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Medicine

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63718
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

Summary

La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.

Abstract

La infiltración de lípidos del músculo esquelético, conocida como miosteatosis, aumenta con la obesidad y el envejecimiento. La miosteatosis también se ha descubierto recientemente como un factor de pronóstico negativo para varios otros trastornos como las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. La infiltración excesiva de lípidos disminuye la masa muscular y la fuerza. También resulta en lipotoxicidad y resistencia a la insulina dependiendo del contenido total de lípidos intramiocelulares, la morfología de las gotas lipídicas (LD) y la distribución subcelular. El tipo de fibra (oxidativa vs glucolítica) también es importante, ya que las fibras oxidativas tienen una mayor capacidad para utilizar lípidos. Debido a sus implicaciones cruciales en la fisiopatología, se justifican estudios en profundidad sobre la dinámica y la función de la DA de una manera específica del tipo de fibra.

Aquí, se presenta un protocolo completo para la cuantificación del contenido de lípidos intramiocelulares y el análisis de la morfología de LD y la distribución subcelular de una manera específica del tipo de fibra. Con este fin, las criosecciones musculares en serie se tiñeron con el tinte fluorescente Bodipy y anticuerpos contra las isoformas de cadena pesada de miosina. Este protocolo permite el procesamiento simultáneo de diferentes músculos, ahorrando tiempo y evitando posibles artefactos y, gracias a una macro personalizada creada en Fiji, también es posible la automatización del análisis LD.

Introduction

La infiltración de lípidos del músculo esquelético, conocida como miosteatosis, aumenta con la obesidad y el envejecimiento. La miostetosis se correlaciona negativamente con la masa muscular y la fuerza y con la sensibilidad a la insulina1. Además, estudios recientes indican que el grado de miosteatosis podría usarse como factor pronóstico para otras afecciones como la enfermedad cardiovascular2, la enfermedad del hígado graso no alcohólico3 o el cáncer4. Los lípidos pueden acumularse en el músculo esquelético entre las fibras musculares como lípidos extramiocelulares o dentro de las fibras, como lípidos intramiocelulares (MMCL). Los MMCL se almacenan predominantemente como triglicéridos en gotas lipídicas (LD) que se utilizan como combustible metabólico durante el ejercicio físico 5,6. Sin embargo, cuando el suministro de lípidos excede la demanda, o cuando las mitocondrias se vuelven disfuncionales, las MMCL estarán implicadas en la resistencia muscular a la insulina, como se ve en individuos obesos metabólicamente insalubres y en pacientes con diabetes tipo 27. Curiosamente, los atletas de resistencia tienen niveles similares, si no más altos, de MMCL a los que se encuentran en pacientes obesos con diabetes mellitus tipo 2, mientras que mantienen una alta sensibilidad a la insulina. Este fenómeno se describe como la "paradoja del atleta"8,9, y se explica por una evaluación más matizada de los LD musculares, relacionados con su tamaño, densidad, localización, dinámica y composición de especies lipídicas.

En primer lugar, el tamaño de la DA está inversamente correlacionado con la sensibilidad a la insulina y la aptitud física10,11. De hecho, los LD más pequeños exhiben un área de superficie relativamente mayor para la acción de la lipasa y, por lo tanto, potencialmente tienen una mayor capacidad para movilizar lípidos12. En segundo lugar, la densidad de LD (número/superficie) juega un papel controvertido en la acción de la insulina 8,10; sin embargo, parece estar aumentado en los atletas. En tercer lugar, la localización subcelular de los LD es importante, ya que los LD situados justo debajo de la membrana superficial (subsarcolémmica o periférica) ejercen un efecto más perjudicial sobre la sensibilidad a la insulina que los centrales 8,9,13. Estos últimos proporcionan combustible a las mitocondrias centrales, que tienen una mayor actividad respiratoria y están más especializadas para satisfacer la alta demanda de energía requerida para la contracción14. Por el contrario, los LD periféricos suministran mitocondrias subsarcolemmales, que están involucradas en procesos relacionados con la membrana8. Finalmente, más allá de los triglicéridos, los lípidos complejos específicos dentro del músculo pueden ser más perjudiciales que otros. Por ejemplo, el diacilglicerol, el acil-CoA de cadena larga y las ceramidas pueden acumularse en el músculo cuando la tasa de renovación de triglicéridos es baja, lo que afecta la señalización de la insulina 9,15. Volviendo a la "paradoja del atleta", los atletas de resistencia tienen un alto número de LD centrales más pequeños con tasas de rotación elevadas en fibras tipo I (oxidativas), mientras que los pacientes obesos y diabéticos tienen LD periféricos más grandes con bajas tasas de renovación en fibras tipo II (glucolíticas) 8,15,16. Además de su papel en el almacenamiento y liberación de energía, los LD a través de ácidos grasos derivados (FA) y una proteína de capa (perilipina 5) también podrían funcionar como actores críticos involucrados en la regulación transcripcional de la oxidación de FA y la biogénesis mitocondrial8. Debido a sus implicaciones cruciales en fisiología y fisiopatología, se justifican estudios en profundidad sobre la dinámica y las funciones de los LD.

Aunque existen varias técnicas para estudiar las IGMCL, no todas son adecuadas para cuantificar con precisión el tamaño, la densidad y la distribución de la LD de una manera específica de la fibra. Por ejemplo, la evaluación de los MMCL por espectroscopia de resonancia magnética, si bien no es invasiva, ofrece un nivel de resolución que no es suficiente para estudiar el tamaño y la ubicación precisa de los LD dentro de la fibra, y no es específico del tipo de fibra17,18. Del mismo modo, las técnicas bioquímicas realizadas en homogeneizados de músculo entero19 no pueden evaluar la ubicación y el tamaño de los lípidos. En consecuencia, el método más adecuado para analizar la morfología y la ubicación de la DA es la microscopía electrónica de transmisión cuantitativa13, pero esta técnica es costosa y requiere mucho tiempo. Por lo tanto, la imagen de fluorescencia confocal en preparaciones con colorantes como Oil Red O (ORO)20,21, monodansilipentano (MDH)22 o Bodipy 23,24,25, se ha convertido en la mejor herramienta para estos estudios.

Aquí, se describe un protocolo completo, que incluye muestreo y procesamiento de tejidos, tinción de Bodipy y adquisición y análisis de imágenes confocales para cuantificar el tamaño, el número y la localización de LD en criosecciones musculares de ratón. Dado que los MMCL no están distribuidos uniformemente entre las fibras oxidativas y glucolíticas, y cada tipo de fibra regula la dinámica de la LD de manera diferente, el estudio de los MMCL debe ser específico del tipo de fibra 16,25,26,27. Por lo tanto, este protocolo utiliza inmunofluorescencia en secciones seriadas para identificar las isoformas de cadena pesada de miosina (MyHC) expresadas por cada fibra. Otra ventaja de este protocolo es el procesamiento simultáneo de un músculo glicolítico (extensor digitorum longus, EDL) y oxidativo (sóleo) colocados uno al lado del otro antes de la congelación (Figura 1). Este procesamiento simultáneo no solo ahorra tiempo, sino que también evita la variabilidad debido al procesamiento separado de las muestras.

