Summary
Post-translationella modifieringar (PTM) förändrar proteinstrukturer och funktioner. Metoder för samtidig anrikning av flera PTM-typer kan maximera täckningen i analyser. Vi presenterar ett protokoll med dubbelfunktionell Ti(IV)-immobiliserad metallaffinitetskromatografi följt av masspektrometri för samtidig anrikning och analys av protein N-glykosylering och fosforylering i bukspottkörtelvävnader.
Abstract
Masspektrometri kan ge djup täckning av post-translationella modifieringar (PTM), även om anrikning av dessa modifieringar från komplexa biologiska matriser ofta är nödvändig på grund av deras låga stökiometri jämfört med icke-modifierade analyter. De flesta anrikningsarbetsflöden av PTM på peptider i bottom-up proteomics-arbetsflöden, där proteiner enzymatiskt smälts innan de resulterande peptiderna analyseras, berikar bara en typ av modifiering. Det är dock hela komplementet av PTM som leder till biologiska funktioner, och anrikning av en enda typ av PTM kan missa sådan överhörning av PTM. PTM-överhörning har observerats mellan proteinglykosylering och fosforylering, de två vanligaste PTM: erna i humana proteiner och även de två mest studerade PTM: erna med masspektrometriarbetsflöden. Med hjälp av den samtidiga anrikningsstrategin som beskrivs här berikas båda PTM: erna från post mortem human bukspottkörtelvävnad, en komplex biologisk matris. Dubbelfunktionell Ti (IV) -immobiliserad metallaffinitetskromatografi används för att separera olika former av glykosylering och fosforylering samtidigt i flera fraktioner i en bekväm spinnspetsbaserad metod, vilket möjliggör nedströmsanalyser av potentiella PTM-överhörningsinteraktioner. Detta anrikningsarbetsflöde för glyko- och fosfopeptider kan tillämpas på olika provtyper för att uppnå djup profilering av flera PTM och identifiera potentiella målmolekyler för framtida studier.
Introduction
Protein post-translationella modifieringar (PTM) spelar en viktig roll för att modulera proteinstrukturer och följaktligen deras funktioner och nedströms biologiska processer. Mångfalden i det mänskliga proteomet ökar exponentiellt på grund av den kombinatoriska variationen som erbjuds av olika PTM. Olika varianter av proteiner från deras kanoniska sekvenser som förutsägs av genomet är kända som proteoformer, och många proteoformer härrör från PTM1. Att studera proteoform mångfald inom hälsa och sjukdom har blivit ett forskningsområde av stort intresse de senaste åren 2,3.
Studien av proteoformer och mer specifikt PTM med stort djup har blivit mer lätt genom utvecklingen av masspektrometri (MS) -baserade proteomikmetoder. Med hjälp av MS joniseras, fragmenteras och identifieras analyter baserat på m /z av fragment. Anrikningsmetoder är ofta nödvändiga på grund av den låga relativa förekomsten av PTM jämfört med icke-modifierade former av proteiner. Även om analys av intakta proteiner och deras PTM, kallade top-down-analyser, har blivit mer rutinmässig, är den enzymatiska matsmältningen av proteiner och analysen av deras komponentpeptider i bottom-up-analyser fortfarande den mest använda vägen för PTM-analys. De två mest studerade PTM: erna, och de två vanligaste PTM : erna in vivo, är glykosylering och fosforylering4. Dessa två PTM spelar stora roller i cellsignalering och igenkänning och är därför viktiga modifieringar att karakterisera inom sjukdomsforskning.
De kemiska egenskaperna hos olika PTM ger ofta vägar mot anrikning av dessa PTM vid protein- och peptidnivåerna före analys. Glykosylering är en hydrofil PTM på grund av överflöd av hydroxylgrupper på varje monosackarid. Denna egenskap kan användas för att berika glykopeptider i hydrofil interaktionskromatografi (HILIC), som kan separera mer hydrofila glykopeptider från de hydrofoba icke-modifierade peptiderna5. Fosforylering tillför fosfatdelen, som är negativt laddad utom vid surt pH. På grund av denna laddning kan olika metallkatjoner, inklusive titan, användas för att locka och binda fosfopeptider medan icke-fosforylerade arter tvättas bort. Detta är principen för immobiliserad metallaffinitetskromatografi (IMAC). Ytterligare diskussioner om dessa och andra anrikningsstrategier för glykosylering och fosforylering finns i de senaste granskningarna 6,7.
