Summary
Modificações pós-translacionais (PTMs) alteram estruturas e funções proteicas. Métodos para o enriquecimento simultâneo de vários tipos de PTM podem maximizar a cobertura nas análises. Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia de afinidade metálica ti(IV) automobilizada duplamente, seguida de espectrometria de massa para o enriquecimento simultâneo e análise da proteína N-glicosilação e fosforilação em tecidos pancreáticos.
Abstract
A espectrometria em massa pode fornecer uma cobertura profunda de modificações pós-translacionais (PTMs), embora o enriquecimento dessas modificações de matrizes biológicas complexas seja frequentemente necessário devido à sua baixa estequiometria em comparação com analitos não modificados. A maioria dos fluxos de trabalho de enriquecimento de PTMs em peptídeos em fluxos de trabalho de proteômica inferior, onde as proteínas são digeridas enzimáticamente antes da análise dos peptídeos resultantes, apenas enriquecem um tipo de modificação. É todo o complemento dos PTMs, porém, que leva a funções biológicas, e o enriquecimento de um único tipo de PTM pode perder tal crosstalk de PTMs. O crosstalk PTM tem sido observado entre a glicosilação proteica e a fosforilação, os dois PTMs mais comuns em proteínas humanas e também os dois PTMs mais estudados usando fluxos de trabalho de espectrometria de massa. Usando a estratégia simultânea de enriquecimento aqui descrita, ambos os PTMs são enriquecidos a partir de tecido pancreático humano pós-morte, uma complexa matriz biológica. A cromatografia de afinidade metálica duplamente funcional Ti(IV) é usada para separar várias formas de glicosilação e fosforilação simultaneamente em múltiplas frações em um método conveniente baseado em ponta de giro, permitindo análises a jusante de interações potenciais de crosstalk ptm. Esse fluxo de trabalho de enriquecimento para glico e fosfopeptídeos pode ser aplicado a vários tipos de amostra para alcançar perfis profundos de múltiplos PTMs e identificar moléculas-alvo potenciais para estudos futuros.
Introduction
As modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) desempenham um papel importante na modulação das estruturas proteicas e, consequentemente, suas funções e processos biológicos a jusante. A diversidade do proteome humano aumenta exponencialmente devido à variabilidade combinatória proporcionada por vários PTMs. Diferentes variantes de proteínas de suas sequências canônicas como previsto pelo genoma são conhecidas como proteoformas, e muitas proteoformas surgem dos PTMs1. Estudar a diversidade proteoforme em saúde e doença tornou-se uma área de pesquisa de grande interesse nos últimos anos 2,3.
O estudo de proteoformes e, mais especificamente, PTMs com grande profundidade tornou-se mais fácil através do desenvolvimento de métodos de proteômica baseados em espectrometria de massa (MS). Utilizando ES, os analitos são ionizados, fragmentados e identificados com base no m/z dos fragmentos. Métodos de enriquecimento são muitas vezes necessários devido à baixa abundância relativa de PTMs em comparação com formas não modificadas de proteínas. Embora a análise de proteínas intactas e seus PTMs, chamados de análises de cima para baixo, tenham se tornado mais rotineiras, a digestão enzimática das proteínas e a análise de seus peptídeos componentes em análises de baixo para cima ainda é o caminho mais utilizado para a análise de PTM. Os dois PTMs mais estudados, e os dois PTMs mais comuns in vivo, são glicosilação e fosforilação4. Esses dois PTMs desempenham papéis importantes na sinalização e reconhecimento celular e, portanto, são modificações importantes para caracterizar na pesquisa de doenças.
As propriedades químicas de vários PTMs muitas vezes fornecem rotas para o enriquecimento desses PTMs nos níveis de proteína e peptídeo antes da análise. A glicosylação é um PTM hidrofílico devido à abundância de grupos hidroxis em cada monossacarídeo. Esta propriedade pode ser usada para enriquecer glicopeptídeos na cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), que pode separar glicopeptídeos mais hidrofílicos dos peptídeos hidrofóbicos não modificados5. A fosforilação adiciona a moiety fosfato, que é negativamente carregada, exceto no pH ácido. Devido a esta carga, várias cálas metálicas, incluindo titânio, podem ser usadas para atrair e ligar fosforpeptídeos enquanto espécies não fosfoiladas são lavadas. Este é o princípio da cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC). Outras discussões sobre essas e outras estratégias de enriquecimento para glicosilação e fosforilação podem ser encontradas em revisões recentes 6,7.