Figure 1
Figura 1: Descripción general esquemática del procedimiento. Después de la disección muscular (1), los músculos seleccionados de tamaño similar se preparan y congelan juntos (2). Las secciones transversales en serie de 10 μm se obtienen mediante un criostato y se montan directamente en portaobjetos de adhesión (3). A partir de dos diapositivas seriadas, la primera (4A) está inmunomarcada para laminina y teñida con Bodipy para reconocer las LD y la segunda (4B) está inmunoteñida con anticuerpos contra MyHCs para el reconocimiento de tipos de fibras musculares. Las imágenes se adquieren utilizando un microscopio confocal para Bodipy (5A) y un microscopio de epifluorescencia para tipos de fibras musculares (5B). Las imágenes se analizan en Fiji aplicando un umbral y cuantificando partículas (6A) para obtener el número, tamaño medio, densidad y porcentaje del área total ocupada por LD (7) o celdas de conteo (6B) para obtener el porcentaje de fibras de cada tipo en la sección (7). Abreviaturas: LD = gotas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoformas de cadena pesada de miosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

Todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Comité Ético para la Experimentación Animal del Sector Médico de la Universidad Católica de Lovaina (2019/UCL/MD/013).

1. Disección y preparación de las muestras para su congelación

  1. Etiquete un trozo de corcho de 3 mm de grosor para cada par de músculos.
  2. A través de una pequeña incisión realizada con una cuchilla en el centro del corcho, insertar perpendicularmente una pieza rectangular de plástico rígido (0,5 cm W, 1 cm H) que servirá de soporte (Figura 2B).
    NOTA: El tamaño de la pieza de plástico rectangular dependerá del tamaño del músculo. Aquí, las dimensiones descritas se adaptan al tamaño del sóleo (~ 9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) y EDL (~ 5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) de un ratón macho C57BL / 6J de 3 meses de edad.
  3. En el momento de la disección, retire el sóleo y el EDL de la extremidad posterior del ratón. Para evitar que las muestras se sequen durante la disección, colóquelas en una compresa ligeramente humedecida con solución salina en una placa de Petri colocada sobre hielo.
    NOTA: Ver Wang et al.28 para explicaciones sobre cómo diseccionar estos dos músculos de las extremidades.
  4. Coloque una pequeña gota de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en la unión corcho/plástico, evitando burbujas de aire.
  5. Elimine el exceso de humedad de las muestras secándolas suavemente con una toalla de papel (Figura 2A) y coloque ambos músculos sobre el plástico perpendicular al corcho (Figura 2C).
  6. Compruebe la orientación de las miofibras musculares bajo un microscopio estereoscópico (Figura 2D).
    NOTA: Es importante no cubrir el músculo con OCT, ya que su efecto aislante evitaría la congelación rápida y producirá artefactos de congelación.

2. Congelación de muestras de músculo esquelético para criosecciona

PRECAUCIÓN: La congelación del músculo debe hacerse bajo una capucha química, usando el equipo de protección personal apropiado (consulte la Tabla de Materiales).

  1. Use un vaso de acero inoxidable (~ 8 cm H, 6 cm Ø) con dos correas laterales unidas a él de al menos 25 cm de largo (Figura 2F), y llene el vaso hasta 2/3 de su capacidad con isopentano.
  2. Agarrando el vaso por las correas, sumérjalo suavemente en una caja de poliestireno llena de nitrógeno líquido para que el nivel de nitrógeno fuera del recipiente esté por encima del nivel de isopentano en el interior (Figura 2F, G).
    PRECAUCIÓN: Cuando el vaso entra en contacto con el nitrógeno, el choque térmico puede causar remolinos. Asegúrese de que el vaso esté lo suficientemente sumergido, pero evite la entrada de nitrógeno, ya que esto causaría precipitación de isopentano. Si esto sucede, deje que el isopentano se enfríe, llene el vaso con nuevo isopentano y comience de nuevo.
  3. Cuando el interior del vaso esté completamente cubierto con una capa sólida blanca de isopentano, sáquelo de la caja de nitrógeno líquido (Figura 2H).
    NOTA: La temperatura de fusión del isopentano es de -159 ° C, los bordes del vaso se volverán blancos cuando esté lo suficientemente frío.
  4. Revuelva suavemente las piezas de isopentano sólido en el isopentano líquido restante con fórceps hasta que todo el volumen vuelva a ser líquido.
  5. Vuelva a sumergir el vaso en el nitrógeno líquido hasta que el isopentano forme guijarros blancos en toda la parte inferior y los bordes del vaso (Figura 2G, H).
    NOTA: Este segundo paso de enfriamiento asegura la temperatura de congelación adecuada del isopentano.
  6. Retire el vaso del nitrógeno líquido y sumerja rápidamente los músculos en la parte inferior del vaso, sosteniendo el corcho con pinzas de dientes de rata. Gire el corcho durante 15 s en el isopentano y guárdelo a -80 °C hasta su procesamiento (Figura 2I).
    NOTA: Para el almacenamiento a corto plazo, las muestras se pueden mantener en un congelador de -20 °C. El protocolo completo para la congelación rápida del músculo esquelético ya se ha publicado en otros lugares. Para referencias detalladas y solución de problemas, ver: Meng et al.29, Kumar et al.30, y Leiva-Cepas et al.31.

3. Crioseccionación

  1. Llevar las muestras a la cámara de un criostato previamente enfriado a -20 °C y la temperatura de la cuchilla ajustada a -25 °C.
    NOTA: Transporte las muestras desde el congelador de -20 °C/-80 °C hasta el criostato en una caja de poliestireno llena de hielo seco y permita que las muestras se equilibren durante al menos 20-30 minutos a la temperatura de la cámara antes del corte.
  2. Retire el plástico del corcho con pinzas finas y coloque el disco de muestra de criostato en la placa de congelación rápida para que se enfríe. Una vez que la placa haya alcanzado los -50 °C, coloque un poco de OCT en el disco y coloque rápidamente el corcho en la parte superior del disco, presionando firmemente. Espere hasta que la OCT se solidifique y el corcho esté bien fijado en el disco.
  3. Coloque el disco en la cabeza del objeto en la orientación de corte deseada (Figura 2J, K) y recorte el bloque muscular más allá de al menos 1/3 de la longitud de los músculos y hasta que ambas secciones transversales de los músculos sean visibles.
  4. Ajuste el espesor de corte a 10 μm y coloque una sección en una diapositiva de adhesión para verificar la orientación correcta de las fibras en un microscopio de campo brillante.
    NOTA: Verificar la orientación transversal de las fibras es crítico. Si las fibras no están adecuadamente orientadas, ajuste el ángulo de la cabeza del objeto, corte otra sección y verifique nuevamente.
  5. Coloque dos secciones transversales en serie en dos diapositivas de adhesión preetiquetadas: una diapositiva para determinar los tipos de fibra, la otra para cuantificar el contenido de lípidos (Figura 2L).
    NOTA: Se pueden obtener secciones transversales seriales adicionales y mantenerlas a -80 °C para otros estudios histológicos. Sin embargo, para evitar alterar el contenido de lípidos y la morfología intracelular24, es esencial procesar las dos primeras diapositivas inmediatamente después del corte para evitar el secado al aire. Congelar y descongelar las diapositivas para la cuantificación de LD tendría el mismo efecto y, por lo tanto, es muy desaconsejable.

