Summary
Post-translasjonelle modifikasjoner (PTMer) endrer proteinstrukturer og funksjoner. Metoder for samtidig berikelse av flere PTM-typer kan maksimere dekningen i analyser. Vi presenterer en protokoll ved hjelp av dobbeltfunksjonell Ti(IV)-immobilisert metallaffinitetskromatografi etterfulgt av massespektrometri for samtidig berikelse og analyse av protein N-glykosylering og fosforylering i bukspyttkjertelvev.
Abstract
Massespektrometri kan gi dyp dekning av post-translasjonelle modifikasjoner (PTMer), selv om berikelse av disse modifikasjonene fra komplekse biologiske matriser ofte er nødvendig på grunn av deres lave stoichiometri i forhold til ikke-modifiserte analytter. De fleste berikelsesarbeidsflyter av PTMer på peptider i proteomiske arbeidsflyter nederst opp, der proteiner fordøyes enzymatisk før de resulterende peptidene analyseres, beriker bare en type modifikasjon. Det er hele komplementet av PTMer, men det fører til biologiske funksjoner, og berikelse av en enkelt type PTM kan gå glipp av en slik krysstale av PTMer. PTM-krysstale har blitt observert mellom proteinglykosylering og fosforylering, de to vanligste PTMene i menneskelige proteiner og også de to mest studerte PTM-ene ved hjelp av massespektrometri arbeidsflyter. Ved hjelp av den samtidige berikelsesstrategien som er beskrevet her, er begge PTM-ene beriket fra post-mortem humant bukspyttkjertelvev, en kompleks biologisk matrise. Dual-funksjonell Ti(IV)-immobilisert metallaffinitetskromatografi brukes til å skille ulike former for glykosylering og fosforylering samtidig i flere fraksjoner i en praktisk spinnspissbasert metode, slik at nedstrømsanalyser av potensielle PTM-krysstaleinteraksjoner. Denne berikelsesarbeidsflyten for glyko- og fosfopeptider kan brukes på ulike prøvetyper for å oppnå dyp profilering av flere PTMer og identifisere potensielle målmolekyler for fremtidige studier.
Introduction
Protein post-translasjonelle modifikasjoner (PTMer) spiller en viktig rolle i modulering av proteinstrukturer og følgelig deres funksjoner og nedstrøms biologiske prosesser. Mangfoldet av den menneskelige proteom øker eksponentielt på grunn av den kombinatoriske variasjonen som tilbys av ulike PTMer. Ulike varianter av proteiner fra deres kanoniske sekvenser som forutsagt av genomet er kjent som proteoformer, og mange proteoformer oppstår fra PTMer1. Å studere proteoform mangfold i helse og sykdom har blitt et forskningsområde av stor interesse de siste årene 2,3.
Studien av proteoformer og mer spesifikt PTMer med stor dybde har blitt mer facile gjennom utvikling av massespektrometri (MS)-baserte proteomiske metoder. Ved hjelp av MS blir analytter ionisert, fragmentert og identifisert basert på m/ z av fragmenter. Berikelsesmetoder er ofte nødvendige på grunn av den lave relative overfloden av PTMer sammenlignet med ikke-modifiserte former for proteiner. Selv om analyse av intakte proteiner og deres PTMer, kalt ovenfra-og-ned-analyser, har blitt mer rutinemessig, er den enzymatiske fordøyelsen av proteiner og analysen av deres komponentpeptider i nedenfra-og-opp-analyser fortsatt den mest brukte ruten for PTM-analyse. De to mest studerte PTM-ene, og de to vanligste PTM-ene in vivo, er glykosylering og fosforylering4. Disse to PTMene spiller store roller i cellesignalering og anerkjennelse og er derfor viktige modifikasjoner for å karakterisere i sykdomsforskning.
De kjemiske egenskapene til ulike PTMer gir ofte ruter mot berikelse av disse PTMene på protein- og peptidnivåene før analyse. Glykosylering er en hydrofil PTM på grunn av overflod av hydroksylgrupper på hvert monosakkarid. Denne egenskapen kan brukes til å berike glykopeptider i hydrofil interaksjonskromatografi (HILIC), som kan skille mer hydrofile glykopeptider fra de hydrofobe ikke-modifiserte peptidene5. Fosforylering legger til fosfatmoiety, som er negativt ladet bortsett fra ved sur pH. På grunn av denne ladningen kan ulike metallkasjoner, inkludert titan, brukes til å tiltrekke og binde fosfopeptider mens ikke-fosforylaterte arter vaskes bort. Dette er prinsippet om immobilisert metallaffinitetskromatografi (IMAC). Videre diskusjoner av disse og andre berikelsesstrategier for glykosylering og fosforylering finnes i nyere vurderinger 6,7.