Jämförelsevis stora mängder utgångspeptidmaterial (0,5 mg eller mer) behövs ofta för anrikningsprotokoll på grund av den låga stökiometrin av PTM på peptider. I scenarier där denna mängd prov kanske inte är lätt att erhålla, såsom tumörkärnbiopsi eller cerebrospinalvätskeanalyser, är det fördelaktigt att använda enkla arbetsflöden som resulterar i maximal biomolekylär information. De senaste strategierna som utvecklats av vårt laboratorium och andra har belyst samtidig och parallell analys av glykosylering och fosforylering med samma PTM-anrikningsarbetsflöde 8,9,10,11,12. Även om de kemiska egenskaperna hos dessa två PTM kan skilja sig åt, kan dessa PTM analyseras i flera steg på grund av de innovativa separationsteknikerna och materialen som används. Till exempel överlagrar elektrostatisk repulsions-hydrofil interaktionskromatografi (ERLIC) separationer baserade på hydrofila interaktioner mellan analyter och den mobila fasen med laddningsladdningsinteraktioner mellan analyter och det stationära fasmaterialet 13,14,15,16. Vid surt pH kan attraktionen av fosforylerade peptider till den stationära fasen förbättra deras retention och separation från icke-modifierade peptider. Material bestående av Ti(IV) immobiliserat på hydrofila mikrosfärer kan användas för HILIC- och IMAC-baserad eluering för att separera fosfopeptider och neutrala, sura och mannos-6-fosforylerade glykopeptider17,18. Denna strategi är känd som dubbelfunktionell Ti (IV) -IMAC. Att använda dessa strategier för att berika flera PTM i ett enda arbetsflöde kan göra analyser av potentiella PTM-överhörningsinteraktioner mer tillgängliga. Dessutom är den totala provmängden och tidskraven mindre än de konventionella anrikningsmetoderna när de utförs parallellt (dvs. HILIC och IMAC på separata prov alikvoter).
För att demonstrera den dubbelfunktionella Ti(IV)-IMAC-strategin för samtidig analys av proteinglykosylering och fosforylering har vi tillämpat den för att analysera post-mortem humana bukspottkörtelvävnader. Bukspottkörteln producerar både matsmältningsenzymer och reglerande hormoner, inklusive insulin och glukagon. Pankreasfunktionen är nedsatt vid bukspottkörtelsjukdom. Vid diabetes påverkas regleringen av blodsockret, vilket leder till högre nivåer av glukos i blodet. Vid pankreatit är inflammation resultatet av automatisk matsmältning av organet3. Förändringar i PTM-profiler, inklusive glykosylering och fosforylering, kan, som ofta är fallet, resultera i andra sjukdomar.
Här beskriver vi ett protokoll för en spin-tip-baserad samtidig anrikningsmetod, baserad på en dubbelfunktionell Ti(IV)-IMAC-strategi, för N-glykopeptider och fosfopeptider härledda från proteiner extraherade från bukspottkörtelvävnad. Protokollet inkluderar proteinutvinning och matsmältning, anrikning, MS-datainsamling och databehandling, vilket kan ses i figur 1. Representativa data från denna studie är tillgängliga via ProteomeXchange Consortium med identifierare PXD033065.
Figur 1: Arbetsflöde för samtidig analys av N-glykopeptider och fosfopeptider från humana bukspottkörtelvävnader. Vävnader pulveriseras först till ett fint pulver före proteinutvinning med användning av tvättmedlet natriumdodecylsulfat (SDS). Proteiner utsätts sedan för enzymatisk matsmältning. De resulterande peptiderna alikvoteras före anrikning med användning av dubbelfunktionell Ti(IV)-IMAC. Rådata samlas in med hjälp av vätskekromatografi-masspektrometri (nRPLC-MS) i nanoskala och analyseras med hjälp av databassökningsprogramvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Detta protokoll är avsett att göra PTM-analyser mer tillgängliga och möjliggöra mer omfattande analys av flera PTM i samma arbetsflöde. Detta protokoll kan tillämpas på andra komplexa biologiska matriser, inklusive celler och biofluider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtycke erhölls för användning av bukspottkörtelvävnader för forskning från den avlidnes anhöriga och ett tillstånd från University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board erhölls. IRB-tillsyn krävs inte eftersom det inte involverar mänskliga ämnen som erkänns av 45 CFR 46.102 (f).
VARNING: Försiktighet bör iakttas vid hantering av reagenserna som används i detta protokoll, som inkluderar syror (myrsyra, ättiksyra, trifluorättiksyra), baser (ammoniumhydroxid) och kryogener (flytande kväve). Läs säkerhetsdatabladen för de reagenser som används för att bekanta dig med de därmed förbundna farorna och nödvändiga försiktighetsåtgärder. Koncentrationer som betecknas med procentsatser är volym / total volym (v / v) och späds ut med vatten.
1. Vävnad kryo-pulverisering, lys och proteinutvinning
- Fyll en dewar med flytande kväve. Förkyl de delar av vävnadspulveriseraren som kommer i kontakt med bukspottkörtelvävnaderna, nämligen kammaren, pulveriseraren och återhämtningsskeden i en polystyrenbehållare.
- Överför de frysta vävnadsbitarna till den förkylda provhållaren och tillsätt en sked flytande kväve till vävnaden.
- Placera pulveriseraren i kammaren och slå den med en klubba fem till tio gånger för att krossa provet. Ta bort pulveriseraren från kammaren och skrapa bort vidhäftande vävnadspulver och bitar.
- Tillsätt en sked flytande kväve i kammaren om vävnader börjar smälta. Upprepa pulveriseringsprocessen tills provet är ett fint pulver utan stora vävnadsbitar. Dela proverna i cirka 100 mg alikvoter i förkylda rör.
- Förbered lysbuffert innehållande 4% natriumdodecylsulfat (SDS), 150 mM NaCl och 25 mM Tris (pH = 7,4). Lös upp en tablett vardera av proteas och fosfatashämmare i 500 μL vatten för en 20x stam av vardera. Tillsätt den erforderliga volymen av 20x lager av varje hämmare till lysbufferten för en slutlig 1x koncentration.
