷（MDH）22或Bodypy 23，24，25等染料制剂的共聚焦荧光成像已成为这些研究的最佳工具。
这里描述了一个完整的方案，包括组织采样和处理，Bodipy染色以及共聚焦图像采集和分析，以量化小鼠肌肉冷冻切片中的LD大小，数量和定位。由于IMCL在氧化纤维和糖酵解纤维之间分布不均匀，并且每种纤维类型调节LD动力学不同，因此IMCL的研究必须是纤维型特异性的16，25，26，27。因此，该方案在连续切片上使用免疫荧光来鉴定每根纤维表达的肌球蛋白重链（MyHC）亚型。该协议的另一个优点是在冷冻前同时处理糖酵解（长指伸肌，EDL）和并排放置的氧化（比目鱼）肌肉（图1）。这种同步处理不仅节省了时间，而且避免了由于样品的单独处理而导致的可变性。
图 1：该过程的示意图。 肌肉解剖（1）后，准备相似大小的选定肌肉并一起冷冻（2）。使用低温恒温器获得10μm的连续横截面，并直接安装在粘附载玻片上（3）。从两张连续载玻片中，第一张（4A）被免疫标记为层粘连蛋白，并用Bodyy染色以识别LD，第二张（4B）用针对MyHC的抗体进行免疫染色，以识别肌肉纤维类型。使用共聚焦显微镜（5A）和肌肉纤维类型（5B）的落射荧光显微镜获取图像。在斐济，通过应用阈值并量化颗粒（6A）来分析图像，以获得LD（7）或计数细胞（6B）所占据的总面积的数量，平均尺寸，密度和百分比，以获得该部分（7）中每种类型纤维的百分比。缩写：LD =脂质液滴;EDL = 长指伸肌;肌HCs=肌球蛋白重链亚型。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
对小鼠进行的所有程序均由鲁汶天主教大学医学部动物实验伦理委员会批准（2019 / UCL / MD / 013）。
1. 解剖和制备冷冻样品
- 为每对肌肉贴上3毫米厚的软木塞标签。
- 通过用软木塞中心的刀片制成的小切口，垂直插入一块矩形的硬质塑料（0.5厘米宽，1厘米高），该矩形块将用作支撑（图2B）。
注意：矩形塑料块的大小取决于肌肉的大小。在这里，所描述的尺寸适用于3个月大的C57BL / 6J雄性小鼠的太阳（约9毫克，1厘米L，2-3毫米宽）和EDL（约5毫克，1厘米长，2-3毫米宽）的大小。 - 在解剖时，取出小鼠后肢的比目鱼和EDL。为了防止样品在解剖过程中变干，请将其放在放在冰上的培养皿中用盐水溶液略微润湿的压缩物上。
注：参见Wang等人28 ，了解如何解剖这两块肢体肌肉。 - 在软木/塑料接头处放置一小滴最佳切削温度化合物（OCT），避免气泡。
- 用纸巾轻轻擦干样品中多余的水分（图2A），并将两块肌肉分别放在垂直于软木塞的塑料上（图2C）。
- 在立体显微镜下检查肌肉肌纤维的方向（图2D）。
注意：重要的是不要用OCT覆盖肌肉，因为它的绝缘效果可以防止快速冻结并产生冻结伪影。
2. 冷冻骨骼肌样本用于冷冻切片
注意：肌肉冻结必须在化学罩下进行，并穿着适当的个人防护装备（参见 材料表）。
- 使用不锈钢不倒翁（约8厘米高，6厘米直径），并附着两条至少25厘米长的侧带（图2F），并用异戊烷填充不超过其容量的2/3。
- 抓住不倒翁的带子，将其轻轻浸入装有液氮的聚苯乙烯盒中，使容器外的氮气水平高于内部异戊烷的水平（图2F，G）。
注意：当不倒翁与氮气接触时，热冲击可能会导致旋转。确保不倒翁充分浸入，但避免氮气进入，因为这会导致异戊烷沉淀。如果发生这种情况，让异戊烷冷却下来，用新的异戊烷填充不倒翁并重新开始。 - 当不倒翁的内部完全覆盖有白色固体异戊烷层时，将其从液氮箱中取出（图2H）。
注意：异戊烷的熔化温度为-159°C，当足够冷时，不倒翁的边缘会变白。 - 用镊子轻轻搅拌固体异戊烷块到剩余的液体异戊烷中，直到整个体积再次变成液体。
- 将不倒翁重新浸入液氮中，直到异戊烷在滚筒的底部和边缘形成白色鹅卵石（图2G，H）。
注意：第二个冷却步骤可确保异戊烷的适当冷冻温度。 - 从液氮中取出不倒翁，并快速将肌肉浸入不倒翁的底部，用大鼠牙镊子握住软木塞。将软木塞在异戊烷中旋转15秒，并将其储存在-80°C直至加工（图2I）。
注意：对于短期储存，样品可以保存在-20°C的冰箱中。骨骼肌快速冷冻的完整方案已经在其他地方发表。有关详细参考和故障排除，请参见：Meng 等人 29、Kumar 等人 30 和莱瓦-塞帕斯等人 31。
3. 冷冻切片
- 将样品放入先前冷却至-20°C的低温恒温器的腔室中，并将叶片温度设置为-25°C。
注意：将样品从-20°C/-80°C冰箱输送到装有干冰的聚苯乙烯盒中的低温恒温器，并允许样品在切割前平衡至少20-30分钟至腔室温度。 - 用细镊子从软木塞中取出塑料，并将低温恒温器试盘放在快速冷冻板上冷却。一旦盘子达到-50°C，在圆盘上放置一些OCT，然后快速将软木塞放在圆盘顶部，用力按压。等到OCT凝固并且软木塞很好地固定在圆盘上。
- 将椎间盘以所需的切割方向（图2J，K）放置在物体头上，并将肌肉块修剪到至少肌肉长度的1/3以上，直到肌肉的两个横截面都可见。
- 将切割厚度设置为10μm，并将一个部分放在附着力载玻片上，以检查明场显微镜上纤维的正确方向。
注：检查光纤的横向方向至关重要。如果纤维没有充分定向，请调整物体头部的角度，切割另一部分并再次检查。 - 在两个预标记的粘附载玻片上放置两个连续横截面：一个载玻片用于确定纤维类型，另一个用于量化脂质含量（图2L）。
注意：可以获得额外的连续横截面，并将其保持在-80°C用于其他组织学研究。然而，为了避免改变脂质含量和细胞内形态24，必须在切割后立即处理前两张载玻片以防止风干。冷冻和解冻载玻片以进行LD定量将具有相同的效果，因此非常不明智。
4. 纤维分型和机身染色
- 肌肉纤维型的免疫组化检测
