Summary
Microfluidics הוא כלי רב עוצמה לפיתוח בדיקות אבחון. עם זאת, ציוד וחומרים יקרים, כמו גם טכניקות ייצור וטיפול מייגע, נדרשים לעתים קרובות. כאן אנו מפרטים את פרוטוקול הייצור של התקן מיקרופלואידי אקרילי עבור אימונו-אנליזות מגנטיות מבוססות מיקרו וננו-חלקיקים בסביבה זולה ופשוטה לשימוש.
Abstract
מערכות מיקרופלואידיות שיפרו מאוד את טכניקות הבדיקה החיסונית. עם זאת, טכניקות מיקרו-פבריקציה רבות דורשות ציוד מיוחד, יקר או מסובך, מה שהופך את הייצור ליקר ולא תואם לייצור המוני, שהוא אחד התנאים המוקדמים החשובים ביותר לאימוץ בדיקות נקודת טיפול (POCT) בסביבה דלת משאבים. עבודה זו מתארת את תהליך הייצור של מכשיר אקרילי (פולימתיל-מתקרילט, PMMA) לבדיקת אימונואסאי אנזימטי מצומד בננו-חלקיקים באמצעות טכניקת המיקרו-מילינג של בקרה נומרית ממוחשבת (CNC). תפקודו של המכשיר המיקרופלואידי מוצג על ידי ביצוע בדיקה חיסונית לאיתור נוגדן מסחרי באמצעות ליזוזים כאנטיגן מודל המצומד לננו-חלקיקים מגנטיים של 100 ננומטר. מכשיר זה משלב מגבלה פיזיקלית של 5 מיקרומטר בלבד בגובה, המשמשת ללכידת מיקרו-חלקיקים מגנטיים המרכיבים מלכודת מגנטית על ידי הצבת מגנט חיצוני. בדרך זו, הכוח המגנטי על התמיכה החיסונית של ננו-חלקיקים מצומדים מספיק כדי ללכוד אותם ולהתנגד לגרירת זרימה. מכשיר מיקרופלואידי זה מתאים במיוחד לייצור המוני בעלות נמוכה ללא אובדן הדיוק לביצועי החיסון.
Introduction
בשנים האחרונות, מיקרופלואידיקה מילאה תפקיד חשוב בטכניקות אימונואסאי1. לטכנולוגיית המזעור יש יתרונות בולטים רבים בהשוואה לחיסוניות מסורתיות, כגון צריכת דגימה וריאגנטים מופחתת, זמני דגירה קצרים יותר, החלפת פתרונות יעילה ואינטגרציה ואוטומציה גבוהות יותר2.
יתר על כן, מערכות מיקרופלואידיות ב- immunoassays, בשיתוף עם ננו-חלקיקים מגנטיים כתמיכה חיסונית, מפחיתות במידה ניכרת את זמני הדגירה, ומשיגות רגישות גילוי גבוהה בשל היחס המוגבר בין פני השטח לנפח3. תנועה בראונית של החלקיקים משפרת את קינטיקה התגובה במהלך היווצרות קומפלקס אנטיגן-נוגדנים 4,5. יתר על כן, התכונות המגנטיות של ננו-חלקיקים מספקות את הרבגוניות שיש לשלב בתצורות שונות של התקנים מיקרופלואידיים, מה שהופך אותם למועמדים אידיאליים לאיתות וללכידת מולקולות במערכות ביוסנסינג ממוזערות על השבב5. עם זאת, הכוחות המגנטיים חלשים משמעותית מכוחות הגרר בקנה מידה ננומטרי בשל היחס הגבוה בין פני השטח לנפח6. לכן, לכידת ננו-חלקיקים עבור שלבים חיוניים של בדיקה חיסונית כגון שטיפה וזיהוי יכולה להיות מאתגרת, ומגנט קונבנציונלי אינו מספיק4.
דרך יעילה לתמרן את הננו-חלקיקים היא שימוש במלכודת מגנטית מיקרופלואידית הנוצרת על ידי מיקרו-חלקיקי ברזל, הארוזים במבנה מיקרופלואידי3. לכן, כאשר מגנט חיצוני מתקרב, נוצרת אינטראקציה מורכבת בתוך התווך הנקבובי הממוגנט בין הכוחות המגנטיים לכוחות השטף. הכוח המגנטי הפועל על הננו-חלקיקים חזק מספיק כדי ללכוד אותם ולהתנגד לגרר זרימה 3,4,7. גישה זו דורשת טכניקות מיקרו-פבריקציה שמשיגות רזולוציות בסדר גודל של כמה מיקרומטרים כדי ליצור מבנים מיקרומטריים ששומרים על המיקרו-חלקיקים.
טכניקות המיקרו-פבריקציה הנוכחיות מאפשרות ייצור ברזולוציה גבוהה של מבנים ממיקרונים בודדים ועד מאות ננומטרים8. עם זאת, רבות מהטכניקות הללו דורשות ציוד מיוחד, יקר או מסובך. אחד הקשיים העיקריים הוא הדרישה לחדר נקי לייצור עובש, שנותר יקר וגוזל זמןרב 8,9. לאחרונה, מהנדסים microfluidic התגברו על חיסרון זה על ידי פיתוח מגוון של שיטות ייצור חלופיות, עם יתרונות שונים כגון עלויות מופחתות, זמני אספקה מהירים יותר, חומרים וכלים זולים יותר, ופונקציונליות מוגברת8. בדרך זו, הפיתוח של טכניקות מיקרו-פבריקציה חדשות הביא לשיטות בעלות נמוכה, שאינן נקיות, המשיגות רזולוציות נמוכות עד 10 מיקרומטר8. ניתן להשתמש בדפוסים ישירות על מצע מבלי ליצור תבנית יציקה יקרה, ובכך להימנע מתהליך גוזל זמן. שיטות ייצור ישירות כוללות כרסום CNC, אבלציה בלייזר וליתוגרפיה ישירה8. כל השיטות הללו מתאימות לייצור תעלות בעלות יחס רוחב-גובה גבוה במגוון רחב של חומרים, ללא קשר לקשיותן9, ומאפשרות גיאומטריות, התנהגויות פיזיקליות ואיכויות חדשות ומועילות בהתקנים מיקרופלואידיים8.
מיקרומילינג CNC יוצר מבנים בקנה מידה זעיר באמצעות כלי חיתוך המסירים חומר בתפזורת ממצע ומהווה שיטת ייצור יעילה להתקנים מיקרופלואידיים10,11. טכניקת המיקרומילינג יכולה להיות שימושית ביישומים מיקרופלואידיים ליצירת מיקרו-ערוצים ותכונות ישירות על משטח העבודה, ומציעה יתרון מרכזי: ניתן לייצר חומר עבודה בזמן קצר (פחות מ-30 דקות), ובכך להפחית משמעותית את זמן האספקה מתכנון לאב טיפוס12. בנוסף, הזמינות הרחבה של אביזרי חיתוך מחומרים, גדלים וצורות שונות הופכת את מכונות כרסום CNC לכלי מתאים שאיפשר ייצור תכונות שונות בסוגים רבים של חומרים חד פעמיים בעלות נמוכה13.
