Summary
الموائع الدقيقة هي أداة قوية لتطوير الاختبارات التشخيصية. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى معدات ومواد باهظة الثمن ، بالإضافة إلى تقنيات التصنيع والمناولة الشاقة. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول تصنيع جهاز الموائع الدقيقة الأكريليك للمقايسات المناعية المغناطيسية الدقيقة والجسيمات النانوية في بيئة منخفضة التكلفة وسهلة الاستخدام.
Abstract
حسنت أنظمة الموائع الدقيقة تقنيات المقايسة المناعية بشكل كبير. ومع ذلك ، تتطلب العديد من تقنيات التصنيع الدقيق معدات متخصصة أو باهظة الثمن أو معقدة ، مما يجعل التصنيع مكلفا وغير متوافق مع الإنتاج الضخم ، وهو أحد أهم الشروط المسبقة لاختبارات نقطة الرعاية (POCT) التي يجب اعتمادها في البيئات منخفضة الموارد. يصف هذا العمل عملية تصنيع جهاز أكريليك (بولي ميثيل ميثاكريلات، PMMA) لاختبار المقايسة المناعية الأنزيمية المترافقة بالجسيمات النانوية باستخدام تقنية الطحن الدقيق للتحكم العددي بالحاسوب (CNC). يظهر عمل جهاز الموائع الدقيقة من خلال إجراء اختبار مناعي للكشف عن جسم مضاد تجاري باستخدام الليزوزيم كمستضد نموذجي مترافق مع جسيمات نانوية مغناطيسية 100 نانومتر. يدمج هذا الجهاز قيدا ماديا متداخلا يبلغ ارتفاعه 5 ميكرومتر فقط ، ويستخدم لالتقاط الجسيمات الدقيقة المغناطيسية التي تشكل مصيدة مغناطيسية عن طريق وضع مغناطيس خارجي. وبهذه الطريقة ، تكون القوة المغناطيسية على الدعم المناعي للجسيمات النانوية المترافقة كافية لالتقاطها ومقاومة سحب التدفق. جهاز الموائع الدقيقة هذا مناسب بشكل خاص للإنتاج الضخم منخفض التكلفة دون فقدان الدقة لأداء المقايسة المناعية.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، لعبت الموائع الدقيقة دورا مهما في تقنيات المقايسة المناعية1. تتميز تقنية التصغير بالعديد من المزايا البارزة مقارنة بالمقايسات المناعية التقليدية ، مثل تقليل استهلاك العينات والكواشف ، وأوقات الحضانة الأقصر ، وتبادل الحلول بكفاءة ، والتكامل العالي والأتمتة2.
علاوة على ذلك ، فإن أنظمة الموائع الدقيقة في المقايسات المناعية ، بالاشتراك مع الجسيمات النانوية المغناطيسية كدعم مناعي ، تقلل بشكل كبير من أوقات الحضانة ، مما يحقق حساسية عالية للكشف بسبب زيادة نسبة السطح إلى الحجم3. تعمل الحركة البراونية للجزيئات على تحسين حركية التفاعل أثناء تكوين مجمع الأجسام المضادةللمستضد 4,5. علاوة على ذلك ، توفر الخصائص المغناطيسية للجسيمات النانوية تنوعا ليتم دمجها في تكوينات مختلفة لأجهزة الموائع الدقيقة ، مما يجعلها مرشحا مثاليا للإشارة والتقاط الجزيئات في أنظمة الاستشعار الحيوي المصغرة على الرقاقة5. ومع ذلك ، فإن القوى المغناطيسية أضعف بكثير من قوى السحب على مقياس النانومتر بسبب ارتفاع نسبة السطح إلى الحجم6. لذلك ، قد يكون التقاط الجسيمات النانوية لخطوات المقايسة المناعية الحاسمة مثل الغسيل والكشف أمرا صعبا ، والمغناطيس التقليدي غير كاف4.
طريقة فعالة لمعالجة الجسيمات النانوية هي استخدام مصيدة مغناطيسية موائع دقيقة تتكون من جزيئات الحديد الدقيقة ، والتي يتم تعبئتها في بنية الموائع الدقيقة3. لذلك ، عندما يقترب مغناطيس خارجي ، يتم إنشاء تفاعل معقد داخل الوسط المسامي الممغنط بين القوى المغناطيسية وقوى التدفق. القوة المغناطيسية المؤثرة على الجسيمات النانوية قوية بما يكفي لالتقاطها ومقاومة سحب التدفق3،4،7. يتطلب هذا النهج تقنيات التصنيع الدقيق التي تحقق قرارات في حدود بضعة ميكرومترات لتوليد هياكل ميكرومترية تحتفظ بالجسيمات الدقيقة.
تسمح تقنيات التصنيع الدقيق الحالية بتصنيع الهياكل عالية الدقة من بضعة ميكرونات إلى مئات النانومتر8. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه التقنيات تتطلب معدات متخصصة أو باهظة الثمن أو معقدة. تتمثل إحدى الصعوبات الرئيسية في الحاجة إلى غرفة أبحاث لتصنيع القوالب ، والتي لا تزال مكلفة وتستغرق وقتا طويلا 8,9. في الآونة الأخيرة ، تغلب مهندسو الموائع الدقيقة على هذا العيب من خلال تطوير مجموعة متنوعة من طرق التصنيع البديلة ، مع مزايا مختلفة مثل انخفاض التكاليف ، وأوقات التسليم الأسرع ، والمواد والأدوات الأرخص ، وزيادة الوظائف8. وبهذه الطريقة ، أدى تطوير تقنيات التصنيع الدقيق الجديدة إلى جلب طرق منخفضة التكلفة وغير غرف الأبحاث تحقق دقة منخفضة تصل إلى 10 ميكرومتر8. يمكن استخدام الزخرفة مباشرة على الركيزة دون إنشاء نمط صب باهظ الثمن ، وبالتالي تجنب عملية تستغرق وقتا طويلا. تشمل طرق التصنيع المباشر الطحن باستخدام الحاسب الآلي والاجتثاث بالليزر والطباعة الحجرية المباشرة8. كل هذه الطرق مناسبة لإنتاج قنوات ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية في مجموعة واسعة من المواد ، بغض النظر عن صلابتها9 ، مما يتيح هندسة وسلوكيات فيزيائية وصفات جديدة ومفيدة في أجهزة الموائع الدقيقة8.
يقوم الطحن الدقيق CNC بإنشاء هياكل مجهرية باستخدام أدوات القطع التي تزيل المواد السائبة من الركيزة وهي طريقة تصنيع فعالة لأجهزة الموائع الدقيقة10,11. يمكن أن تكون تقنية micromilling مفيدة في تطبيقات الموائع الدقيقة لإنشاء قنوات وميزات دقيقة مباشرة على سطح العمل ، مما يوفر ميزة رئيسية: يمكن تصنيع قطعة العمل في وقت قصير (أقل من 30 دقيقة) ، مما يقلل بشكل كبير من وقت الاستجابة من التصميم إلى النموذج الأولي12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التوافر الواسع لملحقات القطع من مختلف المواد والأحجام والأشكال يجعل آلات الطحن CNC أداة مناسبة سمحت بتصنيع ميزات مختلفة في العديد من أنواع المواد منخفضة التكلفة التي تستخدم لمرة واحدة13.