4. Tipificación de fibra y tinción de Bodipy

  1. Detección inmunohistoquímica del tipo de fibra muscular
    NOTA: Para el siguiente protocolo, un volumen total de solución de 250 μL es suficiente para cubrir toda la sección muscular rodeada por un círculo dibujado con una pluma hidrofóbica del tamaño aproximado de una moneda de 1 centavo.
    1. Rodee las secciones con un contorno dibujado con una pluma hidrofóbica y enjuague con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada de 0,1 M durante 1 min a temperatura ambiente (RT). Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda y bloquee durante 90 min a 37 °C en solución de bloqueo (10% de suero normal de cabra (NGS) y reactivo de bloqueo de ratón sobre ratón (MOM) 1:30 en PBS).
    2. Retire la solución bloqueadora e incube los portaobjetos durante 90 min a 37 °C con la solución que contiene los anticuerpos primarios (5% NGS, reactivo bloqueador MOM 1:30, los anticuerpos primarios del ratón para reconocer las fibras de tipo I (IgG2b, a 1:10), tipo IIa (IgG1, a 1:10) y tipo IIx (IgM, a 1:5) y una antilaminina de rata (cadena α2, 1:1.000) en PBS.
    3. Lave las diapositivas con PBS 3 x 5 min en RT.
    4. Incubar los portaobjetos en la oscuridad durante 1 h a RT con la solución que contiene los anticuerpos secundarios (cabra anti-IgG2b AF405 (1:500), cabra anti-IgG1 AF488 (1:500), cabra anti-IgM AF568 (1:1.000) y cabra anti-laminina AF647 (1:500) en PBS).
      PRECAUCIÓN: Para el resto del protocolo, asegúrese de mantener las diapositivas alejadas de la luz para preservar la fluorescencia.
    5. Lavar de nuevo 3 x 5 min en PBS, enjuagar en doble destilación H2O, eliminar el exceso de agua y montar con un reactivo antidesagras.
      NOTA: Guarde las diapositivas a 4 °C, protegidas de la luz para preservar la fluorescencia hasta la adquisición de la imagen. Dado que las diapositivas no son fijas, se recomienda utilizar soluciones recién hechas para cada experimento, autoclave el PBS y adquirir las imágenes lo antes posible para evitar la contaminación de las secciones.
  2. Tinción de LD con Bodipy
    NOTA: Similar al paso 4.1., un volumen total de solución de 250 μL es suficiente para cubrir toda la sección muscular rodeada por un círculo dibujado con una pluma hidrofóbica del tamaño aproximado de una moneda de 1 centavo.
    1. Rodee las secciones con un contorno dibujado por una pluma hidrofóbica y enjuague con PBS 0.1 M helado durante 10 minutos en RT. Use PBS helado para todos los enjuagues y lavados.
    2. Fijar con paraformaldehído (PFA) al 4% en frío sin metanol durante 10 min a RT. Después de un primer enjuague rápido, lave las diapositivas con PBS 3 x 5 min en RT.
      PRECAUCIÓN: Realice este paso bajo una capucha química.
    3. Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda y bloquee durante 1 h en RT con 5% NGS en PBS.
    4. Incubar los portaobjetos durante 90 min a 37 °C con la solución del anticuerpo primario (NGS al 2% y antilaminina de rata (cadena α2, 1:1.000) en PBS). Lave las diapositivas con PBS 3 x 5 min en RT.
      PRECAUCIÓN: Para el resto del protocolo, asegúrese de mantener las diapositivas alejadas de la luz para preservar la fluorescencia.
    5. Incubar durante 1 h a RT con la solución secundaria de anticuerpos que contiene anticuerpos anti-rat-AF647 de cabra (1:500) en PBS. Lave las diapositivas con PBS 3 x 5 min en RT.
    6. Incubar durante 20 min a RT con una solución de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0,5 μg/mL) y BODIPY (1 μg/mL) en PBS.
      NOTA: Para preparar la solución madre de BODIPY, disolverla en DMSO a una concentración de 1 mg/ml. Diferentes formulaciones de Bodipy están disponibles comercialmente para la tinción de LD. Dependiendo de la elección realizada, el método de tinción es el mismo (mismos pasos, concentración y tiempo de incubación); sin embargo, el método de adquisición será ligeramente diferente.
    7. Después de un primer enjuague rápido, lave las diapositivas con PBS 3 x 5 min en RT, enjuague en H2O de doble destilación, elimine el exceso de agua y monte con un reactivo antifade.
      NOTA: Guarde las diapositivas a 4 °C, protegidas de la luz, para preservar la fluorescencia hasta la adquisición de la imagen.

5. Adquisición de imágenes

NOTA: Una vez completados los protocolos de tinción, es importante proceder inmediatamente a la adquisición de la imagen (dentro de las siguientes 24 h), no solo para evitar la contaminación sino también para preservar la morfología, el tamaño y el número de LD.

  1. Adquisición de imágenes para evaluar los tipos de fibra de cada músculo muestreado
    NOTA: Este paso podría lograrse con un microscopio de barrido de fluorescencia de portaobjetos completo o con un microscopio de epifluorescencia convencional. Con este último, se debe hacer una costura manual o automatizada de las imágenes para reconstruir la sección.
    1. Para el reconocimiento de tipo de fibra, use un microscopio de epifluorescencia con un objetivo de 10x/ 0.3. Seleccione filtros de excitación para DAPI (405 nm), FITC, TRITC y Cy5 para detectar fibras de tipo I, IIa, IIx y laminina, respectivamente.
      NOTA: Las fibras de tipo IIb no estarán inmunomarcadas. Se reconocerán como fibras teñidas por laminina en los límites del sarcolema con un sarcoplasma negro.
    2. Ajuste el tiempo de exposición adecuado para cada canal.
    3. Cuando se utilice un microscopio de epifluorescencia convencional, adquirir siempre las imágenes de todo el músculo siguiendo el mismo orden para facilitar la reconstrucción muscular. Asegúrese de que las fibras en el borde derecho de una imagen también aparezcan en el borde izquierdo de la siguiente imagen. Lo mismo se aplica a las partes superior e inferior de las imágenes (Figura 3A).
      NOTA: Como referencia, para una sección del EDL o el sóleo diseccionado de un ratón de 3 meses de edad, un promedio de seis y ocho imágenes, respectivamente, cubrirán toda la sección transversal muscular.
    4. Después de escanear el músculo, cargue las imágenes digitales capturadas en cualquier software de procesamiento de imágenes para la reconstrucción (costura), según la morfología de la fibra (laminina) y la histología de la sección muscular, y guárdelo como un archivo TIFF, PNG o JPG con todos los canales (colores) fusionados (Figura 3A).
  2. Adquisición de imágenes con laminina y co-tinción bodipy
    NOTA: Para reconocer el tipo de fibra y tener una estimación del número de fibras para cada tipo capturado, es esencial tener la sección de tipo de fibra ya escaneada y los músculos reconstruidos antes de comenzar la adquisición de imágenes de Bodipy-laminin (Figura 3B).
    1. Para la observación y adquisición de imágenes bodipy, utilice un microscopio confocal con una lente de objetivo de inmersión en aceite de 40x con una apertura numérica de 1.4.
    2. Utilice los siguientes ajustes: agujero de alfiler a 1 UA, resolución de 2.048 píxeles x 2.048 píxeles, tamaño de píxel a 0,08 μm, modo unidireccional, velocidad de escaneo a 4 (~4 μs/píxel), promedio de línea establecido en 4x y zoom digital establecido en 1.
    3. Para evitar la diafonía entre Bodipy-558/568 y laminina-AF647, utilice el modo de escaneo secuencial en el software confocal.
      NOTA: Cuando el tinte elegido es Bodipy-493/503, es posible el escaneo láser confocal simultáneo sin diafonía entre el canal Bodipy y el canal laminina-AF647. Esto acelerará la adquisición de imágenes.
    4. Excite Bodipy-493/503 usando la línea láser de 488 nm o la línea láser de argón, y excite Bodipy-555/568 usando la línea láser de diodo de 561 nm. Finalmente, detecte laminina-AF647 con una línea láser de diodo de 640 nm.
      PRECAUCIÓN: Tenga en cuenta que las moléculas de Bodipy son muy sensibles al fotoblanqueo, así que evite el escaneo láser innecesario. Para reconocer las fibras, use solo el láser para laminina.
    5. Dependiendo del tinte elegido, establezca los rangos de emisión en 570-650 nm para Bodipy-493/50324 y en 565-620 nm para Bodipy-558/568. Establezca el rango de emisión para laminina en 656-700 nm.
    6. Configure la ganancia y la ganancia digital de manera adecuada para que no se detecten píxeles saturados en el indicador de rango. Corrija la señal de fondo ajustando el desplazamiento.
      NOTA: La selección del filtro y otros parámetros de escaneo mencionados anteriormente deben optimizarse para cada microscopio confocal. Es importante que todos los ajustes mencionados anteriormente se mantengan constantes para que se comparen todas las imágenes capturadas de las muestras.
    7. Para identificar el tipo de fibra entre las visualizadas en el microscopio confocal, use una computadora portátil personal en la que se verifique la imagen de la sección reconstruida después de la inmunodetección de tipo fibra (Figura 3B).
    8. Una vez que un grupo de fibras está correctamente identificado, adquiere la imagen con los canales Bodipy y laminin.
      NOTA: Se recomienda anotar el nombre de la imagen bodipy-laminin en la región del músculo donde se encuentran estas fibras en la imagen adquirida para el reconocimiento MyHC para facilitar el análisis posterior específico de la fibra de los LD.

