Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

चुंबकीय नैनोपार्टिकल-आधारित इम्यूनोएसे के लिए एक क्रमबद्ध प्रतिबंध के साथ माइक्रोफ्लुइडिक ऐक्रेलिक डिवाइस का कंप्यूटर न्यूमेरिकल कंट्रोल माइक्रोमिलिंग

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63899
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (Cinvestav), 2Biomolecular Diversity Laboratory, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (Cinvestav)

Summary

माइक्रोफ्लुइडिक्स नैदानिक परीक्षणों के विकास के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, महंगे उपकरण और सामग्री, साथ ही श्रमसाध्य निर्माण और हैंडलिंग तकनीकों की अक्सर आवश्यकता होती है। यहां, हम कम लागत और सरल-से-उपयोग सेटिंग में चुंबकीय माइक्रो- और नैनोपार्टिकल-आधारित इम्यूनोएसे के लिए एक ऐक्रेलिक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के निर्माण प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं।

Abstract

माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम ने इम्यूनोएसे तकनीकों में काफी सुधार किया है। हालांकि, कई माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों को विशेष, महंगे या जटिल उपकरणों की आवश्यकता होती है, जिससे निर्माण महंगा हो जाता है और बड़े पैमाने पर उत्पादन के साथ असंगत हो जाता है, जो कम संसाधन सेटिंग्स में अपनाए जाने वाले पॉइंट-ऑफ-केयर टेस्ट (पीओसीटी) के लिए सबसे महत्वपूर्ण पूर्व शर्तों में से एक है। यह काम कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) माइक्रोमिलिंग तकनीक का उपयोग करके नैनोपार्टिकल-संयुग्मित एंजाइमेटिक इम्यूनोसे परीक्षण के लिए एक ऐक्रेलिक (पॉलीमेथिलमेथैक्रिलेट, पीएमएमए) डिवाइस की निर्माण प्रक्रिया का वर्णन करता है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के कामकाज को 100 एनएम चुंबकीय नैनोकणों के लिए संयुग्मित मॉडल एंटीजन के रूप में लाइसोजाइम का उपयोग करके एक वाणिज्यिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोसे का प्रदर्शन करके दिखाया गया है। यह उपकरण ऊंचाई में केवल 5 μm के भौतिक क्रमबद्ध प्रतिबंध को एकीकृत करता है, जिसका उपयोग चुंबकीय माइक्रोपार्टिकल्स को पकड़ने के लिए किया जाता है जो बाहरी चुंबक रखकर चुंबकीय जाल बनाते हैं। इस तरह, संयुग्मित नैनोकणों के इम्यूनोसपोर्ट पर चुंबकीय बल उन्हें पकड़ने और प्रवाह खींचने का विरोध करने के लिए पर्याप्त है। यह माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विशेष रूप से इम्यूनोएसे प्रदर्शन के लिए परिशुद्धता के नुकसान के बिना कम लागत वाले बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए उपयुक्त है।

Introduction

हाल के वर्षों में, माइक्रोफ्लुइडिक्स ने इम्यूनोसे तकनीक1 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। लघुकरण प्रौद्योगिकी में पारंपरिक इम्यूनोएसे की तुलना में कई उत्कृष्ट फायदे हैं, जैसे कि कम नमूना और अभिकर्मक खपत, कम इनक्यूबेशन समय, कुशल समाधान विनिमय, और उच्च एकीकरण और स्वचालन2।

