微流控技术是开发诊断检测方法的有力工具。然而，该技术通常需要昂贵的设备和材料，以及繁琐的制备和操作步骤。本文详细描述了一种丙烯酸微流控装置的制备方案，可用于低成本且易于使用的磁性微纳米粒子免疫分析。
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本文内容
摘要
摘要
微流控系统极大地改进了免疫测定技术。然而，许多微加工技术需要专用、昂贵或复杂的设备，导致制造成本高昂且难以实现大规模生产，而大规模生产是低资源环境下采用即时检测（POCT）最重要的前提条件之一。本研究描述了一种利用计算机数控（CNC）微铣削技术制备丙烯酸（聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA）装置的工艺，用于纳米粒子偶联的酶联免疫测定检测。通过使用溶菌酶作为模型抗原，并将其偶联至100 nm磁性纳米颗粒，进而执行免疫测定实验，展示了该微流控装置的功能。该装置集成了仅5 µm高的物理交错限流结构，通过在外侧放置磁铁形成磁阱以捕获磁性微粒。在此设计下，磁力足以捕获偶联纳米颗粒的免疫载体，并抵抗流体剪切力。该微流控装置特别适用于低成本大规模生产，同时不牺牲免疫测定性能的精确性。
引言
近年来，微流控技术在免疫分析技术中发挥了重要作用1。与传统免疫分析方法相比，微型化技术具有诸多显著优势，如减少样品和试剂消耗、缩短孵育时间、高效的溶液交换，以及更高的集成化和自动化程度2。
此外，将磁性纳米颗粒作为免疫载体与微流控系统结合用于免疫分析时，可显著缩短孵育时间，并因表面积与体积比的增加而实现高检测灵敏度3。颗粒的布朗运动在抗原-抗体复合物形成过程中改善了反应动力学4,5。此外，纳米颗粒的磁性使其能够灵活集成到不同的微流控装置构型中，因而成为微型化芯片生物传感系统中信号生成和分子捕获的理想候选材料5。然而，由于纳米尺度下极高的表面积与体积比，磁力远弱于拖曳力6。因此，在洗涤和检测等关键免疫分析步骤中捕获纳米颗粒具有挑战性，常规磁铁难以满足要求4。
操控纳米颗粒的一种高效方法是利用由铁微粒构成的微流控磁阱，这些铁微粒被固定在微流控结构中3。因此，当外部磁体靠近时，磁化....
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方案
1. 微型铣削
- 表面研磨
- 打开微铣削机和压电控制器，启动各自的控制软件12.
- 选择所需的立铣刀头（200 µm 和 800 µm 直径）。将它们放入研磨机的相应隔室中（图1).
- 用激光切割机切割尺寸为 9 mm × 25 mm、厚度为 1.3 mm 的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）矩形片 800 µm 端铣刀头。使用双面胶带将其中一个矩形试样小心地固定在压电平台上（图2).
注意：务必始终将亚克力矩形块放置在相同位置，使其其中一个角与加工时x轴和y轴的原点坐标重合。 - 连接并将 z 轴传感器放置在 PMMA 矩形片表面。选择检测针并将其移至传感器表面。手动降低检测针，但不与传感器接触。启动 Z0 感应 模式（图3).
- 选择 200 µm 端铣刀头移至 x、y 原点。取下 z 轴传感器，小心降低刀头，避免接触亚克力表面。
- 离心 200 µm 以14,500 rpm的转速使用端铣刀具。缓慢将其沿z轴下降至原点坐标（z = 0）。重置z轴 30 µm 原点下方。将此坐标设为新的 z ....
