Summary
Ökande bevis tyder på att överdriven infiltration av lipider inuti skelettmuskulaturen resulterar i lipotoxicitet och diabetes. Här presenterar vi ett komplett protokoll, inklusive vävnadsbehandling, färgning med Bodipy, bildförvärv och analys, för att kvantifiera storleken, densiteten och subcellulär fördelning av lipiddroppar på ett fibertypspecifikt sätt.
Abstract
Skelettmuskellipidinfiltration, känd som myosteatos, ökar med fetma och åldrande. Myosteatos har också nyligen upptäckts som en negativ prognostisk faktor för flera andra sjukdomar som hjärt-kärlsjukdom och cancer. Överdriven lipidinfiltration minskar muskelmassa och styrka. Det resulterar också i lipotoxicitet och insulinresistens beroende på totalt intramyocellulärt lipidinnehåll, lipiddroppe (LD) morfologi och subcellulär distribution. Fibertyp (oxidativ vs glykolytisk) är också viktig, eftersom oxidativa fibrer har större kapacitet att utnyttja lipider. På grund av deras avgörande konsekvenser inom patofysiologi är fördjupade studier av LD-dynamik och funktion på ett fibertypspecifikt sätt motiverade.
Häri presenteras ett komplett protokoll för kvantifiering av intramyocellulärt lipidinnehåll och analys av LD-morfologi och subcellulär distribution på ett fibertypspecifikt sätt. För detta ändamål färgades seriella muskelkryosektioner med det fluorescerande färgämnet Bodipy och antikroppar mot myosin tunga kedjeisoformer. Detta protokoll möjliggör samtidig bearbetning av olika muskler, vilket sparar tid och undviker möjliga artefakter och tack vare ett personligt makro skapat i Fiji är automatiseringen av LD-analys också möjlig.
Introduction
Skelettmuskellipidinfiltration, känd som myosteatos, ökar med fetma och åldrande. Myosteatos är negativt korrelerad med muskelmassa och styrka och med insulinkänslighet1. Dessutom tyder nya studier på att graden av myosteatos kan användas som en prognostisk faktor för andra tillstånd som hjärt-kärlsjukdom2, alkoholfri fettleversjukdom3 eller cancer4. Lipider kan ackumuleras i skelettmuskulaturen mellan muskelfibrer som extramyocellulära lipider eller i fibrerna, som intramyocellulära lipider (IMCLs). IMCLs lagras främst som triglycerider i lipiddroppar (LDs) som används som metaboliskt bränsle under fysisk träning 5,6. Men när lipidutbudet överstiger efterfrågan, eller när mitokondrier blir dysfunktionella, kommer IMCLs att vara inblandade i muskelinsulinresistens, vilket ses hos metaboliskt ohälsosamma, överviktiga individer och hos typ 2-diabetespatienter7. Intressant nog har uthållighetsidrottare liknande, om inte högre, nivåer av IMCLs som de som finns hos överviktiga patienter med typ 2-diabetes mellitus, samtidigt som de bibehåller hög insulinkänslighet. Detta fenomen beskrivs som "idrottarens paradox"8,9 och förklaras av en mer nyanserad bedömning av muskel-LDs, relaterade till deras storlek, densitet, lokalisering, dynamik och lipidartsammansättning.
För det första är LD-storlek omvänt korrelerad till insulinkänslighet och fysisk kondition10,11. Faktum är att mindre LD uppvisar en relativt större ytarea för lipasverkan och därmed potentiellt har en större kapacitet att mobilisera lipider12. För det andra spelar LD-densitet (antal / yta) en kontroversiell roll i insulinverkan 8,10; ändå verkar det ökas hos idrottare. För det tredje är den subcellulära lokaliseringen av LDs viktig, eftersom LDs som ligger strax under ytmembranet (subsarcolemmal eller perifer) utövar en mer skadlig effekt på insulinkänsligheten än centrala 8,9,13. De senare ger bränsle till centrala mitokondrier, som har en större andningsaktivitet och är mer specialiserade för att möta det höga energibehovet som krävs för sammandragning14. Däremot levererar perifera LDs subsarcolemmal mitokondrier, som är involverade i membranrelaterade processer8. Slutligen, utöver triglycerider, kan specifika komplexa lipider i muskeln vara mer skadliga än andra. Till exempel kan diacylglycerol, långkedjig acyl-CoA och ceramider ackumuleras i muskler när triglyceridomsättningshastigheten är låg, vilket försämrar insulinsignalering 9,15. För att återgå till "idrottarens paradox" har uthållighetsidrottare ett stort antal mindre centrala LDs med förhöjda omsättningshastigheter i typ I (oxidativa) fibrer, medan överviktiga och diabetespatienter har större perifera LDs med låg omsättningshastighet i typ II (glykolytiska) fibrer 8,15,16. Förutom sin roll i energilagring och frisättning kan LDs via härledda fettsyror (FA) och ett pälsprotein (perilipin 5) också fungera som kritiska aktörer som är involverade i transkriptionell reglering av FA-oxidation och mitokondriell biogenes8. På grund av deras avgörande konsekvenser inom fysiologi och patofysiologi är fördjupade studier av LDs dynamik och funktioner motiverade.
Även om det finns flera tekniker för att studera IMCLs, är de inte alla lämpliga för att exakt kvantifiera LD-storlek, densitet och distribution på ett fiberspecifikt sätt. Till exempel erbjuder bedömningen av IMCLs genom magnetisk resonansspektroskopi, även om den är icke-invasiv, en upplösningsnivå som inte är tillräcklig för att studera storleken och den exakta placeringen av LD: er i fibern, och det är inte fibertypsspecifikt17,18. På samma sätt kan biokemiska tekniker som utförs på helmuskelhomogenater19 inte bedöma placeringen och storleken på lipider. Följaktligen är den mest adekvata metoden för att analysera LD-morfologi och plats kvantitativ överföring elektronisk mikroskopi13, men denna teknik är dyr och tidskrävande. Därför har konfokal fluorescensavbildning på preparat med färgämnen som Oil Red O (ORO)20,21, monodansylpentan (MDH)22 eller Bodipy 23,24,25 framstått som det bästa verktyget för dessa studier.
Här beskrivs ett komplett protokoll, inklusive vävnadsprovtagning och bearbetning, Bodipy-färgning och konfokal bildförvärv och analys för att kvantifiera LD-storlek, antal och lokalisering i musmuskelkryosektioner. Eftersom IMCLs inte är jämnt fördelade mellan oxidativa och glykolytiska fibrer, och varje fibertyp reglerar LD-dynamiken annorlunda, måste studien av IMCLs vara fibertypspecifik 16,25,26,27. Därför använder detta protokoll immunofluorescens på seriella sektioner för att identifiera myosin tunga kedjor (MyHC) isoform (er) uttryckt av varje fiber. En annan fördel med detta protokoll är samtidig behandling av en glykolytisk (extensor digitorum longus, EDL) och en oxidativ (soleus) muskel placerad sida vid sida före frysning (Figur 1). Denna samtidiga bearbetning sparar inte bara tid utan undviker också variabilitet på grund av separat bearbetning av proverna.
Figur 1: Schematisk översikt över proceduren. Efter muskeldissektion (1) förbereds och fryses utvalda muskler av liknande storlek (2). Seriella tvärsektioner på 10 μm erhålls med användning av en kryostat och monteras direkt på vidhäftningsglas (3). Från två seriella bilder är den första (4A) immunolabelerad för laminin och färgad med Bodipy för att känna igen LDs och den andra (4B) immunostained med antikroppar mot MyHC för erkännande av muskelfibertyper. Bilder förvärvas med hjälp av ett konfokalmikroskop för Bodipy (5A) och ett epifluorescensmikroskop för muskelfibertyper (5B). Bilder analyseras i Fiji genom att tillämpa en tröskel och kvantifiera partiklar (6A) för att erhålla antalet, medelstorleken, densiteten och procentandelen av den totala ytan som upptas av LDs (7) eller räkningsceller (6B) för att erhålla procentandelen fibrer av varje typ i sektionen (7). Förkortningar: LDs = lipiddroppar; EDL = extensor digitorum longus; MyHC = myosin tunga kedjeisoformer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som utfördes på möss godkändes av den etiska kommittén för djurförsök från den medicinska sektorn vid Université Catholique de Louvain (2019/UCL/MD/013).