इसके अलावा, इम्यूनोएसे में माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम, इम्यूनोसपोर्ट के रूप में चुंबकीय नैनोकणों के साथ मिलकर, इनक्यूबेशन गुना को काफी कम करते हैं, सतह-से-मात्रा अनुपात में वृद्धि के कारण उच्च पहचान संवेदनशीलता प्राप्त करतेहैं। कणों का ब्राउनियन आंदोलन एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स 4,5 के गठन के दौरान प्रतिक्रिया कैनेटीक्स में सुधार करता है। इसके अलावा, नैनोकणों के चुंबकीय गुण विभिन्न माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस कॉन्फ़िगरेशन में एकीकृत होने के लिए बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करते हैं, जिससे उन्हें लघु ऑन-चिप बायोसेंसिंग सिस्टम5 में सिग्नलिंग और अणु कैप्चर के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बना दिया जाता है। हालांकि, उच्च सतह-से-आयतन अनुपात 6 के कारण नैनोमीटर पैमाने पर चुंबकीय बल ड्रैग बलों की तुलना में काफी कमजोरहोते हैं। इसलिए, धोने और पहचान जैसे महत्वपूर्ण इम्यूनोएसे चरणों के लिए नैनोकणों को कैप्चर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और एक पारंपरिकचुंबक अपर्याप्त है।

नैनोकणों में हेरफेर करने का एक कुशल तरीका लोहे के माइक्रोपार्टिकल्स द्वारा गठित माइक्रोफ्लुइडिक चुंबकीय जाल का उपयोग है, जो एक माइक्रोफ्लुइडिक संरचना3 में पैक किए जाते हैं। इसलिए, जब एक बाहरी चुंबक आता है, तो चुंबकीय और प्रवाह बलों के बीच चुंबकित छिद्रपूर्ण माध्यम के भीतर एक जटिल बातचीत बनाई जाती है। नैनोकणों पर कार्य करने वाला चुंबकीय बल उन्हें पकड़ने और प्रवाह ड्रैग 3,4,7 का विरोध करने के लिए पर्याप्त मजबूत है। इस दृष्टिकोण के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों की आवश्यकता होती है जो माइक्रोपार्टिकल्स को बनाए रखने वाले माइक्रोमेट्रिक संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए कुछ माइक्रोमीटर के क्रम में संकल्प प्राप्त करते हैं।

वर्तमान माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीक कुछ माइक्रोन से सैकड़ों नैनोमीटर 8 तक संरचनाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन निर्माण की अनुमति देतीहै। हालांकि, इनमें से कई तकनीकों को विशेष, महंगे या जटिल उपकरणों की आवश्यकता होती है। मुख्य कठिनाइयों में से एक मोल्ड निर्माण के लिए एक क्लीनरूम की आवश्यकता है, जो महंगा और समय लेने वाला 8,9 है। हाल ही में, माइक्रोफ्लुइडिक इंजीनियरों ने विभिन्न प्रकार के वैकल्पिक निर्माण विधियों को विकसित करके इस कमी को दूर किया है, जैसे कि कम लागत, तेजी से टर्नअराउंड समय, सस्ती सामग्री और उपकरण, और बढ़ी हुई कार्यक्षमता8। इस तरह, नई माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों के विकास ने कम लागत वाले, गैर-क्लीनरूम विधियों को लाया जो 10 μm8 जितना कम संकल्प प्राप्त करते हैं। पैटर्निंग का उपयोग एक महंगे मोल्डिंग पैटर्न उत्पन्न किए बिना सीधे सब्सट्रेट पर किया जा सकता है, इस प्रकार समय लेने वाली प्रक्रिया से बचा जा सकता है। प्रत्यक्ष निर्माण विधियों में सीएनसी मिलिंग, लेजर एब्लेशन और डायरेक्ट लिथोग्राफी 8 शामिलहैं। ये सभी विधियां सामग्रियों की एक विस्तृत श्रृंखला में उच्च-पहलू-अनुपात चैनलों का उत्पादन करने के लिए उपयुक्त हैं, उनकी कठोरता9 की परवाह किए बिना, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में नए और लाभप्रद ज्यामिति, भौतिक व्यवहार औरगुणों को सक्षम करते हैं।