6. Análisis de imágenes

  1. Análisis de los tipos de fibra en cada muestra muscular
    1. En Fiji (o ImageJ)32, abra el archivo TIFF, PNG o JPG con el músculo reconstruido obtenido de la fusión de todos los canales utilizados para detectar las isoformas de fibra.
    2. Para iniciar la herramienta de conteo de celdas , haga clic en Plugins | Analizar | | de contador de celdas Contador de celdas.
    3. En la ventana Contador de celdas , haga clic en Acciones | Inicializar.
    4. En Contadores de la misma ventana, seleccione Tipo 1.
    5. En la ventana principal de Fiji, seleccione la herramienta Varita .
    6. Para cuantificar el número de fibras de cada tipo, haga clic en cada fibra del mismo tipo, de modo que el programa registre el número de fibras en las que se hizo clic.
    7. Una vez terminado, selecciona el siguiente tipo de fibra y repite los mismos pasos.
    8. Cuando todas las fibras de la imagen se hayan asignado a un tipo de fibra determinado, haga clic en Resultados en la ventana Contador de celdas para mostrar los resultados en una tabla.
    9. Guarde esta tabla como una tabla de hoja de cálculo haciendo clic en archivo | Guardar como en la ventana Resultados .
    10. Guarde y vuelva a cargar las selecciones en la misma imagen en cualquier momento haciendo clic en Guardar marcadores o Cargar marcadores, respectivamente, en la ventana Recuento de celdas .
  2. Análisis de gotitas lipídicas de forma dependiente del tipo de fibra
    1. Analizar las imágenes de Bodipy y laminina obtenidas en el confocal utilizando Fiji para la cuantificación de LDs.
      NOTA: Los autores diseñaron una macro personalizada para automatizar el análisis. Esta macro, junto con una explicación paso a paso sobre cómo usarla, está disponible como Archivo suplementario 1 y Archivo suplementario 2, respectivamente.
    2. Abra cada imagen con la ayuda del Importador de Bioformatos de Fiji. En la opción Ver pila con , seleccione Hyperstack | Modo de color, predeterminado. Asegúrese de que la ventana Escala automática está seleccionada.
      NOTA: Los siguientes pasos describirán el protocolo para el análisis de una fibra en la imagen, pero debe repetirse tantas veces como el número de fibras enteras aparezcan en la imagen.
    3. Utilice la herramienta de selección a mano alzada para seleccionar manualmente el sarcolema de la fibra en función del canal de laminina (Figura 4A) y presione T en el teclado para grabar la selección o región de interés (ROI) en la ventana de ROI .
    4. Vaya a la ventana principal de Fiji y haga clic en Analizar | Establezca Medidas y, en la ventana emergente, seleccione Área y diámetro de Feret. Deje las casillas restantes sin marcar y otros parámetros tal como aparecen de forma predeterminada.
    5. Haga clic en Medir en la ventana ROI para obtener el Área y el Diámetro Mínimo de Feret (MF) de la fibra seleccionada, y anótelos para su uso posterior.
      NOTA: Al analizar los LD, es importante tener en cuenta que su tamaño y densidad varían entre el centro y la periferia (región subsarcolemmal-SS) de la fibra. Por lo tanto, el análisis debe hacerse por separado.
    6. Calcula el valor de 1/6 del MF para delimitar la parte central de la fibra.
      NOTA: En la macro, el valor MF predeterminado se establece en 6, lo que significa que la reducción aplicada se establecerá como 1/6 del MF. Este valor se eligió en base a los datos empíricos obtenidos del sóleo de animales alimentados con una dieta alta en grasas. Sin embargo, cada investigador debe cambiar este número en función de los datos empíricos y el músculo analizado, el tipo de fibra y la condición animal.
    7. En la ventana ROI , haga clic en Agregar para tener un duplicado del primer ROI y seleccione el segundo ROI que aparece en la ventana.
    8. En la ventana principal de Fiji, haga clic en Editar | Selección | Amplíe e introduzca el valor calculado previamente (del paso 6.2.6.) con un signo menos antes del número y haga clic en Aceptar. En la ventana roi, haga clic en Add[t] (debe aparecer un tercer ROI) y Delete, para eliminar el segundo ROI.
      NOTA: El investigador puede verificar los resultados haciendo clic en el cuadro Mostrar todo en la ventana ROI . En este punto, deben aparecer dos ROI, uno que rodea todo el perímetro de la fibra (Figura 4B) y otro que se coloca en el centro (Figura 4C).
    9. Seleccione ambos ROI en la ventana ROI y haga clic en Más | | XOR Añadir[t]. Espere a que aparezca un tercer ROI, que corresponde a la periferia de la fibra (Figura 4D).
    10. Guarde los ROI haciendo clic en Más | Ahorre para guardar los ROI en caso de que se necesite un reanálisis posterior de las mismas fibras.
    11. Seleccione el canal Bodipy y abra la herramienta Umbral haciendo clic en Imagen | Ajustar | Umbral en la ventana principal de Fiji.
    12. En la ventana emergente Umbral , establezca los valores en 70/255, seleccione Yen | Método B&W y haga clic en Fondo oscuro | Aplicar.
      NOTA: Los valores aplicados en el umbral pueden variar en función de las condiciones del experimento y el umbral debe establecerse adecuadamente para optimizar el análisis. Debe aparecer una ventana en blanco y negro con la señal bodipy por encima del límite umbral que se muestra en blanco y el fondo en negro (compare la imagen original de Bodipy en la Figura 4E con la de la Figura 4F).
    13. Vaya a la ventana principal de Fiji y haga clic en Analizar | Establezca Mediciones y, en la ventana emergente, seleccione Área, Fracción de área y Límite al umbral. Deje las casillas restantes sin marcar y otros parámetros tal como aparecen de forma predeterminada.
      NOTA: Si el investigador desea analizar la "circularidad" de los LD, que es un índice de la morfología esférica que varía de 1 para una esfera perfecta a 0 para una línea, haga clic en el cuadro Descriptores de forma de la ventana emergente Establecer medidas .
    14. Vaya a la ventana roi y seleccione el primer ROI. En la ventana principal de Fiji, haga clic en Analizar | Herramienta Analizar partículas.
      NOTA: Esta herramienta cuantifica el número, el tamaño, el área cubierta y el porcentaje del área total cubierta por partículas en cada selección y guarda los resultados como un archivo de hoja de cálculo.
    15. Establezca los valores de 2 a Infinito (2-Infinito) en la ventana Analizar partículas , marque la casilla Píxeles , mantenga los valores de circularidad predeterminados, seleccione Resumir y haga clic en Aceptar.
      NOTA: Para comprobar los resultados en la fibra, en la opción Mostrar , seleccione cualquiera de las opciones disponibles. Para que la información de cada LD se reconozca en la selección en una tabla, marque la opción Mostrar resultados en la ventana Analizar partículas . Los resultados del análisis del área total de la fibra se promedian y resumen en una tabla con varias columnas (Conteo, Área Total, Tamaño promedio, % Área; estos corresponden al número de partículas [LD], el área ocupada por estas partículas, su tamaño promedio y el porcentaje del área total de la selección ocupada por partículas, respectivamente). Para calcular la densidad, divida el número de partículas por el área total de cada selección.
    16. Para obtener los valores del centro y la periferia de la fibra, repita los pasos 6.2.14 y 6.2.15, seleccionando el segundo (centro) y el tercer ROI (periferia) cada vez.
    17. Guarde los resultados haciendo clic en archivo | Guardar como en la ventana Resumen .
      NOTA: Incluya el tipo de fibra, la condición y el nombre de la imagen en el nombre asignado de los resultados para facilitar la unificación posterior y el análisis estadístico de los datos. Para analizar el resto de las fibras de la misma imagen, repita los pasos 6.2.3 a 6.2.17. Para el análisis estadístico, se deben analizar al menos 10-15 fibras de cada tipo por animal.

