Summary
Posttranslationele modificaties (PTM's) veranderen eiwitstructuren en -functies. Methoden voor de gelijktijdige verrijking van meerdere PTM-typen kunnen de dekking in analyses maximaliseren. We presenteren een protocol met behulp van dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie gevolgd door massaspectrometrie voor de gelijktijdige verrijking en analyse van eiwit N-glycosylatie en fosforylering in pancreasweefsels.
Abstract
Massaspectrometrie kan een diepe dekking bieden van posttranslationele modificaties (PTM's), hoewel verrijking van deze modificaties uit complexe biologische matrices vaak noodzakelijk is vanwege hun lage stoichiometrie in vergelijking met niet-gemodificeerde analyten. De meeste verrijkingsworkflows van PTM's op peptiden in bottom-up proteomics-workflows, waarbij eiwitten enzymatisch worden verteerd voordat de resulterende peptiden worden geanalyseerd, verrijken slechts één type modificatie. Het is echter het hele complement van PTM's dat leidt tot biologische functies, en verrijking van een enkel type PTM kan een dergelijke kruisverwijzing van PTM's missen. PTM-kruisverwijzing is waargenomen tussen eiwitglycosylering en fosforylering, de twee meest voorkomende PTM's in menselijke eiwitten en ook de twee meest bestudeerde PTM's met behulp van massaspectrometrieworkflows. Met behulp van de hierin beschreven simultane verrijkingsstrategie worden beide PTM's verrijkt uit postmortaal menselijk pancreasweefsel, een complexe biologische matrix. Dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie wordt gebruikt om verschillende vormen van glycosylering en fosforylering tegelijkertijd in meerdere fracties te scheiden in een handige op spintip gebaseerde methode, waardoor downstream-analyses van potentiële PTM-overspraakinteracties mogelijk zijn. Deze verrijkingsworkflow voor glyco- en fosfopeptiden kan worden toegepast op verschillende monstertypen om diepe profilering van meerdere PTM's te bereiken en potentiële doelmoleculen voor toekomstige studies te identificeren.
Introduction
Eiwit posttranslationele modificaties (PTM's) spelen een belangrijke rol bij het moduleren van eiwitstructuren en bijgevolg hun functies en downstream biologische processen. De diversiteit van het menselijke proteoom neemt exponentieel toe als gevolg van de combinatorische variabiliteit die wordt geboden door verschillende PTM's. Verschillende varianten van eiwitten uit hun canonieke sequenties zoals voorspeld door het genoom staan bekend als proteoformen, en veel proteoformen komen voort uit PTM's1. Het bestuderen van proteoforme diversiteit in gezondheid en ziekte is de afgelopen jaren een onderzoeksgebied van groot belang geworden 2,3.
De studie van proteoformen en meer specifiek PTM's met grote diepgang is gemakkelijker geworden door de ontwikkeling van op massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics-methoden. Met behulp van MS worden analyten geïoniseerd, gefragmenteerd en geïdentificeerd op basis van de m/z van fragmenten. Verrijkingsmethoden zijn vaak nodig vanwege de lage relatieve abundantie van PTM's in vergelijking met niet-gemodificeerde vormen van eiwitten. Hoewel de analyse van intacte eiwitten en hun PTM's, top-down analyses genoemd, meer routine zijn geworden, is de enzymatische vertering van eiwitten en de analyse van hun componentpeptiden in bottom-up analyses nog steeds de meest gebruikte route voor PTM-analyse. De twee meest bestudeerde PTM's, en de twee meest voorkomende PTM's in vivo, zijn glycosylering en fosforylering4. Deze twee PTM's spelen een belangrijke rol in celsignalering en -herkenning en zijn dus belangrijke wijzigingen om te karakteriseren in ziekteonderzoek.
De chemische eigenschappen van verschillende PTM's bieden vaak routes naar verrijking van deze PTM's op eiwit- en peptideniveaus voorafgaand aan de analyse. Glycosylering is een hydrofiele PTM vanwege de overvloed aan hydroxylgroepen op elke monosaccharide. Deze eigenschap kan worden gebruikt om glycopeptiden te verrijken in hydrofiele interactiechromatografie (HILIC), die meer hydrofiele glycopeptiden kan scheiden van de hydrofobe niet-gemodificeerde peptiden5. Fosforylering voegt het fosfaatgedeelte toe, dat negatief geladen is, behalve bij zure pH. Vanwege deze lading kunnen verschillende metaalkationen, waaronder titanium, worden gebruikt om fosfopeptiden aan te trekken en te binden, terwijl niet-gefosforyleerde soorten worden weggespoeld. Dit is het principe van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC). Verdere discussies over deze en andere verrijkingsstrategieën voor glycosylering en fosforylering zijn te vinden in recente beoordelingen 6,7.