- Tillsätt 600 μl lysbuffert per 100 mg vävnad till röret och inkubera vid 95 °C i ett värmeblock i 10 min med skakning vid 800 rpm. Ta bort proverna från värmeblocket och låt dem svalna till rumstemperatur.
- Ultraljudsbehandling proverna vid 60 W energi (20 kHz) för 45 s med 15 s pulser med en 30 s vila däremellan. Pelletera proverna vid 3 000 x g i 15 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt supernatanten till ett 5x utfällningslösningsmedel, 300 μL lysbuffert till 1,5 ml utfällningslösningsmedel, innehållande 50% aceton, 49,9% etanol och 0,1% ättiksyra. Kyl över natten vid -20 °C.
- Pelletera proverna igen vid 3 000 x g i 15 min vid 4 °C och avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten genom att bryta upp med en spatel och blanda med samma mängd utfällningslösningsmedel. Pellet igen, upprepa tvättsteget 2x.
- Pelletera provet vid 16 000 x g i 15 minuter vid 4 °C. Lufttorka provpelleten i en dragskåp i 15 minuter och förvara vid -80 °C tills den är klar att fortsätta.
2. Proteinsmältning och avsaltning
- Återsuspendera proteinpelleten i 300 μL nygjord digestionsbuffert innehållande 50 mM trietylammoniumbikarbonat (TEAB) och 8 M urea.
- Uppskatta proteinkoncentrationen i lösningen med hjälp av en proteinanalys enligt tillverkarens protokoll.
- Till proteinet i lösningen tillsätt ditiotreitol (DTT) till en slutlig koncentration av 5 mM, blanda och minska vid rumstemperatur i 1 timme. Tillsätt sedan jodacetamid (IAA) till en slutlig koncentration på 15 mM, blanda och alkylera vid rumstemperatur i 30 minuter i mörker. Släck alkylering genom att upprepa tillsatsen av DTT i samma volym som tidigare och blanda.
- Tillsätt LysC/trypsin vid förhållandet 1:100 mellan enzym och protein och inkubera vid 37 °C i 4 timmar. Tillsätt sedan 50 mM TEAB för att späda ut 8 M urea som används för att < 1 M. Tillsätt trypsin vid förhållandet 1:100 enzym/protein och inkubera vid 37 °C över natten.
- Släck matsmältningen med tillsats av trifluorättiksyra (TFA) till 0,3% v / v. För varje 1 mg startprotein, konditionera en avsaltningspatron (1 cc, 10 mg) med 1 ml acetonitril (ACN) och 3x med 1 ml 0,1% TFA.
- Ladda den smälta blandningen på avsaltningspatronen. Tvätta blandningen 3x med 1 ml 0,1% TFA. Om elueringen är långsam, applicera positivt tryck men undvik en flödeshastighet > en droppe per sekund.
- Eluera peptider med 1 ml 60% ACN och 0,1% myrsyralösning (FA). Torka eluerade peptider vid cirka 35 °C med hjälp av en centrifugal vakuumkoncentrator tills lösningsmedlet har avdunstat helt.
- Resuspendera peptider i 300 μL vatten och uppskatta peptidkoncentrationer med hjälp av en peptidanalys enligt tillverkarens protokoll. Dela peptiderna i 500 μg alikvoter och torka helt.
3. ERLIC N-glykopeptid anrikning
OBS: Exakta centrifughastigheter och tider kan variera beroende på prover och måste optimeras. I allmänhet är 300 x g i 2 min lämpligt för konditionering och tvättning av materialet och 100 x g i 5 minuter för eluering.
- Väg upp cirka 3 mg bomullsull och packa den i en tom pipettspets på 200 μL (spinnspets; se materialtabell).
- Överför starkt anjonbytaranrikningsmaterial till ett rör och tillsätt 200 μl 0,1% TFA per 10 mg material. För anrikning av 500 μg peptider, använd 15 mg av materialet. Aktivera materialet genom att skaka i 15 minuter.
- Använd en röradapter och placera spinnspetsen över ett 2 ml rör och tillsätt tillräckligt med uppslamning i spetsen för 15 mg material. Ta bort vätskan genom att snurra i en bänkcentrifug.
- Konditionera materialet genom att centrifugera 3x med 200 μL ACN. Upprepa den tredubbla konditioneringen med 100 mM ammoniumacetat (NH4Ac), 1% TFA och 80% ACN/0,1% TFA (laddningsbuffert).
- Resuspendera 500 μg peptidprover i cirka 200 μL laddningsbuffert och flöde genom spinnspetsen. Ladda om genomströmningen 2x för att säkerställa fullständig bindning.
- Tvätta materialet genom att centrifugera 5x med 200 μL 80% ACN/0,1% TFA och sedan 2x med 200 μL 80% ACN/0,1% FA.
- Eluera peptiderna genom centrifugering med 200 μL av vart och ett av följande: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
- Tvätta materialet genom att centrifugera 2x med 200 μL 80% ACN/5% NH4OH. Eluera de återstående peptiderna med 200 μL 10%NH4OH (E5).
- Torka alla elueringar helt med hjälp av en centrifugal vakuumkoncentrator vid ca 35 °C.