Relativt store mengder startpeptidmateriale (0,5 mg eller mer) er ofte nødvendig for berikelsesprotokoller på grunn av lav stisiometri av PTMer på peptider. I scenarier der denne mengden prøve kanskje ikke er lett å få tak i, for eksempel tumorkjernebiopsi eller cerebrospinalvæskeanalyser, er det gunstig å bruke facile arbeidsflyter som resulterer i maksimal biomolekylær informasjon. Nylige strategier utviklet av laboratoriet vårt og andre har fremhevet den samtidige og parallelle analysen av glykosylering og fosforylering ved hjelp av samme PTM-berikelsesarbeidsflyt 8,9,10,11,12. Selv om de kjemiske egenskapene til disse to PTMene kan variere, kan disse PTMene analyseres i flere trinn på grunn av de innovative separasjonsteknikkene og materialene som brukes. For eksempel overlapper elektrostatisk frastøtende hydrofil interaksjonskromatografi (ERLIC) separasjoner basert på hydrofile interaksjoner mellom analytter og den mobile fasen med ladekompensasjoner mellom analytter og det stasjonære fasematerialet 13,14,15,16. Ved sur pH kan tiltrekningen av fosforylerte peptider til den stasjonære fasen forbedre deres oppbevaring og separasjon fra ikke-modifiserte peptider. Materiale som består av Ti(IV) immobilisert på hydrofile mikrosfærer kan brukes til HILIC- og IMAC-basert elution for å skille fosfopeptider og nøytrale, sure og mannose-6-fosforylerte glykopeptider17,18. Denne strategien er kjent som dual-functional Ti(IV)-IMAC. Bruk av disse strategiene for å berike flere PTMer i én enkelt arbeidsflyt kan gjøre analyser av potensielle PTM-krysstaleinteraksjoner mer tilgjengelige. I tillegg er de totale utvalgsmengdene og tidskravene mindre enn de konvensjonelle berikelsesmetodene når de utføres parallelt (dvs. HILIC og IMAC på separate utvalg aliquots).
For å demonstrere den dobbeltfunksjonelle Ti(IV)-IMAC-strategien for samtidig analyse av proteinglykosylering og fosforylering, har vi brukt den til å analysere post-mortem humant bukspyttkjertelvev. Bukspyttkjertelen produserer både fordøyelsesenzymer og regulatoriske hormoner, inkludert insulin og glukagon. Bukspyttkjertelen er svekket ved bukspyttkjertelsykdom. Ved diabetes påvirkes reguleringen av blodsukkeret, noe som fører til høyere nivåer av glukose i blodet. Ved pankreatitt skyldes betennelse automatisk fordøyelse avorgelet 3. Endringer i PTM-profiler, inkludert glykosylering og fosforylering, kan resultere, som det ofte er tilfelle, i andre sykdommer.
Her beskriver vi en protokoll for en spinnspissbasert samtidig berikelsesmetode, basert på en dobbeltfunksjonell Ti(IV)-IMAC-strategi, for N-glykopeptider og fosfopeptider avledet fra proteiner hentet fra bukspyttkjertelvev. Protokollen inkluderer proteinutvinning og fordøyelse, berikelse, INNSAMLING AV MS-data og databehandling, som det fremgår av figur 1. Representative data fra denne studien er tilgjengelige via ProteomeXchange Consortium med identifikator PXD033065.
Figur 1: Arbeidsflyt for samtidig analyse av N-glykopeptider og fosfopeptider fra humant bukspyttkjertelvev. Vev pulveriseres først til et fint pulver før proteinutvinning ved hjelp av vaskemiddelet natrium dodecylsulfat (SDS). Proteiner blir deretter utsatt for enzymatisk fordøyelse. De resulterende peptidene er aliquoted før berikelse ved hjelp av dual-funksjonell Ti (IV)-IMAC. Rådata samles inn ved hjelp av nanoskala omvendt fase væskekromatografi-massespektrometri (nRPLC-MS) og analyseres ved hjelp av databasesøkeprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne protokollen er ment å gjøre PTM-analyser mer tilgjengelige og muliggjøre mer utbredt analyse av flere PTMer i samme arbeidsflyt. Denne protokollen kan brukes på andre komplekse biologiske matriser, inkludert celler og biofluider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtykke ble innhentet for bruk av bukspyttkjertelvev til forskning fra avdødes pårørende og en autorisasjon fra University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board ble innhentet. IRB-tilsyn er ikke nødvendig fordi det ikke involverer mennesker som anerkjent av 45 CFR 46.102(f).
FORSIKTIG: Det må utvises forsiktighet ved håndtering av reagensene som brukes i denne protokollen, som inkluderer syrer (maursyre, eddiksyre, trifluoroacetic), baser (ammoniumhydroksid) og kryogener (flytende nitrogen). Les sikkerhetsdatabladene for reagensene som brukes til å bli kjent med de tilknyttede farene og nødvendige forholdsregler. Konsentrasjoner betegnet med prosenter er volum / totalt volum (v / v) og fortynnes med vann.
1. Vevskryo-pulverisering, lysis og proteinekstraksjon
- Fyll en dewar med flytende nitrogen. Forkjøl de delene av vevs pulverisatoren som kommer i kontakt med bukspyttkjertelen vev, nemlig kammeret, pulverisatoren og gjenopprettingsskjeen i en polystyrenbeholder.
- Overfør de frosne vevsstykkene til den forhåndskjølte prøveholderen og legg til en skje med flytende nitrogen til vevet.
- Plasser pulverisatoren i kammeret og slå den ved hjelp av en mallet fem til ti ganger for å knuse prøven. Fjern pulverisatoren fra kammeret og skrap av fastvevspulver og biter.
- Tilsett en skje med flytende nitrogen til kammeret hvis vev begynner å smelte. Gjenta pulveriseringsprosessen til prøven er et fint pulver uten store vevsbiter. Del prøvene i ca. 100 mg aliquots i forkjølte rør.
- Klargjør lysisbuffer som inneholder 4 % natriumdedylsulfat (SDS), 150 mM NaCl og 25 mM Tris (pH = 7,4). Løs opp en tablett hver av protease og fosfatasehemmer i 500 μL vann for en 20x bestand av hver. Tilsett det nødvendige volumet på 20x lager av hver inhibitor til lysisbufferen for en endelig 1x konsentrasjon.
- Tilsett 600 μL lysisbuffer per 100 mg vev i røret og inkuber ved 95 °C i en varmeblokk i 10 minutter med risting ved 800 o/min. Fjern prøvene fra varmeblokken og la dem avkjøles til romtemperatur.