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Representative Results

El protocolo descrito en este documento proporciona un método eficiente para cuantificar fácilmente los LD de una manera específica de tipo de fibra y subcelular. Muestra cómo, al congelar juntos dos músculos de tamaño similar, como el EDL y el sóleo, el tiempo y los recursos gastados en los siguientes pasos se reducen a la mitad.

Se proporciona un protocolo completo para la inmunotinción, la adquisición de imágenes y el análisis de las diferentes isoformas MyHC expresadas en los músculos del ratón adulto. Este protocolo se basa en el diseñado por primera vez por Schiaffino et al. en 198933, con algunos ajustes como el uso de un anticuerpo adicional para etiquetar la laminina. Esta modificación posterior es crítica para la ubicación de las fibras tipo IIb, que serán negras ya que no están teñidas con ningún anticuerpo. Como se muestra en la Figura 5, este protocolo inmunohistoquímico no solo permite el reconocimiento de fibras de ratón lentamente oxidativas (tipo I y IIa) y glucolíticas rápidas (tipo IIx e IIb), sino también la presencia de fibras híbridas (ver asterisco en la Figura 5D). Además, tener las secciones transversales de ambos músculos en la misma diapositiva permite la comparación de las proporciones de cada tipo de fibra entre los dos músculos seleccionados, asegurando que las condiciones experimentales fueran idénticas en ambas secciones.

Para el etiquetado de LD, los resultados presentados aquí se basan en el uso de Bodipy-558/568 C12 como colorante lipídico; sin embargo, se remite al lector a un excelente documento de protocolo que detalla el uso del tinte clásico Bodipy-493/503 en las secciones musculares23. El protocolo presentado combinó la tinción de LD basada en inmunohistoquímica contra α2-laminina para distinguir el sarcolema de fibra. Al igual que con el experimento de tipo fibra, este paso es esencial, no solo para el reconocimiento de fibras individuales, sino también para el análisis posterior de lípidos en las regiones central y periférica de las fibras (Figura 4). Uno de los pasos críticos de este protocolo es la identificación y etiquetado de las mismas fibras en las dos diapositivas. Como se explicó anteriormente, es importante escanear la diapositiva con tipos de fibra y tener la reconstrucción de las secciones transversales musculares con los colores fusionados antes de la adquisición de imágenes para LDs (Figura 3B). Las estructuras notables de cada sección muscular, como las ramitas de axón o los husos musculares, son buenos puntos de referencia que podrían ayudar al investigador a localizar las mismas fibras en ambas diapositivas (Figura 6). Recuerde que debido a que la diapositiva se coloca boca abajo en la mayoría de los microscopios confocales, se recomienda invertir la imagen reconstruida de tipo fibra en la computadora personal para facilitar la tarea de ubicación.

Los ajustes descritos para la adquisición de la tinción de Bodipy-laminina por microscopía confocal permiten la visualización y posterior análisis del tamaño, número y distribución de LD de tres a seis fibras simultáneamente (Figura 6 y Figura 7). Aquí también se proporciona un protocolo detallado paso a paso para analizar los LD con el software de análisis de imágenes Fiji. Como se muestra en el protocolo, el análisis completo de cada una de las fibras presentes en una imagen es largo y tedioso. Sin embargo, Fiji tiene la ventaja de permitir el diseño de programas personalizados, llamados macros, basados en el lenguaje Java. Los autores diseñaron una macro que permite la automatización de la serie de comandos individuales descritos anteriormente que se ejecuta automáticamente en un bucle para analizar en pocos minutos, no solo cada una de las fibras presentes en una imagen, sino también un gran conjunto de imágenes. La única aportación del investigador es la selección manual del perímetro de la fibra a analizar cada vez, la selección del tipo de fibra y la inspección visual de la imagen resultante después de aplicar el umbral y cuantificar las partículas.

Aquí, se implementa el análisis de los LD de una manera dependiente de la ubicación. Midiendo previamente el área y el diámetro MF de la fibra, se aplica una reducción dependiente del tamaño (no fija como lo describen Strauss et al.25) para obtener las áreas central y periférica de cada fibra (Figura 4 y Figura 7). Como se ve en los histogramas de la Figura 7, este método permite cuantificar tres parámetros importantes: el porcentaje del área de fibra ocupada por los LD (Figura 7E), la densidad de los LD,el número de LD por μm2 (Figura 7F), y el tamaño medio de los LD (Figura 7G). Como resultado, en ratones de 3 meses de edad (N = 5), las fibras de tipo IIa (contorno verde) y tipo IIx (contorno rojo) presentan la mayor proporción de área ocupada por LD en la periferia (Figura 7E). Con respecto a la densidad de partículas, las fibras EDL siempre muestran mayor densidad que las fibras soleus independientemente de la ubicación subcelular (Figura 7F). Finalmente, el tamaño promedio de esos LD es siempre mayor en la periferia que en el centro (Figura 7G).