注意：对于以下方案，250μL的总溶液体积足以覆盖整个肌肉部分，周围是用疏水笔绘制的圆圈，其大小约为1美分硬币。- 用疏水笔绘制的轮廓包围切片，并在室温（RT）下用冰冷的0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗1分钟。将载玻片置于潮湿的腔室中，并在37°C下在封闭溶液中封闭90分钟（PBS中10%正常山羊血清（NGS）和1：30小鼠对小鼠（MOM）封闭试剂）。
- 取出封闭溶液，并将载玻片在37°C下与含有一抗（5%NGS，1：30 MOM阻断试剂，小鼠一抗识别I型（IgG2b，1：10），IIa型（IgG1，1：10）和IIx型（IgM，1：5）纤维和大鼠抗层粘连蛋白（α2链） 的溶液一起孵育90分钟 1：1，000） 在 PBS 中。
- 用PBS在室温下洗涤载玻片3×5分钟。
- 在室温下，将载玻片与含有二抗（山羊抗IgG2b AF405（1：500），山羊抗IgG1 AF488（1：500），山羊抗IgM AF568（1：1，000）和PBS中的山羊抗层粘连蛋白AF647（1：500））的溶液在黑暗中孵育1小时。
注意：对于实验方案的其余部分，请确保使载玻片远离光线以保持荧光。 - 在PBS中再次洗涤3×5分钟，在双蒸馏H2O中冲洗，除去多余的水，然后用抗淬灭试剂安装。
注意：将载玻片储存在4°C，避光以保持荧光，直到图像采集。由于载玻片不是固定的，因此建议每次实验使用新鲜制成的溶液，高压灭菌PBS，并尽快获取图像以避免切片污染。
- 用肉体染色LD
注意：与步骤4.1.类似，250μL的总溶液体积足以覆盖整个肌肉部分，周围是用疏水笔画成的圆圈，该圆圈的大小约为1美分硬币。- 用疏水笔绘制的轮廓包围部分，并在室温下用冰冷的0.1 M PBS冲洗10分钟。
- 在室温下用冷的4%多聚甲醛（PFA）在无甲醇的情况下固定10分钟。第一次快速冲洗后，用PBS在室温下洗涤载玻片3 x 5分钟。
注意：在化学罩下执行此步骤。 - 将载玻片置于潮湿的腔室中，并在室温下用PBS中的5%NGS阻断1小时。
- 将载玻片在37°C下与一抗溶液（2%NGS和大鼠抗层粘连蛋白（α2链，1：1，000）在PBS中孵育90分钟。用PBS在室温下洗涤载玻片3×5分钟。
注意：对于实验方案的其余部分，请确保使载玻片远离光线以保持荧光。 - 在PBS中与含有山羊抗大鼠AF647抗体（1：500）的二抗溶液在室温下孵育1小时。用PBS在室温下洗涤载玻片3×5分钟。
- 在室温下用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，0.5微克/毫升）和BODPY（1微克/毫升）在PBS中的溶液孵育20分钟。
注意：要制备BODY储备溶液，请将其溶解在DMSO中，浓度为1mg / mL。市场上有用于LD染色的不同Body配方。根据所做的选择，染色方法是相同的（相同的步骤，浓度和孵育时间）;但是，采集方法会略有不同。 - 第一次快速冲洗后，用PBS在室温下洗涤载玻片3×5分钟，在双蒸馏H2O中冲洗，除去多余的水，然后用抗淬灭试剂安装。
注意：将载玻片储存在4°C，避光，以保持荧光直至图像采集。
5. 图像采集
注意：染色方案完成后，重要的是立即进行图像采集（在接下来的24小时内），不仅要避免污染，还要保持LD的形态，大小和数量。
- 采集图像以评估采样的每块肌肉的纤维类型
注意：此步骤可以使用全玻片荧光扫描显微镜或传统的落射荧光显微镜来实现。对于后者，必须手动或自动拼接图像以重建该部分。- 对于光纤型识别，请使用具有10x / 0.3物镜的落射荧光显微镜。为 DAPI （405 nm）、菲特克、TRITC 和 Cy5 选择激发滤光片，分别检测 I 型、IIa 型、IIx 纤维和层粘连蛋白。
注意：IIb型纤维不会被免疫标记。它们将被识别为在带有黑色肌质的肌层上被层粘连蛋白染色的纤维。 - 调整每个通道的适当曝光时间。
- 使用传统的落射荧光显微镜时，始终按照相同的顺序获取整个肌肉的图像，以促进肌肉重建。确保一个图像右边缘的光纤也出现在下图的左边缘。这同样适用于图像的顶部和底部（图3A）。
注意：作为参考，对于EDL的一部分或从3个月大的小鼠身上解剖的比目鱼，平均分别有6张和8张图像将覆盖整个肌肉横截面。 - 扫描肌肉后，根据纤维形态（层粘连蛋白）和肌肉部分的组织学，将捕获的数字图像上传到任何图像处理软件中进行重建（拼接），并将其另存为TIFF，PNG或JPG文件，其中所有通道（颜色）合并（图3A）。
- 对于光纤型识别，请使用具有10x / 0.3物镜的落射荧光显微镜。为 DAPI （405 nm）、菲特克、TRITC 和 Cy5 选择激发滤光片，分别检测 I 型、IIa 型、IIx 纤维和层粘连蛋白。
- 采集具有层粘连蛋白和Body共染色的图像
注意：为了识别纤维类型并估计捕获的每种类型的纤维数量，在开始Bodypy-层粘连蛋白的图像采集之前，必须已经扫描了纤维类型切片并重建了肌肉（图3B）。- 对于Bodyy图像观察和采集，请使用带有40x油浸式物镜的共聚焦显微镜，数值孔径为1.4。
- 使用以下设置：1 AU 的针孔、2，048 像素 x 2，048 像素分辨率、0.08 μm 的像素大小、单向模式、4（~4 μs/像素）的扫描速度、线平均数设置为 4 倍和数字变焦设置为 1。
- 为避免Bodyy-558/568和层粘连蛋白-AF647之间的串扰，请使用共聚焦软件上的顺序扫描模式。
注意：当选择的染料为Bodypy-493/503时，可以同时进行共聚焦激光扫描，Bodipy通道和层粘连蛋白-AF647通道之间没有串扰。这将加快图像的采集速度。 - 使用 488 nm 激光线或氩激光线激发 Bodipy-493/503，并使用 561 nm 二极管激光线激发 Bodipy-555/568。最后，使用640nm二极管激光线检测层粘连蛋白-AF647。