1. Dissektion och beredning av proverna för frysning
- Märk en 3 mm tjock korkbit för varje muskelpar.
- Genom ett litet snitt med ett blad på mitten av korken, sätt in vinkelrätt en rektangulär bit styv plast (0,5 cm B, 1 cm H) som kommer att fungera som stöd (Figur 2B).
OBS: Storleken på den rektangulära plastbiten beror på muskelns storlek. Här anpassas de beskrivna måtten till storleken på soleus (~ 9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) och EDL (~ 5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) på en 3 månader gammal C57BL / 6J hanmus. - Vid tidpunkten för dissektion, ta bort soleus och EDL i musens bakben. För att förhindra att proverna torkar ut under dissektion, placera dem på en kompress lätt fuktad med saltlösning i en petriskål placerad på is.
NOTERA: Se Wang et al.28 för förklaringar om hur man dissekerar dessa två benmuskler. - Placera en liten droppe optimal skärtemperaturförening (OCT) vid korsningen kork / plast, undvik luftbubblor.
- Eliminera överflödig fukt från proverna genom att försiktigt torka dem med en pappershandduk (figur 2A) och placera båda musklerna på plasten vinkelrätt mot korken (figur 2C).
- Kontrollera orienteringen av muskelmyofibrerna under ett stereomikroskop (figur 2D).
OBS: Det är viktigt att inte täcka muskeln med OCT, eftersom dess isolerande effekt skulle förhindra snabb frysning och kommer att producera frysartefakter.
2. Frysning av skelettmuskelprover för kryosektion
VARNING: Frysning av muskeln måste göras under en kemisk huva, med lämplig personlig skyddsutrustning (se materialtabellen).
- Använd en tumlare i rostfritt stål (~ 8 cm H, 6 cm Ø) med två sidoremmar fästa på den som är minst 25 cm långa (figur 2F) och fyll tumlaren upp till 2/3 av dess kapacitet med isopentan.
- Ta tag i tumlaren vid remmarna och sänk ner den försiktigt i en polystyrenlåda fylld med flytande kväve så att kvävenivån utanför behållaren ligger över nivån av isopentan inuti (figur 2F, G).
VARNING: När tumlaren kommer i kontakt med kvävet kan värmechocken orsaka virvling. Se till att tumlaren är tillräckligt nedsänkt men undvik att kväve kommer in eftersom detta skulle orsaka isopenfällning. Om detta händer, låt isopentan svalna, fyll tumlaren med ny isopentan och börja om. - När tumlarens insida är helt täckt med ett vitt fast lager isopentan, ta ut det ur den flytande kvävelådan (figur 2H).
OBS: Smälttemperaturen för isopentan är -159 °C, tumlarens kanter blir vita när det är tillräckligt kallt. - Rör försiktigt de fasta isopentanbitarna i den återstående flytande isopentanen med pincett tills hela volymen blir flytande igen.
- Sänk ner tumlaren i det flytande kvävet tills isopentan bildar vita stenar över tumlarens botten och kanter (figur 2G,H).
OBS: Detta andra kylsteg säkerställer lämplig frysningstemperatur för isopentan. - Ta bort tumlaren från det flytande kvävet och doppa snabbt musklerna i botten av tumlaren och håll korken med råtttandpincett. Virvla korken i 15 s i isopanten och förvara den vid -80 °C tills den bearbetas (figur 2I).
OBS: För kortvarig förvaring kan proverna förvaras i en frys på -20 °C. Det fullständiga protokollet för snabb frysning av skelettmuskulaturen har redan publicerats någon annanstans. För detaljerade referenser och felsökning, se: Meng et al.29, Kumar et al.30 och Leiva-Cepas et al.31.
3. Kryosektion
- Ta in proverna i kammaren i en kryostat som tidigare kylts till -20 °C och bladtemperaturen inställd på -25 °C.
OBS: Transportera prover från frysen -20 °C/-80 °C till kryostaten i en polystyrenlåda fylld med torris och låt proverna balansera i minst 20-30 minuter till kammartemperaturen innan de skärs. - Ta bort plasten från korken med fin pincett och placera kryostatprovskivan på snabbfrysningsplattan för att svalna. När plattan har nått -50 °C, placera lite OCT på skivan och placera snabbt korken ovanpå skivan och tryck hårt. Vänta tills OCT stelnar och korken är väl fixerad på skivan.
- Placera skivan på föremålshuvudet i önskad skärorientering (figur 2J,K) och trimma muskelblocket bortom minst 1/3 av musklernas längd och tills båda tvärsnitten av musklerna är synliga.
- Ställ in skärtjockleken på 10 μm och placera en sektion på en vidhäftningsglas för att kontrollera fibrernas korrekta orientering på ett ljusfältmikroskop.
OBS: Att kontrollera fibrernas tvärgående orientering är avgörande. Om fibrerna inte är tillräckligt orienterade, justera vinkeln på objekthuvudet, skär en annan sektion och kontrollera igen. - Placera två seriella tvärsnitt på två förmärkta vidhäftningsglas: en bild för att bestämma fibertyper, den andra för att kvantifiera lipidinnehåll (figur 2L).
OBS: Ytterligare seriella tvärsnitt kan erhållas och hållas vid -80 °C för andra histologiska studier. För att undvika att lipidinnehållet och intracellulär morfologi24 ändras är det emellertid viktigt att bearbeta de två första bilderna omedelbart efter skärning för att förhindra lufttorkning. Frysning och upptining av objektsglas för kvantifiering av LD skulle ha samma effekt och är därför mycket olämpligt.
4. Fibertypning och Bodipy-färgning
- Immunohistokemisk detektion av muskelfibertyp
OBS: För följande protokoll är en total lösningsvolym på 250 μL tillräcklig för att täcka hela muskelsektionen omgiven av en cirkel ritad med en hydrofob penna den ungefärliga storleken på ett 1 cent mynt.- Omge sektionerna med en kontur ritad med en hydrofob penna och skölj med iskall 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 1 min vid rumstemperatur (RT). Placera bilden i en fuktig kammare och blockera bilden i 90 minuter vid 37 °C i blockerande lösning (10 % normalt getserum (NGS) och 1:30 mus på mus (MOM) blockerande reagens i PBS).
- Avlägsna blockeringslösningen och inkubera objektsglasen i 90 minuter vid 37 °C med lösningen som innehåller de primära antikropparna (5 % NGS, 1:30 MOM-blockerande reagens, musens primära antikroppar för att känna igen typ I (IgG2b, vid 1:10), typ IIa (IgG1, vid 1:10) och typ IIx (IgM, vid 1:5) fibrer och en råtta-anti-laminin (α2-kedja, 1:1 000) i PBS.
- Tvätta objektglasen med PBS 3 x 5 min vid RT.
- Inkubera objektglasen i mörker i 1 timme vid RT med lösningen som innehåller de sekundära antikropparna (get-anti-IgG2b AF405 (1:500), get-anti-IgG1 AF488 (1:500), get-anti-IgM AF568 (1:1 000) och get-anti-laminin AF647 (1:500) i PBS).
VARNING: För resten av protokollet, se till att hålla bilderna borta från ljus för att bevara fluorescensen. - Tvätta igen 3 x 5 min i PBS, skölj i dubbeldestilleratH2O, ta bort överflödigt vatten och montera med ett antifadereagens.
OBS: Förvara objektglasen vid 4 °C, skyddade från ljus för att bevara fluorescensen tills bilden samlas in. Eftersom bilderna inte är fixerade rekommenderas det att använda nygjorda lösningar för varje experiment, autoklavera PBS och skaffa bilderna så snart som möjligt för att undvika förorening av sektionerna.