מבין כל החומרים הנפוצים בשימוש במיקרומיל, תרמופלסטיקה נותרה בחירה מובילה בשל תכונותיהם החיוביות הרבות ותאימותם ליישומים ביולוגיים10,14. תרמופלסטיקה היא מצע אטרקטיבי למערכות מיקרופלואידיות בשל יתרונותיה המשמעותיים לפיתוח מערכות אנליטיות חד פעמיות בעלות נמוכה9. בנוסף, חומרים אלה מקובלים מאוד על תהליכי ייצור בנפח גבוה, מה שהופך אותם מתאימים למסחור וייצור המוני. מסיבות אלה, תרמופלסטיקה כגון PMMA נחשבה לחומרים אמינים וחזקים מאז השנים הראשונות של מיקרופלואידיקה10. פרוטוקולים שונים תוארו כדי לייצר תעלות סגורות בתרמופלסטיקה, כגון מליטה ממס15, מליטה בחום 16, ומליטה אולטרה סגולה (UV)/אוזון טיפול פני שטח17.
במקרים רבים, רזולוציית המיקום שהושגה באמצעות מכונות מיקרומילינג קונבנציונליות אינה מספיקה עבור יישומים מיקרופלואידיים מסוימים הדורשים מבנים הקטנים מ-10 מיקרומטר. למיקרומילינג מתקדם יש רזולוציה מספקת. למרבה הצער, בשל מחירים גבוהים, השימוש בו מוגבל לקומץ משתמשים12. בעבר, קבוצת המחקר שלנו דיווחה על ייצור ומניפולציה של כלי בעלות נמוכה המאפשר מבני עיבוד שבבי של פחות מ -10 מיקרומטר, תוך התגברות על הרזולוציה של מכונות כרסום קונבנציונליות12. המתקן הוא פלטפורמה המיוצרת על ידי הדפסה תלת מימדית עם אלקטרוניקה פשוטה, המכילה שלושה מפעילים פיאזואלקטריים. המשטח מכיל חיבורים בצורת ציר המאפשרים לו להיות מורם כאשר האלמנטים הפיאזואלקטריים פועלים בו זמנית. ניתן לשלוט בתזוזה של ציר Z ברזולוציה של 500 ננומטר ובדיוק של ±1.5 מיקרומטר12.
מאמר זה מציג את שלבי תהליך הייצור של מכשיר אקרילי (PMMA) באמצעות טכניקת מיקרומילינג. עיצוב השבב מורכב מערוץ ראשי ברוחב 200 מיקרומטר ובגובה 200 מיקרומטר וערוץ צדדי עם אותם ממדים כדי לטהר את זרימת הריאגנטים. באזור המרכז, הערוץ מופרע על ידי הגבלה פיזיקלית של גובה של 5 מיקרומטר בלבד, המיוצרת עם הפלטפורמה הפיאזואלקטרית המודפסת בתלת-ממד מתוצרת קבוצהזו 12, כדי ללכוד מיקרו-חלקיקים מגנטיים המרכיבים מלכודת מגנטית עבור ננו-חלקיקים על ידי הצבת מגנט חיצוני. אנו מראים את פעולתו של המכשיר המיקרופלואידי על ידי ביצוע בדיקה חיסונית לאיתור נוגדן מסחרי באמצעות ליזוזים כאנטיגן מודל המצומד לננו-חלקיקים מגנטיים של 100 ננומטר. מכשיר זה משלב תכונות שונות שהופכות אותו לייחודי4: השימוש בננו-חלקיקים מגנטיים כתמיכה במערכת החיסון מפחית את זמן הבדיקה הכולל משעות לדקות; שימוש באנזים פלואורוגני לזיהוי מאפשר מגבלות זיהוי דומות לאלה של בדיקות אימונוסורבנט סטנדרטיות הקשורות לאנזים (ELISAs); והשימוש בתרמופלסטי כחומר ייצור הופך אותו לתואם לייצור המוני, מה שלא היה המקרה של ננו-חלקיקים מיקרופלואידיים קודמים3, והופך אותו למועמד מצוין לפיתוח POCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מיקרומילינג
- השחזה על פני השטח
- הפעל את מכונת המיקרומילינג ואת הבקר הפיאזואלקטרי. הפעל את תוכנת הבקרה המתאימהשלהם 12.
- בחר את סיביות טחנת הקצה הנדרשות (קטרים של 200 מיקרומטר ו- 800 מיקרומטר). הניחו אותם בתא המתאים של מכונת הכרסום (איור 1).
- חתוך מלבנים בגודל 9 מ"מ x 25 מ"מ של PMMA בעובי 1.3 מ"מ עם סיבית טחנת הקצה של 800 מיקרומטר. חברו את אחד המלבנים האלה בזהירות באמצעות סרט דבק דו-צדדי לפלטפורמה הפיאזואלקטרית (איור 2).
הערה: הקפידו תמיד למקם את המלבן האקרילי באותו מיקום, כך שאחת הפינות תעלה בקנה אחד עם קואורדינטות המקור בצירי x ו-y לעיבוד שבבי. - חבר והנח את חיישן z על פני השטח של מלבן PMMA. בחר את פין הזיהוי והזז אותו מעל משטח החיישן. הנמיכו את הסיכה באופן ידני מבלי ליצור קשר עם החיישן. הפעל את מצב חישת Z0 (איור 3).
- בחר את סיבית טחנת הקצה של 200 מיקרומטר והעבר אותה למקור x, y. הסר את חיישן z. מנמיכים את המעט בזהירות מבלי לגעת במשטח האקריליק.
- סובב את סיבית הקצה של 200 מיקרומטר ב-14,500 סל"ד. הורידו אותו לאט לאט לקואורדינטות המקור על ציר z (z = 0). אפס את ציר z 30 מיקרומטר מתחת למקור. הגדר קואורדינטות אלה כמקור z החדש.
הערה: לעולם אל תנמיך את הסיבית אם היא אינה מסתובבת. אחרת, הוא מסתכן בשבירה. - לחץ על גזירה כפתור בתוכנת מכונת המיקרומילינג כדי להפעיל את החלונית Cut . לחץ על להוסיף כפתור ובחר את קובץ .txt (קובץ קידוד משלים 1) עם קוד שנוצר בעבר עבור שחיקה של משטח אקריליק. לחץ על פלט כפתור כדי להתחיל בתהליך.
- הביאו את סיבית טחנת הקצה לקואורדינטות שבהן ההגבלה תהיה במכונה. מנע את התרוממות טחנת הקצה מעל פני הקרקע ברגע שמגיעים לקואורדינטות אלה על-ידי לחיצה על לחצן השהה . אחרת, מקם מחדש באופן ידני את סיבית טחנת הקצה לקואורדינטות אלה (איור 4A).
- כרסום של הגבלת 5 מיקרומטר
- הגדר את מהירות הסיבוב של סיבית טחנת הקצה ל-11,000 סל"ד. הרם את הפלטפורמה 6.5 מיקרומטר עם הממשק של הפלטפורמה הפיאזואלקטרית (איור משלים S1). הזיזו את סיבית הקצה לאורך ציר ה-y ב-500 מיקרומטר. החזר את הפלטפורמה הפיאזואלקטרית לערך ההתחלתי שלה על ציר z עם ממשק הבקרה.
- כרסום של מיקרו-ערוצים
- פתח את קובץ העיצוב שנוצר בעבר מתוכנת העיצוב (קובץ עיצוב משלים 1). לחץ על כפתור הדפס . גש לתפריט מאפיינים ולחץ על חלון הצבע המתאים לשכבה המכילה את העיצוב שיש לעבד. הגדר את פרמטרי הייצור בחלונית ' כלים' כפי שצוין באיור משלים S2.
- בטל את ההפעלה של שכבות לא רצויות על-ידי בחירה באפשרות ללא בתפריט הנפתח כלים .
- כרסום חורים
- עבור לביט טחנת הקצה של 800 מיקרומטר. הפעל את שכבת העיצוב של החורים בקוטר 1.2 מ"מ על ידי לחיצה על חלון הצבע המתאים.