من بين جميع المواد المستخدمة بشكل شائع في الطحن الدقيق ، تظل اللدائن الحرارية خيارا رائدا نظرا لخصائصها المواتية العديدة وتوافقها مع التطبيقات البيولوجية10,14. تعتبر اللدائن الحرارية ركيزة جذابة لأنظمة الموائع الدقيقة نظرا لمزاياها الكبيرة لتطوير أنظمة تحليلية منخفضة التكلفة يمكن التخلص منها9. بالإضافة إلى ذلك ، هذه المواد قابلة للغاية لعمليات التصنيع ذات الحجم الكبير ، مما يجعلها مناسبة للتسويق والإنتاج الضخم. لهذه الأسباب ، تم اعتبار اللدائن الحرارية مثل PMMA مواد موثوقة وقوية منذ السنوات الأولى من الموائع الدقيقة10. تم وصف بروتوكولات مختلفة لتصنيع القنوات المغلقة في اللدائن الحرارية ، مثل الترابط بالمذيبات15 ، والترابط الحراري 16 ، والأشعة فوق البنفسجية (UV) / رابطة المعالجة السطحية للأوزون17.
في كثير من الحالات ، لا تكون دقة تحديد المواقع التي تم تحقيقها باستخدام آلات الطحن الدقيقة التقليدية كافية لبعض تطبيقات الموائع الدقيقة التي تتطلب هياكل أصغر من 10 ميكرومتر. الطحن الدقيق المتطور لديه دقة كافية. لسوء الحظ ، نظرا لارتفاع الأسعار ، يقتصر استخدامه على حفنة من المستخدمين12. في السابق ، أبلغت مجموعتنا البحثية عن تصنيع ومعالجة أداة منخفضة التكلفة تسمح بهياكل تصنيع أقل من 10 ميكرومتر ، والتغلب على دقة آلات الطحن التقليدية12. لاعبا اساسيا عبارة عن منصة تم تصنيعها بواسطة طباعة 3D مع إلكترونيات بسيطة ، تحتوي على ثلاثة مشغلات كهرضغطية. يحتوي السطح على مفاصل على شكل مفصلي تسمح برفعه عندما تعمل العناصر الكهرضغطية في وقت واحد. يمكن التحكم في إزاحة المحور Z بدقة 500 نانومتر ودقة ±1.5 ميكرومتر12.
يعرض هذا البحث خطوات عملية تصنيع جهاز الأكريليك (PMMA) من خلال تقنية الطحن الدقيق. يتكون تصميم الرقاقة من قناة رئيسية بعرض 200 ميكرومتر وارتفاع 200 ميكرومتر وقناة جانبية بنفس الأبعاد لتطهير تدفق الكواشف. في المنطقة الوسطى ، تتم مقاطعة القناة من خلال تقييد مادي يبلغ ارتفاعه 5 ميكرومتر فقط ، ملفقة بمنصة كهرضغطية مطبوعة ثلاثية الأبعاد صنعتها هذه المجموعة12 ، لالتقاط الجسيمات الدقيقة المغناطيسية التي تشكل مصيدة مغناطيسية للجسيمات النانوية عن طريق وضع مغناطيس خارجي. نعرض تشغيل جهاز الموائع الدقيقة عن طريق إجراء اختبار مناعي للكشف عن جسم مضاد تجاري باستخدام الليزوزيم كمستضد نموذجي مترافق مع جسيمات نانوية مغناطيسية 100 نانومتر. يجمع هذا الجهاز بين ميزات مختلفة تجعله فريدا4: استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية كدعم مناعي يقلل من إجمالي وقت الاختبار من ساعات إلى دقائق. يسمح استخدام إنزيم فلوري للكشف بحدود للكشف يمكن مقارنتها بحدود مقايسات الممتز المناعي القياسية المرتبطة بالإنزيم (ELISAs) ؛ واستخدام اللدائن الحرارية كمواد تصنيع يجعلها متوافقة مع الإنتاج الضخم ، وهو ما لم يكن عليه الحال بالنسبة للمصائد المغناطيسيةالسابقة لجسيمات الموائع الدقيقة النانوية 3 ، ويجعلها مرشحا ممتازا لتطوير POCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الطحن الدقيق
- طحن السطح
- قم بتشغيل آلة الطحن الدقيقة ووحدة التحكم الكهرضغطية. ابدأ برنامج التحكم الخاص بهم12.
- حدد لقم المطحنة النهائية المطلوبة (أقطار 200 ميكرومتر و 800 ميكرومتر). ضعها في المقصورة المناسبة لآلة الطحن (الشكل 1).
- قطع مستطيلات 9 مم × 25 مم بسمك 1.3 مم PMMA باستخدام لقمة مطحنة نهاية 800 ميكرومتر. قم بتوصيل أحد هذه المستطيلات بعناية بشريط لاصق على الوجهين بالمنصة الكهرضغطية (الشكل 2).
ملاحظة: تأكد دائما من وضع مستطيل الأكريليك في نفس الموضع بحيث يتزامن أحد الزوايا مع إحداثيات الأصل على المحورين x و y للمعالجة. - قم بتوصيل ووضع مستشعر z على سطح مستطيل PMMA. حدد دبوس الكشف وحركه فوق سطح المستشعر. اخفض الدبوس يدويا دون الاتصال بالمستشعر. قم بتنشيط وضع استشعار Z0 (الشكل 3).
- حدد بت مطحنة النهاية 200 ميكرومتر وانقله إلى الأصل x ، y. قم بإزالة مستشعر z. اخفض البت بعناية دون ملامسة سطح الأكريليك.
- قم بتدوير بت المطحنة الطرفية 200 ميكرومتر عند 14500 دورة في الدقيقة. قم بخفضه ببطء إلى إحداثيات الأصل على المحور z (z = 0). أعد ضبط المحور z 30 ميكرومتر أسفل الأصل. قم بتعيين هذا الإحداثي على أنه أصل z الجديد.
ملاحظة: لا تخفض البت أبدا إذا لم تكن تدور. خلاف ذلك ، فإنه يخاطر الانهيار. - انقر فوق الزر Cut في برنامج آلة الطحن الدقيقة لتنشيط لوحة Cut . انقر فوق الزر " إضافة" وحدد ملف .txt (ملف الترميز التكميلي 1) برمز تم إنشاؤه مسبقا لطحن سطح الأكريليك. انقر فوق الزر " إخراج" لبدء العملية.
- أحضر لقمة مطحنة النهاية إلى الإحداثيات حيث سيتم تشكيل القيد. امنع لقمة المطحنة الطرفية من الرفع عن سطح الأرض بمجرد الوصول إلى هذا الإحداثي بالنقر فوق الزر إيقاف مؤقت . خلاف ذلك ، قم بتغيير موضع بت المطحنة الطرفية يدويا إلى هذا الإحداثي (الشكل 4 أ).
- طحن تقييد 5 ميكرومتر
- اضبط سرعة دوران بت المطحنة الطرفية على 11000 دورة في الدقيقة. ارفع المنصة 6.5 ميكرومتر بواجهة المنصة الكهرضغطية (الشكل التكميلي S1). حرك بت المطحنة الطرفية على طول المحور ص بمقدار 500 ميكرومتر. أعد المنصة الكهرضغطية إلى قيمتها الأولية على المحور z باستخدام واجهة التحكم.
- طحن القنوات الصغيرة
- افتح ملف التصميم الذي تم إنشاؤه مسبقا من برنامج التصميم (ملف التصميم التكميلي 1). انقر فوق الزر طباعة . قم بالوصول إلى قائمة الخصائص وانقر على نافذة الألوان المقابلة للطبقة التي تحتوي على التصميم المراد تشكيله. اضبط معلمات التصنيع في لوحة الأدوات كما هو محدد في الشكل التكميلي S2.
- قم بإلغاء تنشيط الطبقات غير المرغوب فيها عن طريق تحديد خيار لا شيء في القائمة المنسدلة أدوات .
- طحن الثقوب
- قم بالتبديل إلى بت مطحنة النهاية 800 ميكرومتر. قم بتنشيط طبقة التصميم للثقوب التي يبلغ قطرها 1.2 مم بالنقر فوق نافذة الألوان المقابلة.
- كرر الخطوة 1.3.2 ، ولكن في هذه الحالة ، قم بتعيين معلمات التصنيع المقابلة كما هو موضح في الشكل التكميلي S3A للثقوب.