- Färgning av LDs med Bodipy
OBS: I likhet med steg 4.1 är en total lösningsvolym på 250 μL tillräcklig för att täcka hela muskelsektionen omgiven av en cirkel ritad med en hydrofob penna med en ungefärlig storlek på ett 1 cent mynt.- Omge sektionerna med en kontur ritad av en hydrofob penna och skölj med iskall 0,1 M PBS i 10 min vid RT. Använd iskall PBS för alla sköljningar och tvättar.
- Fixera med kall 4% paraformaldehyd (PFA) utan metanol i 10 min vid RT. Efter en första snabb sköljning, tvätta bilderna med PBS 3 x 5 min vid RT.
VARNING: Utför detta steg under en kemisk huva. - Placera bilden i en fuktig kammare och blockera i 1 timme vid RT med 5% NGS i PBS.
- Inkubera objektsglasen i 90 minuter vid 37 °C med lösningen av den primära antikroppen (2 % NGS och antilaminin från råtta (α2-kedja, 1:1 000) i PBS). Tvätta objektglasen med PBS 3 x 5 min vid RT.
VARNING: För resten av protokollet, se till att hålla bilderna borta från ljus för att bevara fluorescensen. - Inkubera i 1 timme vid RUMSTEMPERATUR med den sekundära antikroppslösningen innehållande get-anti-råtta-AF647-antikropp (1:500) i PBS. Tvätta objektglasen med PBS 3 x 5 min vid RT.
- Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur med en lösning av 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 0,5 μg/ml) och BODIPY (1 μg/ml) i PBS.
OBS: För att bereda BODIPY stamlösning, lös upp den i DMSO i en koncentration av 1 mg/ml. Olika Bodipy-formuleringar är kommersiellt tillgängliga för LD-färgning. Beroende på valet är färgningsmetoden densamma (samma steg, koncentration och inkubationstid); förvärvsmetoden kommer dock att vara något annorlunda. - Efter en första snabb sköljning, tvätta objektglasen med PBS 3 x 5 min vid RT, skölj i dubbeldestilleradH2O, ta bort överflödigt vatten och montera med ett antifadereagens.
OBS: Förvara objektglasen vid 4 °C, skyddade från ljus, för att bevara fluorescensen tills bilden samlas in.
5. Förvärv av bilder
OBS: När färgningsprotokollen har slutförts är det viktigt att omedelbart gå vidare till bildförvärv (inom följande 24 timmar), inte bara för att undvika kontaminering utan också för att bevara morfologin, storleken och antalet LD: er.
- Förvärv av bilder för att bedöma fibertyperna för varje muskel som provtas
OBS: Detta steg kan uppnås med ett helglas fluorescensskanningsmikroskop eller med ett konventionellt epifluorescensmikroskop. Med det senare måste manuell eller automatiserad sömnad av bilderna göras för att rekonstruera sektionen.- För fiberigenkänning, använd ett epifluorescensmikroskop med ett 10x / 0,3-mål. Välj excitationsfilter för DAPI (405 nm), FITC, TRITC och Cy5 för att detektera typ I-, IIa-, IIx-fibrer respektive laminin.
OBS: Typ IIb-fibrer kommer inte att immunolabeleras. De kommer att erkännas som fibrer färgade av laminin på gränserna för sarcolemma med en svart sarkoplasma. - Justera lämplig exponeringstid för varje kanal.
- När du använder ett konventionellt epifluorescensmikroskop, skaffa alltid bilderna av hela muskeln enligt samma ordning för att underlätta muskelrekonstruktion. Se till att fibrerna på den högra kanten av en bild också visas på vänster kant på följande bild. Detsamma gäller för de övre och nedre delarna av bilderna (figur 3A).
OBS: Som referens, för en del av EDL eller soleus dissekerad från en 3 månader gammal mus, kommer i genomsnitt sex respektive åtta bilder att täcka hela muskeltvärsnittet. - När muskeln har skannats laddar du upp de tagna digitala bilderna till valfri bildbehandlingsprogramvara för rekonstruktion (sömnad), baserat på fibermorfologin (laminin) och histologin i muskelsektionen, och sparar den som en TIFF-, PNG- eller JPG-fil med alla kanaler (färger) sammanslagna (figur 3A).
- För fiberigenkänning, använd ett epifluorescensmikroskop med ett 10x / 0,3-mål. Välj excitationsfilter för DAPI (405 nm), FITC, TRITC och Cy5 för att detektera typ I-, IIa-, IIx-fibrer respektive laminin.
- Förvärv av bilder med laminin och Bodipy samfärgning
OBS: För att känna igen fibertypen och få en uppskattning av antalet fibrer för varje typ som fångats är det viktigt att fibersektionen redan skannas och musklerna rekonstrueras innan du börjar bildförvärvet av Bodipy-laminin (figur 3B).- För Bodipy-bildobservation och -förvärv, använd ett konfokalmikroskop med en 40x oljedykningsmållins med en numerisk bländare på 1,4.
- Använd följande inställningar: pinhole vid 1 AU, 2 048 pixel x 2 048 pixelupplösning, pixelstorlek vid 0,08 μm, enkelriktat läge, skanningshastighet vid 4 (~ 4 μs / pixel), linjegenomsnitt inställt på 4x och digital zoom inställd på 1.
- För att undvika korssamtal mellan Bodipy-558/568 och laminin-AF647, använd sekventiellt skanningsläge på konfokalprogramvaran.
OBS: När det valda färgämnet är Bodipy-493/503 är samtidig konfokal laserskanning möjlig utan överhörning mellan Bodipy-kanalen och laminin-AF647-kanalen. Detta kommer att påskynda förvärvet av bilder. - Excitera Bodipy-493/503 med 488 nm laserlinje eller argonlaserlinje och excitera Bodipy-555/568 med 561 nm diodlaserlinjen. Slutligen detektera laminin-AF647 med en 640 nm diodlaserlinje.
VARNING: Tänk på att Bodipy-molekyler är mycket känsliga för fotoblekning, så undvik onödig laserskanning. För att känna igen fibrer, använd endast lasern för laminin. - Beroende på vilket färgämne som valts, ställ in utsläppsområdena på 570-650 nm för Bodipy-493/50324 och vid 565-620 nm för Bodipy-558/568. Ställ in utsläppsområdet för laminin vid 656-700 nm.
- Ställ in förstärkningen och den digitala förstärkningen på lämpligt sätt så att inga mättade pixlar detekteras på intervallindikatorn. Korrigera bakgrundssignalen genom att justera förskjutningen.
OBS: Filterval och andra ovan nämnda skanningsparametrar måste optimeras för varje konfokalmikroskop. Det är viktigt att alla ovan nämnda inställningar hålls konstanta för att alla bilder som tagits från prover ska jämföras. - För att identifiera typen av fiber bland de som visualiseras på konfokalmikroskopet, använd en personlig bärbar dator där bilden av sektionen rekonstruerad efter fibertyp immunodetektion kontrolleras (Figur 3B).
- När en grupp fibrer är korrekt identifierad, förvärva bilden med Bodipy- och lamininkanalerna.
OBS: Det rekommenderas att notera Bodipy-laminin-bildnamnet på regionen av muskeln där dessa fibrer finns på bilden som förvärvats för MyHC-erkännande för att underlätta den senare fiberspecifika analysen av LD.
6. Analys av bilder
- Analys av fibertyperna på varje muskelprov
- I Fiji (eller ImageJ)32 öppnar du TIFF-, PNG- eller JPG-filen med den rekonstruerade muskeln som erhållits från sammanslagningen av alla kanaler som används för att detektera fiberisoformerna.
- För att starta cellräkningsverktyget , klicka på Plugins | Analysera | | Cellräknare.
- I fönstret Cellräknare klickar du på Åtgärder | Initiera.
- Under Räknare i samma fönster väljer du Typ 1.
- I Fijis huvudfönster väljer du trollstavsverktyget .
- För att kvantifiera antalet fibrer av varje typ, klicka på varje fiber av samma typ, så att programmet registrerar antalet klickade fibrer.
- När du är klar väljer du nästa typ av fiber och upprepar samma steg.
- När alla fibrer i bilden har tilldelats en viss fibertyp klickar du på Resultat i cellräknarfönstret för att visa resultaten i en tabell.