- חזור על שלב 1.3.2., אך במקרה זה, הגדר את פרמטרי הייצור המתאימים כמתואר באיור משלים S3A עבור החורים.
הערה: עומק החורים במכונה הוא מחצית מעובי האקריליק. - הפעילו שני חורים נוספים בפינות קונטרלטרליות של המלבן ליישור האקריליק באופן הפוך על פלטפורמה חדשה (איור 4B). מקלפים את המלבן האקרילי מהפלטפורמה הפיאזואלקטרית. הפוך את האקריליק והדביק אותו עם סרט דבק דו-צדדי מעל המתאם עם העמודים המעובדים (איור 4C,D).
- פתח את הקובץ עם העיצוב של החורים עבור הפנים ההפוכות מתוכנת העיצוב (קובץ עיצוב משלים 2). הגדר את פרמטרי הייצור המתאימים כמתואר באיור משלים S3B. טחנו את המחצית הנותרת של חורי הכניסה והיציאה המגיבה בקוטר של 1.5 מ"מ ובעומק של 0.7 מ"מ (איור משלים S3C).
איור 1: מיקום סיביות טחנת קצה . (A) סיביות הקצה של 200 מיקרומטר ו-800 מיקרומטר ממוקמות ומקובעות דרך בורג לתמיכת הפלדה. (B) כל סיבית טחנת קצה ממוקמת בתא הספציפי של מכונת המיקרומילינג לבחירה אוטומטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: פלטפורמה פיאזואלקטרית. הפלטפורמה מיוצרת על ידי הדפסה תלת ממדית ומורכבת משני בסיסים משושים המחוברים על ידי צירים המאפשרים תזוזה עדינה בציר z הנשלט על ידי שלושה מפעילים פיאזואלקטריים. מתאם אקרילי הוא ציין גם, שבו מלבן PMMA מחובר, אשר מאפשר הגדרה של פינת היישור של הקואורדינטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: כיול ציר Z. השלבים של כיול ציר z מפורטים. (A) חיישן z כולל כבל המתחבר למכונת המיקרומיל. (B) החיישן ממוקם ישירות על המשטח לצורך עיבוד במכונה. (C) פין הגילוי מורכב ממוט מתכת הממוקם בתא מיוחד ליד סיביות טחנת הקצה. (D) כאשר שני האביזרים באים במגע, מכונת המיקרומילינג מחשבת באופן אוטומטי את קואורדינטת המקור על ציר z. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: משטח אקרילי מתוקן . (A) סיבית הקצה בקוטר 200 מיקרומטר סוחפת את כל פני השטח של המלבן האקרילי, ומסירה שכבה בגובה של כ-30 מיקרומטר. (B) התמונה מציגה את המבנים השונים שנטחנו על פני האקריליק שתוקן בעבר. ערוצים וחורים עבור כניסה ושקע מגיב הם נצפו. את מגבלת 5 המיקרומטר לא ניתן לראות בעין בלתי. (C) משטח מיקרומיל עם חורי יישור ומתאם עם עמודי יישור בפינות מנוגדות. (D) האקריליק מיושר הפוך על המתאם עם עמודים, שלתוכם משתלבים חורי היישור. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
2. איטום ערוצים
- ניקוי אקרילי
- הסר את המלבן האקרילי מפלטפורמת מתאם העמודים. קח עוד מלבן אקריליק לא ממוכסן. יש לשטוף את שתי יריעות האקריל באלכוהול איזופרופיל (IPA) ולשטוף במים מזוקקים. יש ללבוש כפפות ולהימנע ממגע עם IPA.
- טבלו את האקריליק באמבט על-קולי למשך 10 דקות (איור 5A,B).
- חשיפה לכלורופורם גזי
- יבשו את שני יריעות האקריל בצורה מושלמת. הדביקו אותם לחלק הפנימי של מכסה צלחת פטרי מזכוכית עם סרט דו-צדדי. הקפידו למקם את הצד של הערוץ המעובד חשוף (איור 5C). יש ללבוש כפפות ולהימנע מלגעת ישירות במשטח האקריליק.
- מקמו את בסיס צלחת פטרי הזכוכית בתוך צלחת פטרי זכוכית גדולה יותר (איור 5D). יוצקים 1 מ"ל של כלורופורם לבסיס צלחת פטרי. הניחו במהירות את המכסה כאשר יריעות האקריליק מחוברות לצד הפנימי.
- הוסיפו מיד מים מזוקקים לבסיס צלחת הפטרי הגדולה יותר עד לגובה מכסה צלחת פטרי. אפשרו חשיפה של האקריליק לגז כלורופורם למשך דקה אחת (איור 5E).
הערה: קחו בחשבון שזמן חשיפה ארוך יותר לכלורופורם יתקוף את המשטח האקרילי, והגבלת 5 מיקרומטר תימס, תשנה את גובהה או תיעלם לחלוטין. - הטה את צלחת הפטרי כדי לשבור את חותם המים שנוצר. הסר מיד את האקריליק מהכלורופורם על ידי חשיפת צלחת פטרי. היזהר לא לשפוך את המים.
אזהרה: יש לבצע תהליך זה במכסה האדים ולהשתמש בכפפות, שכן כלורופורם רעיל ביותר.
- הדבקה על ידי לחיצה וחימום
- מקלפים את שתי צלחות האקריל מהסרט הדו-צדדי.
- יישרו את שני האקריליקים עם הצדדים שנחשפו לכלורופורם גזי פנים אל פנים, ויצרו כריך. מניחים את האקריליק במכבש על 18 קג"מ/ס"מ2 וטמפרטורה של 90°C (איור 5F,G).
הערה: מומלץ למקם את האקריליק מיושר לאורך ולשנות את היישור שלו לאחר 2 דקות לאיטום טוב יותר. אם, לאחר זמן זה, החותם אינו מספיק, הנח אותו בחזרה בעיתונות למרווחים של לא יותר מ 1 דקות. באמצעות הסטריאוסקופ, בדוק את מצב הערוצים וההגבלה. קחו בחשבון שבמקרה של חריגה מזמן הלחיצה, קיים סיכון לביטול ההגבלה.
- חיבור צינור
- חותכים 2-3 ס"מ אורך צינור. בצע חיתוך ישר לחלוטין. חברו כל צינור לחורים של המכשיר באמצעות דבק נוזלי המתייבש באופן מיידי (איור 6A). מנעו מהדבק להיכנס לתוך השבב.
איור 5: תהליך האיטום של המכשיר . (A) כל אחד מיריעות האקריליק מונח בשקית הניתנת לסגירה חוזרת עם מים מזוקקים ושקוע באמבט העל-קולי. (B) התמונה משמאל מציגה את הערוצים מיד לאחר הייצור, והתמונה מימין מציגה את אותו המכשיר לאחר שטיפה עם IPA והאמבטיה הקולית, אשר מסיר את כל זיהומים ושאריות אקריליק מן microchannel. קצוות ההגבלה שקוטעת את הערוץ המרכזי של 200 מיקרומטר נצפים, מה שמאשר את תהליך הטחינה המוצלח. מוטות אבנית = 500 מיקרומטר. (C) שני האקריליקים מיובשים ומודבקים למשטח הזכוכית שעל המכסה. (D) בסיס צלחת הפטרי ממוקם בתוך צלחת אחרת בקוטר גדול יותר. (E) בעת סגירת צלחת פטרי, אטם המים מונע בריחה של כלורופורם גזי. (F) תיאור מרכיבי המנוף במשקל של 5 ק"ג. (G) תמונה של הידית הפתוחה, המציגה באדום את האזור שבו ממוקם האקריליק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
3. הכנת המכשיר
- ממלאים את התעלות במים מזוקקים באמצעות מזרק. ודא שאין דליפות או התנגדות לזרימה. לטבול את המכשיר באמבטיה קולית למשך 10 דקות כדי להסיר כל חומר אקרילי, דבק או לא רצוי שנותר בתוך הערוצים.