注意：请记住，Bodipy分子对光漂白非常敏感，因此请避免不必要的激光扫描。要识别光纤，请仅使用激光进行层粘连蛋白。 - 根据所选染料，将Bodypy-493/50324 的发射范围设置为570-650 nm，将Bodypy-558/568的发射范围设置为565-620 nm。将层粘连蛋白的发射范围设置为656-700 nm。
- 适当地设置增益和数字增益，以便在量程指示器上不检测到饱和像素。通过调整偏移来校正背景信号。
注意：滤光片选择和其他上述扫描参数必须针对每个共聚焦显微镜进行优化。重要的是，对于要比较的样品中捕获的所有图像，上述所有设置均保持不变。 - 为了在共聚焦显微镜上可视化的纤维中识别纤维的类型，请使用个人笔记本电脑，在该笔记本电脑上检查纤维型免疫检测后重建的部分的图像（图3B）。
- 一旦正确识别了一组纤维，就使用Bodypy和层粘连蛋白通道获取图像。
注意：建议在为MyHC识别而获取的图像上，在这些纤维所在的肌肉区域上注明Bodypy-层粘连蛋白图像名称，以便于以后对LD进行纤维特异性分析。
6. 图像分析
- 分析每个肌肉样本上的纤维类型
- 在斐济（或ImageJ）32中，打开TIFF，PNG或JPG文件，其中包含从用于检测纤维亚型的所有通道的合并中获得的重建肌肉。
- 要启动 细胞计数 工具，请单击 插件|分析|细胞计数器|细胞计数器。
- 在 单元格计数器 窗口中，单击 操作|初始化。
- 在同一窗口中的“ 计数器 ”下，选择“ 类型 1”。
- 在斐济主窗口中，选择 魔杖 工具。
- 要量化每种类型的光纤数量，请单击相同类型的每根光纤，以便程序记录单击的光纤数量。
- 完成后，选择下一种类型的光纤并重复相同的步骤。
- 当图像的所有纤维都已分配给给定的纤维类型时，单击细胞计数器窗口中的“结果”以在表格中显示结果。
- 通过单击“文件”将此表另存为电子表格|在结果 窗口中另存为。
- 通过分别单击“细胞计数”窗口中的“保存标记”或“加载标记”，随时保存并重新加载同一图像上的选择。
- 以纤维型依赖性方式分析脂质液滴
- 分析使用斐济在共聚焦上获得的Bodypy和层粘连蛋白的图像，以量化LD。
注意：作者设计了一个自定义宏来自动执行分析。此宏以及有关如何使用它的分步说明分别以 补充文件 1 和 补充文件 2 的形式提供。 - 在斐济 的生物格式导入器 的帮助下打开每个图像。在“ 查看堆栈依据 ”选项下，选择“ 超堆栈|颜色模式，默认。确保已选中“ 自动缩放 ”窗口。
注意：以下步骤将描述用于分析图像上一根光纤的协议，但必须重复该方法的次数与图像上出现的整根光纤的数量一样多。 - 使用 手绘选择 工具根据层粘连蛋白通道手动选择光纤的肌层（图4A），然后按键盘上的T在 ROI 窗口中记录选择或感兴趣区域（ROI）。
- 转到斐济的主窗口，然后单击“分析|设置测量值，然后在弹出窗口中选择面积和 Feret 的直径。将其余框保留为未选中状态，而其他参数则保持其默认显示状态。
- 单击ROI窗口中的“测量”，获取所选光纤的面积和最小费雷特直径（MF），并记下它们以供以后使用。
注意：在分析LD时，重要的是要记住它们的尺寸和密度在纤维的中心和外围（肌肉下区域-SS）之间变化。因此，分析必须单独进行。 - 计算MF的1/6值以限定光纤的中心部分。
注意：在宏中，默认 MF 值设置为 6，这意味着应用的缩减将设置为 MF 的 1/6。该值是根据从喂食高脂肪饮食的动物的实体中获得的经验数据选择的。然而，每个研究人员都必须根据经验数据和分析的肌肉，纤维类型和动物状况来改变这个数字。 - 在 ROI 窗口中，单击 添加 以复制第一个 ROI，然后选择窗口上显示的第二个 ROI。
- 在斐济的主窗口中，单击 “编辑|选择|放大并介绍先前计算的值（从步骤 6.2.6 开始），并在数字前加一个减号，然后单击 “确定”。在 ROI 窗口中，单击 添加[t] （必须显示第三个 ROI）和 “删除”，以删除第二个 ROI。
注意：研究人员可以通过单击ROI窗口中的“全部显示”框来检查结果。此时，必须出现两个ROI，一个围绕光纤的整个周长（图4B），另一个放置在中心（图4C）。 - 在 ROI 窗口中选择两个 ROI ，然后单击“ 更多|异或|添加[t]。等待第三个ROI出现，对应于光纤的外围（图4D）。
- 通过单击“更多|保存 ROI 保存 以节省ROI，以防以后需要对相同的纤维进行重新分析。
- 选择 Bodpy通道 ，然后单击图像|打开 阈值 工具 调整| 斐济 主 窗口的门槛。
- 在 “阈值” 弹出窗口中，将值设置为 70/255，选择“ 日元|B&W方法，然后单击“ 深色背景|应用。
注意：阈 值 上应用的值可能因实验条件而异，必须适当设置阈值以优化分析。必须出现一个B&W窗口，其中Body信号高于白色显示的阈值限制，并且必须以黑色显示背景（将 图4E 中的原始Bodpy图像与 图4F中的原始Bodpy图像进行比较）。 - 转到斐济 的主 窗口，然后单击 “分析|设置测量值，然后在弹出窗口中，选择面积 、面积分数 和 阈值限制。将其余框保留为未选中状态，而其他参数则保持其默认显示状态。
注意：如果研究人员想要分析 LD 的“圆度”（LD）的“圆度”（球形形态的索引，范围从完美球体为 1 到直线的 0），请单击“设置度量值”弹出窗口的“形状描述符”框。 - 转到 ROI 窗口，然后选择第一个 ROI。在斐济 的主 窗口中，单击“ 分析|分析粒子工具。
注意：此工具量化每个选区上粒子覆盖的总面积的数量、大小、覆盖面积和百分比，并将结果另存为电子表格文件。 - 在“分析粒子”窗口中将值从 2 设置为无穷大（2-无穷大），选中“像素”框，保留默认圆度值，选择“汇总”，然后单击“确定”。