ملاحظة: عمق الثقوب المشكلة هو نصف سمك الأكريليك. - قم بتشكيل فتحتين إضافيتين في الزوايا المقابلة للمستطيل لمحاذاة الأكريليك بطريقة مقلوبة على منصة جديدة (الشكل 4 ب). انزع مستطيل الأكريليك من المنصة الكهرضغطية. اقلب الأكريليك وألصقه بشريط لاصق على الوجهين فوق المحول باستخدام الأعمدة المشكلة (الشكل 4C ، D).
- افتح الملف بتصميم الثقوب للوجه المقابل من برنامج التصميم (ملف التصميم التكميلي 2). قم بتعيين معلمات التصنيع المقابلة كما هو موضح في الشكل التكميلي S3B. قم بطحن النصف المتبقي من فتحات مدخل ومخرج الكاشف بقطر 1.5 مم وعمق 0.7 مم (الشكل التكميلي S3C).
الشكل 1: وضع بت مطحنة النهاية . (أ) يتم وضع لقم المطحنة الطرفية 200 ميكرومتر و 800 ميكرومتر وتثبيتها من خلال برغي للدعم الفولاذي. (ب) يتم وضع كل لقمة مطحنة طرفية في المقصورة المحددة لآلة الطحن الدقيقة للاختيار التلقائي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: منصة كهرضغطية. يتم تصنيع المنصة عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد وتتكون من قاعدتين سداسيتين متصلتين بمفصلات تسمح بإزاحة دقيقة في المحور z يتم التحكم فيها بواسطة ثلاثة مشغلات كهرضغطية. لوحظ أيضا محول أكريليك ، يتم إرفاق مستطيل PMMA به ، والذي يسمح بإعداد زاوية محاذاة الإحداثيات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: معايرة المحور Z. خطوات معايرة المحور z مفصلة. (أ) يشتمل مستشعر z على كابل يتم توصيله بآلة الطحن الدقيقة. (ب) يتم وضع المستشعر مباشرة على السطح المراد تشكيله. (ج) يتكون دبوس الكشف من قضيب معدني يوضع في حجرة خاصة بجوار لقم المطحنة الطرفية. (د) عندما يتلامس كلا الملحقين ، تقوم آلة الطحن الدقيقة تلقائيا بحساب إحداثيات الأصل على المحور z. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: سطح أكريليك مصحح . (أ) تقوم لقمة المطحنة الطرفية التي يبلغ قطرها 200 ميكرومتر بمسح كامل سطح مستطيل الأكريليك ، وإزالة طبقة يبلغ ارتفاعها حوالي 30 ميكرومتر. (ب) توضح الصورة التراكيب المختلفة المطحونة على وجه الأكريليك المعدل سابقا. لوحظت قنوات وثقوب لمدخل ومخرج الكاشف. لا يمكن رؤية تقييد 5 ميكرومتر بالعين المجردة. (ج) سطح دقيق مع فتحات محاذاة ومحول مع أعمدة محاذاة في زوايا متقابلة. (د) يتم محاذاة الأكريليك رأسا على عقب على المحول مع أعمدة ، حيث تتناسب فتحات المحاذاة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
2. ختم القناة
- تنظيف الاكريليك
- قم بإزالة مستطيل الأكريليك من منصة محول العمود. خذ مستطيل أكريليك آخر غير مشكل. اغسل كلا من صفائح الأكريليك بكحول الأيزوبروبيل (IPA) واشطفه بالماء المقطر. ارتداء القفازات وتجنب الاتصال مع IPA.
- اغمر الأكريليك في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق (الشكل 5 أ ، ب).
- التعرض للكلوروفورم الغازي
- تجفيف كل من صفائح الاكريليك تماما. قم بلصقها داخل غطاء طبق بتري الزجاجي بشريط على الوجهين. تأكد من وضع جانب القناة الآلية مكشوفا (الشكل 5C). ارتد القفازات وتجنب لمس سطح الأكريليك مباشرة.
- ضع قاعدة طبق بتري الزجاجي داخل طبق بتري زجاجي أكبر (الشكل 5 د). صب 1 مل من الكلوروفورم في قاعدة طبق بتري. ضع الغطاء بسرعة مع ألواح الأكريليك المرفقة بالجانب الداخلي.
- أضف الماء المقطر على الفور إلى قاعدة طبق بتري الأكبر حتى مستوى غطاء طبق بتري. السماح بتعريض الأكريليك لغاز الكلوروفورم لمدة 1 دقيقة (الشكل 5E).
ملاحظة: ضع في اعتبارك أن وقت التعرض الأطول للكلوروفورم سيهاجم سطح الأكريليك ، وسوف يذوب تقييد 5 ميكرومتر ، أو يعدل ارتفاعه ، أو يختفي تماما. - قم بإمالة طبق بتري لكسر ختم الماء الذي تم إنشاؤه. قم بإزالة الأكريليك على الفور من الكلوروفورم عن طريق الكشف عن طبق بتري. احرص على عدم انسكاب الماء.
تنبيه: قم بهذه العملية في غطاء الدخان واستخدم القفازات لأن الكلوروفورم شديد السمية.
- الترابط عن طريق الضغط والتدفئة
- قشر كل من لوحات الاكريليك من الشريط على الوجهين.
- قم بمحاذاة كل من الأكريليك مع الجوانب التي تعرضت للكلوروفورم الغازي وجها لوجه ، لتشكيل شطيرة. ضع الأكريليك في المكبس عند 18 كجم / سم2 ودرجة حرارة 90 درجة مئوية (الشكل 5F ، G).
ملاحظة: يوصى بوضع الأكريليك محاذيا طوليا وتغيير محاذاته بعد 2 دقيقة للحصول على ختم أفضل. إذا كان الختم غير كاف بعد هذا الوقت ، فضعه مرة أخرى في الصحافة لفترات لا تزيد عن 1 دقيقة. باستخدام المجسم ، تحقق من حالة القنوات والتقييد. ضع في اعتبارك أنه في حالة تجاوز وقت الضغط ، هناك خطر من إزالة القيد.
- مرفق خرطوم
- قطع 2-3 سم أطوال خرطوم. جعل قطع مستقيم تماما. قم بتوصيل كل خرطوم بفتحات الجهاز بمادة لاصقة سائلة فورية التجفيف (الشكل 6 أ). منع المادة اللاصقة من الدخول إلى داخل الشريحة.
الشكل 5: عملية ختم الجهاز. (أ) توضع كل ورقة من صفائح الأكريليك في كيس قابل للإغلاق بالماء المقطر وتغمر في الحمام بالموجات فوق الصوتية. (ب) توضح الصورة الموجودة على اليسار القنوات بعد التصنيع مباشرة ، وتوضح الصورة الموجودة على اليمين نفس الجهاز بعد الغسيل باستخدام IPA والحمام بالموجات فوق الصوتية ، الذي يزيل جميع الشوائب وبقايا الأكريليك من القناة الدقيقة. لوحظت حواف التقييد الذي يقطع القناة المركزية البالغة 200 ميكرومتر ، مما يؤكد نجاح عملية الطحن. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. (ج) يتم تجفيف كل من الأكريليك والالتصاق بالمنصة الزجاجية على الغطاء. (د) توضع قاعدة طبق بتري داخل طبق آخر بقطر أكبر. (ه) عند إغلاق طبق بتري، يمنع مانع تسرب الماء الكلوروفورم الغازي من الهروب. (و) وصف عناصر الرافعة التي يبلغ وزنها 5 كجم. (G) صورة للذراع المفتوحة ، تظهر باللون الأحمر المنطقة التي يوضع فيها الأكريليك. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. إعداد الجهاز
- املأ القنوات بالماء المقطر باستخدام حقنة. تأكد من عدم وجود تسرب أو مقاومة للتدفق. اغمر الجهاز في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق لإزالة أي مواد أكريليك أو لاصقة أو غير مرغوب فيها متبقية داخل القنوات.