Relatief grote hoeveelheden uitgangspeptidemateriaal (0,5 mg of meer) zijn vaak nodig voor verrijkingsprotocollen vanwege de lage stoichiometrie van PTM's op peptiden. In scenario's waarin deze hoeveelheid monster mogelijk niet gemakkelijk kan worden verkregen, zoals tumorkernbiopsie of cerebrospinale vloeistofanalyses, is het nuttig om gemakkelijke workflows te gebruiken die resulteren in maximale biomoleculaire informatie. Recente strategieën ontwikkeld door ons laboratorium en anderen hebben de gelijktijdige en parallelle analyse van glycosylering en fosforylering benadrukt met behulp van dezelfde PTM-verrijkingsworkflow 8,9,10,11,12. Hoewel de chemische eigenschappen van deze twee PTM's kunnen verschillen, kunnen deze PTM's in meerdere stappen worden geanalyseerd vanwege de innovatieve scheidingstechnieken en gebruikte materialen. Elektrostatische repulsie-hydrofiele interactiechromatografie (ERLIC) overlays bijvoorbeeld scheidingen op basis van hydrofiele interacties tussen analyten en de mobiele fase met lading-ladingsinteracties tussen analyten en het stationaire fasemateriaal 13,14,15,16. Bij zure pH kan de aantrekkingskracht van gefosforyleerde peptiden naar de stationaire fase hun retentie en scheiding van niet-gemodificeerde peptiden verbeteren. Materiaal bestaande uit Ti(IV) geïmmobiliseerd op hydrofiele microsferen kan worden gebruikt voor HILIC en IMAC-gebaseerde elutie om fosfopeptiden en neutrale, zure en mannose-6-gefosforyleerde glycopeptidente scheiden 17,18. Deze strategie staat bekend als dual-functionele Ti(IV)-IMAC. Het gebruik van deze strategieën voor het verrijken van meerdere PTM's in één workflow kan analyses van potentiële PTM-overspraakinteracties toegankelijker maken. Bovendien zijn de totale hoeveelheid monster en tijdsvereisten minder dan de conventionele verrijkingsmethoden wanneer ze parallel worden uitgevoerd (d.w.z. HILIC en IMAC op afzonderlijke monsteraliquots).
Om de dual-functionele Ti (IV) -IMAC-strategie voor gelijktijdige analyse van eiwitglycosylering en fosforylering te demonstreren, hebben we deze toegepast om postmortale menselijke pancreasweefsels te analyseren. De alvleesklier produceert zowel spijsverteringsenzymen als regulerende hormonen, waaronder insuline en glucagon. De pancreasfunctie is aangetast bij pancreasaandoeningen. Bij diabetes wordt de regulatie van de bloedsuikerspiegel beïnvloed, wat leidt tot hogere glucosespiegels in het bloed. Bij pancreatitis is een ontsteking het gevolg van autovertering van het orgaan3. Veranderingen in PTM-profielen, waaronder glycosylering en fosforylering, kunnen, zoals vaak het geval is, resulteren in andere ziekten.
Hier beschrijven we een protocol voor een op spin-tip gebaseerde gelijktijdige verrijkingsmethode, gebaseerd op een dual-functionele Ti (IV) -IMAC-strategie, voor N-glycopeptiden en fosfopeptiden afgeleid van eiwitten geëxtraheerd uit pancreasweefsel. Het protocol omvat eiwitextractie en -vertering, verrijking, MS-gegevensverzameling en gegevensverwerking, zoals te zien is in figuur 1. Representatieve gegevens uit deze studie zijn beschikbaar via ProteomeXchange Consortium met identifier PXD033065.
Figuur 1: Workflow voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels. Weefsels worden eerst gecryopiseerd tot een fijn poeder voordat eiwit wordt geëxtraheerd met behulp van het wasmiddel natriumdodecylsulfaat (SDS). Eiwitten worden vervolgens onderworpen aan enzymatische spijsvertering. De resulterende peptiden worden gealiquoteerd voorafgaand aan verrijking met behulp van dual-functionele Ti(IV)-IMAC. Ruwe gegevens worden verzameld met behulp van nanoschaal omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (nRPLC-MS) en worden geanalyseerd met behulp van database zoeksoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dit protocol is bedoeld om PTM-analyses toegankelijker te maken en een bredere analyse van meerdere PTM's in dezelfde workflow mogelijk te maken. Dit protocol kan worden toegepast op andere complexe biologische matrices, waaronder cellen en biovloeistoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toestemming werd verkregen voor het gebruik van pancreasweefsels voor onderzoek van de nabestaanden van de overledene en een toestemming van de University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board werd verkregen. IRB-toezicht is niet vereist omdat het geen menselijke proefpersonen betreft zoals erkend door 45 CFR 46.102 (f).
LET OP: Voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van de reagentia die in dit protocol worden gebruikt, waaronder zuren (mierenzuur, azijnzuur, trifluorazijnzuur), basen (ammoniumhydroxide) en cryogenen (vloeibare stikstof). Lees de veiligheidsinformatiebladen voor de gebruikte reagentia om vertrouwd te raken met de bijbehorende gevaren en de benodigde voorzorgsmaatregelen. Concentraties die worden aangeduid met percentages zijn volume/totaal volume (v/v) en worden verdund met water.
1. Cryoverpulvering, lysis en eiwitextractie van weefsel
- Vul een dewar met vloeibare stikstof. Koel de delen van de weefselverpulverizer die in contact komen met de pancreasweefsels, namelijk de kamer, verpulverizer en herstellepel vooraf in een polystyreencontainer.
- Breng de bevroren stukjes weefsel over in de voorgekoelde monsterhouder en voeg een lepel vloeibare stikstof toe aan het weefsel.
- Plaats de vergruizer in de kamer en sla er vijf tot tien keer met een hamer op om het monster te verpletteren. Verwijder de verpulverizer uit de kamer en schraap het aanhangende weefselpoeder en de stukjes eraf.
- Voeg een lepel vloeibare stikstof toe aan de kamer als weefsels beginnen te smelten. Herhaal het verpulveringsproces totdat het monster een fijn poeder is zonder grote weefselbrokken. Verdeel de monsters in ongeveer 100 mg aliquots in voorgekoelde buizen.
- Bereid lysisbuffer met 4% natriumdodecylsulfaat (SDS), 150 mM NaCl en 25 mM Tris (pH = 7,4). Los één tablet protease- en fosfataseremmer op in 500 μL water voor een voorraad van 20x van elk. Voeg het vereiste volume van 20x voorraad van elke remmer toe aan de lysisbuffer voor een uiteindelijke concentratie van 1x.
- Voeg 600 μL lysisbuffer per 100 mg weefsel toe aan de buis en incubeer bij 95 °C in een verwarmingsblok gedurende 10 minuten met schudden bij 800 tpm. Haal de monsters uit het verwarmingsblok en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.