- רוקן את המים בתוך ערוצי המכשיר. השתמש במזרק כדי להציג תמיסת חסימה שהוכנה עם אלבומין בסרום בקר (BSA) של 5% (w/v) מדולל במי מלח 1x עם מאגר טריס (TBS) וסונן בעבר דרך מסנן מזרק פוליאתרסולפון (PES) בגודל 0.2 מיקרומטר.
- הכינו תרחיף של מיקרו-חלקיקי ברזל בקוטר 7.5 מיקרומטר ב-5% BSA.
הערה: המיקרו-חלקיקים עברו פונקציונאליזציה עם שכבת סיליקה-פוליאתילן גליקול (PEG) המקנה עמידות לספיגת חלבונים4. - דגרו את השבב ואת מתלה המיקרו-חלקיקים עם תמיסת החסימה למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר. במידת האפשר, אפשר חסימה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
4. היווצרות מלכודת מיקרו-חלקיקים
- הכנס את המיקרו-חלקיקים לתוך השבב עם מחט מזרק דרך צינור היציאה הצדדי. מניחים את השבב אנכית ומאפשרים למיקרו-חלקיקים לזרום תחת השפעת כוח הכבידה דרך הערוץ הצדדי. סובב את השבב ב-180° בשני שלבים של 90° ואפשר למיקרו-חלקיקים להתמקד ולדחוס במגבלת 5 מיקרומטר.
- הסר מיקרו-חלקיקים עודפים על ידי כוח הכבידה המסתובב ב-45° לכיוון הערוץ הצדדי.
- שמור על המכשיר זקוף כדי למנוע ביטול מלכודת המיקרו-חלקיקים. ראו איור 6B לסיכום תהליך היווצרות מלכודות מיקרו-חלקיקים.
5. אימונואסאי
- הכנת ננו-חלקיקים
- קח 2 μL של ההשעיה של 100 ננומטר ננו-חלקיקים שהוצמדו בעבר עם ליזוזים (מודל אנטיגן). הוסף אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל עם 100 μL של תמיסת חסימה. לדגור לילה ב 4 °C (64 °F).
- הוסף 150 μL של מאגר כביסה (1x TBS, 0.05% Tween 20).
- מקם את צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל במפריד מגנטי. יש לשמור למשך 15 דקות כדי לאפשר את הפרדת הננו-חלקיקים (איור משלים S4).
הערה: עוצמת הקול המינימלית עבור המפריד המגנטי היא 200 μL. הימנע משימוש בנפח קטן יותר. - הסר את הנוזל מן הצינור עם micropipette. יש להימנע ממגע עם דופן הצינור שבו נוצר כדור הננו-חלקיק.
- יש להוסיף 250 מיקרון ליטר של מאגר כביסה טרי. שמור את הצינור תחת תסיסה במשך 15 דקות.
- חזור על שלבים 5.1.3.-5.1.5. פי 2 יותר, רועד רק למשך 5 דקות.
- הוסף את הריכוז הרצוי של נוגדן אנטי-ליזוזים ראשוני (ראה טבלת חומרים). התאם לנפח סופי של 100 μL בדילול נוגדנים (1x TBS, 1% BSA, 0.05% Tween 20).
- דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. המשיכו לרעוד למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלבי הכביסה 5.1.2.-5.1.6.
- יש להוסיף 100 μL של דילול נוגדנים. הוסף את הנוגדן המשני המצומד פרוקסידאז (HRP-AbII) (ראה טבלת החומרים) בדילול של 1:500.
- חזור על שלבי הכביסה 5.1.2.-5.1.6.
- שמור את הננו-חלקיקים בנפח סופי של 50 μL של דילול נוגדנים.
6. הרכבה ניסיונית
- מלאו את שני מזרקי הזכוכית בגודל 100 μL במים, חברו צינור באורך 6.5 ס"מ לכל מזרק, הכניסו פין מתכת לקצה הצינור והניחו את שני המזרקים על משאבת המזרקים הנשלטת על ידי מחשב.
- אטמו את כל הצינורות של המכשיר האקרילי בחום.
- חותכים את צינור הכניסה ושומרים רק כמה מילימטרים. מלאו את מחט החלוקה במאגר כביסה והכניסו אותה לצינור החתוך. אפשרו לתמיסה לטפטף לפני חיבור המחט למכשיר כדי למנוע גישה אווירית למכשיר.
- חותכים את צינור היציאה מהערוץ הצדדי. התחברו למשאבת המזרק. לאחר מכן, בצע את אותו הליך עבור צינור יציאת הערוץ הראשי.
הערה: המפתח לביצוע שלבים 6.3.-6.4. על מנת להימנע מפריקת מלכודת המיקרו-חלקיקים. במידת האפשר, ודא את מצב המלכודת במהלך שלבים אלה בעזרת זכוכית מגדלת. - הניחו שקופית זכוכית על במת המיקרוסקופ. חברו את המגנט לשקופית עם סרט דו-צדדי והניחו פיסת סרט קטנה בכל צד כדי לקבע את קצוות השבב לזכוכית.
- הגדר קצב זרימה של 50 μL/h דרך הכרטיסיות קצב זרימה ויחידות בבקר משאבת המזרק. בחר במצב משיכה ולחץ על לחצן התחל כדי להפעיל את זרימת מאגר הכביסה.
- בזהירות, התקרב למכשיר לכיוון השקופית עם המגנט בצורה אופקית כך שאזור השבב המכיל את המלכודת יוצר קשר עם המגנט.
- הדביקו את קצוות המכשיר לזכוכית באמצעות סרט דו-צדדי למניעת תזוזה. הימנע מחסימת הנתיב האופטי למיקרוסקופיה (איור 6C).
איור 6: תצורת התקן סופית . (A) התקן אקרילי עם צינורות מחוברים לכניסות וליציאות המתאימות. קנה המידה מציג את מידות המכשיר בסנטימטרים. (B) פרוטוקול להיווצרות מלכודת המיקרו-חלקיקים. מיקרו-חלקיקים זורמים בתעלה בכוח הכבידה כאשר המכשיר ממוקם במצב אנכי. מיקרו-חלקיקים מרוכזים במגבלה של 5 מיקרומטר. מיקרו-חלקיקים עודפים מוסרים בקלות על ידי סיבוב השבב דרך הערוץ הצדדי. השבב נשמר אנכית כדי לשמר את המלכודת לפני החיסון. (C) התקן מיקרופלואידי המותקן על שקופית זכוכית המכילה את המגנט, על במת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך. מחט חלוקה שדרכו מתווספים ריאגנטים הוא ציין, כמו גם את צינורות מוצא המתחברים משאבת מזרק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
7. אימונודנציה
- יש לשמור על זרימת מאגר הכביסה למשך 10 דקות במהירות של 50 μL/h כדי להסיר עודפי BSA.
- הסר את מאגר הכביסה הנותר ממחט החלוקה באמצעות מיקרופיפט. הוסף 50 μL של תרחיף ננו-חלקיקים.
- להזרים את התרחיף של ננו-חלקיקים למשך 7 דקות בקצב זרימה של 100 μL/h. לאחר מכן, שנה את קצב הזרימה ל -50 μL / h וזרם במשך 15 דקות נוספות.