注：要检查光纤上的结果，请在“显示”选项下，选择任何可用选项。要在表格中的选定内容上识别每个 LD 的信息，请选中“分析粒子”窗口中的“显示结果”选项。对纤维总面积的分析结果被平均并总结在一个表格中，该表格中有几列（计数，总面积，平均尺寸，%面积;这些对应于颗粒数量[LD]，这些颗粒占用的面积，它们的平均尺寸以及颗粒所占据的选择总面积的百分比， 分别）。要计算密度，请将粒子数除以每个选择的总面积。 - 要获取光纤的中心和外围的值，请重复步骤 6.2.14 和 6.2.15，每次选择第二个（中心）和第三个 ROI（外围）。
- 通过单击“文件|保存结果在“摘要”窗口中另存为。
注意：在结果的指定名称上包括光纤类型、状况和图像名称，以便日后对数据进行统一和统计分析。要分析同一图像中的其余光纤，请重复步骤6.2.3至6.2.17。对于统计分析，每只动物必须分析每种类型的至少10-15根纤维。
- 分析使用斐济在共聚焦上获得的Bodypy和层粘连蛋白的图像，以量化LD。
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Representative Results
本文中描述的方案提供了一种以纤维类型和亚细胞特异性方式容易地量化LD的有效方法。它展示了如何将两块大小相似的肌肉（如EDL和比目鱼）冻结在一起，将以下步骤所花费的时间和资源减少一半。
为免疫染色、图像采集和分析成年小鼠肌肉中表达的不同MyHC亚型提供了完整的方案。该协议基于Schiaffino等人于1989年首次设计的方案3 3，并进行了一些调整，例如使用额外的抗体来标记层粘连蛋白。这种后来的修饰对于IIb型纤维的位置至关重要，IIb型纤维将是黑色的，因为它们没有用任何抗体染色。如图5所示，该免疫组织化学方案不仅允许识别小鼠慢氧化（I型和IIa型）和快速糖酵解（IIx型和IIb型）纤维，而且还允许存在杂化纤维（见图5D中的星号）。此外，在同一张幻灯片上具有两种肌肉的横截面可以比较两种所选肌肉之间每种纤维类型的比例，从而确保两个部分的实验条件相同。
对于LD标记，这里给出的结果是基于使用Bodypy-558 / 568 C12 作为脂质染料;然而，读者被推荐到一篇优秀的实验方案论文，详细介绍了经典染料Bodypy-493/503在肌肉部分23上的使用。该方案结合了基于对α2-层粘连蛋白的免疫组化对LD的染色，以区分纤维肉瘤。与纤维型实验一样，此步骤至关重要，不仅对于识别单个纤维，而且对于随后分析纤维中心和外围区域的脂质也是必不可少的（图4）。该协议的关键步骤之一是在两张载玻片上识别和标记相同的纤维。如前所述，重要的是用纤维类型扫描载玻片，并在获取LD图像之前用合并的颜色重建肌肉横截面（图3B）。每个肌肉部分的显着结构，如轴突树枝或肌肉纺锤体，都是很好的里程碑，可以帮助研究人员在两张幻灯片上找到相同的纤维（图6）。请记住，由于载玻片是倒置放置在大多数共聚焦显微镜上，因此建议在个人计算机上反转光纤型重建图像，以方便定位任务。
通过共聚焦显微镜获取Bodypy-层粘连蛋白染色的设置允许同时对三到六根纤维的LD的大小，数量和分布进行可视化和后期分析（图6 和 图7）。这里还提供了使用图像分析软件斐济分析LD的详细分步协议。如协议所示，对图像上存在的每种光纤的完整分析是漫长而乏味的。但是，斐济的优势在于允许基于Java语言设计称为 宏的自定义程序。作者设计了一个宏，可以自动执行上述一系列单独的命令，这些命令自动在循环中运行，以便在几分钟内进行分析 - 不仅包括图像上存在的每根光纤，还包括大量图像。研究人员的唯一输入是每次手动选择要分析的纤维的周长，选择纤维类型，以及在应用阈值并量化颗粒后对所得图像进行目视检查。
在这里，以位置相关的方式实现LD的分析。通过先前测量光纤的面积和MF直径，施加尺寸依赖性（Strauss等人描述的非固定）还原以获得每根光纤的中心和外围区域（图4 和 图7）。如图 7的直方图所示，该方法允许量化三个重要参数：LD占用的光纤面积的百分比（图7E），LD的密度 - 每μm2 的LD数量（图7F）和LD的平均尺寸（图7G）。结果，在3个月大的小鼠（N = 5），IIa型（绿色轮廓）和IIx型（红色轮廓）纤维呈现出LD在外围占用的最大比例的面积（图7E）。关于颗粒的密度，EDL纤维始终比比苏氏纤维表现出更高的密度，这与亚细胞位置无关（图7F）。最后，这些LD的平均尺寸在外围总是大于在中心（图7G）。
其他小组用于评估啮齿动物骨骼肌34，35 中LD积累的不同方法使得很难将这些结果与先前研究的结果进行比较。然而，根据小宫等人的结果，在太阳辐射IIa型和EDL型IIx光纤中，LD占用的纤维面积百分比更高。最重要的是，IIb型光纤呈现出LD占用面积的最低百分比（图7E，灰色直方图）。由于纤维IIb型是EDL最主要的纤维类型（75%， 图5E），这些结果证实了其他组先前描述的内容：EDL中脂质的总积累低于比目鱼34，35。
与人类25中描述的相反，也与Komiya等人34的结果一致，这里介绍的结果表明，LD在I型纤维中LD的积累相对较低。这可以通过小鼠和人类36之间的纤维型种间差异来解释，因为人类I型纤维的代谢特性与啮齿动物IIa型和IIx的代谢特性更相似，而人类IIx型纤维的代谢特性接近啮齿动物IIb37。总之，这里描述的不同技术提供了一种可重复的，可靠的和省时的方法，以纤维类型依赖性的方式研究和比较与LD及其在细胞内的分布相关的几个参数。
次优实验
如果冷冻过程不正确，并且异戊烷温度不正确，则会在纤维内部形成 冰晶 （图8A）。这些冷冻伪影只有在样品的组织学制备后才能检测到，并且可以识别为纤维上的孔。为了正确量化LD，必须避免这些伪影。已经证明，适当地解冻和重新冻结肌肉块可以显着减少这些伪影29。