- Soniceer de monsters met 60 W energie (20 kHz) gedurende 45 s met behulp van 15 s pulsen met een rust van 30 s ertussen. Pelleteer de monsters bij 3.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Voeg het supernatant toe aan een 5x precipitatieoplosmiddel, 300 μL lysisbuffer tot 1,5 ml precipitatieoplosmiddel, dat 50% aceton, 49,9% ethanol en 0,1% azijnzuur bevat. Koel 's nachts bij -20 °C.
- Pelleteer de monsters opnieuw op 3.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Was de pellet door te breken met een spatel en te mengen met dezelfde hoeveelheid precipitatie-oplosmiddel. Pellet nogmaals, de wasstap 2x herhalen.
- Pelleteer het monster bij 16.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Droog de monsterpellet gedurende 15 minuten aan de lucht in een zuurkast en bewaar bij -80 °C totdat het klaar is om verder te gaan.
2. Eiwitvertering en ontzouting
- Resuspendeer de eiwitpellet in 300 μL vers gemaakte digestiebuffer met 50 mM triethylammoniumbicarbonaat (TEAB) en 8 M ureum.
- Schat de eiwitconcentratie van de oplossing met behulp van een eiwittest volgens het protocol van de fabrikant.
- Voeg aan het eiwit in de oplossing dithiothreitol (DTT) toe tot een uiteindelijke concentratie van 5 mM, meng en verlaag bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Voeg vervolgens jodoacetamide (IAZ) toe aan een eindconcentratie van 15 mM, meng en alkylaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. Doof alkylering door de toevoeging van DTT in hetzelfde volume als voorheen te herhalen en meng.
- Voeg LysC/trypsine toe in een verhouding tussen 1:100 enzym en eiwit en incubeer bij 37 °C gedurende 4 uur. Voeg vervolgens 50 mM TEAB toe om het ureum van 8 M te verdunnen dat wordt gebruikt om 1 M te <. Voeg trypsine toe in een verhouding van 1:100 enzym: eiwit en incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Doof de spijsvertering met de toevoeging van trifluorazijnzuur (TFA) tot 0,3% v/v. Voor elke 1 mg starteiwit, conditioneer een ontzoutingspatroon (1 cc, 10 mg) met 1 ml acetonitril (ACN) en 3x met 1 ml van 0,1% TFA.
- Plaats het verteerde mengsel op de ontzoutingspatroon. Was het mengsel 3x met 1 ml van 0,1% TFA. Als de elutie langzaam is, oefen dan positieve druk uit, maar vermijd een debiet > één druppel per seconde.
- Elutepeptiden met 1 ml 60% ACN en 0,1% mierenzuur (FA) oplossing. Droog geëlueerde peptiden bij ongeveer 35 °C met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator totdat het oplosmiddel volledig is verdampt.
- Resuspend peptiden in 300 μL water en schat peptideconcentraties met behulp van een peptide-assay volgens het protocol van de fabrikant. Deel de peptiden in 500 μg aliquots en droog volledig.
3. ERLIC N-glycopeptide verrijking
OPMERKING: Exacte centrifugesnelheden en -tijden kunnen verschillen op basis van monsters en moeten worden geoptimaliseerd. Over het algemeen is 300 x g gedurende 2 minuten geschikt voor conditionering en wassen van het materiaal en 100 x g gedurende 5 minuten voor eluting.
- Weeg ongeveer 3 mg watten af en verpak deze in een lege pipetpunt van 200 μL (spinpunt; zie Materiaaltabel).
- Breng sterk anionenwisselingsverrijkingsmateriaal over in een buis en voeg 200 μL 0,1% TFA per 10 mg materiaal toe. Gebruik voor de verrijking van 500 μg peptiden 15 mg van het materiaal. Activeer het materiaal door gedurende 15 minuten te schudden.
- Plaats met behulp van een buisadapter de spinpunt over een buis van 2 ml en voeg voldoende drijfmest toe aan de punt voor 15 mg materiaal. Verwijder de vloeistof door in een benchtopcentrifuge te draaien.
- Conditioneer het materiaal door 3x te centrifugeren met 200 μL ACN. Herhaal de drievoudige conditionering met 100 mM ammoniumacetaat (NH4Ac), 1% TFA en 80% ACN/0,1% TFA (laadbuffer).
- Resuspendeer 500 μg peptidemonsters in ongeveer 200 μL laadbuffer en stroom door de spin-tip. Herlaad de doorstroom 2x om volledige binding te garanderen.
- Was het materiaal door 5x te centrifugeren met 200 μL van 80% ACN/0,1% TFA en vervolgens 2x met 200 μL van 80% ACN/0,1% FA.
- Eluteer de peptiden door te centrifugeren met 200 μL van elk van de volgende: 50% ACN / 0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
- Was het materiaal door 2x te centrifugeren met 200 μL van 80% ACN/5% NH4OH. Eluteer de resterende peptiden met 200 μL van 10% NH4OH (E5).
- Droog alle eluties volledig met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator bij ongeveer 35 °C.
- Voer het ontzouten van de basiselution (E5) uit met behulp van een ontziltingstip volgens het protocol van de fabrikant.
- Droog de elutie van de ontziltingspunt met behulp van een centrifugaalvacuümconcentrator bij ongeveer 35 °C tot volledigheid.
4. Ti(IV)-IMAC fosfopeptide verrijking
OPMERKING: Exacte centrifugesnelheden en -tijden kunnen verschillen op basis van monsters en moeten worden geoptimaliseerd. Over het algemeen is 300 x g gedurende 2 minuten geschikt voor conditionering en wassen van het materiaal en 100 x g gedurende 5 minuten voor eluting.
- Weeg ongeveer 3 mg watten en verpak het in een lege pipetpunt van 200 μL (spin-tip).