- החליפו את מחט החלוקה. הזרימו את מאגר הכביסה למשך 10 דקות במהירות של 50 μL/h. הכינו את המצע הפלואורוגני בהתאם למפרט היצרן במהלך שלב הכביסה.
- הסר את מאגר הכביסה הנותר ממחט החלוקה באמצעות מיקרופיפט. הוסף 100 μL של המצע הפלואורוגני (ראה טבלת החומרים). הזרימו את המצע הפלואורוגני למשך 6 דקות במהירות של 50 μL/h.
- הגדר את קצב הזרימה (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h ו- 10 μL/h) ואת פרמטרי מדידת הזמן (6 דקות) בכרטיסיות המתאימות Flow Rate ו - Set Timer של הממשק השולטות במשאבת המזרק. הקפד לבחור במצב משיכה עבור כל אחת מהמדידות שיש לבצע.
- הגדר כרטיסיית קצב זרימה נוספת במהירות של 50 μL/h והגדר טיימר ב- 3 דקות לשלב הכביסה.
- הפעילו את הפלואורסצנציה של המיקרוסקופ 15 שניות לפני שהמצע במהירות של 50 μL/h נעצר. התחל את לכידת התמונה עם התוכנה של מצלמת המיקרוסקופ 10 שניות לפני שהמצע נעצר עם זמן חשיפה של 1,000 אלפיות השנייה. בצע הדמיה במשך 6 דקות במהירות של פריים/שנייה אחת (FPS).
- לחץ על כפתור התחל של פרמטר קצב הזרימה הרצוי מיד לאחר עצירת קצב שטיפת המצע ב-50 μL/h. לחץ על לחצן התחל של זרימת הכביסה (50 μL/h) מיד לאחר הפסקת זרימת המדידה שנבחרה.
- עצור את לכידת התמונה וכבה את הפלואורסצנטיות של המיקרוסקופ כדי למנוע הלבנה של המצע.
- חזור על שלבים 7.8.-7.10. עבור כל מדידת קצב זרימה שנעשה בה שימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן היה ליצור פרוטוקול ייצור בעל יכולת שחזור גבוהה המשפר את הרזולוציה של טכניקת המיקרומילינג הקונבנציונלית. באמצעות פרוטוקול זה מושגת ייצור של תעלה בגובה של עד 5 מיקרומטר הפועלת כהגבלה מדורגת בערוץ בגובה 200 מיקרומטר. העיצוב הפשוט של ההגבלה המדשדשת לוכד מיקרו-חלקיקי ברזל בקוטר 7.5 מיקרומטר, שכאשר הם נדחסים במיקרו-ערוץ, מאפשרים יצירת מלכודת מגנטית כאשר מגנט חיצוני מתקרב למכשיר. מכשיר זה מאפשר לבצע אימונו-אנליזות באמצעות ננו-חלקיקים המצומדים לאנליטיט המעניין כתמיכה אימונולוגית. בעבודה זו בוצעו חיסונים עקיפים לא תחרותיים עם זיהוי מבוסס נוגדנים המסומנים באנזימים. אנטיגן המודל (Ag) היה חלבון ליזוזים מצומד לננו-חלקיקים (NPs) בקוטר 100 ננומטר. Rabbit anti-lysozyme IgG שימש כנוגדן העיקרי (AbI) והזיהוי בוצע על ידי שימוש בנוגדן משני מצומד של חזרת ארנב (HRP-AbII).
הגילוי בוצע על ידי קורלציה של השינוי בעוצמת האות הפלואורסצנטי שהושג לאחר האינטראקציה של HRP-AbII עם מצע פלואורוגני עם מעבר דרך המלכודת עם ננו-חלקיקים לכודים. כדי לבצע את המדידות, נקבעו אזור לפני ואזור אחרי ההשמנה. איור 7A-D מראה את העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות עבור ריכוזים שונים של אנטי-ליזוזים AbI: 0 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL ו-1,000 ng/mL עבור קצב זרימת מצע פלואורוגני נתון (3 μL/h). זה מראה שהשינוי בפלואורסצנטיות המצע עומד ביחס ישר לריכוז של AbI בשימוש.
איור 7: אזורי מדידה פלואורסצנטיים. מדידות הפלואורסצנציה מוצגות עבור ריכוזים שונים של נוגדן אנטי-ליזוזים ראשוני בשימוש: (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL, (C) 100 ng/mL, ו-(D) 1,000 ng/mL. עיגולים כחולים מראים את שטח מדידת הפלואורסצנציה לפני ואחרי המלכודת שנוצרה על ידי הגבלת הגובה של 5 מיקרומטר, כאשר המצע מגיב עם הנוגדן המשני המצומד HRP. כל התמונות מתאימות לזרימה של 3 μL/h. קיצור: HRP = חזרת פרוקסידאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
עם זאת, עבור ריכוז AbI נתון, רמת הפלואורסצנציה המתקבלת היא פונקציה של קצב הזרימה המשמש למצע הפלואורוגני. לפיכך, יכולת ההמרה של סובסטרט זה על ידי האנזים HRP היא ביחס הפוך לקצב הזרימה. הוערכו קצבי זרימת מצע שונים של 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h ו-10 μL/h. עבור כל ניסוי התקבלו העקומות המתאימות להפרש הפלואורסצנטיות שניתן על ידי המצע לפני ואחרי שעבר דרך המלכודת המגנטית. איור 8A-C מראה את העקומות המתקבלות עבור ריכוז של 100 ננוגרם/מ"ל עבור שלושה קצבי זרימה שונים: (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h, ו-(C) 1 μL/h. בהתאם לקצב הזרימה המשמש, יכולת ההמרה של המצע על ידי הנוגדן המשני המצומד HRP הממוקם במלכודת המגנטית משתנה. העקומה הירוקה מייצגת את עוצמת הפלואורסצנטיות של המצע לאחר המרה על ידי HRP הממוקם במלכודת. ניתן לראות כי בשטפים גבוהים יותר, הרמה המקסימלית של פלואורסצנציה השיגה דעיכות. העקומה האדומה מייצגת את הפלואורסצנציה הבסיסית לפני שהמצע מגיע למלכודת. מדידת פלואורסצנטיות המצע באזור זה של המלכודת נשארת קבועה, וערכה תלוי במידת האינטראקציות הלא ספציפיות אם אין חסימה יעילה של משטח הערוץ. חישבנו את ההפרש בין שתי העקומות, המיוצגות על ידי העקומה הכחולה.
איור 8: עקומות פלואורסצנטיות. גרפים שהתקבלו בריכוז של 100 ננוגרם/מ"ל של נוגדנים ראשוניים וקצבי זרימה של (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h, ו-(C) 1 μL/h. שלוש העקומות הצבעוניות מייצגות את הפלואורסצנטיות שנמדדה לפני ההשמנה (עקומה אדומה) ואחרי ההשמנה (עקומה ירוקה) ואת ההפרש בין השתיים (עקומה כחולה) לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9A-C משלב את עקומות ההפרש הפלואורסצנטי שנמדדו לפני ואחרי התגובה החיסונית עבור הזרימות השונות עבור ריכוזי AbI של (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL ו-(C) 1,000 ng/mL. המדידה עבור קצב זרימה של 0 μL/h מציינת את מדידת התגובה החיסונית בתנאים סטטיים שבהם הדיפוזיה שולטת. עבור ריכוז של 1,000 ננוגרם/מ"ל, הפלואורסצנציה רוויה עבור כל הזרמים שהוערכו. עם זאת, התבנית המדשדשת של פלואורסצנטיות בזרימות השונות נובעת מדיפוזיה של המצע, המגיב בשיעור המרה כה גבוה עד שהוא מתגבר על הזרימות הקטנות יותר. לפיכך, יש חזרה של פלואורסצנציה זו לאזור במעלה הזרם של המלכודת.