当 纤维不垂直于纵轴切割时， 会遇到另一个问题（图8B）。当切片不是横向时，纤维，肌肉或动物之间的LD定量和比较不能进行。因此，在冷冻前借助立体显微镜将肌肉正确放置在软木塞上至关重要，并且将明场显微镜靠近低温恒温器。后者将使研究人员能够在低温恒温器上找到样品的正确对齐。
在极少数情况下， MyHC亚型的标记 在一种或多种纤维类型上非常弱（图8C）。如果发生这种情况，对LD的分析将是不完整的。在这种情况下，必须从切割肌肉开始重复实验。最后， Bodipy可以积聚在肌肉横截面的外围 （图8D）。如果发生这种情况，这些纤维上的染色将非常强烈，从而产生人工结果。避免从这些光纤采集图像。
（A-D）解剖小鼠的太阳和EDL肌肉，并将其放在由硬塑料和一滴OCT（E-G）软木塞上，不锈钢滚筒充满异戊烷并在液氮中冷却至其熔化温度。（H，I）将装有冷异戊烷的不倒翁从液氮中取出，将样品浸入不倒翁底部，旋转15秒（J-L）将带有样品的软木塞放置在没有塑料支撑的低温恒温器支架盘上，并将10μm的连续横截面直接安装在粘附载玻片上。立即处理两个相邻的串行横截面，用于LD的染色和MyHC的检测。缩写：LD =脂质液滴;EDL = 长指伸肌;肌HCs=肌球蛋白重链亚型;OCT = 最佳切割温度。请点击此处查看此图的大图。
图3：从另一台计算机上看到的重建复合图像中识别纤维类型后，Bodipy图像采集。 （A）从使用图像处理软件拼接在一起的七个独立的合并图像（虚线矩形）重建针对纤维类型（MyHC）进行免疫标记的整个比目鱼部分。白色箭头和数字表示使用传统落射荧光显微镜获取图像期间遵循的顺序。（B）对于Bodyy图像采集，（1）在连接到共聚焦显微镜的计算机屏幕上可视化包含用层粘连蛋白-AF647和Bodyy-555 /568免疫染色的肌肉切片的场。（2）这些纤维位于肌肉部分的重建图像上，经过免疫染色以检测纤维（MyHC）的类型。（3）使用共聚焦显微镜获取图像。缩写：LD =脂质液滴;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚;肌HCs=肌球蛋白重链亚型。 请点击此处查看此图的大图。
图4：用斐济分析脂质液滴 （A，B）根据层粘连蛋白图像识别纤维的肌层，并选择作为ROI。测量总面积和MF。（C）为了识别光纤的中心部分，选择减少了MF值的1/6。（D） 将中心选区和全部选区之间的区域设置为外围或肌肉以下区域。（E）对于用Bodypy染色的LD的分析，应用阈值，（F）并使用 分析颗粒 工具量化与LD相关的不同参数（见表）。这些值是针对完整纤维（全部）、中心部分（中心）和肌肉下区域（外围）独立获得的。比例尺 = 12 μm。缩写：LD =脂质液滴;投资回报率 = 感兴趣的区域;MF = 最小费雷特直径。 请点击此处查看此图的大图。
图5：EDL（糖酵解）和比目鱼（氧化性）小鼠肌肉中纤维类型的代表性免疫染色。 用数字全玻片荧光显微镜获得的EDL（A，B）和苏耳（C，D）的合并荧光图像。使用针对I型（蓝色-AF405）、IIa型（绿色-AF488）、IIx型（红色-AF568）和层粘连蛋白（白色-AF647）的抗体。黑色光纤对应于 IIb 型光纤。 B 和 D 分别显示面板 A 和 C的白色矩形内的纤维细节。图 D 中的星号 （*） 表示 IIa/IIx 混合光纤。（英，女）来自3个月大小鼠的EDL和比目鱼中纤维型分布的代表性定量（N = 5）。EDL主要由IIb型，然后是IIx型和IIa纤维（分别约75%，15%和5%）组成。相比之下，比目鱼主要由IIa型（>50%）和I型纤维（30%）组成。IIx型纤维的比例在两块肌肉中相当相似，而混合纤维的比例非常低。比例尺 = 200 微米 （A，C）， 100 微米 （B，D）。缩写：EDL = 长指伸肌。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：在先前对 MyHC 亚型进行免疫标记的连续横截面上，用 Bodipy 对 LD 进行代表性染色。荧光合并了使用落射荧光显微镜获得的小鼠EDL（A）和比目鱼（B）的图像，显示I型（蓝色），IIa（绿色），IIx（红色），IIb（黑色）纤维和层粘连蛋白（纤维周围的白色信号）。（中-楼）来自EDL（C，D）和比目鱼（E，F）的共聚焦荧光图像与层粘连蛋白（青色）和肉体（红色）共标记。请注意，C-F 中显示的光纤与面板 A 和 B 上白色矩形内的光纤相同。在 A 中白色矩形的右上角，可以区分轴突树枝（白色箭头）。比例尺 = 200 微米 （A，B），20 微米 （C-F）。缩写：LD =脂质液滴;EDL = 长指伸肌;肌HCs=肌球蛋白重链亚型。请点击此处查看此图的大图。
图 7：以纤维型和亚细胞特异性方式定量 LD。 在与Bodypy（红色）和α2-层粘连蛋白（未显示）共标记后获得的来自比目鱼（A，B）的I型和II型纤维以及来自EDL（C，D）的IIx型和IIb型纤维的代表性荧光共聚焦图像。LD含量（Bodipy和密度所占面积的百分比）和形态（大小）以亚细胞特异性方式进行分析。纤维周长由层粘连蛋白染色定义，中心或外围区域根据MF直径进行设置。每种光纤类型在中心或外围区域被主体 （LD） （E）、LD 密度（数/μm2）（F）或平均 LD 尺寸 （G） 占用的光纤面积百分比。结果表示为均值±SEM.比例尺= 10μm。缩写：LD =脂质液滴;EDL = 长指伸肌;C = 中心;P = 外设。 请点击此处查看此图的大图。