Quantidades comparativamente grandes de material de peptídeo inicial (0,5 mg ou mais) são frequentemente necessárias para protocolos de enriquecimento devido à baixa estequiometria de PTMs em peptídeos. Em cenários onde essa quantidade de amostra pode não ser facilmente obtida, como biópsia do núcleo tumoral ou análises de fluidos cefalorraquidianos, é benéfico usar fluxos de trabalho fáceis que resultam em informações biomoleculares máximas. Estratégias recentes desenvolvidas pelo nosso laboratório e outras têm destacado a análise simultânea e paralela da glicosilação e fosforilação utilizando o mesmo fluxo de trabalho de enriquecimento ptm 8,9,10,11,12. Embora as propriedades químicas desses dois PTMs possam diferir, esses PTMs podem ser analisados em múltiplas etapas devido às técnicas de separação inovadoras e materiais utilizados. Por exemplo, a cromatografia de interação eletrostática-hidrofílica (ERLIC) sobrepõe separações baseadas em interações hidrofílicas entre analitos e a fase móvel com interações de carga entre analitos e o material de fase estacionária 13,14,15,16. No pH ácido, a atração de peptídeos fosforilalatados para a fase estacionária pode melhorar sua retenção e separação de peptídeos não modificados. O material constituído por Ti(IV) imobilizado em microesferas hidrofílicas pode ser usado para elução baseada em HILIC e IMAC para separar fosforpeptídeos e glicopeptídeos neutros, ácidos e sistoluados-6-fosforilados17,18. Esta estratégia é conhecida como Ti(IV)-IMAC dual-funcional. O uso dessas estratégias para enriquecer vários PTMs em um único fluxo de trabalho pode tornar as análises de interações potenciais de crosstalk de PTM mais acessíveis. Além disso, o valor total da amostra e os requisitos de tempo são inferiores aos métodos convencionais de enriquecimento quando realizados em paralelo (ou seja, HILIC e IMAC em alíquotas de amostra separadas).
Para demonstrar a estratégia ti(IV)-IMAC dual-funcional para análise simultânea de glicosilação e fosforilação proteica, aplicamos-na para analisar tecidos pancreáticos humanos pós-morte. O pâncreas produz enzimas digestivas e hormônios regulatórios, incluindo insulina e glucagon. A função pancreática é prejudicada em doença pancreática. No diabetes, a regulação do açúcar no sangue é afetada, levando a níveis mais elevados de glicose no sangue. Na pancreatite, a inflamação resulta da auto-digestão do órgão3. Alterações nos perfis de PTM, incluindo glicosilação e fosforilação, podem resultar, como muitas vezes, em outras doenças.
Aqui, descrevemos um protocolo para um método de enriquecimento simultâneo baseado em spin-tip, baseado em uma estratégia ti(IV)-IMAC dual-funcional, para N-glicopeptídeos e fosfopeptídeos derivados de proteínas extraídas do tecido pancreático. O protocolo inclui extração e digestão de proteínas, enriquecimento, coleta de dados em MS e processamento de dados, como pode ser visto na Figura 1. Os dados representativos deste estudo estão disponíveis via Consórcio ProteomeXchange com o identificador PXD033065.
Figura 1: Fluxo de trabalho para análise simultânea de N-glicopeptídeos e fosfopeptídeos de tecidos pancreáticos humanos. Os tecidos são primeiro crio-pulverizados em um pó fino antes da extração de proteínas usando o sulfato de dodecyl de sódio detergente (SDS). As proteínas são então submetidas à digestão enzimática. Os peptídeos resultantes são aliquosantes antes do enriquecimento usando Ti(IV)-IMAC dual-funcional. Os dados brutos são coletados usando espectrometria de massa líquida de fase invertida de nanoescala (nRPLC-MS) e são analisados usando software de pesquisa de banco de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Este protocolo visa tornar as análises de PTM mais acessíveis e permitir uma análise mais difundida de vários PTMs no mesmo fluxo de trabalho. Este protocolo pode ser aplicado a outras matrizes biológicas complexas, incluindo células e biofluidos.
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Protocol
O consentimento foi obtido para o uso de tecidos pancreáticos para pesquisa dos parentes mais próximos do falecido e obteve-se uma autorização do Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Wisconsin-Madison Health Sciences. A fiscalização do IRB não é necessária porque não envolve seres humanos reconhecidos por 45 CFR 46.102(f).
ATENÇÃO: Deve-se tomar cuidado ao manusear os reagentes utilizados neste protocolo, que incluem ácidos (formic, acético, trifluoroacético), bases (hidróxido de amônio) e criogens (nitrogênio líquido). Leia as folhas de dados de segurança dos reagentes usados para se familiarizar com os perigos associados e as precauções necessárias. As concentrações denotadas usando percentagens são volume/volume total (v/v) e são diluídas com água.
1. Crio-pulverização tecidual, lise e extração de proteínas
- Encha uma de guerra com nitrogênio líquido. Pré-arrefeça as partes do pulverizador de tecido que entrarão em contato com os tecidos pancreáticos, ou seja, a câmara, o pulverizador e a colher de recuperação em um recipiente de poliestireno.
- Transfira os pedaços de tecido congelado para o suporte de amostra pré-refrigerado e adicione uma colher cheia de nitrogênio líquido ao tecido.
- Coloque o pulverizador na câmara e golpee-o usando um martelo de cinco a dez vezes para esmagar a amostra. Remova o pulverizador da câmara e raspe o pó de tecido e pedaços aderentes.
- Adicione uma colher cheia de nitrogênio líquido à câmara se os tecidos começarem a derreter. Repita o processo de pulverização até que a amostra seja um pó fino sem grandes pedaços de tecido. Porção das amostras em aproximadamente 100 mg de alíquotas em tubos pré-refrigerados.
- Prepare o tampão de lise contendo 4% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS), 150 mM NaCl e 25 mM Tris (pH = 7,4). Dissolva um comprimido cada um do inibidor de protease e fosfatase em 500 μL de água para um estoque de 20x de cada um. Adicione o volume necessário de estoque de 20x de cada inibidor ao tampão de lise para uma concentração final de 1x.