- Utför avsaltning av den grundläggande elueringen (E5) med hjälp av en avsaltningsspets enligt tillverkarens protokoll.
- Torka elueringen från avsaltningsspetsen med en centrifugalvakuumkoncentrator vid cirka 35 °C till fullständighet.
4. Ti(IV)-IMAC fosfopeptid anrikning
OBS: Exakta centrifughastigheter och tider kan variera beroende på prover och måste optimeras. I allmänhet är 300 x g i 2 min lämpligt för konditionering och tvättning av materialet och 100 x g i 5 minuter för eluering.
- Väg upp cirka 3 mg bomullsull och packa den i en tom 200 μL pipettspets (spin-tip).
- Överför Ti-IMAC fosfopeptidanrikningsmaterial till ett rör och tillsätt 200 μl 0,1% TFA per 10 mg material. För anrikning av 500 μg peptider, använd 10 mg material.
- Använd en röradapter och placera spinnspetsen över ett 2 ml rör och tillsätt tillräckligt med uppslamning till spetsen för 10 mg material. Ta bort vätskan genom att snurra i en bänkcentrifug.
- Konditionera materialet med 200 μl 40 % ACN/3 % TFA med samma centrifuginställningar som beskrivits ovan. Resuspendera peptidprover i 200 μL av 40% ACN/3% TFA och flöda genom spin-tip. Ladda om genomströmningen två gånger för att säkerställa mer fullständig bindning.
- Tvätta materialet genom centrifugering med 200 μl 50% ACN, 6% TFA och 200 mM NaCl lösning, följt av tvättning 2x i 200 μL 30% ACN och 0,1% TFA-lösning.
- Eluera peptider med 200 μL 10%NH4OH. Torka elueringen helt under vakuum. Utför avsaltning med en avsaltningsspets enligt tillverkarens protokoll. Torka elueringen från avsaltningsspetsen under vakuum till fullständighet.
5. Dubbelfunktionell Ti(IV) samtidig anrikning
OBS: Exakta centrifughastigheter och tider kan variera beroende på prover och måste optimeras. I allmänhet är 300 x g i 2 min lämpligt för konditionering och tvättning av materialet och 100 x g i 5 minuter för eluering.
- Väg cirka 3 mg bomullsull och packa den i en tom spinnspets.
- Överför cirka 1 g Ti(IV)-IMAC-material till ett rör. Tillsätt 0,1 % TFA till en känd materialkoncentration, t.ex. 20 mg/200 μL (material kan förvaras i denna suspension vid 4 °C).
- För anrikning från 500 μg peptider, tillsätt tillräckligt med uppslamning till en spin-tip för att överföra 20 mg material. Tvätta spinnspetsen genom centrifugering med 200 μL 0,1% TFA.
- Resuspendera proverna i 200 μL laddnings-/tvättlösningsmedel (80 % ACN och 3 % TFA) och flödet genom centrifugeringsspetsen. Ladda om genomströmningen 2x.
- Tvätta spinnspetsen 6x genom centrifugering med 200 μL lastnings-/tvättlösningsmedel. Tvätta spinnspetsen med 200 μl 80 % ACN/0,1 % FA-lösning.
- Eluera peptiderna med 200 μL av vart och ett av följande: 60% ACN/0,1% FA (E1) och 40% ACN/0,1% FA (E2). Analysera varje eluering separat.
- Eluera peptiderna med 200 μL av vart och ett av följande: 20% ACN/0,1% FA och 0,1% FA.
- Elue peptiderna med 200 μL av vart och ett av följande: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; och 30 % ACN/0,1 % TFA. Kombinera dessa elueringar och analysera som en (E4) efter avsaltning med en packad spets.
- Konditionera materialet till basiskt pH med 200 μL 90% ACN/2,5%NH4OH för 3x. Kassera dessa tvättar.
- Eluera peptiderna med 200 μL av vart och ett av följande: 60% ACN/10%NH4OH (E5) och 40% ACN/10%NH4OH (E6). Analysera dessa elueringar separat efter avsaltning med en packad spets.
- Elue peptiderna med 200 μL av vart och ett av följande: 20% ACN / 10%NH4OH; 10% ACN/10%NH4OH; och 10%NH4OH. Kombinera dessa elueringar och analysera som en (E7) efter avsaltning med en packad spets.
- Torka alla elueringar helt under vakuum.
6. Nanoflöde omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri (nRPLC-MS)
MS-datainsamlings- och analysmetoder är olika, och därför beskrivs endast en föreslagen LC-MS-pipeline (och dess tillhörande parametrar) här i följande steg. Prover som genereras med hjälp av de tidigare beskrivna provberednings- och anrikningsstegen kan analyseras med hjälp av andra instrumentella inställningar, inklusive användning av kommersiellt tillgängliga kromatografiska kolumner, givet tillräcklig datakvalitet.
- Dra och packa en 15 cm lång kapillär (75 μm innerdiameter) med C18-material enligt beskrivningen i19. Förbered mobil fas A (0,1 % FA i vatten) och mobil fas B (0,1 % FA i ACN).
- Rekonstituera berikade peptidprover i 15 μL av 3% mobil fas B. Ladda 2 μL av provet (~ 13% provvolym) direkt på kolonnen. Analysera varje prov i teknisk duplikat.