- Spara den här tabellen som en kalkylbladstabell genom att klicka på Arkiv | Spara som i fönstret Resultat .
- Spara och ladda om valen på samma bild när som helst genom att klicka på Spara markörer respektive Ladda markörer i fönstret Cellräkning .
- Analys av lipiddroppar på ett fibertypberoende sätt
- Analysera bilderna av Bodipy och laminin erhållna på konfokalen med hjälp av Fiji för kvantifiering av LDs.
OBS: Författarna utformade ett anpassat makro för att automatisera analysen. Detta makro, tillsammans med en steg-för-steg-förklaring om hur du använder det, är tillgängligt som tilläggsfil 1 respektive tilläggsfil 2. - Öppna varje bild med hjälp av Bio-Formats Importer från Fiji. Under alternativet Visa stack med väljer du Hyperstack | Färgläge, standard. Kontrollera att fönstret Autoskalning är markerat.
OBS: Följande steg beskriver protokollet för analys av en fiber på bilden, men det måste upprepas så många gånger som antalet hela fibrer visas på bilden. - Använd verktyget för val av frihand för att manuellt välja fiberns sarcolemma baserat på lamininkanalen (figur 4A) och tryck på T på tangentbordet för att spela in valet eller region av intresse (ROI) i ROI-fönstret .
- Gå till Fijis huvudfönster och klicka på Analysera | Ställ in mått och välj Område och Ferets diameter i popup-fönstret. Lämna de återstående rutorna avmarkerade och andra parametrar som de visas som standard.
- Klicka på Mät i ROI-fönstret för att få area och minimal Ferets diameter (MF) för den valda fibern och notera dem för senare användning.
OBS: När man analyserar LDs är det viktigt att komma ihåg att deras storlek och densitet varierar mellan fiberns centrum och periferi (subsarcolemmal region-SS). Därför måste analysen göras separat. - Beräkna värdet på 1/6 av MF för att avgränsa den centrala delen av fibern.
OBS: I makrot är standardvärdet för MF inställt på 6, vilket innebär att den tillämpade minskningen kommer att ställas in som 1/6 av MF. Detta värde valdes utifrån de empiriska data som erhållits från soleus av djur som matas med en fettrik diet. Varje forskare måste dock ändra detta nummer baserat på empiriska data och den analyserade muskeln, typen av fiber och djurtillståndet. - I ROI-fönstret klickar du på Lägg till för att få en kopia av den första avkastningen och väljer den andra AVKASTNINGEN som visas i fönstret.
- I Fijis huvudfönster klickar du på Redigera | Urval | Förstora och introducera det tidigare beräknade värdet (från steg 6.2.6.) med ett minustecken före numret och klicka på OK. I ROI-fönstret klickar du på Lägg till[t] (en tredje ROI måste visas) och Ta bort för att ta bort den andra ROI.
OBS: Forskaren kan kontrollera resultaten genom att klicka på rutan Visa alla i ROI-fönstret . Vid denna tidpunkt måste två ROI visas, en som omger hela fiberns omkrets (figur 4B) och en annan som är placerad i mitten (figur 4C). - Välj båda avkastningarna i ROI-fönstret och klicka på Mer | XOR | Lägg till[t]. Vänta tills en tredje ROI visas, vilket motsvarar fiberns periferi (figur 4D).
- Spara avkastningen genom att klicka på Mer | Spara för att spara ROI: erna om en senare omanalys av samma fibrer behövs.
- Välj Bodipy-kanalen och öppna tröskelverktyget genom att klicka på Bild | Justera | Tröskel på Fijis huvudfönster .
- I popup-fönstret Tröskelvärde ställer du in värdena på 70/255, väljer Yen | Svartvit metod och klicka på Mörk bakgrund | Applicera.
De värden som tillämpas på tröskelvärdet kan variera beroende på experimentets förhållanden och tröskelvärdet måste vara lämpligt inställt för att optimera analysen. Ett svartvitt fönster med Bodipy-signalen över tröskelgränsen som visas i vitt och bakgrunden i svart måste visas (jämför den ursprungliga Bodipy-bilden i figur 4E med den i figur 4F). - Gå till Fijis huvudfönster och klicka på Analysera | Ställ in mått och i popup-fönstret väljer du Område, Områdesfraktion och Begränsa till tröskelvärde. Lämna de återstående rutorna avmarkerade och andra parametrar som de visas som standard.
OBS: Om forskaren vill analysera "cirkulariteten" hos LD: er, vilket är ett index för den sfäriska morfologin som sträcker sig från 1 för en perfekt sfär till 0 för en linje, klicka på rutan Formbeskrivningar i popup-fönstret Ställ in mätningar . - Gå till ROI-fönstret och välj den första ROI. I Fijis huvudfönster klickar du på Analysera | Analysera partikelverktyget.
OBS: Detta verktyg kvantifierar antal, storlek, täckt yta och procentandel av den totala ytan som täcks av partiklar vid varje markering och sparar resultaten som en kalkylbladsfil. - Ställ in värdena från 2 till Infinity (2-Infinity) i fönstret Analysera partiklar, markera rutan Pixlar, behåll standardcirkularitetsvärdena, välj Sammanfatta och klicka på OK.
OBS: För att kontrollera resultaten på fibern, välj något av de tillgängliga alternativen under alternativet Visa . Om du vill att informationen för varje LD ska kännas igen på markeringen i en tabell markerar du alternativet Visa resultat i fönstret Analysera partiklar . Resultaten från analysen av fiberns totala yta är i genomsnitt och sammanfattas i en tabell med flera kolumner (Antal, Total yta, Medelstorlek, % Yta; dessa motsvarar antalet partiklar [LDs], det område som upptas av dessa partiklar, deras genomsnittliga storlek och procentandelen av den totala ytan av urvalet som upptas av partiklar, respektive). För att beräkna densiteten, dela antalet partiklar med den totala ytan för varje val. - För att få värdena på fiberns centrum och periferi, upprepa steg 6.2.14 och 6.2.15, välj den andra (mitten) och den tredje ROI (periferin) varje gång.
- Spara resultaten genom att klicka på Arkiv | Spara som i fönstret Sammanfattning .
OBS: Inkludera typen av fiber, tillståndet och bildnamnet på det tilldelade namnet på resultaten för att underlätta senare förening och statistisk analys av data. För att analysera resten av fibrerna i samma bild, upprepa steg 6.2.3 till 6.2.17. För den statistiska analysen måste minst 10-15 fibrer av varje typ analyseras per djur.
- Analysera bilderna av Bodipy och laminin erhållna på konfokalen med hjälp av Fiji för kvantifiering av LDs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs häri ger en effektiv metod för att enkelt kvantifiera LDs på ett fibertyp och subcellulärt specifikt sätt. Det visar hur, genom att frysa ihop två muskler av liknande storlek, såsom EDL och soleus, minskas tiden och resurserna som spenderas på följande steg med hälften.
Ett komplett protokoll tillhandahålls för immunfärgning, bildförvärv och analys av de olika MyHC-isoformerna uttryckta i vuxna musmuskler. Detta protokoll är baserat på det som först designades av Schiaffino m.fl. 198933, med vissa justeringar som användningen av en ytterligare antikropp för att märka laminin. Denna senare modifiering är avgörande för placeringen av typ IIb-fibrer, som kommer att vara svarta eftersom de inte är färgade med någon antikropp. Som visas i figur 5 tillåter detta immunhistokemiska protokoll inte bara igenkänning av mus långsamma oxidativa (typ I och IIa) och snabbglytolytiska (typ IIx och IIb) fibrer, utan också närvaron av hybridfibrer (se asterisk i figur 5D). Att ha tvärsnitten av båda musklerna på samma bild möjliggör dessutom jämförelse av proportionerna av varje fibertyp mellan de två valda musklerna, vilket säkerställer att experimentbetingelserna var identiska på båda sektionerna.