- Adicione 600 μL de tampão de lise por 100 mg de tecido ao tubo e incubar a 95 °C em um bloco de aquecimento por 10 min com agitação a 800 rpm. Remova as amostras do bloco de aquecimento e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
- Sonicar as amostras a 60 W de energia (20 kHz) para 45 s usando pulsos de 15 s com um descanso de 30 s no meio. Pelota as amostras a 3.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Adicione o supernante a um solvente de precipitação de 5x, 300 μL de tampão de lise a 1,5 mL de solvente de precipitação, contendo 50% de acetona, 49,9% de etanol e 0,1% ácido acético. Esfrie durante a noite a -20 °C.
- Pelotar as amostras novamente a 3.000 x g por 15 min a 4 °C e remover o sobrenante. Lave a pelota rompendo com uma espátula e misturando com a mesma quantidade de solvente de precipitação. Pelota novamente, repetindo o passo de lavagem 2x.
- Pelota a amostra a 16.000 x g para 15 min a 4 °C. Seque a pelota de amostra em um capô de fumaça por 15 minutos e armazene a -80 °C até estar pronto para prosseguir.
2. Digestão e desalado de proteínas
- Resuspend a pelota de proteína em 300 μL de tampão de digestão recém-feito contendo 50 mM trietilamonium bicarbonato (TEAB) e 8 M ureia.
- Estimar a concentração proteica da solução usando um ensaio proteico de acordo com o protocolo do fabricante.
- À proteína da solução, adicione dithiothreitol (DTT) a uma concentração final de 5 mM, misture e reduza à temperatura ambiente por 1h. Em seguida, adicione iodoacetamida (IAA) a uma concentração final de 15 mM, misture e aquileie a temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Sacie a alquilação repetindo a adição de DTT no mesmo volume de antes e misture.
- Adicione LysC/trypsin a 1:100 enzima:razão de proteína e incubar a 37 °C por 4h. Em seguida, adicione 50 mM TEAB para diluir a ureia de 8 M usada para < 1 M. Adicione trippsina a 1:100 enzima:razão proteica e incubar a 37 °C durante a noite.
- Sacie a digestão com a adição de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,3% v/v. Para cada 1 mg de proteína inicial, condiciona um cartucho de desalting (1 cc, 10 mg) com 1 mL de acetonitrilo (ACN) e 3x com 1 mL de 0,1% TFA.
- Coloque a mistura digerida no cartucho de desalado. Lave a mistura 3x usando 1 mL de 0,1% TFA. Se a elução for lenta, aplique pressão positiva, mas evite uma taxa de fluxo > uma queda por segundo.
- Peptídeos elutes utilizando 1 mL de 60% de ACN e 0,1% de solução de ácido fórmico (FA). Peptídeos elucidos secos a aproximadamente 35 °C usando um concentrador de vácuo centrífuga até que o solvente tenha evaporado completamente.
- Peptídeos resuspend em 300 μL de água e estimam concentrações de peptídeos usando um ensaio de peptídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Poros os peptídeos em 500 μg aliquots e seque completamente.
3. Enriquecimento de N-glycopeptida ERLIC
NOTA: As velocidades e tempos exatos da centrifugação podem diferir com base nas amostras e devem ser otimizados. Em geral, 300 x g por 2 min é apropriado para condicionamento e lavagem do material e 100 x g por 5 min para eluição.
- Pesar aproximadamente 3 mg de algodão e empacotá-lo em uma ponta de pipeta vazia de 200 μL (ponta de spin; ver Tabela de Materiais).
- Transfira material forte de enriquecimento de ânion-troca em um tubo e adicione 200 μL de 0,1% TFA por material de 10 mgs. Para enriquecimento de 500 μg de peptídeos, utilize 15 mg do material. Ative o material tremendo por 15 minutos.
- Com um adaptador de tubo, coloque a ponta de giro sobre um tubo de 2 mL e adicione bastante chorume à ponta por 15 mg de material. Remova o líquido girando em uma centrífuga de bancada.
- Condiciona o material por centrifugação 3x com 200 μL de ACN. Repita o condicionamento triplicado utilizando acetato de amônio de 100 mM (NH4Ac), 1% TFA e 80% ACN/0,1% TFA (tampão de carregamento).
- Resuspend 500 μg amostras de peptídeos em aproximadamente 200 μL de tampão de carga e fluxo através da ponta de giro. Recarregue o fluxo 2x para garantir a ligação completa.
- Lave o material por centrifugação 5x usando 200 μL de 80% ACN/0,1% TFA e, em seguida, 2x usando 200 μL de 80% ACN/0,1% FA.
- Elute os peptídeos por centrifugação com 200 μL de cada um dos seguintes: 50% ACN/0,1% FA (E1); FA 0,1% (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
- Lave o material centrifugando 2x com 200 μL de 80% ACN/5% NH4OH. Elute os peptídeos restantes com 200 μL de 10% NH4OH (E5).
- Seque todas as eluções completamente usando um concentrador de vácuo centrífuga a aproximadamente 35 °C.
- Realize a dessalução da elução básica (E5) utilizando uma ponta de desaling de acordo com o protocolo do fabricante.
- Seque a elução da ponta de desalamento usando um concentrador de vácuo centrífuga a aproximadamente 35 °C para completar.
4. Enriquecimento de fosfopecida Ti(IV)-IMAC
NOTA: As velocidades e tempos exatos da centrifugação podem diferir com base nas amostras e devem ser otimizados. Em geral, 300 x g por 2 min é apropriado para condicionamento e lavagem do material e 100 x g por 5 min para eluição.