सीएनसी माइक्रोमिलिंग काटने वाले उपकरणों का उपयोग करके माइक्रोस्केल संरचनाएं बनाता है जो एक सब्सट्रेट से थोक सामग्री को हटाते हैं और माइक्रोफ्लुइडिकउपकरणों 10,11 के लिए एक प्रभावी निर्माण विधि है। माइक्रोमिलिंग तकनीक माइक्रोचैनलों और सुविधाओं को सीधे काम की सतह पर बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक अनुप्रयोगों में उपयोगी हो सकती है, जो एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती है: एक वर्कपीस को थोड़े समय (30 मिनट से कम) में बनाया जा सकता है, जिससे डिजाइन से प्रोटोटाइप12 तक टर्नअराउंड समय काफी कम हो जाता है। इसके अलावा, विभिन्न सामग्रियों, आकारों और आकृतियों के काटने के सामान की व्यापक उपलब्धता सीएनसी मिलिंग मशीनों को एक उपयुक्त उपकरण बनाती है जिसने कई प्रकार की कम लागत वाली डिस्पोजेबलसामग्री में विभिन्न विशेषताओं के निर्माण की अनुमति दी है।

माइक्रोमिलिंग में आमतौर पर उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों में, थर्मोप्लास्टिक्स अपने कई अनुकूल गुणों और जैविक अनुप्रयोगोंके साथ संगतता के कारण एक प्रमुख विकल्प बने हुए हैं। थर्मोप्लास्टिक्स माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के लिए एक आकर्षक सब्सट्रेट हैं क्योंकि कम लागत वाले, डिस्पोजेबल विश्लेषणात्मक प्रणालियोंको विकसित करने के लिए उनके महत्वपूर्ण फायदे हैं। इसके अलावा, ये सामग्रियां उच्च मात्रा वाली विनिर्माण प्रक्रियाओं के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं, जिससे उन्हें व्यावसायीकरण और बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए उपयुक्त बनाया जाता है। इन कारणों से, पीएमएमए जैसे थर्मोप्लास्टिक्स को माइक्रोफ्लुइडिक्स10 के शुरुआती वर्षों से विश्वसनीय और मजबूत सामग्री माना जाता है। थर्मोप्लास्टिक्स में बंद चैनलों को बनाने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जैसे विलायक बॉन्डिंग15, हीट बॉन्डिंग16, और पराबैंगनी (यूवी)/ओजोन सतह उपचार बॉन्डिंग17।

कई मामलों में, पारंपरिक माइक्रोमिलिंग मशीनों के साथ प्राप्त पोजिशनिंग रिज़ॉल्यूशन कुछ माइक्रोफ्लुइडिक अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त नहीं है जिनके लिए 10 μm से छोटी संरचनाओं की आवश्यकता होती है। हाई-एंड माइक्रोमिलिंग में पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन होता है। दुर्भाग्य से, उच्च कीमतों के कारण, इसका उपयोग मुट्ठीभर उपयोगकर्ताओं तक सीमित है। इससे पहले, हमारे शोध समूह ने कम लागत वाले उपकरण के निर्माण और हेरफेर की सूचना दी थी जो पारंपरिक मिलिंग मशीनों12 के संकल्प पर काबू पाने के लिए 10 μm से कम की मशीनिंग संरचनाओं की अनुमति देता है। फिक्स्चर सरल इलेक्ट्रॉनिक्स के साथ 3 डी प्रिंटिंग द्वारा निर्मित एक मंच है, जिसमें तीन पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर होते हैं। सतह में हिंज के आकार के जोड़ होते हैं जो पीजोइलेक्ट्रिक तत्वों के एक साथ कार्य करने पर इसे उठाने की अनुमति देते हैं। जेड-अक्ष विस्थापन को 500 एनएम के रिज़ॉल्यूशन और ±1.5 μm12 की सटीकता के साथ नियंत्रित किया जा सकता है।