- Breng Ti-IMAC fosfopeptideverrijkingsmateriaal over in een buis en voeg 200 μL 0,1% TFA per 10 mg materiaal toe. Gebruik voor de verrijking van 500 μg peptiden 10 mg materiaal.
- Plaats met behulp van een buisadapter de spin-tip over een buis van 2 ml en voeg voldoende slurry toe aan de tip voor 10 mg materiaal. Verwijder de vloeistof door in een benchtopcentrifuge te draaien.
- Conditioneer het materiaal met 200 μL van 40% ACN/3% TFA met dezelfde centrifuge-instellingen als hierboven beschreven. Resuspend peptide monsters in 200 μL van 40% ACN/3% TFA en stroom door de spin-tip. Laad de doorstroom twee keer opnieuw om een completere binding te garanderen.
- Was het materiaal door te centrifugeren met 200 μL 50% ACN, 6% TFA en 200 mM NaCl-oplossing, gevolgd door 2x in 200 μL van 30% ACN en 0,1% TFA-oplossing te wassen.
- Elute peptiden met 200 μL van 10% NH4OH. Droog de elutie volledig onder vacuüm. Voer ontzouting uit met behulp van een ontziltingstip volgens het protocol van de fabrikant. Droog de elutie van de ontzoutingspunt onder vacuüm tot volledigheid.
5. Dual-functionele Ti(IV) gelijktijdige verrijking
OPMERKING: Exacte centrifugesnelheden en -tijden kunnen verschillen op basis van monsters en moeten worden geoptimaliseerd. Over het algemeen is 300 x g gedurende 2 minuten geschikt voor conditionering en wassen van het materiaal en 100 x g gedurende 5 minuten voor eluting.
- Weeg ongeveer 3 mg watten en verpak het in een lege spin-tip.
- Breng ongeveer 1 g Ti(IV)-IMAC-materiaal over in een buis. Voeg 0,1% TFA toe aan een bekende concentratie materiaal, bijvoorbeeld 20 mg/200 μL (materiaal kan in deze suspensie bij 4 °C worden bewaard).
- Voeg voor verrijking van 500 μg peptiden voldoende drijfmest toe aan een spin-tip om 20 mg materiaal over te brengen. Was de spin-tip door te centrifugeren met 200 μL van 0,1% TFA.
- Resuspendeer de monsters in 200 μL laad-/wasmiddel (80% ACN en 3% TFA) en stroom door de spin-tip. Herlaad de doorstroom 2x.
- Was de centrifugeer 6x door te centrifugeren met 200 μL laad-/wasmiddel. Was de spin-tip met 200 μL 80% ACN/0,1% FA-oplossing.
- Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 60% ACN/0,1% FA (E1) en 40% ACN/0,1% FA (E2). Analyseer elke elutie afzonderlijk.
- Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 20% ACN / 0,1% FA en 0,1% FA. Combineer de twee ellutionen en analyseer als één monster (E3).
- Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; en 30% ACN/0,1% TFA. Combineer deze ellutions en analyseer als één (E4) na ontzouting met behulp van een verpakte punt.
- Conditioneer het materiaal tot een basis-pH met 200 μL van 90% ACN/2,5% NH4OH voor 3x. Gooi deze wasbeurten weg.
- Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 60% ACN/10% NH4OH (E5) en 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analyseer deze ellutions afzonderlijk na ontzouting met behulp van een verpakte punt.
- Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; en 10% NH4OH. Combineer deze ellutions en analyseer als één (E7) na ontzouting met behulp van een verpakte punt.
- Droog alle eluties volledig onder vacuüm.
6. Nano-flow omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (nRPLC-MS)
OPMERKING: MS-methoden voor gegevensverzameling en -analyse zijn divers en daarom wordt slechts één voorgestelde LC-MS-pijplijn (en de bijbehorende parameters) hier in de volgende stappen beschreven. Monsters die zijn gegenereerd met behulp van de eerder geschetste monstervoorbereidings- en verrijkingsstappen kunnen worden geanalyseerd met behulp van andere instrumentele opstellingen, inclusief het gebruik van in de handel verkrijgbare chromatografische kolommen, mits voldoende gegevenskwaliteit.
- Trek en verpak een 15 cm lang capillair (75 μm binnendiameter) met behulp van C18-materiaal zoals beschreven in19. Bereid mobiele fase A (0,1% FA in water) en mobiele fase B (0,1% FA in ACN) voor.
- Reconstitueer verrijkte peptidemonsters in 15 μL van 3% mobiele fase B. Laad 2 μL van het monster (~ 13% monstervolume) rechtstreeks op de kolom. Analyseer elk monster in technisch duplicaat.
- Elutepeptiden met een gradiënt van 3% naar 30% mobiele fase B gedurende 90 minuten bij een stroomsnelheid van 0,3 μL/min. Was de kolom met 75% B gedurende 8 minuten gevolgd door 95% B gedurende 8 minuten en eindig de methode met evenwicht op 3% B gedurende 12 minuten.
- Bedien de massaspectrometer in de positieve ionmodus met behulp van gegevensafhankelijke acquisitie van de bovenste 20 pieken met de volgende parameters: spuitspanning 2 kV; MS1-detectie in LC/MS van 400-2.000 m/z bij een resolutie van 120.000, 2E5 AGC-doel (automatic gain control), maximale injectietijd van 100 ms, 30% RF-lens, quadrupole-isolatie met 1,6 m/z-venster , voor laadtoestanden 2-8 en onbepaald, en dynamische uitsluiting van 30 s; MS2-detectie in de LC/MS met behulp van getrapte HCD-fragmentatie bij 22%, 30% en 38%, vaste eerste massa 120 m/z bij 30.000 resolutie, 5E4 AGC-doel en 2,5E4 minimale intensiteitsvereiste.