- Soniker prøvene ved 60 W energi (20 kHz) i 45 s ved hjelp av 15 s pulser med en 30 s hvile i mellom. Pellet prøvene ved 3000 x g i 15 min ved 4 °C.
- Tilsett supernatanten til et 5x nedbørsløsningsmiddel, 300 μL lysisbuffer til 1,5 ml nedbørsløsningsmiddel, som inneholder 50% aceton, 49,9% etanol og 0,1% eddiksyre. Kjøl deg ned over natten ved -20 °C.
- Pellet prøvene igjen på 3000 x g i 15 min ved 4 °C og fjern supernatanten. Vask pelletsen ved å bryte opp med en spatel og bland med samme mengde nedbørsløsningsmiddel. Pellet igjen, gjenta vasketrinnet 2x.
- Pellet prøven ved 16.000 x g i 15 min ved 4 °C. Lufttørk prøvepelleten i en avtrekkshette i 15 min og oppbevar den ved -80 °C til den er klar til å fortsette.
2. Protein fordøyelse og desalting
- Resuspend proteinpellet i 300 μL nylaget fordøyelsesbuffer som inneholder 50 mM trietylammoniumbikarbonat (TEAB) og 8 M urea.
- Beregn proteinkonsentrasjonen av løsningen ved hjelp av en proteinanalyse i henhold til produsentens protokoll.
- Til proteinet i løsningen, tilsett dithiothreitol (DTT) til en endelig konsentrasjon på 5 mM, bland og reduser ved romtemperatur i 1 time. Tilsett deretter iodoacetamid (IAA) i en endelig konsentrasjon på 15 mM, bland og alkylat ved romtemperatur i 30 minutter i mørket. Slukk alkylering ved å gjenta tilsetningen av DTT i samme volum som før og bland.
- Tilsett LysC/trypsin ved 1:100 enzym:proteinforhold og inkuber ved 37 °C i 4 timer. Tilsett deretter 50 mM TEAB for å fortynne 8 M urea som brukes til å < 1 M. Tilsett trypsin ved 1:100 enzym:proteinforhold og inkuber ved 37 °C over natten.
- Slukk fordøyelsen med tilsetning av trifluoroedinsyre (TFA) til 0,3% v / v. For hver 1 mg startprotein, kondisjoner en avsaltingspatron (1 cc, 10 mg) med 1 ml acetonitril (ACN) og 3x med 1 ml 0,1% TFA.
- Legg den fordøyde blandingen på avsaltingspatronen. Vask blandingen 3x ved hjelp av 1 ml 0,1% TFA. Hvis elution er treg, bruk positivt trykk, men unngå en strømningshastighet > ett fall per sekund.
- Elute peptider med 1 ml 60% ACN og 0,1% maursyre (FA) oppløsning. Tørre eluterte peptider ved ca. 35 °C ved hjelp av en sentrifugalvakuumkonsentrator til løsningsmidlet er fullstendig fordampet.
- Resuspendpeptider i 300 μL vann og estimere peptidkonsentrasjoner ved hjelp av en peptidanalyse i henhold til produsentens protokoll. Del peptidene i 500 μg aliquots og tørk helt.
3. ERLIC N-glykopeptid berikelse
MERK: Nøyaktige sentrifugeringshastigheter og -tider kan variere basert på prøver og må optimaliseres. Generelt er 300 x g i 2 min egnet for kondisjonering og vasking av materialet og 100 x g i 5 min for eluting.
- Vei ca. 3 mg bomullsull og pakk den i en tom 200 μL pipettespiss (spinnspiss; se Materialbord).
- Overfør sterkt anionbytteberikelsesmateriale til et rør og tilsett 200 μL 0,1% TFA per 10 mg materiale. For berikelse av 500 μg peptider, bruk 15 mg av materialet. Aktiver materialet ved å riste i 15 min.
- Bruk en røradapter til å plassere spinnspissen over et 2 ml rør og tilsett nok slurry til spissen for 15 mg materiale. Fjern væsken ved å spinne i en bentrikk sentrifuge.
- Kondisjoner materialet ved å sentrifugere 3x med 200 μL ACN. Gjenta triplikatkondisjonen ved hjelp av 100 mM ammoniumacetat (NH4Ac), 1 % TFA og 80 % ACN/0,1 % TFA (lastebuffer).
- Resuspend 500 μg peptidprøver i ca. 200 μL lastebuffer og strømning gjennom spinnspissen. Last inn gjennomstrømningen 2x på nytt for å sikre fullstendig binding.
- Vask materialet ved sentrifugering 5x ved hjelp av 200 μL 80% ACN / 0,1% TFA, og deretter 2x ved hjelp av 200 μL på 80% ACN / 0,1% FA.
- Elute peptidene ved sentrifugering med 200 μL av hver av følgende: 50% ACN / 0,1% FA (E1); 0.1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
- Vask materialet ved å sentrifugere 2x med 200 μL 80% ACN / 5% NH4OH. Elute de resterende peptidene med 200 μL av 10% NH4OH (E5).
- Tørk alle elutionene helt ved hjelp av en sentrifugalvakuumkonsentrator ved ca. 35 °C.
- Utfør avsalting av den grunnleggende elutionen (E5) ved hjelp av en avsaltingsspiss i henhold til produsentens protokoll.
- Tørk elutionen fra avsaltingsspissen ved hjelp av en sentrifugalvakuumkonsentrator ved ca. 35 °C for å fullføre.