यह पेपर एक माइक्रोमिलिंग तकनीक के माध्यम से ऐक्रेलिक डिवाइस (पीएमएमए) की विनिर्माण प्रक्रिया के चरणों को प्रस्तुत करता है। चिप डिजाइन में अभिकर्मकों के प्रवाह को शुद्ध करने के लिए एक मुख्य चैनल 200 μm चौड़ा और 200 μm ऊंचा और समान आयामों के साथ एक साइड चैनल होता है। मध्य क्षेत्र में, चैनल को केवल 5 μm ऊंचाई के भौतिक प्रतिबंध द्वारा बाधित किया जाता है, जो इस समूह12 द्वारा बनाए गए 3D-मुद्रित पीज़ोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म के साथ बनाया गया है, चुंबकीय माइक्रोपार्टिकल्स को पकड़ने के लिए जो बाहरी चुंबक रखकर नैनोकणों के लिए चुंबकीय जाल बनाते हैं। हम 100 एनएम चुंबकीय नैनोकणों के लिए संयुग्मित मॉडल एंटीजन के रूप में लाइसोजाइम का उपयोग करके एक वाणिज्यिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोसे का प्रदर्शन करके माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के संचालन को दिखाते हैं। यह उपकरण विभिन्न विशेषताओं को जोड़ता है जो इसे अद्वितीय बनाते हैं4: प्रतिरक्षा समर्थन के रूप में चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग कुल परीक्षण समय को घंटों से मिनटों तक कम कर देता है; पता लगाने के लिए एक फ्लोरोजेनिक एंजाइम का उपयोग करने से पता लगाने की सीमा ओं की अनुमति मिलती है जो मानक एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (ईएलआईएसए) के बराबर हैं; और एक निर्माण सामग्री के रूप में थर्मोप्लास्टिक का उपयोग इसे बड़े पैमाने पर उत्पादन के साथ संगत बनाता है, जो पिछले माइक्रोफ्लुइडिक नैनोकणों के चुंबकीय जाल3 के लिए मामला नहीं था, और इसे पीओसीटी विकसित करने के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. माइक्रोमिलिंग