- أفرغ الماء داخل قنوات الجهاز. استخدم حقنة لإدخال محلول مانع محضر بنسبة 5٪ (وزن / حجم) من ألبومين مصل البقر (BSA) المخفف في محلول ملحي 1x Tris (TBS) وتم ترشيحه مسبقا من خلال مرشح حقنة بولي إيثر سلفون (PES) 0.2 ميكرومتر.
- تحضير تعليق من الجسيمات الدقيقة الحديد من قطر 7.5 ميكرومتر في 5 ٪ BSA.
ملاحظة: تعمل الجسيمات الدقيقة مسبقا بطبقة من السيليكا والبولي إيثيلين جلايكول (PEG) التي تمنح مقاومة لامتصاص البروتين4. - احتضان الرقاقة وتعليق الجسيمات الدقيقة بمحلول الحجب لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. إذا أمكن ، اترك الحجب طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
4. تشكيل فخ الجسيمات الدقيقة
- أدخل الجسيمات الدقيقة في الشريحة بإبرة حقنة من خلال خرطوم مخرج القناة الجانبية. ضع الشريحة عموديا واترك الجسيمات الدقيقة تتدفق تحت تأثير الجاذبية عبر القناة الجانبية. قم بتدوير الشريحة 180 درجة في خطوتين بزاوية 90 درجة واسمح للجسيمات الدقيقة بالاستهداف والضغط عند تقييد 5 ميكرومتر.
- قم بإزالة الجسيمات الدقيقة الزائدة عن طريق تدوير الجاذبية 45 درجة باتجاه القناة الجانبية.
- حافظ على الجهاز في وضع مستقيم لتجنب التراجع عن مصيدة الجسيمات الدقيقة. انظر الشكل 6 ب للحصول على ملخص لعملية تكوين مصيدة الجسيمات الدقيقة.
5. المقايسة المناعية
- تحضير الجسيمات النانوية
- خذ 2 ميكرولتر من تعليق الجسيمات النانوية 100 نانومتر المترافقة سابقا مع الليزوزيم (نموذج المستضد). أضفه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من محلول الحظر. احتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- أضف 150 ميكرولتر من محلول الغسيل (1x TBS ، 0.05٪ توين 20).
- ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل في فاصل مغناطيسي. احتفظ بها لمدة 15 دقيقة للسماح بفصل الجسيمات النانوية (الشكل التكميلي S4).
ملاحظة: الحد الأدنى لحجم الفاصل المغناطيسي هو 200 ميكرولتر. تجنب استخدام حجم أصغر. - أخرج السائل من الأنبوب باستخدام ماصة صغيرة. تجنب ملامسة جدار الأنبوب حيث تشكلت حبيبات الجسيمات النانوية.
- أضف 250 ميكرولتر من محلول الغسيل الطازج. حافظ على الأنبوب تحت التحريك لمدة 15 دقيقة.
- كرر الخطوات 5.1.3.-5.1.5. 2x أكثر ، يهتز فقط لمدة 5 دقائق.
- أضف التركيز المطلوب من الجسم المضاد الأساسي المضاد للليزوزيم (انظر جدول المواد). اضبط الحجم النهائي 100 ميكرولتر في مخفف الأجسام المضادة (1x TBS ، 1٪ BSA ، 0.05٪ Tween 20).
- احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استمر في الرج لمدة 15 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
- كرر خطوات الغسيل 5.1.2.-5.1.6.
- أضف 100 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة. أضف الجسم المضاد الثانوي المقترن ببيروكسيديز الفجل (HRP-AbII) (انظر جدول المواد) بتخفيف 1: 500.
- كرر خطوات الغسيل 5.1.2.-5.1.6.
- احتفظ بالجسيمات النانوية في حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة.
6. التركيب التجريبي
- املأ الحقاقتين الزجاجيتين سعة 100 ميكرولتر بالماء ، وقم بتوصيل خرطوم بطول 6.5 سم بكل حقنة ، وأدخل دبوسا معدنيا في نهاية الخرطوم ، وضع كلتا الحقابتين على مضخة المحقنة التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر.
- ختم جميع خراطيم جهاز الاكريليك بالحرارة.
- قطع خرطوم مدخل والحفاظ على بضعة ملليمترات فقط. املأ إبرة التوزيع بمخزن الغسيل وأدخله في خرطوم القطع. اترك المحلول بالتنقيط قبل توصيل الإبرة بالجهاز لمنع وصول الهواء إلى الجهاز.
- قطع خرطوم المخرج من القناة الجانبية. قم بتوصيله بمضخة المحقنة. بعد ذلك ، قم بنفس الإجراء لخرطوم مخرج القناة الرئيسية.
ملاحظة: من الضروري تنفيذ الخطوات 6.3.-6.4. من أجل تجنب تفريغ مصيدة الجسيمات الدقيقة. إذا أمكن ، تحقق من حالة الملائمة أثناء هذه الخطوات بمساعدة عدسة مكبرة. - ضع شريحة زجاجية على مسرح المجهر. قم بتوصيل المغناطيس بالشريحة بشريط على الوجهين وضع قطعة صغيرة من الشريط على كل جانب لتثبيت حواف الشريحة على الزجاج.
- اضبط معدل تدفق يبلغ 50 ميكرولتر / ساعة من خلال علامتي التبويب معدل التدفق والوحدات في وحدة التحكم في مضخة المحقنة. حدد وضع السحب وانقر فوق الزر " ابدأ" لتنشيط تدفق المخزن المؤقت للغسيل.
- بحذر ، اقترب من الجهاز باتجاه الشريحة مع المغناطيس بطريقة أفقية بحيث تلامس منطقة الشريحة التي تحتوي على المصيدة المغناطيس.
- قم بلصق حواف الجهاز على الزجاج بشريط على الوجهين لمنع الحركة. تجنب عرقلة المسار البصري للفحص المجهري (الشكل 6C).
الشكل 6: التكوين النهائي للجهاز . (أ) جهاز أكريليك مع الخراطيم المرفقة بالمدخلات والمخرجات المقابلة. يوضح المقياس أبعاد الجهاز بالسنتيمتر. (ب) بروتوكول لتشكيل مصيدة الجسيمات الدقيقة. تتدفق الجسيمات الدقيقة عبر القناة عن طريق الجاذبية عندما يتم وضع الجهاز في وضع رأسي. تتركز الجسيمات الدقيقة عند تقييد 5 ميكرومتر. تتم إزالة الجسيمات الدقيقة الزائدة بسهولة عن طريق تدوير الشريحة عبر القناة الجانبية. يتم الاحتفاظ بالشريحة عمودية للحفاظ على المصيدة قبل المقايسة المناعية. (ج) جهاز الموائع الدقيقة المثبت على شريحة زجاجية تحتوي على المغناطيس ، على مرحلة المجهر الفلوري المقلوب. تتم ملاحظة إبرة الاستغناء التي يتم من خلالها إضافة الكواشف ، وكذلك خراطيم المخرج التي تتصل بمضخة حقنة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
7. الكشف المناعي
- حافظ على تدفق مخزن الغسيل المؤقت لمدة 10 دقائق عند 50 ميكرولتر / ساعة لإزالة BSA الزائد.
- قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي للغسيل من إبرة الاستغناء باستخدام ماصة دقيقة. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الجسيمات النانوية.
- تدفق تعليق الجسيمات النانوية لمدة 7 دقائق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة. بعد ذلك ، قم بتغيير معدل التدفق إلى 50 ميكرولتر / ساعة والتدفق لمدة 15 دقيقة أخرى.
- تغيير إبرة الاستغناء. تدفق المخزن المؤقت للغسيل لمدة 10 دقائق عند 50 ميكرولتر / ساعة. تحضير الركيزة الفلوروجينية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة أثناء خطوة الغسيل.
- قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي للغسيل من إبرة الاستغناء باستخدام ماصة دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من الركيزة الفلوروجينية (انظر جدول المواد). تدفق الركيزة الفلوروجينية لمدة 6 دقائق عند 50 ميكرولتر / ساعة.
- اضبط معدل التدفق (1 ميكرولتر / ساعة ، 3 ميكرولتر / ساعة ، 5 ميكرولتر / ساعة ، و 10 ميكرولتر / ساعة) والوقت (6 دقائق) في علامتي التبويب معدل التدفق وضبط المؤقت المقابلة للواجهة التي تتحكم في مضخة المحقنة. تأكد من تحديد وضع السحب لكل من القياسات التي سيتم إجراؤها.
- اضبط علامة تبويب معدل التدفق الإضافية على 50 ميكرولتر / ساعة واضبط المؤقت على 3 دقائق لخطوة الغسيل.
- قم بتشغيل مضان المجهر 15 ثانية قبل توقف الركيزة عند 50 ميكرولتر / ساعة. ابدأ التقاط الصورة باستخدام برنامج كاميرا المجهر قبل 10 ثوان من توقف الركيزة بوقت تعريض يبلغ 1000 مللي ثانية. قم بإجراء التصوير لمدة 6 دقائق بمعدل 1 إطار / ثانية (FPS).
- انقر فوق الزر " ابدأ" لمعلمة معدل التدفق المطلوبة مباشرة بعد توقف معدل تدفق غسل الركيزة عند 50 ميكرولتر / ساعة. انقر فوق الزر "ابدأ" لتدفق الغسيل (50 ميكرولتر / ساعة) فور توقف تدفق القياس المحدد.
- أوقف التقاط الصور وأوقف مضان المجهر لتجنب التبييض الضوئي للركيزة.
- كرر الخطوات 7.8.-7.10. لكل معدل تدفق القياس المستخدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان من الممكن إنشاء بروتوكول تصنيع قابل للتكرار بدرجة عالية يحسن دقة تقنية الطحن الدقيقة التقليدية. باستخدام هذا البروتوكول ، يتم تصنيع قناة صغيرة يصل ارتفاعها إلى 5 ميكرومتر تعمل كقيد متداخل في قناة بارتفاع 200 ميكرومتر. يلتقط التصميم البسيط للتقييد المتدرج جزيئات الحديد الدقيقة التي يبلغ قطرها 7.5 ميكرومتر والتي ، عند ضغطها في القناة الدقيقة ، تسمح بإنشاء مصيدة مغناطيسية عندما يقترب مغناطيس خارجي من الجهاز. يسمح هذا الجهاز بإجراء المقايسات المناعية باستخدام الجسيمات النانوية المترافقة مع المادة المراد تحليلها كدعم مناعي. في هذا العمل ، تم إجراء فحوصات مناعية غير مباشرة غير تنافسية مع الكشف القائم على الأجسام المضادة المسمى بالإنزيم. كان مستضد النموذج (Ag) عبارة عن بروتين ليزوزيم مترافق مع جسيمات نانوية (NPs) بقطر 100 نانومتر. تم استخدام IgG المضاد للليزوزيم الأرنب كجسم مضاد أولي (AbI) وتم الكشف باستخدام الجسم المضاد الثانوي المترافق مع بيروكسيديز الفجل (HRP-AbII).
تم إجراء الكشف عن طريق ربط التغير في شدة إشارة التألق التي تم الحصول عليها بعد تفاعل HRP-AbII مع ركيزة فلورية عند المرور عبر المصيدة مع الجسيمات النانوية المحاصرة. لإجراء القياسات ، تم تحديد منطقة قبل المصيدة ومنطقة بعد المصيدة. يوضح الشكل 7A-D الزيادة في شدة التألق لتركيزات مختلفة من مضاد الليزوزيم AbI: 0 نانوغرام / مل ، 10 نانوغرام / مل ، 100 نانوغرام / مل ، و 1000 نانوغرام / مل لمعدل تدفق ركيزة فلوروجيني معين (3 ميكرولتر / ساعة). هذا يدل على أن التغيير في مضان الركيزة يتناسب طرديا مع تركيز AbI المستخدم.
الشكل 7: مناطق قياس التألق. تظهر قياسات التألق لتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية المضادة للليزوزيم المستخدمة: (أ) 0 نانوغرام / مل ، (ب) 10 نانوغرام / مل ، (ج) 100 نانوغرام / مل ، و (د) 1000 نانوغرام / مل. تظهر الدوائر الزرقاء منطقة قياس التألق قبل وبعد المصيدة التي تشكلت من تقييد الارتفاع 5 ميكرومتر ، حيث تتفاعل الركيزة مع الجسم المضاد الثانوي المترافق مع HRP. تتوافق جميع الصور مع تدفق 3 ميكرولتر / ساعة. اختصار: HRP = بيروكسيديز الفجل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
ومع ذلك ، بالنسبة لتركيز AbI معين ، فإن مستوى التألق الذي تم الحصول عليه هو دالة لمعدل التدفق المستخدم في الركيزة الفلورية. وبالتالي ، فإن قدرة تحويل هذه الركيزة بواسطة إنزيم HRP تتناسب عكسيا مع معدل التدفق. تم تقييم معدلات تدفق الركيزة المختلفة من 1 ميكرولتر / ساعة ، 3 ميكرولتر / ساعة ، 5 ميكرولتر / ساعة ، و 10 ميكرولتر / ساعة. لكل تجربة ، تم الحصول على المنحنيات المقابلة للاختلاف في التألق الذي قدمته الركيزة قبل وبعد المرور عبر المصيدة المغناطيسية. يوضح الشكل 8A-C المنحنيات التي تم الحصول عليها لتركيز 100 نانوغرام / مل لثلاثة معدلات تدفق مختلفة: (A) 10 μL / h ، (B) 3 μL / h ، و (C) 1 μL / h. اعتمادا على معدل التدفق المستخدم ، تختلف قدرة تحويل الركيزة بواسطة الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP الموجود في المصيدة المغناطيسية. يمثل المنحنى الأخضر شدة التألق للركيزة بعد التحويل بواسطة HRP الموجود في المصيدة. يمكن ملاحظة أنه في التدفقات الأعلى ، يتحلل الحد الأقصى لمستوى التألق الذي تم الحصول عليه. يمثل المنحنى الأحمر التألق القاعدي قبل أن تصل الركيزة إلى المصيدة. يظل قياس مضان الركيزة في هذه المنطقة من المصيدة ثابتا ، وتعتمد قيمته على درجة التفاعلات غير المحددة إذا لم يكن هناك حجب فعال لسطح القناة. حسبنا الفرق بين كلا المنحنيين ، الذي يمثله المنحنى الأزرق.
الشكل 8: منحنيات التألق. الرسوم البيانية التي تم الحصول عليها بتركيز 100 نانوغرام / مل من الأجسام المضادة الأولية ومعدلات التدفق (A) 10 μL / h ، (B) 3 μL / h ، و (C) 1 μL / h. تمثل المنحنيات الثلاثة الملونة التألق المقاس قبل المصيدة (المنحنى الأحمر) وبعد المصيدة (المنحنى الأخضر) والفرق بين الاثنين (المنحنى الأزرق) بمرور الوقت. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
يدمج الشكل 9A-C منحنيات فرق التألق المقاسة قبل وبعد التفاعل المناعي للتدفقات المختلفة لتركيزات AbI من (A) 0 نانوغرام / مل ، (ب) 10 نانوغرام / مل ، و (ج) 1000 نانوغرام / مل. يشير قياس معدل التدفق البالغ 0 ميكرولتر / ساعة إلى قياس التفاعل المناعي في ظل ظروف ثابتة حيث يحكم الانتشار. لتركيز 1000 نانوغرام / مل ، يتشبع التألق لجميع التدفقات التي تم تقييمها. ومع ذلك ، فإن النمط المتدرج للتألق في التدفقات المختلفة يرجع إلى انتشار الركيزة ، والتي تتفاعل مع معدل تحويل مرتفع بحيث تتغلب على التدفقات الأصغر. وبالتالي ، هناك عودة لهذا التألق إلى منطقة المنبع من المصيدة.