- Eluera peptider med en gradient från 3% till 30% mobil fas B över 90 min vid en flödeshastighet på 0,3 μL/min. Tvätta kolonnen med 75% B i 8 min följt av 95% B i 8 min, avsluta metoden med jämvikt vid 3% B i 12 min.
- Använd masspektrometern i positivt jonläge med databeroende förvärv av de 20 bästa topparna med följande parametrar: sprutspänning 2 kV; MS1-detektion i LC /MS från 400-2 000 m / z vid 120 000 upplösning, 2E5-mål för automatisk förstärkningskontroll (AGC), 100 ms maximal injektionstid, 30% RF-lins, fyrdubbla isolering med 1,6 m / z fönster, för laddningstillstånd 2-8 och obestämd och 30 s dynamisk uteslutning; MS 2-detektion i LC / MS med stegad HCD-fragmentering vid 22%, 30% och 38%, fast första massa 120 m / z vid 30 000 upplösning, 5E4 AGC-mål och 2,5E4 minsta intensitetskrav.
7. Analys av uppgifter från medlemsstaterna
En dataanalyspipeline som använder två olika program för att analysera samma datauppsättning visas här. Fosforylering och glykosylering kan sökas samtidigt med en enda programvara istället för två separata program som beskrivs här, men i allmänhet är programvarusökningstiden proportionell mot sökutrymmet, dvs. antalet PTM som beaktas. Av denna anledning används två olika programvaror parallellt med sökandet efter glykopeptider och fosfopeptider.
- Bearbeta rådatafiler med lämplig programvara (se materialtabell).
- Sök spektra mot UniProts mänskliga (eller lämpliga artspecifika) databas. Ställ in karbamidometylering av Cys som en fast modifiering. Ställ in det maximala antalet missade enzymatiska klyftor som två.
- I rådatafilerna, med hjälp av en kommersiell programvara (se materialtabell), sök efter glykopeptider som ska analyseras20. Använd en masstolerans på 10 ppm prekursorer och en masstolerans på 0,01 Da-fragment med en minsta peptidlängd på fyra rester.
- Sök med hjälp av den programvaruinbäddade N-glykandatabasen utökad med typiska mannos-6-fosfat (M6P) glykaner, inklusive HexNAc (2) Hex (4-9) Fosfo (1-2), HexNAc (3-4) Hex (4-9) Fosfo (1-2), HexNAc (2) Hex (3-4) Fosfo (1) och HexNAc (3) Hex (3-4) Fosfo (1).
- Ställ in N-glykosylering som en vanlig modifiering. Ställ in de maximala totala modifieringarna per peptidspektralmatchning (PSM) som en vanlig och två sällsynta.
- Ställ in följande variabla modifieringar: oxidation av Met (sällsynt), deamidation vid Asn och Gln (sällsynt) och fosforylering vid Ser, Thr och Tyr (vanligt). Ange följande identifieringsfilter: poängavgränsning > 150, |log prob| > 1 och delta mod-poäng > 10.
- Exportera och analysera sökresultat på flikarna Proteiner och peptidgrupp.
- Screena manuellt identifieringarna som innehåller M6P-glykaner för förekomst av fosfohexoxoniumjonen (243 m/z) i MS/MS-spektra och ta bort falska positiva identifieringar, som inte innehåller denna diagnostiska jon.
- I rådatafilerna, med hjälp av en programvara med öppen källkod (se materialtabell), sök efter fosfopeptider som ska analyseras21. Använd en 20 ppm första sökpeptidtolerans och en 4.5 ppm huvudsökpeptidtolerans.
- Ställ in det maximala antalet modifieringar per peptid till 5. Ställ in PSM och protein falsk upptäcktshastighet (FDR) till 1% och minsta peptidlängd till 7 rester.
- Ställ in variabla modifieringar som oxidation vid Met, N-terminal proteinacetylering och fosforylering vid Ser, Thr och Tyr. Analysera sökresultat med hjälp av modificationSpecificPeptides-filerna.
- Bestäm antalet identifieringar av PTM vid protein-, peptid- och modifieringsställenivåerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa masspektrometridata, inklusive råfiler och sökresultat, har deponerats till ProteomeXchange Consortium via PRIDE-partnerförvaret med datasetidentifieraren PXD03306522.
I detta arbete analyserades duplicerade injektionsreplikat för varje anrikningseluering. Identifieringar gjorda av båda tekniska replikaten sammanställdes i den slutliga analysen. På grund av den semi-stokastiska karaktären hos databeroende förvärv vid plockning av peptidprekursorer för MS/MS-fragmentering förväntas identifieringsöverlappning på cirka 70%-80% mellan tekniska dubbletter. I program som använder dessa metoder uppmuntras minst två tekniska replikat. För statistiska analyser nedströms bör biologiska replikat för olika försöksförhållanden beaktas. Beroende på önskad stränghet för datarapportering kan det vara användbart att ställa in filter för identifieringar, t.ex. identifiering i minst x antal tekniska eller biologiska replikat som ska rapporteras.