För LD-märkning är resultaten som presenteras här baserade på användningen av Bodipy-558/568 C12 som lipidfärgämne; läsaren hänvisas dock till ett utmärkt protokollpapper som beskriver användningen av det klassiska färgämnet Bodipy-493/503 påmuskelsektioner 23. Protokollet som presenterades kombinerade färgningen av LD: er baserade på immunohistokemi mot α2-laminin för att skilja fibersarkolemma. Som med fibertypsexperimentet är detta steg viktigt, inte bara för erkännande av enskilda fibrer utan också för efterföljande analys av lipider i både de centrala och perifera regionerna av fibrer (Figur 4). Ett av de kritiska stegen i detta protokoll är identifiering och märkning av samma fibrer på de två bilderna. Som förklarats tidigare är det viktigt att skanna bilden med fibertyper och ha rekonstruktion av muskeltvärsnitt med de sammanslagna färgerna innan du hämtar bilder för LDs (Figur 3B). Anmärkningsvärda strukturer i varje muskelsektion, såsom axonkvistar eller muskelspindlar, är bra landmärken som kan hjälpa forskaren att hitta samma fibrer på båda bilderna (figur 6). Kom ihåg att eftersom bilden placeras upp och ner på de flesta konfokala mikroskop, rekommenderas att invertera den fibertyprekonstruerade bilden på persondatorn för att underlätta platsuppgiften.
De inställningar som beskrivs för förvärv av Bodipy-lamininfärgning genom konfokalmikroskopi möjliggör visualisering och senare analys av storlek, antal och fördelning av LD: er från tre till sex fibrer samtidigt (Figur 6 och Figur 7). Ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för att analysera LDs med bildanalysprogramvaran Fiji finns också här. Som visas i protokollet är den fullständiga analysen av var och en av fibrerna som finns på en bild lång och tråkig. Fiji har dock fördelen att tillåta design av anpassade program, kallade makron, baserat på Java-språket. Författarna utformade ett makro som möjliggör automatisering av serien av enskilda kommandon som beskrivs ovan som automatiskt körs i en slinga för att analysera på några minuter - inte bara var och en av fibrerna som finns på en bild utan också en stor uppsättning bilder. Den enda ingången från forskaren är det manuella valet av fiberns omkrets som ska analyseras varje gång, valet av fibertyp och den visuella inspektionen av den resulterande bilden efter applicering av tröskeln och kvantifiering av partiklarna.
Här genomförs analysen av LDs på ett platsberoende sätt. Genom att tidigare mäta fiberns yta och MF-diameter appliceras en storleksberoende (icke-fixerad som beskrivs av Strauss et al.25) reduktion för att erhålla de centrala och perifera områdena för varje fiber (figur 4 och figur 7). Som framgår av histogrammen i figur 7 möjliggör denna metod kvantifiering av tre viktiga parametrar: procentandelen av fiberområdet som upptas av LDs (Figur 7E), densiteten hos LDs - antalet LDs per μm2 (Figur 7F) och den genomsnittliga storleken på LDs (Figur 7G). Som ett resultat, i 3 månader gamla möss (N = 5), typ IIa (grön kontur) och typ IIx (röd kontur) fibrer presenterar den största andelen av området som upptas av LDs i periferin (Figur 7E). Med avseende på partiklarnas densitet visar EDL-fibrer alltid högre densitet än soleusfibrer oberoende av den subcellulära platsen (figur 7F). Slutligen är den genomsnittliga storleken på dessa LDs alltid större i periferin än i mitten (figur 7G).
De olika metoder som används av andra grupper för att bedöma ackumuleringen av LDs i gnagare skelettmuskulatur34,35 gör det svårt att jämföra dessa resultat med tidigare studier. I linje med resultaten från Komiya et al.34 är dock andelen fiberarea som upptas av LDs högre i soleus typ IIa och EDL typ IIx fibrer. Viktigast av allt var att fibrer av typ IIb presenterade den lägsta andelen yta som upptas av LDs (figur 7E, grå histogram). Eftersom fiber typ IIb är den mest dominerande fibertypen av EDL (75%, figur 5E), bekräftar dessa resultat vad andra grupper tidigare har beskrivit: den totala ackumuleringen av lipider är lägre i EDL än i soleus34,35.
I motsats till vad som har beskrivits hos människor25, och även i linje med resultaten från Komiya et al.34, visar resultaten som presenteras här att ackumuleringen av LDs i soleus typ I-fibrer är relativt låg. Detta kan förklaras av skillnader mellan arter av fibertyp mellan möss och människor36, eftersom de metaboliska egenskaperna hos humana typ I-fibrer liknar dem hos gnagare typ IIa och IIx, medan de hos humana typ IIx-fibrer ligger nära gnagare typ IIb37. Sammanfattningsvis ger de olika teknikerna som beskrivs här en reproducerbar, tillförlitlig och tidseffektiv metod för att studera och jämföra flera parametrar relaterade till LDs och deras fördelning i cellen på ett fibertypberoende sätt.
Suboptimala experiment
Om frysningsproceduren inte utförs korrekt och isopentan inte har rätt temperatur kommer iskristaller att bildas inuti fibrerna (figur 8A). Dessa frysartefakter är detekterbara först efter den histologiska beredningen av provet och kan erkännas som hål i fibrerna. För korrekt kvantifiering av LDs måste dessa artefakter undvikas. Det har visat sig att upptining och återfrysning av muskelblocket på lämpligt sätt kan avsevärt minska dessa artefakter29.
Ett annat problem uppstår när fibrer inte skärs vinkelrätt mot längdaxeln (figur 8B). LD-kvantifiering och jämförelse mellan fibrer, muskler eller djur kan inte göras när sektioner inte är tvärgående. Av denna anledning är det viktigt att placera musklerna korrekt på korken med hjälp av ett stereomikroskop innan du fryser och ha ett ljusfältmikroskop nära kryostaten. Det senare gör det möjligt för forskaren att hitta rätt inriktning av provet på kryostaten.
I vissa sällsynta fall är märkningen av MyHC-isoformer mycket svag på en eller flera fibertyper (figur 8C). Om detta händer kommer analysen av LDs att vara ofullständig. I detta fall måste experimentet upprepas från och med skärningen av musklerna. Slutligen kan Bodipy ackumuleras i periferin av muskeltvärsnittet (figur 8D). Om detta händer kommer färgningen att vara mycket stark på de fibrer som ger ett artefaktiskt resultat. Undvik förvärv av bilder från dessa fibrer.