（A）为苏木精 - 曙红染色的肌肉横截面的明场图像，显示冻结过程中形成的冰晶。（B）对MyHC和层粘连蛋白免疫染色的比目鱼切片的荧光合并图像，表明大多数纤维沿纵轴切割。（C）对MYHC和层粘连蛋白免疫染色的EDL切片的荧光图像。IIa型纤维（绿色）的弱染色阻碍了每种纤维类型的正确定量。（D）共聚焦图像显示位于肌肉横截面外围的纤维上Bodyy（红色）的强烈伪影染色。比例尺 = 50 微米 （A，B）， 200 微米 （C，D）。缩写：EDL = 长指伸肌;肌HCs=肌球蛋白重链亚型。请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：在肌肉横截面上用油红O染色LD染色。 （一、二）共聚焦图像分别显示了在纯真和EDL中用油红O获得的染色模式。用于该染色的方案由Prats等人详细描述。请注意，LD在肌纤维的肌层下区域的积累较高，如前所述。比例尺 = 20 μm。缩写： LD = 脂质液滴;EDL = 长指伸肌。请按此下载此档案。
补充图S2：裸子肌中LD和线粒体的共染色。（A）共聚焦合并图像，显示Tomm20的免疫标记，Tomm20是一种存在于线粒体膜上的蛋白质（绿色），DAPI（蓝色）和Bodyy-558 / 568标记LD（红色）。A中的插图显示了几个与LD（红色）结合的线粒体（绿色）。该图像是通过应用艾瑞斯堪共聚焦超分辨率显微镜获得的。（乙、丙）LD和线粒体的相应单通道图像。比例尺 = 10 微米 （A-C），5 微米（A，插入）。缩写：LD =脂质液滴;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚。请按此下载此档案。
补充文件 1： 斐济宏，用于自动分析多个层粘连蛋白+体质图像上的LD。 请按此下载此档案。
补充文件 2： 有关如何使用宏 Bodipy_JoVE.ijm 的分步说明。 请按此下载此档案。
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Discussion
这里详细介绍的方案描述了一种在纤维类型和亚细胞特异性基础上量化用Body标记的LD的有效方法。近年来，经典的脂质染料，如ORO或苏丹黑B，已被一系列新的细胞渗透性亲脂性荧光染料取代，这些染料与中性脂质（例如Bodypy）结合。作为不同的偶联物，Bodipy已被证明在标记LD以研究其形态，动力学和与其他细胞器的相互作用方面非常有效，不仅在不同的固定组织和细胞23，38，39，40中，而且在活细胞41，42中也是如此。
在协议中，研究人员必须考虑几个关键方面才能获得最佳结果。必须将所选的肌肉正确放置在软木塞上，以确保肌肉肌纤维的完美对齐和方向，因为一旦冻结，只能在低温恒温器上对支架进行轻微的重新调整。此外，在切片切割后立即启动免疫染色方案至关重要，因为空气干燥冷冻切片（仅15分钟）对LD具有严重的不良影响，导致LD密度降低66%，平均尺寸减少37%24。同样，冷冻和解冻载玻片会产生不良影响，因此不建议这样做。该协议的第三个重要特征与样品的固定有关。为了用这里引用的抗体鉴定不同的MyHC亚型，必须避免组织固定，因为它会破坏所选抗体与其表位的结合。如果肌肉样本先前已固定，则读者将参考最近发表的一篇使用不同抗体43的论文。仅建议将不含甲醇的PFA用于LD的标记和定量，因为使用甲醇或丙酮会破坏LD23，44的形态。此外，用层粘连蛋白免疫标记的载玻片上LD的定量不需要透化步骤。由于一些小组已经表明，使用TritonX-100，皂苷或甘氨酸等洗涤剂渗透可以减少LD44，45的大小或数量，因此非常不鼓励渗透。最后，对共聚焦显微镜设置进行微调对于仅识别LD中存在的中性脂质而不是其他细胞器膜中的中性脂质至关重要24。
在这里，Bodipy-558/568 C12 被用作LD标记。然而，最常用于标记LD并研究其形态和在骨骼肌肌纤维内的位置的Bodypy是Body-493 / 503。这两种染料在孵育时间、工作浓度和窄发射光谱方面相似，尽管它们的激发和发射范围略有不同。有关使用Bodypy-493/503的完整协议，读者可以参考李斯滕伯格和布朗46 或斯潘根堡等人的作品。Bodipy-558/568 C12 已被用于染色其他组织中的LD，例如脂肪组织47，退化视网膜48，纤维化肾49或成纤维细胞50。该Bodypy产生与ORO获得的染色相似的染色（参见 补充图S1），但技术负担大大减轻，特异性更高24，51。此外，Bodipy-558/568 C12 的优点是能够结合检测用绿谱二抗标记的蛋白质或细胞器（参见 补充图S2 和Yan等人）或GFP转基因模型52来定量LD。这两个应用程序是非常强大的工具，可以解开LD与其他细胞器和蛋白质的动力学和相互作用。然而，当不打算在细胞内对蛋白质进行共标记时，作者建议使用最佳表征的LD染料Bodyy-493 / 503。
该协议的局限性之一与图像的获取和LD形态特征的定量有关。与宽视场显微镜相比，共聚焦激光扫描显微镜的技术进步大大提高了平面分辨率，并允许在Z平面扫描样品时对物体进行3D重建。这对于研究LD形态学24 和骨骼肌纤维38，53中与其他蛋白质的相互作用非常有用，但是增加了图像的获取和处理时间，因为每个3D重建的图像由几个独立的2D图像组成。在上述协议中，共聚焦图像是用40倍物镜拍摄的，并且仅在2D中。这种方法允许每张图像采集三到六个肌纤维，而不是像使用63x物镜时那样只采集一个肌纤维。这导致分辨率较低，并且对LD尺寸和形态的总体估计并不完全准确。然而，它允许分析每个样品的更多纤维，这也是一个需要考虑的重要事实，特别是在动物实验中，必须比较大量的肌肉和条件。