איור 9: יחסי הפרש פלואורסצנטי. עקומות מסכמות של הפרשי הפלואורסצנציה (אחרי-לפני) עבור השטפים השונים המשמשים ב-(A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL, ו-(C) 1,000 ng/mL. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
מדידות המתקבלות עם מכשיר זה מאפשרות ליצור עקומת כיול סטנדרטית עבור immunoassays שבוצעו עם lysozyme כאנטיגן מודל. איור 10 מראה את עקומת הכיול המתקבלת מהערכים המרביים של ההבדלים בין הפלואורסצנציה לפני ואחרי התגובה החיסונית המבוצעת במלכודת המגנטית. פרוטוקול זה מאפשר לזהות את הנוגדן העיקרי נגד ליזוזים עם ריכוזים בסדר גודל של ננוגרם למיליליטר באמצעות זרימות בין 1 μL/h ל-10 μL/h. השונות הגבוהה ורמות הפלואורסצנטיות הגבוהות ב -1 μL/h מצביעות על כך שהתגובתיות של האימונוקומפלקס היא כזו שקצב זה אינו מעדיף את זרימת המצע המגיב ונוטה להצטבר מיד לאחר המלכודת, בנוסף לעובדה שההתנגדות של המכשיר מפחיתה את הרזולוציה של המכשיר לקצב זרימה זה.
איור 10: עקומת כיול. הגרף מציג את הערך המרבי של ההבדלים בעוצמת הפלואורסצנטיות של העקומות המתקבלות ביחס לריכוז הנוגדן העיקרי המשמש (AB1) עבור כל קצב זרימה. I/Iישב תואם את היחס בין הערך הפלואורסצנטי המתקבל עבור כל מדידה פלואורסצנטית (I), מנורמל ביחס לערך הפלואורסצנטי המרבי שהושג עם הרוויה (ישבתי). קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלושת הניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים S1: ממשק בקר פלטפורמה פיאזואלקטרי. התמונה השמאלית מציגה את הממשק השולט על תזוזת ציר z של הפלטפורמה הפיאזואלקטרית. ההגבלה נוצרת על ידי העלאת הפלטפורמה באמצעות יישום מתח לשלושה מפעילים פיאזואלקטריים. התמונה הימנית מציגה את הממשק של התוכנה השולטת במכונת המיקרומילינג, שם ניתן לצפות בקואורדינטות המדויקות בצירי x ו- y שבהם ההגבלה מכונה במהירות של 11,000 סל"ד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: עיצוב המכשיר. העיצוב של המכשיר שנוצר באמצעות תוכנת העיצוב נראה בצד שמאל. העיצוב מורכב משני ערוצים מחוברים, האחד הוא הערוץ הראשי המכיל את מגבלת הגובה של 5 מיקרומטר והשני הוא הערוץ הצדדי לשקע הפסולת. התעלות הן micromilled עם סיבית טחנת קצה 200 מיקרומטר. החלונית מימין מציגה את פרמטרי הייצור. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S3: פרמטרים של מיקרומילינג של חורי כניסה ויציאה. (A) חורים בקוטר 1.2 מ"מ ובעומק 0.65 מ"מ (מחצית מעובי האקריליק) מיוצרים במיקרומיל על פני המכונה. החלונית מימין מציגה את פרמטרי מהירות התזוזה, הסיבוב והעומק של סיבית טחנת הקצה. (B) חורים בקוטר 1.5 מ"מ ובעומק 0.7 מ"מ נמצאים במיקרומיל בצד הנגדי ומחברים בין החורים. החלונית מימין מציגה את פרמטרי הייצור. שני המקרים הם micromilled עם סיבית טחנת קצה 800 מיקרומטר. (C) חורי כניסה מגיב (מימין) ושקע (משמאל) מוצגים לאחר עיבוד משני הפנים. מידות החצי בקוטר הגדול יותר מאפשרות להצמיד את הצינור, ואילו המחסום שנוצר על ידי החצי בקוטר הקטן יותר מונע מהצינור לחסום את הפתחים. סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S4: הפרדת ננו-חלקיקים. באמצעות מפריד מגנטי מסחרי, ניתן לרכז בקלות ננו-חלקיקים של 100 ננומטר כדי לבצע את שלבי השטיפה במהלך הבדיקה החיסונית. הכדור שנוצר לאחר 15 דקות נצפה בעיגול האדום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 1: קוד להשחזה של משטח אקרילי. הקוד שנוצר מוצג עם הוראות לטחינת המשטח האקרילי בגודל 25 מ"מ x 9 מ"מ לאורך צירי x ו- y. השורה האחרונה של הקוד ממקמת את סיבית המקדחה ממש בקואורדינטות שבהן האילוץ יהיה במכונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ עיצוב משלים 1: תכנון של חורי הכניסה והשקע המיקרו-ערוציים והריאגנטים. העיצוב מכיל שתי שכבות של מבנים בצבעים שונים (תעלות שחורות וחורים אדומים) המונחים במכונה על פני האקריל שהיו טחונים בעבר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ עיצוב משלים 2: עיצוב החורים בצד הנגדי. העיצוב מורכב חורים בקוטר גדול יותר עבור הפנים ההפוכות לתקשר עם הקודמים ומשמשים כדי לתקן את הצינורות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מכשיר מיקרופלואידי אקרילי לאימונו-אנליזות תוך שימוש בננו-חלקיקים כתמיכה חיסונית יוצר בטכניקת מיקרו-מילינג. השיטה של ייצור ישיר על המצע יש את היתרון של הימנעות משימוש בתבנית מאסטר ואת הזמן והעלויות כי זה מרמז. עם זאת, הוא מוגבל לבניית אב-טיפוס מהירה ולייצור מכשירים בנפח גבוה.
כאן, השתמשנו בפלטפורמה פיאזואלקטרית אביזרית שדווחה בעבר עבור מכונת הכרסום12. הפלטפורמה יוצרה על ידי הדפסה תלת-ממדית כדי ליצור ערוצים בעומק משתנה עם רזולוציה אנכית טובה יותר מהרזולוציה של 10 מיקרומטר של מכונות מיקרומילינג קונבנציונליות. השגנו כרסום של תעלות בגובה של עד 5 מיקרומטר שיוצרות הגבלה מדורגת בתעלה המיקרופלואידית של 200 מיקרומטר.
רק שתי סיביות טחנת קצה בקוטר 200 מיקרומטר ו-800 מיקרומטר נדרשות לייצור המכשיר המיקרופלואידי, ללא כל צורך בשינוי ידני של סיביות. מודל מכונת הכרסום המשמש מבצע את חילופי הסיביות באופן אוטומטי, מה שמסייע באופטימיזציה של זמן. בנוסף, מצב "חישת Z0" מאפשר קביעת המקור באופן אוטומטי בציר z בדיוק גבוה על ידי יצירת קשר עם החיישן והסיכה הכלולה במכונת הכרסום.