Los diferentes métodos utilizados por otros grupos para evaluar la acumulación de LD en el músculo esquelético de roedores34,35 dificultan la comparación de estos resultados con los de estudios previos. Sin embargo, en línea con los resultados de Komiya et al.34, el porcentaje de área de fibra ocupada por LD es mayor en fibras soleus tipo IIa y EDL tipo IIx. Lo más importante es que las fibras de tipo IIb presentaron el menor porcentaje de área ocupada por LD (Figura 7E, histogramas grises). Dado que la fibra tipo IIb es el tipo de fibra más predominante de la EDL (75%, Figura 5E), estos resultados confirman lo que otros grupos han descrito previamente: la acumulación global de lípidos es menor en la EDL que en el sóleo34,35.

Contrariamente a lo descrito en humanos25, y también en línea con los resultados de Komiya et al.34, los resultados aquí presentados muestran que la acumulación de LD en fibras de sóleo tipo I es relativamente baja. Esto podría explicarse por las diferencias entre especies de tipo fibra entre ratones y humanos36, ya que las propiedades metabólicas de las fibras humanas tipo I son más similares a las de las fibras de tipo IIx de roedores, mientras que las de las fibras de tipo IIx humano están cerca de las de tipo IIb37 de roedores. En resumen, las diferentes técnicas descritas aquí proporcionan un método reproducible, confiable y eficiente en el tiempo para estudiar y comparar varios parámetros relacionados con los LD y su distribución dentro de la célula de una manera dependiente del tipo de fibra.

Experimentos subóptimos
Si el procedimiento de congelación no se realiza correctamente y el isopentano no está a la temperatura adecuada, se formarán cristales de hielo dentro de las fibras (Figura 8A). Estos artefactos de congelación son detectables solo después de la preparación histológica de la muestra y pueden reconocerse como agujeros en las fibras. Para una cuantificación adecuada de los LD, estos artefactos deben evitarse. Se ha demostrado que descongelar y volver a congelar el bloqueo muscular adecuadamente puede reducir significativamente estos artefactos29.

Otro problema se encuentra cuando las fibras no se cortan perpendicularmente al eje longitudinal (Figura 8B). La cuantificación de la DA y la comparación entre fibras, músculos o animales no se pueden hacer cuando las secciones no son transversales. Por esta razón, es esencial colocar los músculos correctamente en el corcho con la ayuda de un microscopio estereoscópico antes de congelarse y tener un microscopio de campo brillante cerca del criostato. Este último permitirá al investigador encontrar la alineación correcta de la muestra en el criostato.

En algunas raras ocasiones, el etiquetado de las isoformas MyHC es muy débil en uno o más tipos de fibra (Figura 8C). Si esto sucede, el análisis de los LD será incompleto. En este caso, el experimento debe repetirse a partir del corte de los músculos. Finalmente, Bodipy podría acumularse en la periferia de la sección transversal muscular (Figura 8D). Si esto sucede, la tinción será muy fuerte en esas fibras produciendo un resultado artificioso. Evitar la adquisición de imágenes a partir de estas fibras.

Figure 2
Figura 2: Preparación de las muestras para congelación y crioseccionación. (A-D) Los músculos del sóleo de ratón y EDL se diseccionan y se colocan sobre un corcho sostenido por un plástico rígido con una gota de OCT. (E-G) Un vaso de acero inoxidable se llena con isopentano y se enfría a su temperatura de fusión en nitrógeno líquido. (H,I) El vaso con el isopentano frío se saca del nitrógeno líquido, y la muestra se sumerge hasta la parte inferior del vaso, girando durante 15 s. (J-L) El corcho con las muestras se coloca en el disco del soporte del criostato sin el soporte de plástico, y las secciones transversales en serie de 10 μm se montan directamente en las diapositivas de adhesión. Dos secciones transversales seriales adyacentes se procesan inmediatamente para la tinción de LD y la detección de MyHC. Abreviaturas: LD = gotas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoformas de cadena pesada de miosina; OCT = temperatura óptima de corte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Adquisición de imágenes de Bodipy después de identificar el tipo de fibra a partir de la imagen compuesta reconstruida vista en otra computadora. (A) Reconstrucción de toda la sección del sóleo inmunomarcada para el tipo de fibra (MyHC) a partir de siete imágenes combinadas independientes (rectángulos discontinuos) cosidas entre sí utilizando un software de procesamiento de imágenes. Las flechas blancas y los números representan el orden seguido durante la adquisición de imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia convencional. (B) Para la adquisición de imágenes de Bodipy, (1) un campo que contiene la sección muscular inmunoteñida con laminina-AF647 y Bodipy-555/568 se visualiza en la pantalla de una computadora conectada al microscopio confocal. (2) Esas fibras se encuentran en la imagen reconstruida de la sección muscular inmunoteñida para detectar el tipo de fibras (MyHC). (3) La imagen se adquiere utilizando un microscopio confocal. Abreviaturas: LD = gotas lipídicas; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; MyHCs = isoformas de cadena pesada de miosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de gotas lipídicas con Fiji. (A,B) El sarcolema de la fibra se reconoce en base a la imagen de laminina y se selecciona como el ROI. Se mide el área total y el MF. (C) Para reconocer la parte central de la fibra, la selección se reduce en 1/6 del valor del MF. (D) El área entre la selección central y la total se establece como la periferia o el área subsarcolemmal. (E) Para el análisis de LD teñidos con Bodipy, se aplica un umbral, (F) y se utiliza la herramienta Analizar partículas para cuantificar diferentes parámetros relacionados con los LD (ver tabla). Estos valores se obtienen para la fibra completa (Todo), para la parte central (Centro), y para el área subsarcolemmal (Periferia), de forma independiente. Barras de escala = 12 μm. Abreviaturas: LD = gotas lipídicas; ROI = región de interés; MF = Diámetro mínimo de Feret. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Inmunotinción representativa de tipos de fibra en el músculo de ratón EDL (glicolítico) y sóleo (oxidativo). Imágenes de fluorescencia combinadas de EDL (A, B) y sóleo (C, D) obtenidas con un microscopio digital de fluorescencia de diapositiva completa. Se utilizaron anticuerpos contra el tipo I (azul-AF405), el tipo IIa (verde-AF488), el tipo IIx (rojo-AF568) y la laminina (blanco-AF647). Las fibras negras corresponden a fibra tipo IIb. B y D muestran detalles de las fibras dentro de los rectángulos blancos de los paneles A y C, respectivamente. El asterisco (*) del panel D muestra una fibra híbrida IIa/IIx. (E,F) Cuantificación representativa de la distribución del tipo de fibra en EDL y sóleo de ratones de 3 meses de edad (N = 5). EDL se compuso principalmente de fibras de tipo IIb, luego IIx e IIa (~ 75%, 15% y 5%, respectivamente). Por el contrario, el sóleo estaba compuesto principalmente por fibras de tipo IIa (>50%) y tipo I (30%). Las proporciones de fibras tipo IIx fueron bastante similares en ambos músculos, mientras que las de fibras híbridas fueron muy bajas. Barras de escala = 200 μm (A,C), 100 μm (B,D). Abreviatura: EDL = extensor digitorum longus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Tinción representativa de LD con Bodipy en secciones transversales seriadas previamente inmunomarcadas para isoformas MyHC. La fluorescencia fusionó imágenes de EDL (A) y sóleo (B) de ratón adquiridas utilizando un microscopio de epifluorescencia que muestra fibras de tipo I (azul), IIa (verde), IIx (rojo), IIb (negro) y laminina (señal blanca que rodea las fibras). (C-F) Imágenes de fluorescencia confocal del EDL (C,D) y el sóleo (E,F) co-etiquetados con laminina (cian) y Bodipy (rojo). Tenga en cuenta que las fibras que se muestran en C-F son las mismas que las que se encuentran dentro de los rectángulos blancos en los paneles A y B. En la esquina derecha del rectángulo blanco en A, se puede distinguir una ramita de axón (punta de flecha blanca). Barras de escala = 200 μm (A,B), 20 μm (C-F). Abreviaturas: LD = gotas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoformas de cadena pesada de miosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Cuantificación de los LD de una manera específica de tipo de fibra y subcelular. Imágenes confocales de fluorescencia representativas de fibras tipo I y tipo IIa de soleus (A,B) y tipo IIx y fibras tipo IIb de EDL (C,D) obtenidas tras el coetiquetado con Bodipy (rojo) y α2-laminina (no mostrado). El contenido de DA (% del área ocupada por Bodipy y densidad) y la morfología (tamaño) se analizaron de manera subcelular específica. El perímetro de la fibra se definió mediante tinción de laminina y las áreas centrales o periféricas se establecieron en función del diámetro MF. Porcentaje del área de fibra ocupada por Bodipy (LDs) (E), densidad de LD (número/μm2) (F), o tamaño promedio de LD (G) en regiones centrales o periféricas para cada tipo de fibra. Los resultados se representan como media ± SEM. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: LD = gotas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; C = central; P = periférico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Imágenes correspondientes a resultados subóptimos. (A) Imagen de campo brillante de la sección transversal muscular teñida para hematoxilina-eosina que muestra cristales de hielo formados durante el proceso de congelación. (B) Imagen fusionada de fluorescencia de una sección de sóleo inmunoteñida para MyHC y laminina, mostrando que la mayoría de las fibras se cortan a lo largo del eje longitudinal. (C) Imagen de fluorescencia de una sección de EDL inmunoteñida para MyHCs y laminina. La débil tinción de fibra tipo IIa (verde) dificulta la correcta cuantificación de cada tipo de fibra. (D) Imagen confocal que muestra una fuerte tinción artificiosa de Bodipy (rojo) en fibras ubicadas en la periferia de la sección transversal muscular. Barras de escala = 50 μm (A,B), 200 μm (C,D). Abreviaturas: EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoformas de cadena pesada de miosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Tinción de LD con aceite rojo O en secciones transversales musculares. (A,B) Imágenes confocales que muestran el patrón de tinción obtenido con Aceite Rojo O en el sóleo y EDL, respectivamente. El protocolo utilizado para esta tinción es descrito en detalle por Prats et al.24. Tenga en cuenta que la acumulación de LD es mayor en la región subsarcolemmal de las miofiberes, como se describió anteriormente para Bodipy. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: LD = gota lipídica; EDL = extensor digitorum longus. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Tinción conjunta de LD y mitocondrias en el músculo sóleo. (A) Imagen combinada confocal que muestra el inmunoetiquetado de Tomm20, una proteína presente en la membrana mitocondrial (verde), DAPI (azul) y LD marcados con Bodipy-558/568 (rojo). El recuadro en A muestra varias mitocondrias (verde) unidas a LDs (rojo). Esta imagen se obtuvo mediante la aplicación de microscopía de superresolución confocal Airyscan. (B,C) Imágenes correspondientes de un solo canal de LD y mitocondrias, respectivamente. Barras de escala = 10 μm (A-C), 5 μm (A, recuadro). Abreviaturas: LD = gotas lipídicas; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 1: Fiji macro para el análisis automatizado de LD en múltiples imágenes de laminin + Bodipy. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 2: Explicación paso a paso de cómo trabajar con la macro Bodipy_JoVE.ijm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El protocolo detallado aquí describe un método eficiente para cuantificar los LD etiquetados con Bodipy sobre una base específica de tipo de fibra y subcelular. En los últimos años, los colorantes lipídicos clásicos, como ORO o Sudan Black B, han sido sustituidos por una nueva gama de colorantes fluorescentes, lipofílicos y permeables a las células que se unen a lípidos neutros (por ejemplo, Bodipy). Disponible como diferentes conjugados, Bodipy ha demostrado ser muy eficaz en el etiquetado de LD para estudiar su morfología, dinámica e interacción con otros orgánulos, no solo en diferentes tejidos fijos y células 23,38,39,40 sino también en células vivas 41,42.