7. Gegevensanalyse van de lidstaten
OPMERKING: Een pijplijn voor gegevensanalyse met behulp van twee verschillende software om dezelfde gegevensset te analyseren, wordt hier gepresenteerd. Fosforylering en glycosylatie kunnen tegelijkertijd worden doorzocht met behulp van een enkele software in plaats van twee afzonderlijke software zoals hier beschreven, hoewel over het algemeen de zoektijd van software evenredig is met de zoekruimte, d.w.z. het aantal beschouwde PTM's. Om deze reden worden twee verschillende software gebruikt parallel aan de zoektocht naar glycopeptiden en fosfopeptiden.
- Verwerk onbewerkte gegevensbestanden met behulp van de juiste software (zie Materiaalopgave).
- Zoek spectra tegen de UniProt menselijke (of geschikte soortspecifieke) database. Stel carbamidomethylatie van Cys in als een vaste modificatie. Stel het maximum aantal gemiste enzymatische decolleté's in op twee.
- Zoek in de onbewerkte gegevensbestanden met behulp van commerciële software (zie Tabel met materialen) naar glycopeptiden die moeten worden geanalyseerd20. Gebruik een 10 ppm precursor massatolerantie en een 0,01 Da fragment massatolerantie met een minimale peptidelengte van vier residuen.
- Zoeken met behulp van de software-embedded N-glycan database uitgebreid met typische mannose-6-fosfaat (M6P) glycanen, waaronder HexNAc (2) Hex (4-9) Fosfo (1-2), HexNAc (3-4) Hex (4-9) Fosfo (1-2), HexNAc (2) Hex (3-4) Phospho (1) en HexNAc (3) Hex (3-4) Phospho (1).
- Stel N-glycosylatie in als een veel voorkomende wijziging. Stel de maximale totale modificaties per peptide spectrale match (PSM) in als één veel voorkomende en twee zeldzame.
- Stel de volgende variabele modificaties in: oxidatie van Met (zeldzaam), deamidatie bij Asn en Gln (zeldzaam) en fosforylering bij Ser, Thr en Tyr (vaak). Stel de volgende identificatiefilters in: score cut-off > 150, |log prob| > 1 en delta mod score > 10.
- Exporteer en analyseer zoekresultaten op de tabbladen Eiwitten en Peptidegroep.
- Screen handmatig de identificaties die M6P-glycanen bevatten op de aanwezigheid van het fosfohex oxoniumion (243 m/z) in de MS/MS-spectra en verwijder vals-positieve identificaties, die dit diagnostische ion niet bevatten.
- Zoek in de onbewerkte gegevensbestanden met behulp van een open-source software (zie Tabel van materialen) naar fosfopeptiden die moeten worden geanalyseerd21. Gebruik een 20 ppm first search peptide tolerantie en een 4,5 ppm main search peptide tolerantie.
- Stel het maximum aantal modificaties per peptide in op 5. Stel PSM en protein false discovery rate (FDR) in op 1% en minimale peptidelengte op 7 residuen.
- Stel variabele modificaties in als oxidatie bij Met, N-terminale eiwitacetylering en fosforylering bij Ser, Thr en Tyr. Analyseer zoekresultaten met behulp van de modificationSpecificPeptides-bestanden.
- Bepaal het aantal identificaties van PTM's op het niveau van eiwitten, peptiden en modificaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve massaspectrometriegegevens, waaronder onbewerkte bestanden en zoekresultaten, zijn gedeponeerd bij het ProteomeXchange Consortium via de PRIDE-partnerrepository met de dataset-id PXD03306522.
In dit werk werden dubbele injectiereplicaties geanalyseerd voor elke verrijkingselelution. Identificaties gemaakt van beide technische replica's werden verzameld in de uiteindelijke analyse. Vanwege de semi-stochastische aard van gegevensafhankelijke acquisitie bij het kiezen van peptideprecursoren voor MS / MS-fragmentatie, wordt identificatieoverlapping van ongeveer 70% -80% verwacht tussen technische duplicaten. In toepassingen die deze methoden gebruiken, worden ten minste twee technische replicaties aangemoedigd. Voor downstream statistische analyses moet rekening worden gehouden met biologische replicaties voor verschillende experimentele omstandigheden. Afhankelijk van de gewenste strengheid voor gegevensrapportage kan het nuttig zijn om filters in te stellen voor identificaties, bijvoorbeeld identificatie in ten minste x aantal te rapporteren technische of biologische replicaties.
Een voorbeeld van een totaal ionchromatogram (TIC) voor elke elutie van elke verrijking is te zien in aanvullende figuur S1, aanvullende figuur S2 en aanvullende figuur S3. Het gebruik van strenge filters tijdens het zoeken in databases van onbewerkte MS-bestanden kan zorgen voor nauwkeurigere en meer zelfverzekerde identificaties van MS / MS-spectra tot peptidesequenties met PTM's. Zoals blijkt uit de TIC's voor elke elutie, zijn de peptidemonsters nog steeds complex, zelfs na fractionering van de verrijking. Nanoflowchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie, hoge massanauwkeurigheid en snel scannende massaspectrometer kan helpen bij het analyseren van complexe mengsels, zoals peptiden uit een tryptische digest, met grote gevoeligheid en diepte. Voorbeelden van MS/MS-spectra voor geglycosyleerde en gefosforyleerde spectra zijn te zien in figuur 2. Goed geannoteerde spectra zoals deze zijn het gevolg van een rijke fragmentatie van precursoren die het vertrouwen in de identificatie zoals toegewezen door de databasezoeksoftware vergroten.
Figuur 3 illustreert de peptide-identificaties die zijn gemaakt met behulp van de dual-functionele Ti(IV)-IMAC spin-tip verrijkingsmethode over elke elutiefractie. De meerderheid van de glycopeptiden elueren in de eerste vier fracties, terwijl de meerderheid van de fosfopeptiden elueren in de laatste drie fracties. Deze scheiding van verschillende PTM's tussen de fracties helpt interferentie in ionisatie te voorkomen die kan optreden als ze niet zo adequaat gescheiden waren over ellutions.