העיצוב של מכשיר זה הוא פשוט, המורכב רק של הערוץ הראשי מופרע על ידי הגבלה של 5 μm stagged וערוץ אביזר המשמש טיהור וכניסה עבור microparticles. עם זאת, הדיוק הגבוה של מבנים כאלה נדרש עבור ההגבלה ללכוד מיקרו-חלקיקי ברזל בקוטר 7.5 מיקרומטר. הגבלה גדולה יותר מאפשרת למיקרו-חלקיקים לעבור דרכם ללא שמירה, מה שמונע את לכידתם ואת היווצרות מלכודת המיקרו-חלקיקים. לעומת זאת, הגבלה קטנה יותר מגדילה מאוד את התנגדות הזרימה של הערוץ וגורמת לריאגנטים לצאת דרך הערוץ הצדדי במקום לעבור דרך תווך המיקרו-חלקיקים הנקבובי. שימוש במיקרו-חלקיקים בקוטר גדול יותר ליצירת המלכודת המגנטית יאפשר לבצע הגבלה גדולה יותר. לדוגמה, חלקיקים בקוטר של 40 מיקרומטר זקוקים להגבלה של ~30 מיקרומטר. במקרה זה, אין צורך להשתמש בפלטפורמה piezoelectric, ואת פרוטוקול הייצור הוא פשוט יותר. עם זאת, תווך נקבובי המורכב ממיקרו-חלקיקים גדולים יותר ילכד ננו-חלקיקים באופן שונה וישפיע על ביצועי החיסון; עם זאת, לא ברור אם זה יהיה לטוב ולרע. העבודה מתבצעת כדי ללמוד תכונות אלה כדי לייעל את המכשיר7.
כדי להשיג את הדיוק הנדרש, בוצעה השחזה של פני השטח כדי להסיר שכבה של 30 מיקרומטר של המשטח האקרילי על ידי הזזת סיבית הקצה של 200 מיקרומטר דרך כל המשטח האקרילי ב-14,500 סל"ד. תהליך זה מאפשר לקבל מקור חדש בציר z לאורך כל המשטח לדיוק רב יותר בגובה. חשוב ליישר תמיד את האקריליק באותו מיקום, כך שקואורדינטות המקור על צירי ה-x וה-y (שנקבעו בעבר) יחפפו לאחת מפינות האקריליק. כמו כן, יש לוודא כי אקריליק יושב בצורה מושלמת על הבסיס; אחרת, ייתכן שהמשטח לא יתבלה כראוי, מה שיגרום לבעיות בשלבי ההרכבה הבאים.
לאחר שהתוכנית משלימה את תהליך השחזה על פני השטח, היא מביאה באופן אוטומטי את סיבית טחנת הקצה לקואורדינטות ספציפיות שבהן האילוץ של 5 מיקרומטר היוצר את המלכודת יהיה במכונה. זה קריטי כדי למנוע את קצה טחנת הקצה להרים את פני השטח ברגע שהוא מגיע לקואורדינטות אלה. מומלץ לזהות אם למכונת המיקרומילינג יש אפשרות שמונעת ממעט טחנת הקצה להתנתק מפני השטח לאחר שתהליך הטחינה מסתיים. אחרת, יהיה צורך למקם מחדש באופן ידני את החותך לקואורדינטות אלה, מה שעלול לגרום לשגיאות דיוק מיקום.
כדי למכונה את ההגבלה המדשדשת באקריליק, יש צורך להגדיל יתר על המידה ב -1.5 מיקרומטר. עבור גובה 5 מיקרומטר, הפלטפורמה הפיאזואלקטרית הועלתה ל -6.5 מיקרומטר מכיוון שהמיקרו-ערוץ נוטה להשתטח מעט בתהליך איטום התעלות. בנוסף, האורך הסופי של ההגבלה במכשיר הוא רק 50 מיקרומטר; עם זאת, הוא מכונה זמן רב יותר כדי להבטיח שהוא מתקשר עם שני הקצוות של הערוץ הראשי כאשר הוא מכונה לאחר מכן. בשלב אחד, התעלות העמוקות של 200 מיקרומטר מיוצרות באמצעות סיבית הקצה בקוטר 200 מיקרומטר ומהירות סיבוב של 11,000 סל"ד. לפיכך, עיבוד שבבי של 200 מיקרומטר ערוצים רחבים באקריליק לוקח רק כמה שניות.
השלב הבא בייצור המכשיר הוא מכונה את החורים המחברים את הערוצים החוצה. חורים אלה משמשים להנחת הצינורות המאפשרים לחבר את המכשיר בקלות למשאבת המזרק המפעילה אותו. אחת הבעיות שנתקלו בהן כאן היא מיקום הצינורות. מרחק אופטימלי הוא קריטי כדי לאפשר זרימה של ריאגנטים ולהימנע מיצירת חותם עם הפנים של אקריליק לא מעובד. כדי להתגבר על החיסרון הזה, החורים מיוצרים בשני שלבים כדי ליצור גבול שבו הצינורות אינם עולים על העומק הרצוי.
עם סיבית טחנת הקצה של 800 מיקרומטר, תבנית החורים נטחנה על אותו פרצוף מיקרומיל בעבר. חורים הם במכונה לתוך הקצה של כל ערוץ עם קוטר של 1.2 מ"מ ועומק של 0.65 מ"מ, שהוא מחצית עובי של אקריליק. בנוסף, שני חורים מיוצרים בפינות הקונטרלטרליות של המלבן, המאפשרים ליישר את האקריליק עם הפנים כלפי מטה על הפלטפורמה עם עמודים. חשוב להשתמש במגרד או חותך כדי להסיר את האקריליק מהפלטפורמה הפיאזואלקטרית כדי למנוע את שבירתו. בצד הנגדי של האקריליק, קוטר החורים הוא 1.5 מ"מ (גדול יותר מהחצי הקודם), השווה לקוטר הצינור שיש לקבוע. העומק הוא 0.7 מ"מ וצריך להיות מעט גדול ממחצית חור הפנים הקדמי כדי להבטיח ששני החורים במכונה יתקשרו זה עם זה. המחסום שנוצר על ידי חור בקוטר קטן יותר מונע מהצינור להגיע לתחתית ולחסום את הכניסה. יישום זה בפרוטוקול משפר מאוד את המיקום של כניסת נוזל צינורות מוצא לשבב.
שלב מרכזי בייצור המכשיר הוא איטום. יש צורך לאטום את הפנים המכילים את התעלות במכונה עם כיסוי אקריליק לא מעובד עם אותם ממדים. איטום היריעות בשיטה שאינה מתקרבת לטמפרטורת מעבר הזכוכית של האקריליק מאפשר קבלת תעלות נטולות דפורמציה. באמצעות שיטת המליטה שבה נעשה שימוש, סרט דק של ממס בין שתי יריעות PMMA ממיס סרט דק מפני השטח של יריעת PMMA, ואז מתאדה, ולבסוף מחבר מחדש את המונומרים של יריעות PMMA בטמפרטורת הפעלה מסוימת.
השיטה המתוארת באופן נרחב של חשיפה לאדי כלורופורם שימשה לאיטום מכשיר אקרילי זה. כפי שדווח בעבר בספרות, כלורופורם מספק חוזק קשר גבוה; עם זאת, מכיוון שכלורופורם תוקף את האקריל בצורה אגרסיבית מאוד, אקריליק לעולם לא אמור לבוא במגע ישיר עם כלורופורם נוזלי, אלא רק עם כלורופורם גזי. חיוני לשמור על מרחק אופטימלי בין הכלורופורם המתנדף לבין האקריליק. יצרנו מערכת פשוטה באמצעות צלחת פטרי מזכוכית, בה הודבק האקריליק למכסה. נעשה שימוש בפלטפורמה המורכבת מתשע מגלשות שחוברו וחוברו למכסה של צלחת פטרי, שעליה הודבקו האקריליק בנייר דבק דו-צדדי כדי לווסת את המרחק. למרות שתהליך הכלורופורם הגזי רגיש מאוד לשינויים בטמפרטורת הסביבה, ניתן לשלוט בטמפרטורה של צלחות הפטרי על ידי הצבתן בתוך קופסת פוליסטירן. אטם המים מונע מהכלורופורם להתאדות מהר מדי.