- Pesar aproximadamente 3 mg de algodão e empacotá-lo em uma ponta de pipeta vazia de 200 μL (ponta de spin).
- Transfira o material de enriquecimento de fosfopeptídeo Ti-IMAC em um tubo e adicione 200 μL de 0,1% de TFA por material de 10 mgs. Para enriquecimento de peptídeos de 500 μg, utilize 10 mg de material.
- Com um adaptador de tubo, coloque a ponta de giro sobre um tubo de 2 mL e adicione bastante chorume à ponta para 10 mg de material. Remova o líquido girando em uma centrífuga de bancada.
- Condiciona o material com 200 μL de 40% de ACN/3% TFA utilizando as mesmas configurações de centrífugas descritas acima. Amostras de peptídeos resuspend em 200 μL de 40% ACN/3% TFA e fluem através da ponta de spin. Recarregue o fluxo duas vezes para garantir uma ligação mais completa.
- Lave o material por centrifugação com 200 μL de 50% ACN, 6% TFA e solução de NaCl de 200 mM, seguido pela lavagem de 2x em 200 μL de 30% de ACN e solução de 0,1% TFA.
- Peptídeos elutos com 200 μL de 10% NH4OH. Seque a elução completamente sob vácuo. Realize a desalting usando uma ponta de desalhing de acordo com o protocolo do fabricante. Seque a elução da ponta de desalamento sob vácuo até a completude.
5. Enriquecimento simultâneo ti(IV) dual-funcional
NOTA: As velocidades e tempos exatos da centrifugação podem diferir com base nas amostras e devem ser otimizados. Em geral, 300 x g por 2 min é apropriado para condicionamento e lavagem do material e 100 x g por 5 min para eluição.
- Pese aproximadamente 3 mg de algodão e embale-o em uma ponta de spin vazia.
- Transfira aproximadamente 1 g de material Ti(IV)-IMAC em um tubo. Adicione 0,1% TFA a uma concentração conhecida de material, por exemplo, 20 mg/200 μL (o material pode ser armazenado nesta suspensão a 4 °C).
- Para o enriquecimento a partir de peptídeos de 500 μg, adicione chorume suficiente a uma ponta de giro para transferir 20 mg de material. Lave a ponta de giro por centrifugação com 200 μL de 0,1% TFA.
- Resuspenque as amostras em 200 μL de solvente de carga/lavagem (80% ACN e 3% TFA) e flua através da ponta de spin. Recarregue o fluxo 2x.
- Lave a ponta de giro 6x por centrifugação com 200 μL de solvente de carga/lavagem. Lave a ponta giratória com 200 μL de 80% de solução ACN/0,1% FA.
- Elute os peptídeos com 200 μL de cada um dos seguintes: 60% ACN/0,1% FA (E1) e 40% ACN/0,1% FA (E2). Analise cada elução separadamente.
- Elute os peptídeos com 200 μL de cada um dos seguintes: 20% ACN/0,1% FA e 0,1% FA. Combine as duas eluções e analise como uma amostra (E3).
- Elute os peptídeos com 200 μL de cada um dos seguintes: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; e 30% ACN/0,1% TFA. Combine essas eluções e analise como um (E4) após a dessedação usando uma ponta embalada.
- Condicionar o material ao pH básico utilizando 200 μL de 90% ACN/2,5% NH4OH para 3x. Descarte essas lavagens.
- Elute os peptídeos com 200 μL de cada um dos seguintes: 60% ACN/10% NH4OH (E5) e 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analise essas eluções separadamente após a dessedação usando uma ponta embalada.
- Elute os peptídeos com 200 μL de cada um dos seguintes: 20% ACN/10% NH4OH; ACN/10% ACN/10% NH4OH; e 10% NH4OH. Combine essas eluções e analise como um (E7) após a dessedação usando uma ponta embalada.
- Seque todas as eluções completamente sob vácuo.
6. Espectrometria de massa líquida de cromatografia líquida de nano-fluxo (nRPLC-MS)
NOTA: Os métodos de aquisição e análise de dados ms são diversos e, portanto, apenas um pipeline sugerido de LC-MS (e seus parâmetros associados) é descrito aqui nas seguintes etapas. As amostras geradas utilizando as etapas de preparação e enriquecimento da amostra previamente delineadas podem ser analisadas utilizando outras configurações instrumentais, incluindo o uso de colunas cromaatográficas disponíveis comercialmente, dada a qualidade suficiente dos dados.
- Puxe e embale um capilar de 15 cm de comprimento (75 μm de diâmetro interno) usando material C18 como descrito em19. Preparar a fase móvel A (0,1% FA na água) e a fase móvel B (0,1% FA na ACN).
- Reconstituir amostras de peptídeo enriquecido em 15 μL de 3% de fase móvel B. Carregue 2 μL da amostra (~13% de volume amostral) diretamente na coluna. Analise cada amostra em duplicata técnica.
- Peptídeos elutes usando um gradiente de 3% a 30% de fase móvel B acima de 90 min a uma taxa de fluxo de 0,3 μL/min. Lave a coluna utilizando 75% B por 8 min seguido de 95% B por 8 min, terminando o método com equilíbrio em 3% B por 12 min.