Dentro del protocolo, hay varios aspectos críticos que el investigador debe considerar para obtener resultados óptimos. Es fundamental colocar los músculos elegidos correctamente sobre el corcho para asegurar una perfecta alineación y orientación de las miofibras musculares, ya que una vez congeladas, solo se pueden realizar ligeros reajustes del soporte sobre el criostato. Además, es fundamental comenzar el protocolo de inmunotinción inmediatamente después de que se cortan las secciones, ya que las criosecciones de secado al aire (durante solo 15 minutos) tienen efectos adversos graves en las LD, lo que resulta en una disminución del 66% en la densidad de LD y una disminución del 37% en el tamaño promedio24. Del mismo modo, congelar y descongelar los portaobjetos tendría efectos adversos y, por lo tanto, no se recomiendan. Una tercera característica importante de este protocolo está relacionada con la fijación de muestras. Para la identificación de las diferentes isoformas de MyHC con los anticuerpos aquí citados, se debe evitar la fijación tisular ya que interrumpe la unión de los anticuerpos elegidos a sus epítopos. Si las muestras musculares han sido previamente fijadas, se remite al lector a un artículo recientemente publicado utilizando diferentes anticuerpos43. Solo se recomienda PFA sin metanol para el etiquetado y cuantificación de LD, porque el uso de metanol o acetona altera la morfología de los LD23,44. Además, no es necesario un paso de permeabilización para la cuantificación de LD en portaobjetos inmunomarcados con laminina. Dado que algunos grupos han demostrado que la permeabilización con detergentes como TritonX-100, saponina o glicina puede reducir el tamaño o el número de LD44,45, la permeabilización es altamente desaconsejada. Finalmente, el ajuste fino de los ajustes del microscopio confocal es crucial para reconocer solo los lípidos neutros presentes en los LD y no los de las membranas de otros orgánulos24.

Aquí, Bodipy-558/568 C12 se utilizó como un marcador LD. Sin embargo, el Bodipy más frecuentemente utilizado para etiquetar LD y estudiar su morfología y ubicación dentro de las miofiberes del músculo esquelético es Bodipy-493/503. Ambos colorantes son similares en su tiempo de incubación, concentración de trabajo y sus estrechos espectros de emisión, aunque sus rangos de excitación y emisión son ligeramente diferentes. Para un protocolo completo sobre el uso de Bodipy-493/503, se remite al lector al trabajo de Listenberger y Brown46 o Spangenburg et al.23. Bodipy-558/568 C12 se ha utilizado para teñir LD en otros tejidos como el tejido adiposo47, la retina degenerada48, los riñones fibróticos49 o los fibroblastos50. Este Bodipy produce una tinción similar a la obtenida con ORO (ver Figura Suplementaria S1) pero con considerablemente menos carga técnica y más especificidad24,51. Además, Bodipy-558/568 C12 tiene la ventaja de permitir la cuantificación de LD en combinación con la detección de proteínas u orgánulos marcados con un anticuerpo secundario de espectro verde (ver Figura suplementaria S2 y Yan et al.49) o con modelos modificados genéticamente GFP52. Estas dos aplicaciones son herramientas muy poderosas para desentrañar la dinámica y las interacciones de los LD con otros orgánulos y proteínas celulares. Sin embargo, cuando no se pretende colabeling de proteínas dentro de las células, los autores recomiendan el uso del colorante LD mejor caracterizado Bodipy-493/503.