Ett exempel på totalt jonkromatogram (TIC) för varje eluering från varje anrikning kan ses i tilläggsfigur S1, tilläggsfigur S2 och tilläggsfigur S3. Att använda stränga filter under databassökning av råa MS-filer kan säkerställa mer exakta och mer säkra identifieringar av MS / MS-spektra till peptidsekvenser med PTM. Som framgår av TC för varje eluering är peptidproverna fortfarande komplexa även efter fraktionering från anrikningen. Nanoflödeskromatografi kopplad till en högupplöst, hög massnoggrannhet och snabbscannande masspektrometer kan hjälpa till att analysera komplexa blandningar, såsom peptider från en tryptisk smältning, med stor känslighet och djup. Exempel ms/ms-spektra för glykosylerade och fosforylerade spektra kan ses i figur 2. Väl kommenterade spektra som dessa är resultatet av rik fragmentering av prekursorer som ökar förtroendet för identifieringen som tilldelats av databassökningsprogramvaran.
Figur 3 illustrerar peptididentifieringarna gjorda med hjälp av den dubbelfunktionella Ti(IV)-IMAC spin-tip-anrikningsmetoden över varje elueringsfraktion. Majoriteten av glykopeptider eluerar i de första fyra fraktionerna, medan majoriteten av fosfopeptider eluerar i de tre sista fraktionerna. Denna separation av olika PTM mellan fraktionerna hjälper till att förhindra störningar i jonisering som kan uppstå om de inte var lika tillräckligt separerade över elueringar.
Figur 4 jämför glykoproteomikresultaten från den dubbla Ti-metoden jämfört med en ERLIC-glykopeptid-anrikning. Som framgår av figur 4A är många identifieringar vid nivåerna av protein, glykoform, PTM och modifieringsställe gemensamma för båda metoderna. ERLIC har dock fler unika identifieringar på alla nivåer jämfört med den dubbla Ti-metoden. Detta inkluderar M6P -glykoformer (glykaner med hög mannos med minst en fosfatgrupp), som kräver ytterligare manuell kurering av data för att ta bort falska positiva identifieringar. Vidare är de typer av glykaner som identifieras med användning av endera metoden likartade. Proportionerna för varje typ av glykan efter binning i sex kategorier baserat på deras kompositioner är likartade mellan båda metoderna16.
Fosfoproteomikresultat från den dubbla Ti-metoden jämförs med en konventionell IMAC-fosfopeptid-anrikning i figur 5. Den dubbelfunktionella Ti (IV) -anrikningen fungerar på samma sätt som konventionell IMAC, vilket framgår av betydande överlappning vid protein-, peptid- och PTM-nivåerna. Med hjälp av endera metoden är majoriteten av fosforylerade aminosyror serin och treonin, med cirka 1% fosforylerat tyrosin identifierat också. Båda metoderna kan också användas för att identifiera multifosforylerade peptider.
Listorna över modifierade proteiner mappas till gener och analyseras med hjälp av genontologi (GO) anrikning som visas i figur 6 och figur 7. GO-analyser för de modifierade proteiner som identifierats med erlic och IMAC visas i kompletterande figur S4 och kompletterande figur S5. Det kostnadsfria Metascape-verktyget online utför berikningen och skapar nätverk baserade på berikade vägar och processer och länkar dem med likhet23. Nodtermerna för varje GO-analys finns i tilläggstabell S1, tilläggstabell S2, tilläggstabell S3 och tilläggstabell S4. Eftersom glykosylering är ett viktigt protein PTM i den extracellulära matrisen är det inte förvånande att flera termer berikade med hjälp av listan över identifierade N-glykoproteiner är relaterade till den extracellulära matrisen. Fosforylering är involverad i cellsignalering och detta kan ses i flera berikade termer som finns med hjälp av listan över identifierade fosfoproteiner.
Figur 2: Kommenterade MS/MS-spektra med hög konfidens från N-glykosylerade och fosforylerade peptider. Närvaron av fosfohexoxoniumjonen vid 243 m/z förbättrar förtroendet för denna PTM-uppgift. (B) Fosforylerad peptid VEEEQEADEEDVS(Fosfo)EEEAESK från tioredoxinrelaterat transmembranprotein 1 (TMX1) från retentionstider 32,31-32,72 min från den sjätte berikningselueringen. Närvaron av -98 (-H3PO4) neutrala förluster mellan peptidfragmentjoner och deras avfosforylerade varianter (betecknas med fragment*) förbättrar förtroendet för denna PTM-tilldelning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av peptididentifieringar från dubbelfunktionell Ti (IV) -IMAC-anrikning över sju eluationer. Antalet identifieringar inkluderar peptider som identifierats i minst en av de två tekniska (injektions)replikaten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Jämförelse av glykoproteomik är resultatet av dubbelfunktionell Ti (IV) -IMAC-anrikning jämfört med en konventionell ERLIC-glykopeptidanrikning. (B) Cirkeldiagram över glykaner identifierade på peptidstommar mellan anrikningsmetoder. Glykaner delas in i sex grupper baserat på deras sammansättning16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Jämförelse av fosfoproteomik är resultatet av dubbelfunktionell Ti(IV)-IMAC-anrikning jämfört med en konventionell Ti(IV)-IMAC fosfopeptidanrikning. (B) Cirkeldiagram över säkert lokaliserade (75% eller högre sannolikhet) fosfositer uppdelade efter aminosyrarester. (C) Staplat stapeldiagram över identifierade fosfopeptider som binned av ett antal fosforylerade rester. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Genontologianrikning av N-glykoproteiner identifierade med användning av dubbelfunktionell Ti (IV) -IMAC-anrikning. N-glykoproteiner mappas tillbaka till gener och signifikant berikade vägar och processtermer identifieras med hela genomet som bakgrund. Olika färger används för att märka kluster av termer som är kopplade till termlikhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Genontologisk anrikning av fosfoproteiner identifierade med hjälp av dubbelfunktionell Ti(IV)-IMAC-anrikning. Fosfoproteiner mappas tillbaka till gener och signifikant berikade vägar och processtermer identifieras med hela genomet som bakgrund. Olika färger används för att märka kluster av termer, som är kopplade till termlikhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: Exempel på totala jonkromatogram (TC) från varje eluering från dubbelfunktionell Ti(IV)-IMAC (E1 till E7, paneler A-G)-anrikning. Total signal (jonström) plottas över datainsamlingsperioden på 117 minuter. Intensiteten hos bastoppen ges av värdet NL. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Exempel på totala jonkromatogram (TC) från varje eluering från ERLIC (E1 till E5, paneler A-E) anrikning. Total signal (jonström) plottas över datainsamlingsperioden på 117 minuter. Intensiteten hos bastoppen ges av värdet NL. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Exempel på totalt jonkromatogram (TIC) från elueringen från Ti-IMAC-anrikning. Total signal (jonström) plottas över datainsamlingsperioden på 117 minuter. Intensiteten hos bastoppen ges av värdet NL. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S4: Genontologianrikning av N-glykoproteiner identifierade med konventionell glykopeptidanrikning med ERLIC. N-glykoproteiner mappas tillbaka till gener och signifikant berikade vägar och processtermer identifieras med hela genomet som bakgrund. Olika färger används för att märka kluster av termer, som är kopplade till termlikhet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S5: Genontologisk anrikning av fosfoproteiner identifierade med konventionell fosfopeptidanrikning med Ti(IV)-IMAC. Fosfoproteiner mappas tillbaka till gener och signifikant berikade vägar och processtermer identifieras med hela genomet som bakgrund. Olika färger används för att märka kluster av termer, som är kopplade till termlikhet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabeller S1-S4: Metascape-nodinformation för genontologianrikningsanalyser. Tabeller innehåller nodinformation för listor över N-glykoproteiner och fosfoproteiner identifierade med dubbla Ti (tabell S1 och tabell S2), N-glykoproteiner med ERLIC (tabell S3) och fosfoproteiner med IMAC (tabell S4). Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dubbelfunktionella Ti (IV) -IMAC-strategin är användbar för samtidig analys av N-glykopeptider och fosfopeptider från samma prov i ett enda arbetsflöde för provberedning. ERLIC-baserade metoder har också visat sig utföra samtidig anrikning av PTM. Båda strategierna har tidigare använts för djup täckning i PTM-analyser14,18. Genom att anpassa den dubbla Ti-metoden till att minska provinkubationstiden med hjälp av spin-tips hoppas vi att detta protokoll har blivit mindre resurskrävande och därmed mer tillgängligt.
Samtidig analys av flera PTM uppnås genom synergistiska interaktioner mellan analyter och de funktionella grupperna på ytan av anrikningsmaterialet. I första förpackningsspinnspetsar med bomull ökar retentionen av glykopeptider i hilic-läge på grund av förekomsten av hydroxylgrupper på cellulosa24. Genom att använda vatten och acetonitril (ett vattenblandbart lösningsmedel) behålls och separeras glykopeptider på grund av bildandet av vatten och organiska skikt. Materialet för dubbelfunktionell Ti(IV)-anrikning är beroende av de immobiliserade Ti(IV)-katjonerna för bindning av fosfopeptider. De hydrofila egenskaperna hos materialets sidokedjor används för att behålla glykopeptider i ett HILIC-läge, vilka först elueras med sur eluering med ökande vattenhaltigt innehåll. Materialet tvättas vidare med konventionella IMAC-fosfopeptidanrikningsbuffertar för att eluera sialylerade glykopeptider, som har högre affinitet till den stationära fasen än andra neutrala glykopeptider. Efter konditionering av materialet till basiskt pH används ammoniumhydroxid och ACN-lösning för att bryta de elektrostatiska interaktionerna som håller fosfopeptider bundna till materialet. Under tiden möjliggör det minskande organiska innehållet separation av mono- och multifosforylerade peptider och M6P-glykopeptider.
När du separerar PTM med flera elueringssteg i samma arbetsflöde kan biomolekylär information maximeras från begränsade prover. En varning med sådana dubbla PTM-analysarbetsflöden är kravet på en relativt stor mängd prov (0,5 mg peptider) som utgångsmaterial för varje anrikning när minst fem fraktioner samlas in. Icke desto mindre erbjuder den samtidiga anrikningsstrategin som presenteras här fortfarande betydande materialbesparing jämfört med konventionella strategier. Redan före berikning är flera viktiga steg nödvändiga för att säkerställa PTM-integritet och för att undvika artefaktisk förlust av PTM-information. Dessa inkluderar korrekt lagring av prover vid låga temperaturer när de inte används (helst -80 ° C), användning av proteas- och fosfatashämmare under proteinextraktion och användning av en hydrofil peptidrengöringsmetod, såsom HLB-patronerna som används här.