Figuur 4 vergelijkt de glycoproteomics-resultaten van de dual Ti-methode in vergelijking met een ERLIC glycopeptide-only verrijking. Zoals te zien is in figuur 4A, zijn veel identificaties op het niveau van eiwitten, glycoformen, PTM en modificatieplaatsen gemeenschappelijk voor beide methoden. ERLIC heeft echter meer unieke identificaties op alle niveaus in vergelijking met de dubbele Ti-methode. Dit omvat M6P (high mannose glycans met ten minste één fosfaatgroep) glycovormen, die extra handmatige curatie van de gegevens vereisen om vals-positieve identificaties te verwijderen. Verder zijn de soorten glycanen die met beide methoden worden geïdentificeerd vergelijkbaar. De verhoudingen van elk type glycan na het inzaaien in zes categorieën op basis van hun samenstellingen zijn vergelijkbaar tussen beide methoden16.
Fosfoproteomics resultaten van de dual Ti methode worden vergeleken met een conventionele IMAC fosfopeptide-only verrijking in figuur 5. De dual-functionele Ti(IV)-verrijking presteert op dezelfde manier als conventionele IMAC, zoals blijkt uit aanzienlijke overlap op eiwit-, peptide- en PTM-niveaus. Met behulp van beide methoden zijn de meeste gefosforyleerde aminozuren serine en threonine, waarbij ook ongeveer 1% gefosforyleerde tyrosine wordt geïdentificeerd. Beide methoden kunnen ook worden gebruikt om multifosforylerende peptiden te identificeren.
De lijsten van gemodificeerde eiwitten worden in kaart gebracht aan genen en geanalyseerd met behulp van genontologie (GO) verrijking zoals weergegeven in figuur 6 en figuur 7. GO-analyses voor de gemodificeerde eiwitten geïdentificeerd met behulp van ERLIC en IMAC zijn weergegeven in aanvullende figuur S4 en aanvullende figuur S5. De gratis, online Metascape-tool voert de verrijking uit en creëert netwerken op basis van verrijkte paden en processen, die door gelijkenis worden gekoppeld23. De knooppunttermen voor elke GO-analyse zijn te vinden in aanvullende tabel S1, aanvullende tabel S2, aanvullende tabel S3 en aanvullende tabel S4. Aangezien glycosylatie een belangrijk eiwit PTM is in de extracellulaire matrix, is het niet verwonderlijk dat verschillende termen verrijkt met behulp van de lijst van geïdentificeerde N-glycoproteïnen gerelateerd zijn aan de extracellulaire matrix. Fosforylering is betrokken bij celsignalering en dit kan worden gezien in verschillende verrijkte termen die worden gevonden met behulp van de lijst met geïdentificeerde fosfoproteïnen.
Figuur 2: Geannoteerde ms/ms-spectra met hoge betrouwbaarheid van N-geglycosyleerde en gefosforyleerde peptiden. (A) Mannose-6-gefosforyleerd peptide GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Fosfo(1))VTR van cathepsine D (CATD) geïdentificeerd uit retentietijden 53,08-53,33 min van de zevende verrijkingselelution. De aanwezigheid van het fosfoHex oxonium ion bij 243 m/z verbetert het vertrouwen in deze PTM-opdracht. (B) Gefosforyleerd peptide VEEEQEADEEDVS(Fosfo)EEEAESK van thioredoxine-gerelateerd transmembraaneiwit 1 (TMX1) uit retentietijden 32,31-32,72 min vanaf de zesde verrijkingselelution. De aanwezigheid van -98 (-H3PO4) neutrale verliezen tussen peptidefragmentionen en hun gedefosforyleerde varianten (aangeduid met fragment*) verbetert het vertrouwen in deze PTM-toewijzing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van peptide-identificaties van dual-functionele Ti(IV)-IMAC-verrijking over zeven elties. Het aantal identificaties omvat peptiden geïdentificeerd in ten minste één van de twee technische (injectie) replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van glycoproteomica resultaten van dual-functionele Ti(IV)-IMAC verrijking in vergelijking met een conventionele ERLIC glycopeptide verrijking. (A) Venn diagrammen van glycoproteïne, glycoform (eiwit, site, glycan), glycaan samenstelling, en glycosiet identificaties tussen verrijkingsmethoden. (B) Cirkeldiagrammen van glycanen geïdentificeerd op peptide-backbones tussen verrijkingsmethoden. Glycanen worden in zes groepen ingedeeld op basis van hun samenstelling16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van fosfoproteomica resultaten van dual-functionele Ti(IV)-IMAC-verrijking in vergelijking met een conventionele Ti(IV)-IMAC fosfopeptideverrijking. (A) Venn-diagrammen van fosfoproteïne, fosfopeptide en fososietidentificaties tussen verrijkingsmethoden. (B) Cirkeldiagrammen van zelfverzekerd gelokaliseerde (75% of hogere waarschijnlijkheid) fosfosieten afgebroken naar aminozuurresidu. (C) Gestapelde staafplot van geïdentificeerde fosfopeptiden in de vuilnisbak van een aantal gefosforyleerde residuen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Genonologieverrijking van N-glycoproteïnen geïdentificeerd met behulp van dual-functionele Ti(IV)-IMAC-verrijking. N-glycoproteïnen worden terug in kaart gebracht naar genen en aanzienlijk verrijkte routes en procestermen worden geïdentificeerd met het geheel van het genoom als achtergrond. Verschillende kleuren worden gebruikt om clusters van termen te labelen die verbonden zijn door termovereenkomst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Genontologieverrijking van fosfoproteïnen geïdentificeerd met behulp van dual-functionele Ti(IV)-IMAC-verrijking. Fosfoproteïnen worden terug in kaart gebracht naar genen en aanzienlijk verrijkte routes en procestermen worden geïdentificeerd met het geheel van het genoom als achtergrond. Verschillende kleuren worden gebruikt om clusters van termen te labelen, die verbonden zijn door termovereenkomst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Voorbeeld van totale ionchromatogrammen (TIC's) van elke elutie van dual-functionele Ti(IV)-IMAC (E1 t/m E7, panelen A-G) verrijking. Het totale signaal (ionenstroom) wordt uitgezet over de gegevensverzamelingsperiode van 117 minuten. De intensiteit van de basispiek wordt gegeven door de waarde NL. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Voorbeeld van totale ionchromatogrammen (TIC's) van elke elutie van ERLIC (E1 tot en met E5, panelen A-E) verrijking. Het totale signaal (ionenstroom) wordt uitgezet over de gegevensverzamelingsperiode van 117 minuten. De intensiteit van de basispiek wordt gegeven door de waarde NL. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Voorbeeld totaal ionchromatogram (TIC) van de elutie van Ti-IMAC-verrijking. Het totale signaal (ionenstroom) wordt uitgezet over de gegevensverzamelingsperiode van 117 minuten. De intensiteit van de basispiek wordt gegeven door de waarde NL. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: Genonologieverrijking van N-glycoproteïnen geïdentificeerd met behulp van conventionele glycopeptideverrijking met ERLIC. N-glycoproteïnen worden terug in kaart gebracht naar genen en aanzienlijk verrijkte routes en procestermen worden geïdentificeerd met het geheel van het genoom als achtergrond. Verschillende kleuren worden gebruikt om clusters van termen te labelen, die verbonden zijn door termovereenkomst. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S5: Genontologieverrijking van fosfoproteïnen geïdentificeerd met behulp van conventionele fosfopeptideverrijking met Ti(IV)-IMAC. Fosfoproteïnen worden terug in kaart gebracht naar genen en aanzienlijk verrijkte routes en procestermen worden geïdentificeerd met het geheel van het genoom als achtergrond. Verschillende kleuren worden gebruikt om clusters van termen te labelen, die verbonden zijn door termovereenkomst. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabellen S1-S4: Metascape node informatie voor gen ontologie verrijking analyses. Tabellen bevatten knooppuntinformatie voor lijsten van N-glycoproteïnen en fosfoproteïnen geïdentificeerd met behulp van dual Ti (tabel S1 en tabel S2), N-glycoproteïnen met ERLIC (tabel S3) en fosfoproteïnen met IMAC (tabel S4). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De dual-functionele Ti(IV)-IMAC strategie is nuttig voor de gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit hetzelfde monster in een enkele monstervoorbereidingsworkflow. Erlic-gebaseerde methoden hebben ook aangetoond dat ze gelijktijdige verrijking van PTM's uitvoeren. Beide strategieën zijn eerder gebruikt voor diepe dekking in PTM-analyses 14,18. Door de dual Ti-methode aan te passen aan het verminderen van de incubatietijd van monsters door gebruik te maken van spin-tips, hopen we dat dit protocol minder resource-intensief en dus breder toegankelijk is geworden.
De gelijktijdige analyse van meerdere PTM's wordt bereikt door synergetische interacties tussen analyten en de functionele groepen op het oppervlak van het verrijkingsmateriaal. In de eerste verpakking spin-tips met katoen, wordt de retentie van glycopeptiden in een HILIC-modus verhoogd vanwege de prevalentie van hydroxylgroepen op cellulose24. Door water en acetonitril (een in water mengbaar oplosmiddel) te gebruiken, worden glycopeptiden vastgehouden en gescheiden door de vorming van water en organische lagen. Het materiaal voor dual-functionele Ti(IV) verrijking is afhankelijk van de geïmmobiliseerde Ti(IV) kationen voor de binding van fosfopeptiden. De hydrofiele eigenschappen van de zijketens van het materiaal worden gebruikt om glycopeptiden in een HILIC-modus te behouden, die eerst worden geëlueerd met behulp van zure elutie met een toenemend waterig gehalte. Het materiaal wordt verder gewassen met conventionele IMAC-fosfopeptideverrijkingsbuffers om geialyleerde glycopeptiden te elueren, die een hogere affiniteit hebben met de stationaire fase dan andere neutrale glycopeptiden. Na conditionering van het materiaal tot basis pH, wordt ammoniumhydroxide en ACN-oplossing gebruikt om de elektrostatische interacties te verbreken die fosfopeptiden aan het materiaal gebonden houden. In de tussentijd maakt het afnemende organische gehalte scheiding van mono- en multi-gefosforyleerde peptiden en M6P-glycopeptiden mogelijk.
Bij het scheiden van PTM's met behulp van meerdere elutiestappen in dezelfde workflow, kan biomoleculaire informatie worden gemaximaliseerd uit beperkte monsters. Een voorbehoud bij dergelijke dubbele PTM-analyseworkflows is de vereiste van een relatief grote hoeveelheid monster (0,5 mg peptiden) als uitgangsmateriaal voor elke verrijking wanneer ten minste vijf fracties worden verzameld. Niettemin biedt de hier gepresenteerde simultane verrijkingsstrategie nog steeds een aanzienlijke besparing van materialen in vergelijking met conventionele strategieën. Zelfs vóór de verrijking zijn verschillende belangrijke stappen nodig om de integriteit van PTM te waarborgen en artefactueel verlies van PTM-informatie te voorkomen. Deze omvatten de juiste opslag van monsters bij lage temperaturen wanneer ze niet in gebruik zijn (idealiter -80 °C), het gebruik van protease- en fosfataseremmers tijdens eiwitextractie en het gebruik van een hydrofiele peptide-opruimmethode, zoals de HLB-cartridges die hier worden gebruikt.