- Opere o espectrômetro de massa no modo íon positivo utilizando a aquisição dependente de dados dos 20 picos superiores com os seguintes parâmetros: tensão de pulverização 2 kV; Detecção de MS1 em LC/MS de 400-2.000 m/z a 120.000 de resolução, meta de controle automático de ganho (AGC) 2E5, tempo máximo de injeção de 100 ms, lente RF de 30%, isolamento quadrupole com janela de 1,6 m/z , para estados de carga 2-8 e indeterminados, e exclusão dinâmica de 30 s; Detecção de MS2 na LC/MS utilizando fragmentação escalonada de HCD em 22%, 30% e 38%, primeira massa fixa de 120 m/z com resolução de 30.000, meta 5E4 AGC e exigência de intensidade mínima de 2,5E4.
7. Análise de dados de MS
NOTA: Um pipeline de análise de dados usando dois softwares diferentes para analisar o mesmo conjunto de dados é apresentado aqui. A fosforilação e a glicosilação podem ser pesquisadas ao mesmo tempo usando um único software em vez de dois softwares separados descritos aqui, embora, em geral, o tempo de pesquisa de software seja proporcional ao espaço de pesquisa, ou seja, número de PTMs considerados. Por essa razão, dois softwares diferentes são usados em paralelo à busca por glicopeptídeos e fosfopeptídeos.
- Processe arquivos de dados brutos usando o software apropriado (ver Tabela de Materiais).
- Pesquise espectros contra o banco de dados humano (ou específico de espécies) do UniProt. Coloque a carbamidometilação de Cys como uma modificação fixa. Defina o número máximo de decotes enzimáticos perdidos como dois.
- Nos arquivos de dados brutos, utilizando um software comercial (ver Tabela de Materiais), procure glycopeptides para ser analisado20. Use uma tolerância de massa precursora de 10 ppm e uma tolerância à massa de fragmentos 0,01 Da com um comprimento mínimo de peptídeo de quatro resíduos.
- Pesquise usando o banco de dados N-glicano incorporado pelo software expandido com glicanos típicos de sisão-6-fosfato (M6P)glicas, incluindo HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1 -2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) e HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1).
- Defina a glicossylation como uma modificação comum. Defina as modificações totais máximas por partida espectral de peptídeos (PSM) como uma comum e duas raras.
- Definir as seguintes modificações variáveis: oxidação de Met (raro), desamidação em Asn e Gln (raro) e fosforilação em Ser, Thr e Tyr (comum). Defina os seguintes filtros de identificação: corte de pontuação > 150, prob |log| > 1, e delta mod pontuação > 10.
- Exportar e analisar os resultados da pesquisa nas guias Proteins e Peptide Group.
- Tela manualmente as identificações contendo gliccanos M6P para a presença do íon oxonium PhosphoHex (243 m/z) no espectro MS/MS e remover falsas identificações positivas, que não contêm este íon diagnóstico.
- Nos arquivos de dados brutos, usando um software de código aberto (ver Tabela de Materiais), procure por fosforpeptídeos a serem analisados21. Use uma tolerância de peptídeo de primeira pesquisa de 20 ppm e uma tolerância de peptídeo de pesquisa principal de 4,5 ppm.
- Defina o número máximo de modificações por peptídeo para 5. Defina a taxa de descoberta falsa de PSM e proteína (FDR) para 1% e o comprimento mínimo do peptídeo para 7 resíduos.
- Definir modificações variáveis como oxidação em Met, acetilação de proteína n-terminal e fosforilação em Ser, Thr e Tyr. Analise os resultados da pesquisa usando os arquivos de modificaçõesSpecificPeptides.
- Determinar o número de identificações de PTMs nos níveis de proteína, peptídeo e modificação do local.
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Representative Results
Dados representativos de espectrometria de massa, incluindo arquivos brutos e resultados de pesquisa, foram depositados no Consórcio ProteomeXchange através do repositório de parceiros PRIDE com o identificador de conjunto de dados PXD03306522.
Neste trabalho, foram analisadas réplicas de injeção duplicada para cada eluição de enriquecimento. As identificações feitas a partir de ambas as réplicas técnicas foram colhidas na análise final. Devido à natureza semi-estocástica da aquisição dependente de dados na coleta de precursores de peptídeos para fragmentação de MS/MS, espera-se uma sobreposição de identificação de cerca de 70%-80% entre duplicatas técnicas. Em aplicações que utilizam esses métodos, pelo menos duas réplicas técnicas são incentivadas. Para análises estatísticas a jusante, devem ser levadas em consideração as réplicas biológicas para diferentes condições experimentais. Dependendo da sequência desejada para relatórios de dados, pode ser útil definir filtros para identificações, por exemplo, identificação em pelo menos x número de réplicas técnicas ou biológicas a serem relatadas.
Um exemplo de cromatografia de íon total (TIC) para cada eluição de cada enriquecimento pode ser visto em Figura Suplementar S1, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3. O uso de filtros rigorosos durante a pesquisa de banco de dados de arquivos de MS brutos pode garantir identificações mais precisas e mais confiantes de espectros de MS/MS para sequências de peptídeos com PTMs. Como é evidente nos TICs para cada eluição, as amostras de peptídeos ainda são complexas mesmo após o fracionamento do enriquecimento. A cromatografia de nanofluxo acoplada a uma alta resolução, alta precisão de massa e espectrômetro de massa de varredura rápida pode ajudar a analisar misturas complexas, como peptídeos de um digestor trippático, com grande sensibilidade e profundidade. Exemplo, espectros MS/MS para espectros glicosilatos e fosfoilados podem ser vistos na Figura 2. Espectros bem anotados como esses resultam de rica fragmentação de precursores que aumentam a confiança na identificação atribuída pelo software de pesquisa de banco de dados.