Figur 2: Beredning av proverna för frysning och kryosektion. (H,I) Tumlaren med den kalla isopentanen tas ut ur det flytande kvävet och provet nedsänks upp till tumlarens botten och virvlar i 15 s. (J-L) Korken med proverna placeras på kryostathållarskivan utan plaststöd och seriella tvärsektioner på 10 μm är direkt monterade på vidhäftningsglas. Två intilliggande seriella tvärsnitt bearbetas omedelbart för färgning av LD och detektering av MyHC. Förkortningar: LDs = lipiddroppar; EDL = extensor digitorum longus; MyHC = myosin tunga kedjeisoformer; OCT = optimal skärtemperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bodipy-bildförvärv efter att ha identifierat typen av fiber från den rekonstruerade sammansatta bilden som ses på en annan dator. (A) Rekonstruktion av hela soleussektionen immunolabelerad för fibertyp (MyHC) från sju oberoende sammanslagna bilder (streckade rektanglar) sydda ihop med hjälp av bildbehandlingsprogram. De vita pilarna och siffrorna representerar den ordning som följts under bildförvärv med hjälp av ett konventionellt epifluorescensmikroskop. (B) För Bodipy-bildförvärv visualiseras (1) ett fält som innehåller muskelsektionen immunstained med laminin-AF647 och Bodipy-555/568 på skärmen på en dator ansluten till konfokalmikroskopet. (2) Dessa fibrer är belägna på den rekonstruerade bilden av muskelsektionen immunstained för att detektera typen av fibrer (MyHC). (3) Bilden förvärvas med hjälp av ett konfokalmikroskop. Förkortningar: LDs = lipiddroppar; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; MyHC = myosin tunga kedjeisoformer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A,B) Fiberns sarkomom känns igen baserat på lamininbilden och väljs som ROI. Total yta och MF mäts. (C) För att känna igen den centrala delen av fibern reduceras valet med 1/6 av värdet på MF. (D) Området mellan det centrala och det totala urvalet anges som periferin eller subsarcolemmalområdet. (E) För analys av LDs färgade med Bodipy tillämpas en tröskel, (F) och verktyget Analysera partiklar används för att kvantifiera olika parametrar relaterade till LDs (se tabell). Dessa värden erhålls för hela fibern (Alla), för den centrala delen (Centrum) och för det subsarcolemmala området (Periferi), oberoende. Skalstänger = 12 μm. Förkortningar: LDs = lipiddroppar; ROI = region av intresse; MF = Minimal Ferets diameter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativ immunfärgning av fibertyper i EDL (glykolytisk) och soleus (oxidativ) musmuskel. Sammanslagna fluorescensbilder av EDL (A,B) och soleus (C,D) erhållna med ett digitalt fluorescensmikroskop med hel bild. Antikroppar mot typ I (blå-AF405), typ IIa (grön-AF488), typ IIx (röd-AF568) och laminin (vit-AF647) användes. Svarta fibrer motsvarar fiber typ IIb. B och D visar detaljer om fibrerna inuti de vita rektanglarna på panelerna A respektive C. Asterisken (*) i panel D visar en IIa/IIx hybridfiber. (E,F) Representativ kvantifiering av fibertypfördelning i EDL och soleus från 3 månader gamla möss (N = 5). EDL bestod huvudsakligen av typ IIb, sedan IIx och IIa-fibrer (~ 75%, 15% respektive 5%). Däremot bestod soleus huvudsakligen av typ IIa (>50%) och typ I-fibrer (30%). Proportionerna av typ IIx-fibrer var ganska lika i båda musklerna, medan de av hybridfibrer var mycket låga. Skalstaplar = 200 μm (A,C), 100 μm (B,D). Förkortning: EDL = extensor digitorum longus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Representativ färgning av LDs med Bodipy på seriella tvärsnitt som tidigare immunmärkts för MyHC-isoformer. Fluorescens sammanfogade bilder av mus EDL (A) och soleus (B) som förvärvats med hjälp av ett epifluorescensmikroskop som visar typ I (blå), IIa (grön), IIx (röd), IIb (svart) fibrer och laminin (vit signal som omger fibrerna). (C-F) Konfokala fluorescensbilder från EDL (C,D) och soleus (E,F) sammärkta med laminin (cyan) och Bodipy (röd). Observera att fibrer som visas i C-F är desamma som de inuti de vita rektanglarna på panelerna A och B. I det högra hörnet av den vita rektangeln i A kan en axonkvist särskiljas (vit pilspets). Skalstaplar = 200 μm (A,B), 20 μm (C-F). Förkortningar: LDs = lipiddroppar; EDL = extensor digitorum longus; MyHC = myosin tunga kedjeisoformer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Kvantifiering av LDs på ett fibertyp- och subcellulärt specifikt sätt. Representativa fluorescenskonfokala bilder av typ I- och typ IIa-fibrer från soleus (A,B) och typ IIx- och typ IIb-fibrer från EDL (C,D) erhållna efter sammärkning med Bodipy (röd) och α2-laminin (visas inte). LD-innehåll (% av det område som upptas av Bodipy och densitet) och morfologi (storlek) analyserades på ett subcellulärt specifikt sätt. Fiberomkrets definierades av lamininfärgning och de centrala eller perifera områdena sattes baserat på MF-diametern. Procentandel fiberyta som upptas av Bodipy (LDs) (E), LD-densitet (antal / μm2) (F) eller genomsnittlig LD-storlek (G) i centrala eller perifera regioner för varje fibertyp. Resultaten representeras som medelvärde ± SEM. Förkortningar: LDs = lipiddroppar; EDL = extensor digitorum longus; C = centralt; P = perifer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Bilder som motsvarar suboptimala resultat. (B) Fluorescens sammanfogad bild av en soleussektion immunostained för MyHC och laminin, vilket visar att majoriteten av fibrerna skärs längs längdaxeln. (C) Fluorescensbild av en EDL-sektion immunostained för MyHC och laminin. Den svaga färgningen av fiber typ IIa (grön) hindrar korrekt kvantifiering av varje fibertyp. (D) Konfokal bild som visar en stark artefaktisk färgning av Bodipy (röd) på fibrer som ligger i periferin av muskeltvärsnittet. Skalstaplar = 50 μm (A,B), 200 μm (C,D). Förkortningar: EDL = extensor digitorum longus; MyHC = myosin tunga kedjeisoformer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: LD-färgning med oil red O på muskeltvärsnitt. (A,B) Konfokala bilder som visar färgningsmönstret som erhållits med Oil Red O i soleus respektive EDL. Protokollet som används för denna färgning beskrivs i detalj av Prats et al.24. Observera att ackumuleringen av LDs är högre i myofibers subsarcolemmala region, som tidigare beskrivits för Bodipy. Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: LD = lipiddroppe; EDL = extensor digitorum longus. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Samfärgning av LDs och mitokondrier i soleusmuskeln. (A) Konfokal sammanslagen bild som visar immunmärkning av Tomm20, ett protein som finns på mitokondriemembranet (grönt), DAPI (blått) och Bodipy-558/568 märkt LDs (rött). Insatsen i A visar flera mitokondrier (gröna) bundna till LDs (röd). Denna bild erhölls genom att applicera Airyscan konfokal superresolutionsmikroskopi. (B,C) Motsvarande enkanalsbilder av LD respektive mitokondrier. Skalstänger = 10 μm (A-C), 5 μm (A, infällt). Förkortningar: LDs = lipiddroppar; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1: Fiji-makro för automatiserad analys av LDs på flera laminin + Bodipy-bilder. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Steg-för-steg-förklaring av hur man arbetar med makrot Bodipy_JoVE.ijm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här beskriver en effektiv metod för att kvantifiera LD: er märkta med Bodipy på en fibertyp- och subcellulär specifik basis. Under de senaste åren har klassiska lipidfärger, såsom ORO eller Sudan Black B, ersatts med en ny uppsättning cellgenomsläppliga, lipofila, fluorescerande färgämnen som binder till neutrala lipider (t.ex. Bodipy). Bodipy finns som olika konjugat och har visat sig vara mycket effektivt för att märka LDs för att studera deras morfologi, dynamik och interaktion med andra organeller, inte bara i olika fasta vävnader och celler 23,38,39,40 utan också i levande celler 41,42.
Inom protokollet finns det flera kritiska aspekter som forskaren måste överväga för att få optimala resultat. Det är viktigt att placera de valda musklerna korrekt på korken för att säkerställa perfekt inriktning och orientering av muskelmyofibrer, eftersom när de väl är frusna kan endast små justeringar av hållaren göras på kryostaten. Dessutom är det viktigt att starta immunfärgningsprotokollet omedelbart efter att sektionerna har skurits, eftersom lufttorkande kryosektioner (endast 15 minuter) har allvarliga negativa effekter på LDs, vilket resulterar i en 66% minskning av LD-densiteten och en 37% minskning av medelstorleken24. På samma sätt skulle frysning och upptining av objektsglasen ha negativa effekter och rekommenderas därför inte. Ett tredje viktigt inslag i detta protokoll är relaterat till fixering av prover. För identifiering av de olika MyHC-isoformerna med de antikroppar som nämns här måste vävnadsfixering undvikas eftersom det stör bindningen av de valda antikropparna till deras epitoper. Om muskelproverna tidigare har fixerats hänvisas läsaren till en nyligen publicerad artikel med olika antikroppar43. Endast PFA utan metanol rekommenderas för märkning och kvantifiering av LDs, eftersom användningen av metanol eller aceton stör morfologin hos LDs23,44. Dessutom är ett permeabiliseringssteg inte nödvändigt för kvantifiering av LD på objektsglas immunmärkta med laminin. Eftersom vissa grupper har visat att permeabilisering med tvättmedel som TritonX-100, saponin eller glycin kan minska storleken eller antalet LDs44,45, är permeabilisering mycket avskräckt. Slutligen är finjusteringen av konfokalmikroskopinställningarna avgörande för att endast känna igen de neutrala lipiderna som finns i LDs och inte de i membran från andra organeller24.