4. Ti(IV)-IMAC fosfopeptidberikelse
MERK: Nøyaktige sentrifugeringshastigheter og -tider kan variere basert på prøver og må optimaliseres. Generelt er 300 x g i 2 min egnet for kondisjonering og vasking av materialet og 100 x g i 5 min for eluting.
- Vei ca. 3 mg bomullsull og pakk den inn i en tom pipettespiss på 200 μL (spinnspiss).
- Overfør Ti-IMAC fosfopeptidberikelsesmateriale i et rør og tilsett 200 μL 0,1% TFA per 10 mg materiale. For berikelse av 500 μg peptider, bruk 10 mg materiale.
- Bruk en røradapter til å plassere spinnspissen over et 2 ml rør og tilsett nok slurry til spissen for 10 mg materiale. Fjern væsken ved å spinne i en bentrikk sentrifuge.
- Kondisjoner materialet med 200 μL 40% ACN / 3% TFA ved hjelp av de samme sentrifugeinnstillingene som beskrevet ovenfor. Resuspend peptidprøver i 200 μL på 40% ACN / 3% TFA og strømme gjennom spinnspissen. Last inn gjennomstrømningen på nytt to ganger for å sikre mer fullstendig binding.
- Vask materialet ved sentrifugering med 200 μL 50% ACN, 6% TFA og 200 mM NaCl-løsning, etterfulgt av vasking 2x i 200 μL på 30% ACN og 0,1% TFA-løsning.
- Elute peptider med 200 μL 10% NH4OH. Tørk elutionen helt under vakuum. Utfør avsalting ved hjelp av en avsaltingsspiss i henhold til produsentens protokoll. Tørk elutionen fra avsaltingsspissen under vakuum for å fullføre.
5. Dobbeltfunksjonelt ti (IV) samtidig berikelse
MERK: Nøyaktige sentrifugeringshastigheter og -tider kan variere basert på prøver og må optimaliseres. Generelt er 300 x g i 2 min egnet for kondisjonering og vasking av materialet og 100 x g i 5 min for eluting.
- Vei ca. 3 mg bomullsull og pakk den inn i en tom spinnspiss.
- Overfør ca. 1 g Ti(IV)-IMAC-materiale til et rør. Tilsett 0,1% TFA i en kjent konsentrasjon av materiale, for eksempel 20 mg / 200 μL (materialet kan lagres i denne suspensjonen ved 4 °C).
- For berikelse fra 500 μg peptider, legg nok slurry til en spinnspiss for å overføre 20 mg materiale. Vask spinnspissen ved sentrifugering med 200 μL 0,1% TFA.
- Resuspend prøvene i 200 μL lasting / vasking løsningsmiddel (80% ACN og 3% TFA) og strømme gjennom spin-tip. Last inn gjennomstrømningen på nytt 2x.
- Vask spin-tip 6x ved sentrifugering med 200 μL lasting / vasking av løsningsmiddel. Vask spinnspissen med 200 μL 80% ACN / 0,1% FA-løsning.
- Elute peptidene med 200 μL av hver av følgende: 60% ACN / 0,1% FA (E1) og 40% ACN / 0,1% FA (E2). Analyser hver elution separat.
- Elute peptidene med 200 μL av hver av følgende: 20% ACN / 0,1% FA og 0,1% FA. Kombiner de to elutionene og analyser som en prøve (E3).
- Elute peptidene med 200 μL av hver av følgende: 40% ACN / 3% TFA; 50% ACN / 6% TFA, 200 mM NaCl; og 30 % ACN/0,1 % TFA. Kombiner disse elutionene og analyser som en (E4) etter avsalting ved hjelp av en pakket spiss.
- Kondisjoner materialet til grunnleggende pH ved hjelp av 200 μL 90% ACN / 2,5% NH4OH for 3x. Kast disse vaskene.
- Elute peptidene med 200 μL av hver av følgende: 60% ACN / 10% NH4OH (E5) og 40% ACN / 10% NH4OH (E6). Analyser disse elutionene separat etter avsalting ved hjelp av en pakket spiss.
- Elute peptidene med 200 μL av hver av følgende: 20% ACN / 10% NH4OH; 10% ACN / 10% NH4OH; og 10 % NH4OH. Kombiner disse elutionene og analyser som en (E7) etter avsalting ved hjelp av en pakket spiss.
- Tørk alle elutionene helt under vakuum.
6. Nano-strømning omvendt fase flytende kromatografi-masse spektrometri (nRPLC-MS)
MERK: MS-datainnsamlings- og analysemetoder er forskjellige, og dermed er bare en foreslått LC-MS-rørledning (og tilhørende parametere) beskrevet her i følgende trinn. Prøver som genereres ved hjelp av de tidligere skisserte prøveforberedelsene og berikelsestrinnene, kan analyseres ved hjelp av andre instrumentelle oppsett, inkludert bruk av kommersielt tilgjengelige kromatografiske kolonner, gitt tilstrekkelig datakvalitet.
- Trekk og pakk en 15 cm lang kapillær (75 μm indre diameter) ved hjelp av C18-materiale som beskrevet i19. Forbered mobil fase A (0,1% FA i vann) og mobil fase B (0,1% FA i ACN).
- Rekonstituer berikede peptidprøver i 15 μL av 3 % mobil fase B. Last 2 μL av prøven (~13 % prøvevolum) direkte på kolonnen. Analyser hvert utvalg i teknisk duplikat.
- Elute peptider med en gradient fra 3% til 30% mobil fase B over 90 min med en strømningshastighet på 0,3 μL / min. Vask kolonnen med 75% B i 8 min etterfulgt av 95% B i 8 min, og fullfør metoden med likevekt ved 3% B i 12 minutter.