Una de las limitaciones de este protocolo está relacionada con la adquisición de imágenes y la cuantificación de las características morfológicas de la DA. Los avances tecnológicos en microscopía de barrido láser confocal han mejorado en gran medida la resolución del plano en comparación con los microscopios de campo amplio y permiten la reconstrucción 3D de objetos al escanear la muestra en el plano Z. Esto ha sido muy útil para el estudio de la morfologíaLD 24 y la interacción con otras proteínas en miofibras esqueléticas38,53, pero ha aumentado el tiempo de adquisición y procesamiento de imágenes, ya que cada imagen reconstruida en 3D está compuesta por varias imágenes 2D independientes. En el protocolo anterior, las imágenes confocales se adquirieron con una lente de objetivo 40x y solo en 2D. Este método permite la adquisición de tres a seis myofibers por imagen en lugar de solo una como sería cuando se usa un objetivo 63x. Esto da como resultado una resolución más baja y una estimación general del tamaño y la morfología de la LD que no es completamente precisa. Sin embargo, permite el análisis de un mayor número de fibras por muestra, lo que también es un dato importante a tener en cuenta, especialmente en experimentos con animales, en los que se debe comparar un alto número de músculos y condiciones.

Aquí, se muestra que, al congelar dos músculos de tamaño similar que son adyacentes entre sí34, el tiempo de procesamiento de las muestras se reduce considerablemente y se reducen las posibles diferencias artificiosas derivadas de su procesamiento independiente. Además, este método de análisis de LD tiene en cuenta las diferencias entre la distribución subcelular de los LD dentro y entre los tipos de fibra54. Seleccionar el perímetro de la miofibra y reducir esta selección en relación con el diámetro mínimo de Feret de la fibra facilita el estudio del tamaño y la densidad de los LD centrales y periféricos (subsarcolemmales) de forma independiente. La aplicación de este método es extremadamente importante ya que se ha demostrado que la acumulación subsarcolemmal de LD contribuye directamente a la resistencia a la insulina. Si bien algunos informes en humanos han estudiado los LD de una manera dependiente del tipo de fibra y la ubicación 11,16,25, esta es la primera vez, que sepamos, que este método se ha aplicado a los músculos de roedores. Además, la cuantificación de los LD con la ayuda de una macro de diseño propio para Fiji redujo y simplificó significativamente el tiempo de análisis de imágenes. Tanto la macro como una explicación paso a paso sobre cómo usarla están disponibles como Archivo suplementario 1 y Archivo complementario 2, respectivamente.

En general, los autores consideran que el protocolo descrito aquí podría ser una herramienta útil para otros investigadores que estudian el metabolismo de los lípidos en el músculo esquelético. Las técnicas explicadas se pueden aplicar a diferentes músculos y en condiciones distintas (ayuno / sobrealimentado, entrenado / sedentario, joven / envejecido, delgado / obeso) y se espera que ayuden a comprender mejor la dinámica de los LD, la importancia de sus interacciones con otros componentes de la célula, cómo se almacenan y metabolizan los lípidos en las fibras glucolíticas y oxidativas, y su papel en el inicio de la resistencia a la insulina en la diabetes tipo 2.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) y la Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. es el receptor de una beca de doctorado de la FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. recibió una beca del Programa de Excelencia Internacional Wallonie-Bruxelles.

Los autores agradecen a Alice Monnier por su contribución al desarrollo de este protocolo y a Caroline Bouzin por su experiencia y ayuda técnica en el proceso de adquisición de imágenes. También agradecemos a la plataforma de imágenes 2IP-IREC por el acceso al criostato y los microscopios (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Bruselas, Bélgica). Finalmente, los autores desean agradecer a Nicolas Dubuisson, Romain Versele y Michel Abou-Samra por la crítica constructiva del manuscrito. Algunas de las figuras de estos artículos fueron creadas con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix camera Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera  Zeiss
Chemical hood Potteau Labo EN-14175
Confocal microscope Zeiss LSM800
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick)  Electron Microscopy Sciences 63305
Cryo-Gloves Tempshield 16072252
Cryostat  Thermo Scientific  Microm Cryo Star HM 560
Dissecting Stereo Microscope SMZ745 Nikon
Dry Ice
Dumont Forceps F.S.T 11295-10
Epifluorescence microscope Zeiss AxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn Scissors F.S.T 14084-08
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) ThermoFisher 22-363-552 Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) BRAND Petri dish, MERK BR455751 Used to place the muscles on ice during dissection
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen Vector Labs H-4000 Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections
Incubator MMM Medcenter Incucell 707 
Microscope Cover Glasses (24x50 mm) Assistent  40990151
Microscope Slide Boxes  Kartell 278 Used as humid chambers for immunohistochemistry
Neck holder Linie zwo SB-035X-02 Used as strap to hold the stainless steel tumbler
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade Swann-Morton 0205
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X Used to handle cryosections
Permanent Marker Pen Black Klinipath/VWR 98307-R Used to label slides
Pierce Fixation Forceps F.S.T 18155-13
Polystyrene Box  H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 Aesculap BB073R
Stainless Steel Cup 10oz  Eboxer B07GFCBPFH Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing
Superfrost Ultra Plus slides ThermoFisher J1800AMNZ
Surgical tweezers 1/2 teeth Medische Vakhandel 1303152 Also called "Rat teeth tweezers"
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge F.S.T 15000-00
Weighing boats VWR international 611-2249
Whole-Slide Scanner for Fluorescence Zeiss Axio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b Sigma-Aldrich SAB4600477 Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 ThermoFisher A-21121 Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM Abcam ab175702 Used at a final concentration of 1:1,000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody ThermoFisher A-21247 Used at a final concentration of 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) ThermoFisher D3922 Used at a final concentration of 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) ThermoFisher D3835 Used at a final concentration of 1 µg/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) ThermoFisher D1306 Used at a final concentration of 0.5 µg/mL
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D-8418 Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 1004969011 CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Isopentane GPR RectaPur VWR international 24872.298 CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.
Liquid Nitrogen CAUTION:  Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids.
Mouse on mouse Blocking Reagent  Vector Labs MKB-2213-1 Used at concentration of 1:30
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b DSHB University of Iowa BA-D5-supernatant Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene:  MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 DSHB University of Iowa SC-71-supernatant Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene:  MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa 6H1-supernatant Used at a final concentration of 1:5
Normal Goat Serum (NGS) Vector Labs S-1000
PBS 0.1 M Commonly used on histology laboratories
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen  P36930
Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) Sigma-Aldrich L0663 Used at a final concentration of 1:1,000
Tissue-Tek O.C.T compound Sakura  4583
Software
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Adobe Photoshop Adobe Inc. Confocal software
BioRender https://biorender.com/ Used to design the figures
Fiji/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ Used to analyse the acquired images
Microsoft PowerPoint Microsoft Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types
Zen Blue 2.6 Zeiss Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types

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Medicina Número 184
Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético
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Selvais, C. M., De Cock, L. L.,… More

Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-López de Carrizosa, M. A. Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63718, doi:10.3791/63718 (2022).

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