Här användes Bodipy-558/568 C12 som LD-markör. Den vanligaste Bodipy som används för att märka LDs och studera deras morfologi och plats i skelettmuskelmyofibrerna är Bodipy-493/503. Båda färgämnena liknar deras inkubationstid, arbetskoncentration och deras smala emissionsspektra, även om deras excitations- och emissionsområden är något annorlunda. För ett komplett protokoll om användningen av Bodipy-493/503 hänvisas läsaren till Listenberger och Brown46 eller Spangenburg et al.23. Bodipy-558/568 C12 har använts för färgning av LDs i andra vävnader såsom fettvävnad47, degenererande näthinnan48, fibrotiska njurar49 eller fibroblaster50. Denna Bodipy ger en liknande färgning som den som erhölls med ORO (se kompletterande figur S1) men med betydligt mindre teknisk börda och mer specificitet24,51. Dessutom har Bodipy-558/568 C12 fördelen att det möjliggör kvantifiering av LD i kombination med detektion av proteiner eller organeller märkta med en grönspektrum sekundär antikropp (se kompletterande figur S2 och Yan et al.49) eller med GFP-genetiskt modifierade modeller52. Dessa två applikationer är mycket kraftfulla verktyg för att avslöja dynamiken och interaktionerna mellan LD: er med andra cellorganeller och proteiner. Ändå, när ingen kollinering av proteiner i cellerna är avsedd, rekommenderar författarna användningen av det bäst karakteriserade LD-färgämnet Bodipy-493/503.
En av begränsningarna i detta protokoll är relaterad till förvärv av bilder och kvantifiering av LD-morfologiska egenskaper. Tekniska framsteg inom konfokal laserscanningsmikroskopi har avsevärt förbättrat planupplösningen jämfört med bredfältmikroskop och tillåter 3D-rekonstruktion av objekt vid skanning av provet i Z-planet. Detta har varit mycket användbart för studier av LD-morfologi24 och interaktion med andra proteiner i skelettmyofibrer 38,53, men har ökat bildförvärvs- och bearbetningstiden, eftersom varje 3D-rekonstruerad bild består av flera oberoende 2D-bilder. I ovanstående protokoll förvärvades konfokala bilder med en 40x objektivlins och endast i 2D. Denna metod möjliggör förvärv av tre till sex myofibrer per bild istället för bara en som det skulle vara när man använder ett 63x-mål. Detta resulterar i lägre upplösning och en övergripande uppskattning av LD-storleken och morfologin som inte är helt korrekt. Ändå tillåter det analys av ett större antal fibrer per prov, vilket också är ett viktigt faktum att överväga, särskilt i djurförsök, där ett stort antal muskler och tillstånd måste jämföras.
Här visas att genom att frysa två muskler av liknande storlek som ligger intill varandra34 minskar bearbetningstiden för proverna avsevärt och eventuella artefaktiska skillnader härledda från deras oberoende bearbetning reduceras. Dessutom tar denna metod för att analysera LDs hänsyn till skillnaderna mellan den subcellulära fördelningen av LD inom och mellan fibertyper54. Att välja myofiberns omkrets och minska detta urval i förhållande till fiberns minimala Ferets diameter underlättar studien av storleken och densiteten hos centrala och perifera (subsarcolemmala) LD: er oberoende. Att tillämpa denna metod är extremt viktigt eftersom det har visats att den subsarkollemmala ackumuleringen av LD direkt bidrar till insulinresistens. Medan vissa rapporter hos människor har studerat LDs på ett fibertyp- och platsberoende sätt 11,16,25, är detta första gången, vad vi vet, som denna metod har tillämpats på muskler från gnagare. Dessutom minskade och förenklade kvantifieringen av LD med hjälp av ett egendesignat makro för Fiji avsevärt bildanalystiden. Både makrot och en steg-för-steg-förklaring om hur du använder det finns som tilläggsfil 1 respektive tilläggsfil 2.
Sammantaget anser författarna att protokollet som beskrivs häri kan vara ett användbart verktyg för andra forskare som studerar lipidmetabolism i skelettmuskulaturen. De tekniker som förklaras kan tillämpas på olika muskler och under olika förhållanden (fasta / överfödda, utbildade / stillasittande, unga / åldrade, magra / överviktiga) och kommer förhoppningsvis att bidra till att bättre förstå dynamiken hos LDs, vikten av deras interaktioner med andra komponenter i cellen, hur lipider lagras och metaboliseras i glykolytiska och oxidativa fibrer och deras roll i början av insulinresistens vid typ 2-diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) och Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. är mottagare av ett doktorandstipendium från FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. fick ett stipendium från Wallonie-Bruxelles International Excellence Program.
Författarna tackar Alice Monnier för hennes bidrag till utvecklingen av detta protokoll och Caroline Bouzin för hennes expertis och tekniska hjälp i bildförvärvsprocessen. Vi tackar också 2IP-IREC-bildplattformen för tillgång till kryostaten och mikroskopen (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Bryssel, Belgien). Slutligen vill författarna tacka Nicolas Dubuisson, Romain Versele och Michel Abou-Samra för konstruktiv kritik av manuskriptet. Några av figurerna i denna artikel skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AxioCam 506 mono 6 Mpix camera | Zeiss | ||
| AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera | Zeiss | ||
| Chemical hood | Potteau Labo | EN-14175 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM800 | |
| Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Cryo-Gloves | Tempshield | 16072252 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm Cryo Star HM 560 | |
| Dissecting Stereo Microscope SMZ745 | Nikon | ||
| Dry Ice | |||
| Dumont Forceps | F.S.T | 11295-10 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T | 14084-08 | |
| FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) | ThermoFisher | 22-363-552 | Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing |
| Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | BRAND Petri dish, MERK | BR455751 | Used to place the muscles on ice during dissection |
| ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen | Vector Labs | H-4000 | Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections |
| Incubator | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
| Microscope Cover Glasses (24x50 mm) | Assistent | 40990151 | |
| Microscope Slide Boxes | Kartell | 278 | Used as humid chambers for immunohistochemistry |
| Neck holder | Linie zwo | SB-035X-02 | Used as strap to hold the stainless steel tumbler |
| No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade | Swann-Morton | 0205 | |
| Paint brushes | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections |
| Permanent Marker Pen Black | Klinipath/VWR | 98307-R | Used to label slides |
| Pierce Fixation Forceps | F.S.T | 18155-13 | |
| Polystyrene Box | H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat | ||
| Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 | Aesculap | BB073R | |
| Stainless Steel Cup 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing |
| Superfrost Ultra Plus slides | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
| Surgical tweezers 1/2 teeth | Medische Vakhandel | 1303152 | Also called "Rat teeth tweezers" |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | F.S.T | 15000-00 | |
| Weighing boats | VWR international | 611-2249 | |
| Whole-Slide Scanner for Fluorescence | Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM | Abcam | ab175702 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher | A-21247 | Used at a final concentration of 1:500 |
| BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) | ThermoFisher | D3922 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) | ThermoFisher | D3835 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFisher | D1306 | Used at a final concentration of 0.5 µg/mL |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8418 | Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1004969011 | CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Isopentane GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. |
| Liquid Nitrogen | CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids. | ||
| Mouse on mouse Blocking Reagent | Vector Labs | MKB-2213-1 | Used at concentration of 1:30 |
| Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b | DSHB University of Iowa | BA-D5-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 | DSHB University of Iowa | SC-71-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | 6H1-supernatant | Used at a final concentration of 1:5 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Vector Labs | S-1000 | |
| PBS 0.1 M | Commonly used on histology laboratories | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) | Sigma-Aldrich | L0663 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | Confocal software | |
| BioRender | https://biorender.com/ | Used to design the figures | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | Used to analyse the acquired images | |
| Microsoft PowerPoint | Microsoft | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types | |
| Zen Blue 2.6 | Zeiss | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types |
References
- Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963 (2020).