Er is waargenomen dat ERLIC (conventionele glycopeptideverrijking) resulteerde in een betere glycoproteoomdekking, terwijl dual-functionele Ti (IV) -IMAC beter presteerde in unieke identificaties door conventionele Ti-IMAC in fosfoproteomics-resultaten. De fysieke structuur en verhoogde hydrofilie van het ERLIC-materiaal in vergelijking met die van het dubbele Ti-verrijkingsmateriaal is waarschijnlijk een belangrijke factor in de verbeterde glycoproteïnedekking in ERLIC. De verhoogde dekking van het fosfoproteoom in conventionele IMAC kan een gevolg zijn van verminderde ionenonderdrukking door de verwijdering van glycopeptiden tijdens de eerste elutiestappen en wasstappen. Ondanks deze lichte dalingen in dekking met behulp van de gelijktijdige dubbele Ti-workflow, wordt nog steeds een aanzienlijke overlap met conventionele enkele PTM-verrijking bereikt met het extra voordeel dat slechts één verrijkingsworkflow wordt uitgevoerd in plaats van twee.
Wat tijdsdruk betreft, hebben ERLIC en conventionele Ti-IMAC minder fracties dan de dubbele Ti-workflow. Wat betreft de benodigde middelen, is het anionenuitwisselingsmateriaal dat nodig is voor ERLIC goedkoper dan het gefunctionaliseerde materiaal dat nodig is voor de dubbele Ti- en conventionele IMAC-workflows. In deze protocollen werd alleen N-gebonden en niet O-gebonden glycosylatie geanalyseerd. Het enzym PNGase F kan (en moet) worden gebruikt om N-glycanen te splitsen om het aantal fout-positieven te beperken dat wordt verkregen bij het zoeken naar O-glycopeptiden. Het is echter aangetoond dat deze strategie de specificiteit van HILIC en ERLIC voor glycopeptideverrijking vermindert25. In het protocol wordt een strategie met behulp van twee afzonderlijke software gebruikt om onbewerkte gegevensbestanden te analyseren. Byonic, een commerciële software, wordt beschouwd als de gouden standaard bij het analyseren van glycoproteomics-gegevens. Door de diversiteit van N-glycaanstructuren wordt de zoekruimte van peptiden vergroot, waardoor de zoektijden toenemen. Fosforylering kan ook worden toegevoegd als een veel voorkomende PTM naast glycosylatie tijdens het zoeken, hoewel de zoektijden omhoog kunnen schieten, afhankelijk van of peptide multifosforylering wordt overwogen. MaxQuant, een open-source software, kan worden geoptimaliseerd om FDR in fosfoproteomics-resultaten te minimaliseren, hoewel complexe glycosylatie niet zo gemakkelijk te doorzoeken is. Er zijn ook andere open-source opties voor het zoeken naar glycoproteomische gegevens 26,27,28. Afhankelijk van de experimentele doelen en beschikbare middelen, kan de hier beschreven LC-MS- en data-analysepijplijn worden gebruikt zoals gepresenteerd of worden gewijzigd. Verdere optimalisatie van de methoden zal naar verwachting de dekking van de PTM's verbeteren.
PTM's spelen een belangrijke rol in biochemische processen vanwege de veranderingen in de eiwitstructuur die ze geven. Het is ideaal dat alle proteomische analyses tegelijkertijd rekening houden met alle eiwit-PTM's. Het belang van de som van alle eiwitglycosylatie wordt bijvoorbeeld meta-heterogeniteitgenoemd 29. Het doel van totale PTM-analyse is echter nog niet mogelijk met de huidige MS-gebaseerde technologieën. Bottom-up proteomics gevolgd door PTM-specifieke verrijking, d.w.z. HILIC en IMAC, is nog steeds de gouden standaard voor PTM-analyses, hoewel door gelijktijdige verrijkingsstrategieën zoals die hier beschreven te gebruiken, biomoleculaire informatie beter kan worden opgehelderd. Cross-talk interacties zijn gevonden tussen verschillende PTM's30,31, waaronder glycosylatie en fosforylering32. Kwantitatieve analyse van dergelijke interacties bij ziekten, bijvoorbeeld bij pancreasziekten zoals diabetes en kanker, kan vruchtbaar zijn in het vergroten van ons begrip van ziektemechanismen. Met optimalisatie van extractiemethoden tussen verschillende monstertypen kunnen de hier beschreven verrijkingsprotocollen worden gebruikt voor diepgaande profilering van het glycoproteoom en het fosfoproteoom in complexe biologische matrices.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door subsidiefinanciering van de NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 en R21AG065728) en Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B en SRA-2016-168-S-B). De hier gepresenteerde gegevens werden ook gedeeltelijk verkregen door steun van een NIH / NCATS UL1TR002373-prijs via het University of Wisconsin Institute for Clinical and Translational Research. De Orbitrap-instrumenten werden gekocht met de steun van een NIH shared instrument grant (NIH-NCRR S10RR029531) en office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education aan de University of Wisconsin-Madison. We willen ook de genereuze steun erkennen van de Orgaan- en Weefseldonatieorganisatie van de Universiteit van Wisconsin die de menselijke alvleesklier voor onderzoek heeft geleverd en de hulp van Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett en Prof. Jon Odorico voor het verstrekken van de monsters aan ons laboratorium. Ons onderzoeksteam wil in het bijzonder de families bedanken die weefsels hebben gedoneerd voor deze studie. L.L. erkent NIH-subsidie S10OD025084, een Pancreas Cancer Pilot-beurs van het Carbone Cancer Center van de Universiteit van Wisconsin (233-AAI9632), evenals een Vilas Distinguished Achievement Professorship en het Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship met financiering door de Wisconsin Alumni Research Foundation en de University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
- Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
- Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
- Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
- Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
- Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
- Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
- Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
- Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
- Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
- Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
- Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
- Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
- Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
- Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
- Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
- Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
- Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
- Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
- Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).