לעומת זאת, ישנן שיטות הצטרפות מדווחות אחרות שהן מהירות יותר ואינן דורשות ציוד מיוחד; עם זאת, חלקם מתאימים רק לחיבור שני יריעות אקריליות ללא עיבוד שבבי. כמו כן, קשה לשלוט בכוח המליטה שכן יש לשפוך את הממס ישירות בין שתי יריעות האקריל18, עם סיכון גבוה להתכה של מבנים בממדים קטנים כגון הגבלת micromilled 5 מיקרומטר.
באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, חותמות הומוגניות הושגו עם מכבש תוצרת בית, שבו לחץ האיטום והטמפרטורה נשלטו. לבניית מכבש זה, הן מסגרת של אלומיניום והן ציר יוצרים מנוף המגביר את הכוח המכני המגיע ממשקל של 5 ק"ג לגורם של 9:1. גופי החימום מעבירים את החום שלהם ללוחות אלומיניום בעובי 2 ס"מ הנמצאים במגע עם החלקים האקריליים.
לאחר אטימת שכבות האקריליק, השלב האחרון בתהליך הייצור הוא לחבר את הצינורות החיצוניים לכניסות ולשקעים המתאימים של המכשיר. הדבק הנוזלי מוחל חיצונית ברגע שהצינורות נמצאים בתוך החורים. אם קוטר הצינור קטן מהחורים, הדבק הנוזלי יכול להיכנס למכשיר, לסתום את הערוצים.
לשיטות ייצור ישירות על המצע, כגון מיקרומילינג, יש כמה חסרונות, כגון חספוס של פני השטח המעובדים ומבנים עם קצוות מופרדים היטב9. למרות החספוס של פני השטח המעובדים של הערוצים, אין צורך בטיפול נוסף עבור מכשיר זה. נקודה חשובה שיש לשים לב אליה לגבי פרוטוקול ההדבקה הזה היא שכלורופורם מאפשר להפחית את החספוס של המיקרו-ערוצים הטחונים על ידי ליטוש המשטחים שנחשפו לממס. ליטוש המשטח כל כך טוב שאפילו האיכות האופטית משופרת19.
כאשר המכשיר כבר מפוברק, זה חייב להיות מוכן לשמש immunoassay. שטיפה קולית של המכשיר היא בעלת חשיבות רבה כדי להסיר כל פסולת אקרילית לא רצויה שעלולה לסתום את הערוצים ולהפריע ל- immunoassay.
בנוסף, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לחסימה הנכונה של הערוצים כדי למנוע אינטראקציות לא ספציפיות ואותות רעש רקע גבוהים. חסימה עם 5% BSA הוכחה כמפחיתה את הרעש של קשירה לא ספציפית של נוגדנים בתעלות, ומספיקה שעה אחת של דגירה. מיקרו-חלקיקי הברזל מצופים בשכבת סיליקה-PEG כדי למנוע קשירה לא ספציפית בתוכם. יתר על כן, המיקרו-חלקיקים נחסמים באמצעות BSA (במקביל לתעלות) לפני שהם יוצרים את המלכודת במכשיר. דגירה של לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס טובה יותר, כלומר נדרש יום אחד לייצור ודגירה של המכשיר לפני החיסון החיסוני. הפחתת החספוס על ידי הכלורופורם וחסימת המשטחים כדי להפחית אינטראקציות לא ספציפיות הוכחו כעובדות בצורה יוצאת דופן, ומאפשרות לפלטפורמה זו להשיג גבול זיהוי דומה ל- ELISA סטנדרטי במודל חיסוני4.
היווצרות מלכודת המיקרו-חלקיקים בהגבלת המיקרו-ערוצים היא תהליך ידני. למרות שאין שליטה מדויקת על מספר המיקרו-חלקיקים הנכנסים, אנו מסתמכים על הערכה של אורך החלקיקים הדחוסים. ניתן להגדיל את המלכודת או להסיר את העודף בקלות. החלקיקים המושלכים מצטברים בערוץ הצדדי ואין צורך להסירם מהשבב. חיוני למנוע ממיקרו-חלקיקים לזרום לתעלה הראשית, מכיוון שהם יכולים לקיים אינטראקציה עם ננו-חלקיקים במעלה הזרם של המלכודת ולשנות את מדידות החיסון.
כהוכחת היתכנות, יישמנו זיהוי חיסוני של קומפלקס שנוצר על ידי חלבון ליזוזים המצומד לננו-חלקיקים בקוטר 100 ננומטר על ידי דגירה של הנוגדן הראשוני הספציפי והנוגדן המשני המתאים שכותרתו HRP. האימונוקומפלקס נוצר מחוץ למכשיר. עם זאת, ניתן לבצע את כל immunoassay בתוך המכשיר. התכונות המגנטיות של הננו-חלקיקים מאפשרות מניפולציה קלה עם מפריד מגנט קבוע ניאודימיום בעל ביצועים גבוהים. יש פשוט לשמור את מיקרו-צינורית התגובה למשך 15 דקות כדי לאפשר לננו-חלקיקים להימשך על ידי המגנט לדופן המיקרו-צינורית, מה שמקל על שלבי השטיפה של החיסון מחוץ למכשיר.
גולת הכותרת של מכשיר זה היא שהוא פשוט, מהיר (זמן בדיקה כולל של 40 דקות 4 לעומת4-6 שעות עבור ELISA), וזול (להשוות את המחיר של בדיקת זרימה לרוחב). כל התכונות הללו הופכות את פרופיל המכשיר הזה למועמד טוב לפיתוח POCT. בנוסף, המכשיר יכול לזהות באופן כמותי ריכוזי אנליטים בדומה לתקן הזהב ELISA4, שהוא בעל ערך רב למחקרים אפידמיולוגיים וקבלת החלטות בבריאות הציבור. בדרך כלל, למערכות מיקרופלואידיות לחיסוניות יש גבולות גילוי טובים אך זמני בדיקה ארוכים, או שיש להם זמני בדיקה קצרים אך גבולות לא אופטימליים של זיהוי4. על ידי שילוב של ננו-חלקיקים מגנטיים כתמיכה במערכת החיסון ואנזימים פלואורוגניים לזיהוי, לפלטפורמה זו יש זמן בדיקה קצר וגבול זיהוי טוב (בעבודות קודמות, מצאנו גבול זיהוי של 8 pg/mL באמצעות ביוטין כאנטיגן, הדומה ל-ELISA4 סטנדרטי). לבסוף, לטכנולוגיה זו יש יתרון חשוב על פני בדיקות זרימה לרוחב: האפשרות לתת תוצאות כמותיות ולא רק איכותיות ("כן" או "לא"). בניגוד לרוב המערכות המיקרופלואידיות האחרות שפותחו במעבדות בהן נעשה שימוש בחומרים נדירים, מערכת זו עשויה מאקריליק (PMMA), תרמופלסטי בעלות נמוכה התואם מאוד לייצור המוני של מכשירי אבחון רפואיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Conacyt, מקסיקו תחת מענק 312231 של "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación", ועל ידי AMEXCID ומשרד יחסי החוץ המקסיקני (SRE) תחת מענק "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO מודה לקונסיט מקסיקו על מלגת הדוקטורט שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R.
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