- Miljkovic, I., et al. Greater skeletal muscle fat infiltration is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality in older men. Journals of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (9), 1133-1140 (2015).
- Nachit, M., et al. Myosteatosis rather than sarcopenia associates with non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease preclinical models. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 12 (1), 144-158 (2021).
- Aleixo, G. F. P., et al. Myosteatosis and prognosis in cancer: Systematic review and meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematolgoy. 145, 102839 (2020).
- Gemmink, A., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Exercising your fat (metabolism) into shape: a muscle-centred view. Diabetologia. 63 (8), 1453-1463 (2020).
- van Loon, L. J. Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 97 (4), 1170-1187 (2004).
- Coen, P. M., Goodpaster, B. H. Role of intramyocelluar lipids in human health. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23 (8), 391-398 (2012).
- Seibert, J. T., Najt, C. P., Heden, T. D., Mashek, D. G., Chow, L. S. Muscle lipid droplets: cellular signaling to exercise physiology and beyond. Trends in Endocrinology and Metabolism. 31 (12), 928-938 (2020).
- Bergman, B. C., Goodpaster, B. H. Exercise and muscle lipid content, composition, and localization: influence on muscle insulin sensitivity. Diabetes. 69 (5), 848-858 (2020).
- Nielsen, J., Christensen, A. E., Nellemann, B., Christensen, B. Lipid droplet size and location in human skeletal muscle fibers are associated with insulin sensitivity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 313 (6), 721-730 (2017).
- Covington, J. D., et al. Intramyocellular lipid droplet size rather than total lipid content is related to insulin sensitivity after 8 weeks of overfeeding. Obesity (Silver Spring). 25 (12), 2079-2087 (2017).
- Bosma, M. Lipid droplet dynamics in skeletal muscle). Experimental Cell Research. 340 (2), 180-186 (2016).
- Nielsen, J., et al. Increased subsarcolemmal lipids in type 2 diabetes: effect of training on localization of lipids, mitochondria, and glycogen in sedentary human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 298 (3), 706-713 (2010).
- Ferreira, R., et al. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria proteome differences disclose functional specializations in skeletal muscle. Proteomics. 10 (17), 3142-3154 (2010).
- Barrett, J. S., Whytock, K. L., Strauss, J. A., Wagenmakers, A. J. M., Shepherd, S. O. High intramuscular triglyceride turnover rates and the link to insulin sensitivity: influence of obesity, type 2 diabetes and physical activity. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism. , 1-14 (2022).
- Daemen, S., et al. Distinct lipid droplet characteristics and distribution unmask the apparent contradiction of the athlete's paradox. Molecular Metabolism. 17, 71-81 (2018).
- Bredella, M. A., Ghomi, R. H., Thomas, B. J., Miller, K. K., Torriani, M. Comparison of 3.0 T proton magnetic resonance spectroscopy short and long echo-time measures of intramyocellular lipids in obese and normal-weight women. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 32 (2), 388-393 (2010).
- Schrauwen-Hinderling, V. B., Hesselink, M. K., Schrauwen, P., Kooi, M. E. Intramyocellular lipid content in human skeletal muscle. Obesity (Silver Spring). 14 (3), 357-367 (2006).
- De Bock, K., et al. Evaluation of intramyocellular lipid breakdown during exercise by biochemical assay, NMR spectroscopy, and Oil Red O staining. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (1), 428-434 (2007).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochemistry and Cell Biology. 116 (1), 63-68 (2001).
- Gueugneau, M., et al. Skeletal muscle lipid content and oxidative activity in relation to muscle fiber type in aging and metabolic syndrome. Journal of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (5), 566-576 (2015).
- Gemmink, A., et al. Super-resolution microscopy localizes perilipin 5 at lipid droplet-mitochondria interaction sites and at lipid droplets juxtaposing to perilipin 2. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (11), 1423-1432 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 598358, (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), 77774 (2013).
- Strauss, J. A., Shepherd, D. A., Macey, M., Jevons, E. F. P., Shepherd, S. O. Divergence exists in the subcellular distribution of intramuscular triglyceride in human skeletal muscle dependent on the choice of lipid dye. Histochemistry and Cell Biology. 154 (4), 369-382 (2020).
- Shepherd, S. O., et al. Sprint interval and traditional endurance training increase net intramuscular triglyceride breakdown and expression of perilipin 2 and 5. Journal of Physiology. 591 (3), 657-675 (2013).
- Whytock, K. L., et al. A 7-day high-fat, high-calorie diet induces fibre-specific increases in intramuscular triglyceride and perilipin protein expression in human skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (6), 1151-1167 (2020).
- Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using h&e staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), (2017).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51586 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52793 (2015).
- Leiva-Cepas, F., et al. Laboratory methodology for the histological study of skeletal muscle. Archivos de Medicina del Deporte. 35 (186), 254-262 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 10 (3), 197-205 (1989).
- Komiya, Y., et al. Mouse soleus (slow) muscle shows greater intramyocellular lipid droplet accumulation than EDL (fast) muscle: fiber type-specific analysis. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 38 (2), 163-173 (2017).
- Andrich, D. E., et al. Altered lipid metabolism impairs skeletal muscle force in young rats submitted to a short-term high-fat diet. Frontiers in Physiology. 9, 1327 (2018).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiologica. 199 (4), 451-463 (2010).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Gemmink, A., et al. Decoration of intramyocellular lipid droplets with PLIN5 modulates fasting-induced insulin resistance and lipotoxicity in humans. Diabetologia. 59 (5), 1040-1048 (2016).
- Askinas, C., et al. Biophotonics Congress: Biomedical Optics Congress 2018 (Microscopy/Translational/Brain/OTS). , JTu3A.4 (Optical Society of America) (2018).
- Morén, B., et al. EHD2 regulates adipocyte function and is enriched at cell surface-associated lipid droplets in primary human adipocytes. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1147-1159 (2019).
- Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
- de la Rosa Rodriguez, M. A., et al. Hypoxia-inducible lipid droplet-associated induces DGAT1 and promotes lipid storage in hepatocytes. Molecular Metabolism. 47, 101168 (2021).
- Jevons, E. F. P., Gejl, K. D., Strauss, J. A., Ørtenblad, N., Shepherd, S. O. Skeletal muscle lipid droplets are resynthesized before being coated with perilipin proteins following prolonged exercise in elite male triathletes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 318 (3), 357-370 (2020).
- Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochemistry and Cell Biology. 124 (5), 445-452 (2005).
- Prats, C., et al. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine. Journal of Lipid Research. 47 (11), 2392-2399 (2006).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24 (Unit 24.22) (2007).
- Xue, Y., Lim, S., Bråkenhielm, E., Cao, Y. Adipose angiogenesis: quantitative methods to study microvessel growth, regression and remodeling in vivo. Nature Protocols. 5 (5), 912-920 (2010).
- Muliyil, S., et al. ADAM17-triggered TNF signalling protects the ageing Drosophila retina from lipid droplet-mediated degeneration. The EMBO Journal. 39 (17), 104415 (2020).
- Yan, Q., et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis. Cell Death Discovery. 4, 2 (2018).
- Coassin, S., et al. Investigation and functional characterization of rare genetic variants in the adipose triglyceride lipase in a large healthy working population. PLoS Genetics. 6 (12), 1001239 (2010).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Chen, Q., et al. Rab8a deficiency in skeletal muscle causes hyperlipidemia and hepatosteatosis by impairing muscle lipid uptake and storage. Diabetes. 66 (9), 2387-2399 (2017).
- Gemmink, A., et al. Decoration of myocellular lipid droplets with perilipins as a marker for in vivo lipid droplet dynamics: A super-resolution microscopy study in trained athletes and insulin resistant individuals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (2), 158852 (2021).
- Bergman, B. C., Hunerdosse, D. M., Kerege, A., Playdon, M. C., Perreault, L. Localisation and composition of skeletal muscle diacylglycerol predicts insulin resistance in humans. Diabetologia. 55 (4), 1140-1150 (2012).