Det har observerats att ERLIC (konventionell glykopeptidanrikning) resulterade i bättre glykoproteomtäckning, medan dubbelfunktionell Ti (IV) -IMAC överträffades i unika identifieringar av konventionella Ti-IMAC i fosfoproteomikresultat. Den fysiska strukturen och den ökade hydrofiliciteten hos ERLIC-materialet jämfört med det dubbla Ti-anrikningsmaterialet är sannolikt en viktig faktor i den förbättrade glykoproteomtäckningen i ERLIC. Den ökade täckningen av fosfoproteomet i konventionell IMAC kan vara ett resultat av minskad jonundertryckning från avlägsnandet av glykopeptider under de första elueringsstegen och tvättstegen. Trots dessa små minskningar av täckningen med det samtidiga dubbla Ti-arbetsflödet uppnås fortfarande betydande överlappning med konventionell enkel PTM-berikning med den extra fördelen att endast utföra ett berikningsarbetsflöde istället för två.
När det gäller tidsbegränsningar har ERLIC och konventionell Ti-IMAC färre fraktioner än det dubbla Ti-arbetsflödet. När det gäller resurser som behövs är anjonutbytesmaterialet som behövs för ERLIC billigare än det funktionaliserade material som behövs för de dubbla Ti- och konventionella IMAC-arbetsflödena. I dessa protokoll analyserades endast N-länkad och inte O-länkad glykosylering. Enzymet PNGase F kan (och bör) användas för att klyva N-glykaner för att begränsa antalet falska positiva resultat som erhålls vid sökning efter O-glykopeptider. Det har dock visat sig att denna strategi minskar specificiteten hos HILIC och ERLIC för glykopeptidanrikning25. I protokollet används en strategi med två separata program för att analysera rådatafiler. Byonic, en kommersiell programvara, anses vara guldstandarden vid analys av glykoproteomikdata. På grund av mångfalden av N-glykanstrukturer ökar sökutrymmet för peptider, vilket ökar söktiderna. Fosforylering kan också läggas till som en vanlig PTM utöver glykosylering under sökning, även om söktiderna kan skjuta i höjden beroende på om peptid multifosforylering beaktas. MaxQuant, en programvara med öppen källkod, kan optimeras för att minimera FDR i fosfoproteomikresultat, även om komplex glykosylering inte är lika lätt att söka. Det finns också andra alternativ med öppen källkod för att söka glykoproteomiska data 26,27,28. Beroende på tillgängliga experimentella mål och resurser kan LC-MS- och dataanalyspipelinen som beskrivs här användas som presenterad eller modifieras. Ytterligare optimering av metoderna förväntas förbättra täckningen av PTM: erna.
PTM spelar en viktig roll i biokemiska processer på grund av de förändringar i proteinstrukturen de ger. Det är idealiskt att alla proteomiska analyser tar hänsyn till alla protein-PTM samtidigt. Betydelsen av summan av all proteinglykosylering har till exempel kallats meta-heterogenitet29. Målet med total PTM-analys är dock ännu inte möjligt med nuvarande MS-baserad teknik. Bottom-up proteomik följt av PTM-specifik anrikning, dvs HILIC och IMAC, är fortfarande guldstandarden för PTM-analyser, men genom att använda samtidiga anrikningsstrategier som de som beskrivs här kan biomolekylär information belysas bättre. Cross-talk interaktioner har visat sig förekomma mellan olika PTM30,31, inklusive glykosylering och fosforylering32. Kvantitativ analys av sådana interaktioner vid sjukdom, till exempel vid bukspottkörtelsjukdomar som diabetes och cancer, kan visa sig fruktbar för att öka vår förståelse för sjukdomsmekanismer. Med optimering av extraktionsmetoder mellan olika provtyper kan de anrikningsprotokoll som beskrivs här användas för fördjupad profilering av glykoproteomet och fosfoproteomet i komplexa biologiska matriser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes delvis av bidragsfinansiering från NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 och R21AG065728) och Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B och SRA-2016-168-S-B). Data som presenteras här erhölls också delvis genom stöd från en NIH / NCATS UL1TR002373-utmärkelse genom University of Wisconsin Institute for Clinical and Translational Research. Orbitrap-instrumenten köptes genom stöd av ett NIH-delat instrumentbidrag (NIH-NCRR S10RR029531) och rektorskansliet för forskning och forskarutbildning vid University of Wisconsin-Madison. Vi vill också erkänna det generösa stödet från University of Wisconsin Organ and Tissue Donation Organization som tillhandahöll mänsklig bukspottkörtel för forskning och hjälp av Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett och Prof. Jon Odorico för att tillhandahålla proverna till vårt laboratorium. Vår forskargrupp vill särskilt tacka de familjer som donerade vävnader för denna studie. L.L. erkänner NIH-bidrag S10OD025084, ett bukspottkörtelcancerpilotbidrag från University of Wisconsin Carbone Cancer Center (233-AAI9632), samt en Vilas Distinguished Achievement Professorship och Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship med finansiering från Wisconsin Alumni Research Foundation och University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
- Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
- Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
- Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
- Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
- Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
- Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
- Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
- Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
- Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
- Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
- Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
- Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
- Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
- Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
- Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
- Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
- Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
- Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
- Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).