- Bruk massespektrometeret i positiv ionmodus ved hjelp av dataavhengig oppkjøp av de 20 beste toppene med følgende parametere: sprayspenning 2 kV; MS1-deteksjon i LC/MS fra 400-2000 m/z ved 120 000 oppløsning, 2E5 automatisk forsterkningskontroll (AGC), 100 ms maksimal injeksjonstid, 30 % RF-objektiv, quadrupole-isolasjon med 1,6 m/z-vindu , for ladetilstander 2-8 og ubestemt og ubestemt og 30 s dynamisk ekskludering; MS2-deteksjon i LC/MS ved hjelp av trappet HCD-fragmentering med 22 %, 30 % og 38 %, fast første masse 120 m/z med 30 000 oppløsning, 5E4 AGC-mål og 2,5E4 minimum intensitetskrav.
7. MS-dataanalyse
MERK: En dataanalysepipeline som bruker to forskjellige programvare for å analysere det samme datasettet, presenteres her. Fosforylering og glykosylering kan søkes samtidig ved hjelp av en enkelt programvare i stedet for to separate programvarer som beskrevet her, men generelt er programvaresøketid proporsjonal med søkeområdet, det vil si antall PTMer som vurderes. Av denne grunn brukes to forskjellige programvare parallelt med søket etter glykopeptider og fosfopeptider.
- Behandle rådatafiler ved hjelp av riktig programvare (se Materialfortegnelser).
- Søk spektra mot UniProt human (eller passende artsspesifikk) database. Sett carbamidomethylation av Cys som en fast modifikasjon. Angi maksimalt antall tapte enzymatiske spaltinger som to.
- I rå datafilene, ved hjelp av en kommersiell programvare (se Tabell over materialer), søk etter glykopeptider som skal analyseres20. Bruk en 10 ppm forløper massetoleranse og en 0.01 Da fragment masse toleranse med en minimum peptid lengde på fire rester.
- Søk ved hjelp av den programvareinbygde N-glykandatabasen utvidet med typiske mannose-6-fosfat (M6P)glykaner, inkludert HexNAc(2)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Fosfo(1) og HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1)
- Angi N-glykosylering som en vanlig modifikasjon. Angi maksimalt antall modifikasjoner per peptidspektral match (PSM) som en vanlig og to sjeldne.
- Angi følgende variable modifikasjoner: oksidasjon av Met (sjeldne), deamidasjon ved Asn og Gln (sjeldne) og fosforylering ved Ser, Thr og Tyr (vanlig). Angi følgende identifikasjonsfiltre: score cut-off > 150, |log prob| > 1, og delta mod score > 10.
- Eksporter og analyser søkeresultater i kategoriene Proteiner og Peptidgruppe.
- Screen identifikasjonene som inneholder M6P-glykaner manuelt for tilstedeværelsen av FosfoHex oxonium ion (243 m/z) i MS/MS-spektraet og fjern falske positive identifikasjoner, som ikke inneholder denne diagnostiske ionen.
- I rå datafiler, ved hjelp av en åpen kildekode programvare (se Tabell over materialer), søk etter fosfopeptider som skal analyseres21. Bruk en 20 ppm første søk peptid toleranse og en 4.5 ppm hovedsøk peptid toleranse.
- Sett maksimalt antall modifikasjoner per peptid til 5. Sett PSM og protein falsk oppdagelsesrate (FDR) til 1% og minimum peptidlengde til 7 rester.
- Angi variable modifikasjoner som oksidasjon ved Met, N-terminal proteinacetylering og fosforylering ved Ser, Thr og Tyr. Analyser søkeresultater ved hjelp av modifikasjonenSpecificPeptides filer.
- Bestem antall identifikasjoner av PTMer på protein-, peptid- og modifikasjonsstedsnivåene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative massespektrometridata, inkludert råfiler og søkeresultater, er deponert i ProteomeXchange Consortium via PRIDE-partnerrepositoriet med datasettidentifikatoren PXD03306522.
I dette arbeidet ble dupliserte injeksjonsreplikeringer analysert for hver berikelses-elution. Identifikasjoner gjort fra begge tekniske replikeringer ble samlet i den endelige analysen. På grunn av den semi-stokastiske karakteren av dataavhengig oppkjøp i plukking av peptidforløpere for MS / MS-fragmentering, forventes identifikasjonsoverlapping på ca. 70% -80% mellom tekniske duplikater. I applikasjoner som bruker disse metodene, oppfordres minst to tekniske replikeringer. For nedstrøms statistiske analyser bør man ta hensyn til biologiske replikeringer for ulike eksperimentelle forhold. Avhengig av ønsket strenghet for datarapportering, kan det være nyttig å angi filtre for identifikasjoner, for eksempel identifikasjon i minst x antall tekniske eller biologiske repliker som skal rapporteres.
Et eksempel på total ionkromatogram (TIC) for hver elution fra hver berikelse kan ses i Supplerende figur S1, tilleggsfigur S2 og tilleggsfigur S3. Hvis du bruker strenge filtre under databasesøking av RÅ MS-filer, kan du sikre mer nøyaktige og sikrere identifikasjoner av MS/MS-spektra for å peptidsekvenser med PTMer. Som det fremgår av TICene for hver elution, er peptidprøvene fortsatt komplekse selv etter fraksjonering fra berikelsen. Nanoflow-kromatografi kombinert med høyoppløselig, høy massenøyaktighet og hurtigskanning av massespektrometer kan bidra til å analysere komplekse blandinger, for eksempel peptider fra en tryptisk fordøyelse, med stor følsomhet og dybde. Eksempel MS/MS-spektra for glykosylerte og fosforylerte spektra kan ses i figur 2. Godt kommenterte spektra som disse skyldes rik fragmentering av forløpere som øker tilliten til identifikasjonen som er tildelt av databasesøkeprogramvaren.