A Figura 3 ilustra as identificações de peptídeos feitas usando o método de enriquecimento de ponta de spin ti(IV)-IMAC dual-funcional sobre cada fração de eluição. A maioria dos glicopeptídeos elute nas quatro primeiras frações, enquanto a maioria dos fosfopeptides elute nas últimas três frações. Essa separação de diferentes PTMs entre as frações ajuda a evitar qualquer interferência na ionização que possa resultar se não estiverem adequadamente separadas entre as eluções.
A Figura 4 compara os resultados da glicoproteômica do método Ti duplo em comparação com um enriquecimento erlic somente glicopeptídeo. Como pode ser visto na Figura 4A, muitas identificações nos níveis de proteína, glicoforme, PTM e site de modificação são comuns a ambos os métodos. Erlic tem identificações mais únicas em todos os níveis em comparação com o método Ti duplo, no entanto. Isso inclui glifos M6P (glicanos de alta mannose com pelo menos um grupo de fosfato), que requerem curadoria manual adicional dos dados para remover identificações falsas positivas. Além disso, os tipos de glicanos identificados usando qualquer método são semelhantes. As proporções de cada tipo de glicano após o binning em seis categorias com base em suas composições são semelhantes entre ambos os métodos16.
Os resultados da fosfoproteômica do método Ti duplo são comparados a um enriquecimento convencional de fosfopeptídeo iMAC na Figura 5. O enriquecimento ti(IV) dual-funcional tem desempenho semelhante ao IMAC convencional, como mostrado pela sobreposição substancial nos níveis de proteína, peptídeo e PTM. Usando qualquer método, a maioria dos aminoácidos fosfoilados são serinos e ritróoninos, com cerca de 1% de tirasina fosforilada identificada também. Ambos os métodos também podem ser usados para identificar peptídeos multifosforilalatados.
As listas de proteínas modificadas são mapeadas em genes e analisadas utilizando o enriquecimento de ontologia genética (GO), como mostrado na Figura 6 e Figura 7. As análises go para as proteínas modificadas identificadas utilizando ERLIC e IMAC são mostradas em Figura Suplementar S4 e Figura Suplementar S5. A ferramenta metascape gratuita e online realiza o enriquecimento e cria redes baseadas em caminhos e processos enriquecidos, vinculando-os por similaridade23. Os termos do nó para cada análise de GO podem ser encontrados na Tabela Suplementar S1, Tabela Suplementar S2, Tabela Suplementar S3 e Tabela Suplementar S4. Uma vez que a glicosylation é uma grande proteína PTM na matriz extracelular, não é de surpreender que vários termos enriquecidos usando a lista de N-glicoproteínas identificadas estejam relacionados à matriz extracelular. A fosforilação está envolvida na sinalização celular e isso pode ser visto em vários termos enriquecidos encontrados usando a lista de fosfoproteínas identificadas.
Figura 2: Anotado espectros ms/ms de alta confiança de peptídeos N-glicosylated e fosforilados. (A) Phosphorylated peptídeo GSLSYLN(2)Hex(7)Phospho(1))VTR da catepsina D (CATD) identificado a partir dos vezes de retenção 53,08-53,33 min da sétima eluição de enriquecimento. A presença do íon oxonium PhosphoHex a 243 m/z melhora a confiança nesta atribuição do PTM. (B) Peptídeo fosfoilado VEEEQEADEEDVS(Phospho)EEEAESK da proteína transmembrana relacionada à tiametoxina 1 (TMX1) de vezes 32,31-32,72 min da sexta eluição de enriquecimento. A presença de perdas neutras de -98 (-H3PO4) entre íons fragmentos de peptídeos e suas variantes desfosforiladas (denotadas por fragmento*) melhora a confiança nesta atribuição de PTM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação de identificações de peptídeos a partir do enriquecimento ti(IV)-IMAC dual-funcional em sete eluções. O número de identificações inclui peptídeos identificados em pelo menos uma das duas réplicas técnicas (de injeção). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação da glicoproteômica resulta do enriquecimento ti(IV)-IMAC dual-funcional em comparação com um enriquecimento erlic erlic erlic. (A) diagramas venn de glicoproteína, glicoforme (proteína, local, glica, glica, composição glica), e identificações de glicosite entre métodos de enriquecimento. (B) Gráficos de tortas de glicanos identificados em espinhas de peptídeos entre métodos de enriquecimento. Os glicanos são colocados em seis grupos com base em sua composição16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparação da fosfoproteômica resulta do enriquecimento ti(IV)-IMAC dual-funcional em comparação com um enriquecimento convencional de fosfopeptídeo ti(IV)-IMAC. (A) Diagramas de Venn de fosfoproteína, fosfopeptídeo e identificações fosfosite entre métodos de enriquecimento. (B) Gráficos de tortas de fosfosites confiantemente localizados (75% ou mais de probabilidade) discriminados por resíduo de aminoácidos. (C) Parcela de barras empilhadas de fosfopeptídeos identificados binados por uma série de resíduos fosforilalatados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Enriquecimento de ontologia genética de N-glicoproteínas identificadas usando enriquecimento ti(IV)-IMAC dual-funcional. N-glicoproteínas são mapeadas de volta aos genes e caminhos e termos de processo significativamente enriquecidos são identificados usando a totalidade do genoma como pano de fundo. Várias cores são usadas para rotular clusters de termos que são conectados por termos similaridade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Enriquecimento de ontologia genética de fosfoproteínas identificadas utilizando enriquecimento ti(IV)-IMAC dual-funcional. As fosfoproteínas são mapeadas de volta aos genes e caminhos e termos de processo significativamente enriquecidos são identificados usando a totalidade do genoma como pano de fundo. Várias cores são usadas para rotular clusters de termos, que são conectados por termos similaridade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Exemplo de cromatógrafos de íons totais (TICs) de cada eluição de ti(IV)-IMAC dual-funcional (E1 a E7, painéis A-G). O sinal total (corrente de íon) é plotado durante o período de coleta de dados de 117 min. A intensidade do pico base é dada pelo valor NL. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S2: Exemplo de cromatógrafos de íons totais (TICs) de cada elução do ERLIC (E1 a E5, painéis A-E) enriquecimento. O sinal total (corrente de íon) é plotado durante o período de coleta de dados de 117 min. A intensidade do pico base é dada pelo valor NL. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S3: Exemplo de cromatograma de íon total (TIC) a partir da elução do enriquecimento Ti-IMAC. O sinal total (corrente de íon) é plotado durante o período de coleta de dados de 117 min. A intensidade do pico base é dada pelo valor NL. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S4: Enriquecimento de ontologia genética de N-glicoproteínas identificadas utilizando enriquecimento convencional de glicopticida com ERLIC. N-glicoproteínas são mapeadas de volta aos genes e caminhos e termos de processo significativamente enriquecidos são identificados usando a totalidade do genoma como pano de fundo. Várias cores são usadas para rotular clusters de termos, que são conectados por termos similaridade. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S5: Enriquecimento de ontologia genética de fosfoproteínas identificadas utilizando enriquecimento convencional de fosfopeptídeo com Ti(IV)-IMAC. As fosfoproteínas são mapeadas de volta aos genes e caminhos e termos de processo significativamente enriquecidos são identificados usando a totalidade do genoma como pano de fundo. Várias cores são usadas para rotular clusters de termos, que são conectados por termos similaridade. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Tabelas suplementares S1-S4: Informações do nó metascape para análises de enriquecimento de ontologia genética. As tabelas contêm informações de nó para listas de N-glicoproteínas e fosfoproteínas identificadas usando ti dupla (Tabela S1 e Tabela S2), N-glicoproteínas usando ERLIC (Tabela S3) e fosfoproteínas usando IMAC (Tabela S4). Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
A estratégia Ti(IV)-IMAC dual-funcional é útil para a análise simultânea de N-glicopeptídeos e fosfopeptídeos da mesma amostra em um único fluxo de trabalho de preparação de amostra. Métodos baseados em ERLIC também têm sido mostrados para realizar o enriquecimento simultâneo de PTMs. Ambas as estratégias têm sido utilizadas anteriormente para cobertura profunda em análises de PTM14,18. Ao adaptar o método Ti duplo para diminuir o tempo de incubação da amostra usando spin-tips, esperamos que este protocolo tenha se tornado menos intensivo em recursos e, portanto, mais amplamente acessível.
A análise simultânea de múltiplos PTMs é obtida através de interações sinérgicas entre analitos e grupos funcionais na superfície do material de enriquecimento. Nas primeiras dicas de spin-embalagem com algodão, a retenção de glicoptocidas em um modo HILIC é aumentada devido à prevalência de grupos de hidroxis na celulose24. Usando água e acetonitrilo (um solvente incompleto de água), os glycopeptídeos são retidos e separados devido à formação de água e camadas orgânicas. O material para enriquecimento ti(IV) dual-funcional depende das célções imobilizadas de Ti(IV) para a ligação de fosforpeptídeos. As propriedades hidrofílicas das cadeias laterais do material são usadas para reter glicacopeptídeos em um modo HILIC, que são eluidas primeiro usando elução ácida com conteúdo aquoso crescente. O material é ainda lavado com tampões convencionais de enriquecimento de fosfopeptídeos IMAC para glicopeptídeos elutos, que têm maior afinidade com a fase estacionária do que outros glicopeptídeos neutros. Após o condicionamento do material ao pH básico, hidróxido de amônio e solução ACN é usado para quebrar as interações eletrostáticas que mantêm os fosforpeptídeos ligados ao material. Enquanto isso, a diminuição do conteúdo orgânico permite a separação de peptídeos mono e multifosforilados e glycopeptídeos M6P.
Ao separar os PTMs usando várias etapas de elução no mesmo fluxo de trabalho, as informações biomoleculares podem ser maximizadas a partir de amostras limitadas. Uma ressalva com esses fluxos de trabalho de análise ptm dupla é a exigência de uma quantidade relativamente grande de amostra (0,5 mg de peptídeos) como material inicial para cada enriquecimento quando pelo menos cinco frações são coletadas. No entanto, a estratégia simultânea de enriquecimento aqui apresentada ainda oferece uma economia significativa de materiais em relação às estratégias convencionais. Mesmo antes do enriquecimento, várias etapas importantes são necessárias para garantir a integridade do PTM e evitar a perda artefatosual de informações de PTM. Estes incluem o armazenamento adequado de amostras a baixas temperaturas quando não estão em uso (idealmente -80 °C), o uso de inibidores de protease e fosfatase durante a extração de proteínas, e o uso de um método de limpeza de peptídeos hidrofílicos, como os cartuchos HLB utilizados aqui.