الشكل 9: نسب فرق التألق. منحنيات ملخصة لاختلافات التألق (بعد-قبل) للتدفقات المختلفة المستخدمة عند (A) 0 نانوغرام/مل، (B) 10 نانوغرام/مل، (C) 1000 نانوغرام/مل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تتيح القياسات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الجهاز إنشاء منحنى معايرة قياسي للمقايسات المناعية التي يتم إجراؤها باستخدام الليزوزيم كمستضد نموذجي. يوضح الشكل 10 منحنى المعايرة الذي تم الحصول عليه من القيم القصوى للاختلافات بين التألق قبل وبعد التفاعل المناعي الذي يتم إجراؤه في المصيدة المغناطيسية. يسمح هذا البروتوكول بالكشف عن الجسم المضاد الأساسي المضاد للليزوزيم بتركيزات بترتيب نانوجرام لكل ملليلتر باستخدام تدفقات تتراوح بين 1 ميكرولتر / ساعة و 10 ميكرولتر / ساعة. يشير التباين العالي ومستويات التألق العالية عند 1 ميكرولتر / ساعة إلى أن تفاعل المركب المناعي هو أن هذا المعدل لا يفضل تدفق الركيزة المتفاعلة ويميل إلى التراكم بعد المصيدة مباشرة ، بالإضافة إلى حقيقة أن مقاومة الجهاز تقلل من دقة الجهاز لمعدل التدفق هذا.
الشكل 10: منحنى المعايرة. يوضح الرسم البياني القيمة القصوى للاختلافات في شدة التألق للمنحنيات التي تم الحصول عليها فيما يتعلق بتركيز الجسم المضاد الأولي المستخدم (AB1) لكل معدل تدفق. I / Isat يتوافق مع نسبة قيمة التألق التي تم الحصول عليها لكل قياس مضان (I) ، تم تسويتها فيما يتعلق بالحد الأقصى لقيمة التألق التي تم الوصول إليها عند التشبع(جلست). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للتجارب الثلاث. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي S1: واجهة تحكم منصة كهرضغطية. تظهر الصورة اليسرى الواجهة التي تتحكم في إزاحة المحور z للمنصة الكهرضغطية. يتم إنشاء التقييد عن طريق رفع المنصة من خلال تطبيق الجهد على ثلاثة مشغلات كهرضغطية. تظهر الصورة اليمنى واجهة البرنامج الذي يتحكم في آلة الطحن الدقيقة ، حيث يمكن ملاحظة الإحداثيات الدقيقة في المحورين x و y حيث يتم تشكيل التقييد بسرعة 11000 دورة في الدقيقة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: تصميم الجهاز. يظهر تصميم الجهاز الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج التصميم على اليسار. يتكون التصميم من قناتين متصلتين ، إحداهما هي القناة الرئيسية التي تحتوي على تقييد الارتفاع 5 ميكرومتر والأخرى هي القناة الجانبية لمخرج النفايات. يتم طحن القنوات باستخدام بت مطحنة نهاية 200 ميكرومتر. تظهر اللوحة الموجودة على اليمين معلمات التصنيع. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: معلمات الطحن الدقيق لفتحات المدخل والمخرج. (أ) يتم طحن فتحات القطر 1.2 مم وعمق 0.65 مم (نصف سمك الأكريليك) على الوجه المشكل. تظهر اللوحة الموجودة على اليمين سرعة الإزاحة والدوران ومعلمات العمق لقمة مطحنة النهاية. (ب) يتم طحن ثقوب قطرها 1.5 مم وعمقها 0.7 مم على الوجه المقابل الذي يربط الثقوب. تظهر اللوحة الموجودة على اليمين معلمات التصنيع. كلتا الحالتين مطحنتان بطرف 800 ميكرومتر. (ج) يتم عرض فتحات مدخل الكاشف (يمين) ومخرج (يسار) بعد تصنيع كلا الوجهين. تسمح أبعاد النصف ذو القطر الأكبر بإقران الخرطوم ، بينما يمنع الحاجز الناتج عن النصف ذي القطر الأصغر الخرطوم من سد المداخل. قضبان المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S4: فصل الجسيمات النانوية. باستخدام فاصل مغناطيسي تجاري ، يمكن تركيز الجسيمات النانوية 100 نانومتر بسهولة لأداء خطوات الغسيل أثناء المقايسة المناعية. لوحظ الحبيبات التي تشكلت بعد 15 دقيقة في الدائرة الحمراء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 1: رمز لطحن سطح الأكريليك. يظهر الرمز الذي تم إنشاؤه مع تعليمات لطحن سطح الأكريليك 25 مم × 9 مم على طول المحورين x و y. يضع السطر الأخير من الكود مثقاب الحفر مباشرة عند الإحداثيات حيث سيتم تشكيل القيد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف التصميم التكميلي 1: تصميم فتحات مدخل ومخرج القناة الدقيقة والكاشف. يحتوي التصميم على طبقتين من الهياكل الملونة المختلفة (القنوات السوداء والثقوب الحمراء) التي يتم تشكيلها على وجه الأكريليك الأرضي سابقا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف التصميم التكميلي 2: تصميم الثقوب على الجانب الآخر. يتكون التصميم من ثقوب ذات قطر أكبر للوجه المقابل تتواصل مع الثقوب السابقة وتعمل على إصلاح الخراطيم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تصنيع جهاز الموائع الدقيقة الأكريليك للمقايسات المناعية باستخدام الجسيمات النانوية كدعم مناعي باستخدام تقنية الطحن الدقيق. تتميز طريقة التصنيع المباشر على الركيزة بميزة تجنب استخدام القالب الرئيسي والوقت والتكاليف التي ينطوي عليها ذلك. ومع ذلك ، فإنه يقتصر على النماذج الأولية السريعة وتصنيع الأجهزة ذات الحجم الكبير.
هنا ، استخدمنا منصة كهرضغطية ملحقة تم الإبلاغ عنها مسبقا لآلة الطحن12. تم تصنيع المنصة بواسطة الطباعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء قنوات متغيرة العمق بدقة رأسية أفضل من دقة 10 ميكرومتر لآلات الطحن الدقيقة التقليدية. لقد حققنا طحن قنوات يصل ارتفاعها إلى 5 ميكرومتر والتي تشكل قيدا متداخلا في قناة الموائع الدقيقة 200 ميكرومتر.
مطلوب فقط اثنين من بت مطحنة نهاية من 200 ميكرومتر وقطر 800 ميكرومتر لتصنيع جهاز الموائع الدقيقة ، دون الحاجة إلى تغيير البتات يدويا. يقوم نموذج آلة الطحن المستخدم بتبادل البتات تلقائيا ، مما يساعد في تحسين الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح وضع "Z0 ssensoring" بتحديد الأصل تلقائيا في المحور z بدقة عالية عن طريق الاتصال بالمستشعر والدبوس المتضمن في آلة الطحن.