Figur 3 illustrerer peptididentifikasjonene som gjøres ved hjelp av den dobbeltfunksjonelle Ti(IV)-IMAC spin-tip-berikelsesmetoden over hver elutionfraksjon. Flertallet av glykopeptider elute i de første fire fraksjonene, mens flertallet av fosfopeptider elute i de tre siste fraksjonene. Denne separasjonen av forskjellige PTMer blant brøkene bidrar til å forhindre forstyrrelser i iioniseringen som kan oppstå hvis de ikke var så tilstrekkelig adskilt på tvers av elutions.
Figur 4 sammenligner glykoproteomics-resultatene fra den doble Ti-metoden sammenlignet med en ERLIC glykopeptidberikelse. Som det fremgår av figur 4A, er mange identifikasjoner på protein-, glykoform-, PTM- og modifikasjonsstedsnivåene felles for begge metodene. ERLIC har imidlertid mer unike identifikasjoner på alle nivåer sammenlignet med den doble Ti-metoden. Dette inkluderer M6P (høy mannose glykaner med minst en fosfatgruppe) glykoformer, som krever ytterligere manuell kurering av dataene for å fjerne falske positive identifikasjoner. Videre er typene glykaner identifisert ved hjelp av en av metodene like. Proporsjonene av hver type glykan etter binning i seks kategorier basert på deres komposisjoner er like mellom begge metodene16.
Fosfoproteomics resultater fra den doble Ti-metoden sammenlignes med en konvensjonell IMAC fosfopeptid-bare berikelse i figur 5. Den dobbeltfunksjonelle Ti(IV)-berikelsen fungerer på samme måte som konvensjonell IMAC, som vist ved betydelig overlapping på protein-, peptid- og PTM-nivåene. Ved hjelp av begge metodene er flertallet av fosforylerte aminosyrer serin og treonin, med rundt 1% fosforylert tyrosin identifisert også. Begge metodene kan også brukes til å identifisere multifosforylaterte peptider.
Listene over modifiserte proteiner kartlegges gener og analyseres ved hjelp av gen ontologi (GO) berikelse som vist i figur 6 og figur 7. GO-analyser for de modifiserte proteinene identifisert ved hjelp av ERLIC og IMAC er vist i tilleggsfigur S4 og tilleggsfigur S5. Det gratis, online Metascape-verktøyet utfører berikelsen og skaper nettverk basert på berikede veier og prosesser, og kobler dem sammen med likhet23. Nodebetingelsene for hver GO-analyse finner du i Supplerende tabell S1, Supplerende tabell S2, Supplerende tabell S3 og Supplerende tabell S4. Siden glykosylering er et stort protein PTM i den ekstracellulære matrisen, er det ikke overraskende at flere termer beriket ved hjelp av listen over N-glykoproteiner identifisert er relatert til den ekstracellulære matrisen. Fosforylering er involvert i cellesignalering, og dette kan ses i flere berikede termer som finnes ved hjelp av listen over fosfoproteiner identifisert.
Figur 2: Kommenterte høy tillit TIL MS/MS-spektra fra N-glykosylerte og fosforylerte peptider. (A) Mannose-6-fosforyllatert peptid GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Fosfo(1))VTR fra cathepsin D (CATD) identifisert fra oppbevaringstider 53.08-53.33 min fra den syvende berikelses-elutionen. Tilstedeværelsen av FosfoHex oxonium ion på 243 m/z forbedrer tilliten til dette PTM-oppdraget. (B) Fosforylatert peptid VEEEQEADEEDVS(Fosfo)EEEAESK fra tioredoxinrelatert transmembranprotein 1 (TMX1) fra oppbevaringstider 32.31-32.72 min fra den sjette berikelses-elutionen. Tilstedeværelsen av -98 (-H3PO4) nøytrale tap mellom peptidfragmentioner og deres avfosforylaterte varianter (betegnet av fragment*) forbedrer tilliten til dette PTM-oppdraget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av peptididentifikasjoner fra dobbeltfunksjonell Ti(IV)-IMAC-berikelse over syv elutioner. Antall identifikasjoner inkluderer peptider identifisert i minst en av de to tekniske (injeksjon) replikerer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av glykoproteomics er et resultat av dobbeltfunksjonelt Ti(IV)-IMAC-berikelse sammenlignet med en konvensjonell ERLIC glykopeptidberikelse. (A) Venn-diagrammer over glykoprotein, glykoform (protein, sted, glykan), glykansammensetning og glykosittidentifikasjoner mellom berikelsesmetoder. (B) Sektordiagrammer av glykaner identifisert på peptid ryggrader mellom berikelsesmetoder. Glykaner er binned i seks grupper basert på deres sammensetning16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av fosfoproteomikk er et resultat av dobbeltfunksjonelt Ti(IV)-IMAC-berikelse sammenlignet med en konvensjonell Ti(IV)-IMAC fosfopeptidberikelse. (A) Venn-diagrammer over fosfoprotein-, fosfopeptid- og fosfosittidentifikasjoner mellom berikelsesmetoder. (B) Sektordiagrammer med trygt lokaliserte (75% eller høyere sannsynlighet) fosforer brutt ned av aminosyrerester. (C) Stablet stangplott av identifiserte fosfopeptider binned av en rekke fosforylater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Gen ontologi berikelse av N-glykoproteiner identifisert ved hjelp av dobbeltfunksjonell Ti (IV)-IMAC berikelse. N-glykoproteiner kartlegges tilbake til gener, og betydelig berikede veier og prosessbetingelser identifiseres ved hjelp av hele genomet som bakgrunn. Ulike farger brukes til å merke klynger av termer som er forbundet med term likhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Gen ontologiberikelse av fosfoproteiner identifisert ved hjelp av dobbeltfunksjonell Ti(IV)-IMAC-berikelse. Fosfoproteiner kartlegges tilbake til gener, og betydelig berikede veier og prosessbetingelser identifiseres ved hjelp av hele genomet som bakgrunn. Ulike farger brukes til å merke klynger av termer, som er forbundet med term likhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Eksempel på total ionkromatogrammer (TICer) fra hver elution fra dobbeltfunksjonell Ti(IV)-IMAC (E1 til E7, paneler A-G) berikelse. Totalt signal (ionstrøm) er plottet over den 117 min datainnsamlingsperioden. Intensiteten til grunntoppen angis av verdien NL. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Eksempel på total ionkromatogrammer (TICer) fra hver elution fra ERLIC (E1 til E5, paneler A-E) berikelse. Totalt signal (ionstrøm) er plottet over den 117 min datainnsamlingsperioden. Intensiteten til grunntoppen angis av verdien NL. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Eksempel total ionkromatogram (TIC) fra elution fra Ti-IMAC berikelse. Totalt signal (ionstrøm) er plottet over den 117 min datainnsamlingsperioden. Intensiteten til grunntoppen angis av verdien NL. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S4: Gen ontologi berikelse av N-glykoproteiner identifisert ved hjelp av konvensjonell glykopeptid berikelse med ERLIC. N-glykoproteiner kartlegges tilbake til gener, og betydelig berikede veier og prosessbetingelser identifiseres ved hjelp av hele genomet som bakgrunn. Ulike farger brukes til å merke klynger av termer, som er forbundet med term likhet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S5: Gen ontologi berikelse av fosfoproteiner identifisert ved hjelp av konvensjonell fosfopeptid berikelse med Ti (IV)-IMAC. Fosfoproteiner kartlegges tilbake til gener, og betydelig berikede veier og prosessbetingelser identifiseres ved hjelp av hele genomet som bakgrunn. Ulike farger brukes til å merke klynger av termer, som er forbundet med term likhet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabeller S1-S4: Metascape nodeinformasjon for gen ontologi berikelsesanalyser. Tabeller inneholder nodeinformasjon for lister over N-glykoproteiner og fosfoproteiner identifisert ved hjelp av dual Ti (Tabell S1 og Tabell S2), N-glykoproteiner som bruker ERLIC (Tabell S3) og fosfoproteiner ved hjelp av IMAC (tabell S4). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dobbeltfunksjonelle Ti(IV)-IMAC-strategien er nyttig for samtidig analyse av N-glykopeptider og fosfopeptider fra samme prøve i en enkelt arbeidsflyt for prøveforberedelse. ERLIC-baserte metoder har også vist seg å utføre samtidig berikelse av PTMer. Begge strategiene har tidligere blitt brukt til dyp dekning i PTM-analyserpå 14,18. Ved å tilpasse den doble Ti-metoden til å redusere prøveinkubasjonstiden ved å bruke spinntips, håper vi at denne protokollen har blitt mindre ressurskrevende og dermed mer allment tilgjengelig.
Samtidig analyse av flere PTMer oppnås gjennom synergistiske interaksjoner mellom analytter og funksjonsgruppene på overflaten av berikelsesmaterialet. Ved første pakking av spinnspisser med bomull økes oppbevaringen av glykopeptider i HILIC-modus på grunn av utbredelsen av hydroksylgrupper på cellulose24. Ved å bruke vann og acetonitril (et vann-blandbart løsningsmiddel) beholdes glykopeptider og separeres på grunn av dannelse av vann og organiske lag. Materialet for dobbeltfunksjonell Ti(IV) berikelse er avhengig av immobiliserte Ti (IV) kasjoner for binding av fosfoptider. De hydrofile egenskapene til materialets sidekjeder brukes til å beholde glykopeptider i HILIC-modus, som først elutes ved hjelp av sur elution med økende vandig innhold. Materialet vaskes videre med konvensjonelle IMAC fosfopeptidberikelsesbuffere for å elute sialylerte glykopeptider, som har høyere affinitet til den stasjonære fasen enn andre nøytrale glykopeptider. Etter å ha kondisjonert materialet til grunnleggende pH, brukes ammoniumhydroksid og ACN-løsning til å bryte de elektrostatiske interaksjonene som holder fosfopeptider bundet til materialet. I mellomtiden tillater det avtagende organiske innholdet separasjon av mono- og multifosforilaterte peptider og M6P glykopeptider.
Ved separering av PTMer ved hjelp av flere elutiontrinn i samme arbeidsflyt, kan biomolekylær informasjon maksimeres fra begrensede prøver. En advarsel med slike doble PTM-analysearbeidsflyter er kravet om en relativt stor mengde prøve (0,5 mg peptider) som startmateriale for hver berikelse når minst fem fraksjoner samles inn. Likevel tilbyr den samtidige berikelsesstrategien som presenteres her fortsatt betydelig besparelse av materialer sammenlignet med konvensjonelle strategier. Selv før berikelse er det nødvendig med flere viktige trinn for å sikre PTM-integritet og for å unngå artefaktuelt tap av PTM-informasjon. Disse inkluderer riktig lagring av prøver ved lave temperaturer når de ikke er i bruk (ideelt -80 °C), bruk av protease- og fosfathemmere under proteinutvinning, og bruk av en hydrofil peptidoppryddingsmetode, for eksempel HLB-patronene som brukes her.