这里表明，通过冷冻彼此相邻的两个相似大小的肌肉34，样品的处理时间大大减少，并且从其独立处理中衍生的可能的人工差异减少。此外，这种分析LD的方法考虑了LD在纤维类型54内和纤维类型之间的亚细胞分布之间的差异。选择肌纤维的周长并减少与纤维的最小费雷特直径相关的选择，有助于独立研究中心和外周（肌肉下）LD的尺寸和密度。应用这种方法非常重要，因为已经证明LD的肌肉下积累直接导致胰岛素抵抗。虽然一些人类报告已经以纤维类型和位置依赖的方式研究了LD11，16，25，但据我们所知，这是第一次将这种方法应用于啮齿动物的肌肉。此外，借助斐济自行设计的宏对LD进行量化，大大减少并简化了图像分析时间。宏和有关如何使用它的分步说明分别作为 补充文件 1 和 补充文件 2 提供。
总体而言，作者认为本文中描述的方案可能是研究骨骼肌脂质代谢的其他研究人员的有用工具。所解释的技术可以应用于不同的肌肉和不同的条件（禁食/过度喂养，训练/久坐，年轻/老年，瘦/肥胖），并希望有助于更好地理解LD的动力学，它们与细胞其他成分相互作用的重要性，脂质如何在糖酵解和氧化纤维中储存和代谢，以及它们在2型糖尿病胰岛素抵抗发作中的作用。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了 国家科学研究基金会 （FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20）和 法语国家糖尿病护理协会 （SFD-Roche糖尿病护理）的资助。M.A.D.-L.D.C.获得了瓦隆-布鲁塞尔国际卓越计划的研究金。
作者感谢爱丽丝·莫尼尔对该协议开发的贡献，并感谢卡罗琳·布津在图像获取过程中的专业知识和技术帮助。我们还感谢2IP-IREC成像平台访问低温恒温器和显微镜（2IP-IREC成像平台，鲁汶天主教大学实验和临床研究所，比利时布鲁塞尔1200）。最后，作者要感谢尼古拉斯·杜比松、罗曼·维塞尔和米歇尔·阿布-萨姆拉对手稿的建设性批评。这些文章的一些数字是用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AxioCam 506 mono 6 Mpix camera | Zeiss | ||
| AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera | Zeiss | ||
| Chemical hood | Potteau Labo | EN-14175 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM800 | |
| Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Cryo-Gloves | Tempshield | 16072252 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm Cryo Star HM 560 | |
| Dissecting Stereo Microscope SMZ745 | Nikon | ||
| Dry Ice | |||
| Dumont Forceps | F.S.T | 11295-10 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T | 14084-08 | |
| FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) | ThermoFisher | 22-363-552 | Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing |
| Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | BRAND Petri dish, MERK | BR455751 | Used to place the muscles on ice during dissection |
| ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen | Vector Labs | H-4000 | Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections |
| Incubator | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
| Microscope Cover Glasses (24x50 mm) | Assistent | 40990151 | |
| Microscope Slide Boxes | Kartell | 278 | Used as humid chambers for immunohistochemistry |
| Neck holder | Linie zwo | SB-035X-02 | Used as strap to hold the stainless steel tumbler |
| No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade | Swann-Morton | 0205 | |
| Paint brushes | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections |
| Permanent Marker Pen Black | Klinipath/VWR | 98307-R | Used to label slides |
| Pierce Fixation Forceps | F.S.T | 18155-13 | |