تصميم هذا الجهاز بسيط ، ويتكون فقط من القناة الرئيسية التي يقطعها تقييد متداخل 5 ميكرومتر وقناة ملحقة تعمل كتطهير ومدخل للجسيمات الدقيقة. ومع ذلك ، فإن الدقة العالية لهذه الهياكل مطلوبة لتقييد حبس جزيئات الحديد الدقيقة التي يبلغ قطرها 7.5 ميكرومتر. يسمح التقييد الأكبر للجسيمات الدقيقة بالمرور دون الاحتفاظ بها ، مما يمنع التقاطها وتشكيل مصيدة الجسيمات الدقيقة. على العكس من ذلك ، فإن التقييد الأصغر يزيد بشكل كبير من مقاومة تدفق القناة ويتسبب في خروج الكواشف عبر القناة الجانبية بدلا من المرور عبر وسط الجسيمات الدقيقة المسامية. إن استخدام الجسيمات الدقيقة ذات القطر الأكبر لتشكيل المصيدة المغناطيسية سيسمح بإجراء قيود أكبر. على سبيل المثال ، تحتاج الجسيمات التي يبلغ قطرها 40 ميكرومتر إلى تقييد متداخل ~ 30 ميكرومتر. في هذه الحالة ، ليس من الضروري استخدام منصة كهرضغطية ، ويتم تبسيط بروتوكول التصنيع. ومع ذلك ، فإن الوسط المسامي المكون من جسيمات دقيقة أكبر من شأنه أن يحبس الجسيمات النانوية بشكل مختلف وسيؤثر على أداء المقايسة المناعية. ومع ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كان سيكون للأفضل أو للأسوأ. يجري العمل على دراسة هذه الميزات لتحسين الجهاز7.
لتحقيق الدقة المطلوبة ، تم إجراء طحن السطح لإزالة طبقة 30 ميكرومتر من سطح الأكريليك عن طريق تحريك لقمة المطحنة الطرفية 200 ميكرومتر عبر سطح الأكريليك بالكامل عند 14500 دورة في الدقيقة. تسمح هذه العملية بالحصول على أصل جديد عند المحور z على طول السطح بأكمله لمزيد من الدقة في الارتفاع. من الأهمية بمكان دائما محاذاة الأكريليك في نفس الموضع بحيث تتزامن إحداثيات الأصل على المحورين x و y (المحددة مسبقا) مع أحد أركان الأكريليك. وبالمثل ، ينبغي للمرء أن يتأكد من أن الأكريليك مثبت تماما على القاعدة ؛ خلاف ذلك ، قد لا يتآكل السطح بشكل صحيح ، مما يتسبب في حدوث مشاكل في خطوات التجميع التالية.
بمجرد أن يكمل البرنامج عملية طحن السطح ، فإنه يقوم تلقائيا بإحضار بت المطحنة النهائية إلى إحداثي محدد حيث سيتم تشكيل القيد 5 ميكرومتر الذي يشكل المصيدة. من الأهمية بمكان منع لقمة الطاحونة النهائية من رفع السطح بمجرد وصولها إلى هذا الإحداثي. يوصى بتحديد ما إذا كانت آلة الطحن الدقيقة لديها خيار يمنع بت المطحنة الطرفية من الانفصال عن السطح بمجرد انتهاء عملية الطحن. خلاف ذلك ، سيكون من الضروري إعادة وضع القاطع يدويا إلى هذا الإحداثي ، مما قد يؤدي إلى أخطاء في دقة الموقع.
لتصنيع التقييد المتدرج في الأكريليك ، من الضروري زيادة الحجم بمقدار 1.5 ميكرومتر. لارتفاع 5 ميكرومتر ، تم رفع المنصة الكهرضغطية إلى 6.5 ميكرومتر لأن القناة الدقيقة تميل إلى التسطيح قليلا في عملية إغلاق القنوات. بالإضافة إلى ذلك ، يبلغ الطول النهائي للتقييد في الجهاز 50 ميكرومتر فقط ؛ ومع ذلك ، يتم تشكيله لفترة أطول للتأكد من أنه يتصل بطرفي القناة الرئيسية عندما يتم تشكيله بعد ذلك. في خطوة واحدة ، يتم تصنيع القنوات العميقة 200 ميكرومتر باستخدام لقمة مطحنة نهاية قطرها 200 ميكرومتر وسرعة دوران تبلغ 11000 دورة في الدقيقة. وبالتالي ، فإن تصنيع القنوات العريضة 200 ميكرومتر في الأكريليك يستغرق بضع ثوان فقط.
الخطوة التالية في تصنيع الجهاز هي تصنيع الثقوب التي تربط القنوات بالخارج. تستخدم هذه الثقوب لوضع الخراطيم التي تسمح بتوصيل الجهاز بسهولة بمضخة المحقنة التي تديره. واحدة من المشاكل التي واجهتها هنا هي وضع الخراطيم. تعد المسافة المثلى أمرا بالغ الأهمية للسماح بتدفق الكواشف وتجنب إنشاء ختم بوجه الأكريليك غير المشكل. للتغلب على هذا العيب ، يتم تشكيل الثقوب في خطوتين لإنشاء حدود حيث لا تتجاوز الخراطيم العمق المطلوب.
مع بت مطحنة نهاية 800 ميكرومتر ، تم طحن نمط الثقوب على نفس الوجه الدقيق سابقا. يتم تشكيل ثقوب في نهاية كل قناة بقطر 1.2 مم وعمق 0.65 مم ، وهو نصف سمك الأكريليك. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تشكيل فتحتين في الزوايا المقابلة للمستطيل ، مما يسمح بمحاذاة الأكريليك ووجهه لأسفل على المنصة بأعمدة. من المهم استخدام مكشطة أو قاطع لإزالة الأكريليك من المنصة الكهرضغطية لتجنب كسرها. على الجانب الآخر من الأكريليك ، يبلغ قطر الثقوب 1.5 مم (أكبر من النصف السابق) ، وهو ما يساوي قطر الخرطوم المراد تثبيته. العمق 0.7 مم ويجب أن يكون أكبر قليلا من نصف فتحة الوجه الأمامية لضمان اتصال كل من الثقوب المشكلة مع بعضها البعض. يمنع الحاجز الذي يتكون من فتحة القطر الأصغر الخرطوم من الوصول إلى القاع وسد المدخل. هذا التنفيذ في البروتوكول يحسن بشكل كبير من وضع خراطيم مدخل ومخرج السوائل على الشريحة.
الخطوة الرئيسية في تصنيع الجهاز هي الختم. من الضروري إغلاق الوجه الذي يحتوي على القنوات المشكلة بغطاء أكريليك غير آلي بنفس الأبعاد. يسمح ختم الألواح بطريقة لا تقترب من درجة حرارة التزجج للأكريليك بالحصول على قنوات خالية من التشوه. من خلال طريقة الترابط المستخدمة ، يذوب فيلم رقيق من المذيب بين ورقتي PMMA طبقة رقيقة من سطح ورقة PMMA ، ثم يتبخر ، وأخيرا يعيد توصيل مونومرات صفائح PMMA عند درجة حرارة تشغيل محددة.
تم استخدام الطريقة الموصوفة على نطاق واسع للتعرض لبخار الكلوروفورم لإغلاق جهاز الأكريليك هذا. كما ورد سابقا في الأدبيات ، يوفر الكلوروفورم قوة رابطة عالية. ومع ذلك ، نظرا لأن الكلوروفورم يهاجم الأكريليك بقوة شديدة ، فلا ينبغي أبدا أن يتلامس الأكريليك مباشرة مع الكلوروفورم السائل ، فقط مع الكلوروفورم الغازي. من الضروري الحفاظ على مسافة مثالية بين الكلوروفورم المتبخر والأكريليك. أنشأنا نظاما بسيطا باستخدام طبق بتري زجاجي ، حيث تم لصق الأكريليك على الغطاء. تم استخدام منصة مكونة من تسع شرائح متصلة ومتصلة بغطاء طبق بتري ، حيث تم لصق الأكريليك بشريط على الوجهين لتنظيم المسافة. على الرغم من أن عملية الكلوروفورم الغازية حساسة للغاية للتغيرات في درجة الحرارة المحيطة ، إلا أنه يمكن التحكم في درجة حرارة أطباق بتري عن طريق وضعها داخل صندوق من البوليسترين. يمنع ختم الماء الكلوروفورم من التبخر بسرعة كبيرة.