Observou-se que o ERLIC (enriquecimento convencional de glicopeptídeo) resultou em melhor cobertura glicoproteome, enquanto o Ti(IV)-IMAC dual-funcional foi superado em identificações únicas pelo Ti-IMAC convencional nos resultados da fosfoproteômica. A estrutura física e o aumento da hidrofilicidade do material ERLIC em comparação com o material de enriquecimento dual Ti é provavelmente um fator importante na melhor cobertura de glicoprotetos em ERLIC. O aumento da cobertura do fosfoproteome no IMAC convencional pode ser resultado da diminuição da supressão de íons da remoção de glycopeptídeos durante as primeiras etapas de eluição e etapas de lavagem. Apesar dessas ligeiras reduções na cobertura usando o fluxo de trabalho dual Ti simultâneo, uma sobreposição significativa com o enriquecimento único de PTM convencional ainda é alcançada com o benefício adicional de realizar apenas um fluxo de trabalho de enriquecimento em vez de dois.
Em relação às restrições de tempo, o ERLIC e o Ti-IMAC convencional têm menos frações do que o fluxo de trabalho Ti duplo. Em relação aos recursos necessários, o material de troca de íons necessário para o ERLIC é mais barato do que o material funcionalizado necessário para os fluxos de trabalho Ti duplo e IMAC convencional. Nesses protocolos, apenas a glicosylation ligada a N e não ligada a O foi analisada. A enzima PNGase F pode (e deve) ser usada para cortar N-glicanos para limitar o número de falsos positivos obtidos se procurar o-glycopeptides. Foi demonstrado, no entanto, que essa estratégia reduz a especificidade do HILIC e do ERLIC para o enriquecimento de glicopticida25. No protocolo, uma estratégia usando dois softwares separados é usada para analisar arquivos de dados brutos. Byonic, um software comercial, é considerado o padrão-ouro na análise de dados de glicoproteomia. Devido à diversidade de estruturas N-glycan, o espaço de busca de peptídeos é aumentado, aumentando assim o tempo de busca. A fosforilação também pode ser adicionada como um PTM comum, além da glicosilação durante a busca, embora os tempos de pesquisa possam disparar dependendo se a multiforilação do peptídeo é considerada. MaxQuant, um software de código aberto, pode ser otimizado para minimizar o FDR em resultados fosfoproteomicos, embora a glicosilação complexa não seja tão fácil de pesquisar. Há também outras opções de código aberto para pesquisar dados glicoproteômicos 26,27,28. Dependendo das metas e recursos experimentais disponíveis, o LC-MS e o pipeline de análise de dados descritos aqui podem ser usados como apresentados ou modificados. Espera-se que a otimização dos métodos melhore a cobertura dos PTMs.
Os PTMs desempenham um papel importante nos processos bioquímicos devido às mudanças na estrutura proteica que transmitem. É ideal que todas as análises proteômicas levem em conta todas as PTMs proteicas simultaneamente. A importância da soma de toda a glicossylation proteica, por exemplo, tem sido denominada meta-heterogeneidade29. No entanto, a meta de análise total do PTM ainda não é possível com as tecnologias atuais baseadas em MS. A proteômica de baixo para cima seguida pelo enriquecimento específico do PTM, ou seja, HILIC e IMAC, ainda é o padrão ouro para análises de PTM, embora usando estratégias simultâneas de enriquecimento como as descritas aqui, as informações biomoleculares podem ser melhor elucidadas. Interações entre conversas foram encontradas entre vários PTMs30,31, incluindo glicosilação e fosforilação32. A análise quantitativa dessas interações em doenças, por exemplo, em doenças pancreáticas como diabetes e câncer, pode ser frutífera no aumento da compreensão dos mecanismos da doença. Com a otimização dos métodos de extração entre diferentes tipos de amostras, os protocolos de enriquecimento descritos aqui podem ser utilizados para o perfil aprofundado do glicoproteome e do fosfoproteome em matrizes biológicas complexas.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo financiamento de subvenções do NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 e R21AG065728), e da Fundação de Pesquisa de Diabetes Juvenil (1-PNF-2016-250-S-B e SRA-2016-168-S-B). Os dados aqui apresentados também foram obtidos em parte através do apoio de um prêmio NIH/NCATS UL1TR0002373 através do Instituto de Pesquisa Clínica e Translacional da Universidade de Wisconsin. Os instrumentos Orbitrap foram adquiridos através do apoio de uma bolsa de instrumentos compartilhados NIH (NIH-NCRR S10RR029531) e do Escritório do Vice-Chanceler de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade de Wisconsin-Madison. Também gostaríamos de reconhecer o generoso apoio da Organização de Doação de Órgãos e Tecidos da Universidade de Wisconsin, que forneceu pâncreas humano para pesquisa e a ajuda de Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett e Prof. Jon Odorico para fornecer as amostras ao nosso laboratório. Nossa equipe de pesquisa gostaria de agradecer especial às famílias que doaram tecidos para este estudo. L.L. reconhece a bolsa nih S10OD025084, uma bolsa piloto de câncer de pâncreas do Centro de Câncer carbone da Universidade de Wisconsin (233-AAI9632), bem como um Professor de Conquista Distinto de Vilas e o Professor de Cadeira Distinto Charles Melbourne Johnson com financiamento fornecido pela Wisconsin Alumni Research Foundation e Pela University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
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