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结果
已成功建立一种高度可重复的制备方案，可提升传统微铣削技术的加工分辨率。利用该方案，可在高度为200 µm的通道中加工出低至5 µm高的微通道结构，形成交错式限流结构。该交错式限流结构的简单设计可捕获直径为7.5 µm的铁磁微粒；当这些微粒在微通道内被压缩后，可在外部磁体接近装置时形成磁阱。该装置可用于以与目标分析物偶联的纳米颗粒作为免疫载体的免疫分析。本研究中进行了基于酶标记抗体检测的非竞争性间接免疫分析。模型抗原（Ag）为与直径100 nm的纳米颗粒（NPs）偶联的溶菌酶蛋白。以兔抗溶菌酶IgG作为一抗（AbI），通过辣根过氧化物酶标记的兔源二抗（HRP-AbII）进行检测。
通过检测HRP-AbII与荧光底物反应后，经过含有捕获纳米颗粒的捕获区时荧光信号强度的变化，实现检测。为进行测量，确定了捕获区之前和之后的两个区域。图7A-D展示了在固定荧光底物流速（3 µL/h）条件下，不同浓度抗溶菌酶AbI（0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL.......
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讨论
采用微铣削技术制备了一种用于免疫分析的丙烯酸微流控装置，该装置以纳米颗粒作为免疫载体。这种在基底上直接制造的方法具有避免使用母模及其所涉及的时间和成本的优势。然而，该方法仅限于快速原型制作和高通量设备的制造。
本研究采用了一种先前报道过的用于铣床的压电辅助平台12。该平台通过3D打印技术制造，可加工出深度可变的微通道，其垂直分辨率优于传统微铣床的10 µm分辨率。我们成功加工出高达5 µm的通道，其在200 µm的微流控通道中形成交错式缩窄结构。
加工该微流控装置仅需直径为 200 µm 和 800 µm 的两种端铣刀具，无需手动更换刀具。所使用的铣床型号可自动更换刀具，有助于节省时间。此外，"Z0 感应"模式可通过传感器与铣床上配备的探针接触，自动精确确定 z 轴方向的原点位置。
该装置的设计十分简单，仅包含一个主通道和一个辅助通道，其中主通道被一个5 µm的交错式狭窄结构中断，辅助通道则用作微粒的冲洗和进.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由墨西哥国家科学技术委员会（Conacyt）资助，项目编号为312231。 "科技创新活动支持计划"，以及由美洲基金（AMEXCID）和墨西哥外交关系部（SRE）在资助项目下支持 "SARS-CoV-2快速、低成本且高灵敏度的血清学检测方法"JAHO 感谢墨西哥国家科学与技术委员会（Conacyt Mexico）提供的博士奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.008 铣刀 | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 铣刀 | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| 羰基铁微粒 | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| 氯仿 | Fermont | 6201 | 健康危害：中等 易燃性：无 反应性：无 接触危害：中等 |
| CMOS 相机 Moment | Teledyne Photometrics | 传感器技术：CMOS 量子效率：73% 像素尺寸：4.5 µm × 4.5 µm 支持接口：USB 3.2 Gen 2 | |
| Dr Engrave 软件 | Roland DGA Corporation | 用于在表面设计和生成雕刻路径的雕刻软件 | |
| 通风橱 | 未知 | 未知 | |
| 柔性塑料管 | Tygon | AAD04103 | 内径 = 0.020，外径 = 0.060 |
| 荧光显微镜 | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| 高精度点胶针头 | Loctite | 98612 | |
| 自制压电控制器应用 | LabView | 详见参考文献12。 | |
| Loctite 495 瞬干胶 | Henkel | 49503 | 使用微量移液器吸头或点胶针头施加 |
| MagJET 分离架 | thermoscientific | 12 × 1.5 mL | |
| 机械压力机 | 自制 | ||
| 铣床 | Roland | MDX-50 | |
| 压电平台 | 自制 | 参见参考文献12 | |
| 聚甲基丙烯酸甲酯板材 - PMMA，亚克力 | Goodfellow | ME303018/1 | 厚度：1.3 mm，透明度：透明 |
| PVCamTest 软件 | Teledyne Photometrics | 版本 3.10.107 | 图像采集软件 |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag 羧基磁珠 | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| 注射泵 | kd Scientific | KDS200 | 最多可容纳两个注射器 |
| 超声波清洗机 | Branson | 2800 | |
| VPanel 软件 | Windows 操作系统 | 版本 1.0.3.0 | 用于控制微铣床的软件 |
参考文献
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R. Immunoassays in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 991-1007 (2010).
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysi....
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重印与许可