Det har blitt observert at ERLIC (konvensjonell glykopeptidberikelse) resulterte i bedre glykoproteomdekning, mens dobbeltfunksjonell Ti (IV)-IMAC ble utkonkurrert i unike identifikasjoner av konvensjonelle Ti-IMAC i fosfoproteomics resultater. Den fysiske strukturen og økt hydrofilitet av ERLIC-materialet sammenlignet med det doble Ti-berikelsesmaterialet er sannsynligvis en viktig faktor i den forbedrede glykoproteomdekningen i ERLIC. Den økte dekningen av fosfoproteomet i konvensjonell IMAC kan være et resultat av redusert ionundertrykking fra fjerning av glykopeptider under de første elutiontrinnene og vasketrinnene. Til tross for disse små reduksjonene i dekningen ved hjelp av den samtidige doble Ti-arbeidsflyten, oppnås fortsatt betydelig overlapping med konvensjonell enkelt PTM-berikelse med den ekstra fordelen av bare å utføre en berikelsesarbeidsflyt i stedet for to.
Når det gjelder tidsbegrensninger, har ERLIC og konvensjonell Ti-IMAC færre brøker enn den doble Ti-arbeidsflyten. Når det gjelder ressurser som trengs, er anionutvekslingsmaterialet som trengs for ERLIC billigere enn det funksjonaliserte materialet som trengs for de doble Ti og konvensjonelle IMAC-arbeidsflytene. I disse protokollene ble bare N-koblet og ikke O-koblet glykosylering analysert. Enzymet PNGase F kan (og bør) brukes til å spalte N-glykaner for å begrense antall falske positiver oppnådd hvis du søker etter O-glykopeptider. Det har imidlertid vist seg at denne strategien reduserer spesifisiteten til HILIC og ERLIC for glykopeptidberikelse25. I protokollen brukes en strategi ved hjelp av to separate programvare for å analysere rådatafiler. Byonic, en kommersiell programvare, regnes som gullstandarden for å analysere glykoproteomikkdata. På grunn av mangfoldet av N-glykanstrukturer økes peptidsøkeområdet, og øker dermed søketidene. Fosforylering kan også tilsettes som en vanlig PTM i tillegg til glykosylering under søk, selv om søketidene kan skyrocket avhengig av om peptid multifosforylering vurderes. MaxQuant, en programvare med åpen kildekode, kan optimaliseres for å minimere FDR i fosfoproteomics resultater, selv om kompleks glykosylering ikke er så facile å søke. Det finnes også andre alternativer for åpen kildekode for søking etter glykoproteomiske data 26,27,28. Avhengig av de eksperimentelle målene og ressursene som er tilgjengelige, kan rørledningen LC-MS og dataanalyse som er beskrevet her, brukes som presentert eller endret. Ytterligere optimalisering av metodene forventes å forbedre dekningen av PTMene.
PTMer spiller en viktig rolle i biokjemiske prosesser på grunn av endringene i proteinstrukturen de gir. Det er ideelt at alle proteomiske analyser tar hensyn til alle protein-PTMer samtidig. Betydningen av summen av all proteinglykosylering, for eksempel, har blitt kalt meta-heterogenitet29. Målet med total PTM-analyse er imidlertid ennå ikke mulig med dagens MS-baserte teknologier. Bottom-up proteomics etterfulgt av PTM-spesifikk berikelse, det vil si HILIC og IMAC, er fortsatt gullstandarden for PTM-analyser, men ved å bruke samtidige berikelsesstrategier som de som er beskrevet her, kan biomolekylær informasjon bli bedre belyst. Interaksjoner på tvers av samtaler har vist seg å forekomme mellom ulike PTMer30,31, inkludert glykosylering og fosforylering32. Kvantitativ analyse av slike interaksjoner i sykdom, for eksempel i bukspyttkjertelsykdommer som diabetes og kreft, kan vise seg fruktbart for å øke vår forståelse av sykdomsmekanismer. Med optimalisering av ekstraksjonsmetoder blant forskjellige utvalgstyper, kan berikelsesprotokollene beskrevet her brukes til grundig profilering av glykoproteom og fosfoproteom i komplekse biologiske matriser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble delvis støttet av tilskuddsmidler fra NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 og R21AG065728) og Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B og SRA-2016-168-S-B). Data som ble presentert her ble også delvis innhentet gjennom støtte fra en NIH/NCATS UL1TR002373-pris gjennom University of Wisconsin Institute for Clinical and Translational Research. Orbitrap-instrumentene ble kjøpt gjennom støtte fra et NIH delt instrumentstipend (NIH-NCRR S10RR029531) og Office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education ved University of Wisconsin-Madison. Vi vil også anerkjenne den generøse støtten fra University of Wisconsin Organ and Tissue Donation Organization som ga menneskelig bukspyttkjertel til forskning og hjelp av Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett og prof. Jon Odorico for å gi prøvene til laboratoriet vårt. Vårt forskerteam ønsker å gi spesiell takk til familiene som donerte vev til denne studien. L.L. anerkjenner NIH grant S10OD025084, et Pancreas Cancer Pilot-stipend fra University of Wisconsin Carbone Cancer Center (233-AAI9632), samt et Vilas Distinguished Achievement Professorship og Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship med finansiering fra Wisconsin Alumni Research Foundation og University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
- Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
- Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
- Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
- Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
- Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
- Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
- Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
- Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
- Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
- Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
- Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
- Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
- Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
- Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
- Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
- Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
- Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
- Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
- Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).