في المقابل ، هناك طرق ربط أخرى تم الإبلاغ عنها أسرع ولا تتطلب معدات خاصة ؛ ومع ذلك ، فإن بعضها مناسب فقط للانضمام إلى لوحين من الأكريليك بدون معالجة. وبالمثل ، من الصعب التحكم في قوة الترابط حيث يجب سكب المذيب مباشرة بين كل من صفائح الأكريليك18 ، مع وجود خطر كبير في ذوبان الهياكل ذات الأبعاد الصغيرة مثل تقييد 5 ميكرومتر.
باستخدام البروتوكول الموضح هنا ، تم تحقيق أختام متجانسة باستخدام مكبس محلي الصنع ، حيث تم التحكم في ضغط الختم ودرجة الحرارة. لبناء هذه المكبس ، يخلق كل من إطار الألمنيوم والمفصلة رافعة تضخم القوة الميكانيكية القادمة من وزن 5 كجم إلى عامل 9: 1. تنقل عناصر التسخين حرارتها إلى ألواح ألمنيوم بسمك 2 سم ملامسة لقطع الأكريليك.
بمجرد إغلاق طبقات الأكريليك ، فإن الخطوة الأخيرة في عملية التصنيع هي توصيل الخراطيم الخارجية بمداخل ومنافذ الجهاز المقابلة. يتم تطبيق المادة اللاصقة السائلة خارجيا بمجرد أن تكون الخراطيم داخل الثقوب. إذا كان قطر الخرطوم أصغر من الثقوب ، يمكن أن يدخل اللاصق السائل إلى الجهاز ، مما يؤدي إلى انسداد القنوات.
طرق التصنيع المباشر على الركيزة ، مثل الطحن الدقيق ، لها بعض العيوب ، مثل خشونة السطح الميكانيكي والهياكل ذات الحواف المحددة بشكل سيئ9. على الرغم من خشونة السطح التشكيلي للقنوات ، لا يلزم إجراء معالجة إضافية لهذا الجهاز. نقطة مهمة يجب ملاحظتها حول بروتوكول الترابط هذا هي أن الكلوروفورم يسمح بتقليل خشونة القنوات الدقيقة المطحونة عن طريق تلميع الأسطح المعرضة للمذيب. تلميع السطح جيد جدا لدرجة أنه حتى الجودة البصرية تم تحسينها19.
عندما يتم تصنيع الجهاز ، يجب أن يكون مستعدا للاستخدام في المقايسة المناعية. يعد الغسيل بالموجات فوق الصوتية للجهاز ذا أهمية كبيرة لإزالة أي حطام أكريليك غير مرغوب فيه قد يسد القنوات ويتداخل مع المقايسة المناعية.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب إيلاء اهتمام خاص للانسداد الصحيح للقنوات لتجنب التفاعلات غير المحددة وإشارات الضوضاء العالية في الخلفية. ثبت أن الحجب بنسبة 5٪ BSA يقلل من ضوضاء الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة في القنوات ، و 1 ساعة من الحضانة كافية. يتم طلاء جزيئات الحديد الدقيقة بطبقة السيليكا PEG لمنع الارتباط غير المحدد فيها. علاوة على ذلك ، يتم حظر الجسيمات الدقيقة باستخدام BSA (في نفس وقت القنوات) قبل تشكيل المصيدة في الجهاز. الحضانة بين عشية وضحاها في 4 °C هو أفضل ، وهذا يعني أن 1 يوم مطلوب لتصنيع وحضانة الجهاز قبل المقايسة المناعية. لقد ثبت أن تقليل الخشونة بواسطة الكلوروفورم وانسداد الأسطح لتقليل التفاعلات غير المحددة يعمل بشكل جيد للغاية ، مما يسمح لهذه المنصة بتحقيق حد من الكشف يمكن مقارنته بمعيار ELISA في نموذج المقايسة المناعية4.
تشكيل مصيدة الجسيمات الدقيقة في تقييد microchannel هو عملية يدوية. على الرغم من عدم وجود تحكم دقيق في عدد الجسيمات الدقيقة الداخلة ، فإننا نعتمد على تقدير طول الجسيمات المضغوطة. من الممكن جعل المصيدة أكبر أو إزالة الفائض بسهولة. تتراكم الجسيمات المهملة في القناة الجانبية ولا تحتاج إلى إزالتها من الشريحة. من الأهمية بمكان منع الجسيمات الدقيقة من التدفق إلى القناة الرئيسية ، حيث يمكنها التفاعل مع الجسيمات النانوية في المنبع من المصيدة وتعديل قياسات المقايسة المناعية.
كدليل على المفهوم ، قمنا بتنفيذ الكشف المناعي لمركب يتكون من بروتين الليزوزيم المترافق مع جسيمات نانوية قطرها 100 نانومتر عن طريق حضانة الجسم المضاد الأولي المحدد والجسم المضاد الثانوي المقابل المسمى HRP. يتم تشكيل المركب المناعي خارج الجهاز. ومع ذلك ، من الممكن إجراء المقايسة المناعية بأكملها داخل الجهاز. تسمح الخصائص المغناطيسية للجسيمات النانوية بالتلاعب السهل باستخدام فاصل مغناطيسي دائم من النيوديميوم عالي الأداء. يجب على المرء ببساطة الاحتفاظ بأنبوب التفاعل الدقيق لمدة 15 دقيقة للسماح للجسيمات النانوية بجذب المغناطيس إلى جدار الأنبوب الدقيق ، مما يسهل خطوات غسل المقايسة المناعية خارج الجهاز.
أهم ما يميز هذا الجهاز هو أنه بسيط وسريع (إجمالي وقت الفحص 40 دقيقة 4 مقارنة ب4-6 ساعات ل ELISA) ، ورخيص (يمكن مقارنته بسعر اختبار التدفق الجانبي). كل هذه الميزات تجعل ملف تعريف الجهاز هذا مرشحا جيدا لتطوير POCT. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للجهاز الكشف الكمي عن تركيزات التحليل المشابهة للمعيار الذهبي ELISA4 ، وهو أمر ذو قيمة كبيرة للدراسات الوبائية واتخاذ القرارات في مجال الصحة العامة. عادة ما يكون لأنظمة الموائع الدقيقة للمقايسات المناعية حدود جيدة للكشف ولكن أوقات فحص طويلة ، أو لديها أوقات فحص قصيرة ولكن حدود الكشف دون المستوى الأمثل4. من خلال الجمع بين الجسيمات النانوية المغناطيسية كدعم مناعي وإنزيمات فلوروجينية للكشف ، تتمتع هذه المنصة بوقت فحص قصير وحد جيد للكشف (في العمل السابق ، وجدنا حدا للكشف يبلغ 8 بيكوغرام / مل باستخدام البيوتين كمستضد ، وهو ما يمكن مقارنته بمعيار ELISA4). أخيرا ، تتمتع هذه التقنية بميزة مهمة على اختبارات التدفق الجانبي: إمكانية إعطاء نتائج كمية وليس فقط نوعية ("نعم" أو "لا"). على عكس معظم أنظمة الموائع الدقيقة الأخرى التي تم تطويرها في المختبرات التي تستخدم فيها المواد النادرة ، فإن هذا النظام مصنوع من الأكريليك (PMMA) ، وهو لدن حراري منخفض التكلفة ومتوافق للغاية مع الإنتاج الضخم لأجهزة التشخيص الطبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل Conacyt، المكسيك بموجب منحة 312231 من "برنامج Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación"، ومن AMEXCID ووزارة العلاقات الخارجية المكسيكية (SRE) بموجب منحة "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO تشكر Conacyt Mexico على منحة الدكتوراه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R.
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