| Polystyrene Box | H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat | ||
| Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 | Aesculap | BB073R | |
| Stainless Steel Cup 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing |
| Superfrost Ultra Plus slides | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
| Surgical tweezers 1/2 teeth | Medische Vakhandel | 1303152 | Also called "Rat teeth tweezers" |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | F.S.T | 15000-00 | |
| Weighing boats | VWR international | 611-2249 | |
| Whole-Slide Scanner for Fluorescence | Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM | Abcam | ab175702 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher | A-21247 | Used at a final concentration of 1:500 |
| BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) | ThermoFisher | D3922 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) | ThermoFisher | D3835 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFisher | D1306 | Used at a final concentration of 0.5 µg/mL |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8418 | Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1004969011 | CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Isopentane GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. |
| Liquid Nitrogen | CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids. | ||
| Mouse on mouse Blocking Reagent | Vector Labs | MKB-2213-1 | Used at concentration of 1:30 |
| Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b | DSHB University of Iowa | BA-D5-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 | DSHB University of Iowa | SC-71-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | 6H1-supernatant | Used at a final concentration of 1:5 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Vector Labs | S-1000 | |
| PBS 0.1 M | Commonly used on histology laboratories | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) | Sigma-Aldrich | L0663 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | Confocal software | |
| BioRender | https://biorender.com/ | Used to design the figures | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | Used to analyse the acquired images | |
| Microsoft PowerPoint | Microsoft | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types | |
| Zen Blue 2.6 | Zeiss | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types |
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