  1. सतह पीसना
    1. माइक्रोमिलिंग मशीन और पीजोइलेक्ट्रिक नियंत्रक चालू करें। अपने संबंधित नियंत्रण सॉफ्टवेयर12 शुरू करें।
    2. आवश्यक अंत मिल बिट्स (200 μm और 800 μm व्यास) का चयन करें। उन्हें मिलिंग मशीन के उपयुक्त डिब्बे में रखें (चित्रा 1)।
    3. 1.3 मिमी मोटी पीएमएमए के 9 मिमी x 25 मिमी आयताकारों को 800 μm एंड मिल बिट के साथ काटें। इन आयतों में से एक को दो तरफा चिपकने वाले टेप के साथ ध्यान से पीजोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म (चित्रा 2) में संलग्न करें।
      नोट: ऐक्रेलिक आयत को हमेशा एक ही स्थिति में रखना सुनिश्चित करें ताकि कोनों में से एक मशीनिंग के लिए एक्स- और वाई-अक्षों पर मूल निर्देशांक के साथ मेल खाए।
    4. कनेक्ट करें और पीएमएमए आयत की सतह पर जेड-सेंसर रखें। डिटेक्शन पिन का चयन करें और इसे सेंसर की सतह पर ले जाएं। सेंसर से संपर्क किए बिना पिन को मैन्युअल रूप से कम करें। Z0 सेंसिंग मोड को सक्रिय करें (चित्रा 3)।
    5. 200 μm एंड मिल बिट का चयन करें और इसे x, y मूल पर ले जाएं। जेड-सेंसर को हटा दें। ऐक्रेलिक सतह से संपर्क किए बिना बिट को सावधानी से कम करें।
    6. 14,500 आरपीएम पर 200 μm एंड मिल बिट स्पिन करें। धीरे-धीरे इसे z-अक्ष (z = 0) पर मूल समन्वय तक कम करें। मूल के नीचे z-अक्ष 30 μm रीसेट करें। इस समन्वय को नए z-मूल के रूप में सेट करें।
      नोट: यदि यह घूम नहीं रहा है तो बिट को कभी कम न करें। अन्यथा, यह टूटने का खतरा है।
    7. कट पैनल को सक्रिय करने के लिए माइक्रोमिलिंग मशीन सॉफ्टवेयर में कट बटन पर क्लिक करें। ऐड बटन पर क्लिक करें और ऐक्रेलिक सतह को पीसने के लिए पहले से बनाए गए कोड के साथ .txt फ़ाइल (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) का चयन करें। प्रक्रिया शुरू करने के लिए आउटपुट बटन पर क्लिक करें।
    8. अंत मिल बिट को समन्वय में लाएं जहां प्रतिबंध मशीनीकृत किया जाएगा। पॉज बटन पर क्लिक करके इस निर्देशांक तक पहुंचने के बाद एंड मिल बिट को जमीन की सतह से उठाने से रोकें। अन्यथा, मैन्युअल रूप से इस निर्देशांक (चित्रा 4 ए) के लिए अंतिम मिल बिट को पुनर्स्थापित करें।
  2. 5 μm प्रतिबंध की मिलिंग
    1. अंत मिल बिट के रोटेशन की गति 11,000 आरपीएम पर सेट करें। पीजोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म (पूरक चित्रा एस 1) के इंटरफ़ेस के साथ प्लेटफ़ॉर्म 6.5 μm बढ़ाएं। Y-अक्ष के साथ अंतिम मिल बिट को 500 μm से स्थानांतरित करें। नियंत्रण इंटरफ़ेस के साथ जेड-अक्ष पर पीजोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म को उसके प्रारंभिक मूल्य पर वापस लाएं।
  3. माइक्रोचैनलों की मिलिंग
    1. डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर (पूरक डिज़ाइन फ़ाइल 1) से पहले बनाई गई डिज़ाइन फ़ाइल खोलें। प्रिंट बटन पर क्लिक करें। गुण मेनू तक पहुंचें और मशीनीकृत किए जाने वाले डिज़ाइन वाली परत के अनुरूप रंग विंडो पर क्लिक करें। पूरक चित्रा एस 2 में निर्दिष्ट टूल पैनल में निर्माण पैरामीटर सेट करें।
    2. उपकरण पुल-डाउन मेनू में कोई विकल्प नहीं चुनकर अवांछित परतों को निष्क्रिय करें।
  4. छेदों की मिलिंग
    1. 800 μm एंड मिल बिट पर स्विच करें। संबंधित रंग विंडो पर क्लिक करके 1.2 मिमी व्यास छेद की डिजाइन परत को सक्रिय करें।
    2. चरण 1.3.2 दोहराएं, लेकिन इस मामले में, छेद के लिए पूरक चित्रा एस 3 ए में वर्णित संबंधित निर्माण पैरामीटर सेट करें।
      नोट: मशीन छेद की गहराई ऐक्रेलिक मोटाई का आधा है।
    3. मशीन ने आयत के विपरीत कोनों पर एक नए मंच पर उल्टे तरीके से ऐक्रेलिक के संरेखण के लिए दो अतिरिक्त छेद किए (चित्रा 4 बी)। पीजोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म से ऐक्रेलिक आयत को छील लें। ऐक्रेलिक को फ्लिप करें और इसे मशीनी स्तंभों (चित्रा 4 सी, डी) के साथ एडाप्टर पर डबल-साइडेड चिपकने वाला टेप के साथ टेप करें।
    4. डिजाइन सॉफ्टवेयर (पूरक डिजाइन फ़ाइल 2) से विपरीत चेहरे के लिए छेद के डिजाइन के साथ फ़ाइल खोलें। पूरक चित्रा एस 3 बी में वर्णित संबंधित निर्माण पैरामीटर सेट करें। 1.5 मिमी के व्यास और 0.7 मिमी की गहराई के साथ अभिकर्मक इनलेट और आउटलेट छेद के शेष आधे हिस्से को मिलाएं (पूरक चित्रा एस 3 सी)।

Figure 1
चित्र 1: एंड मिल बिट प्लेसमेंट। (A) 200 μm और 800 μm एंड मिल बिट्स को स्टील सपोर्ट के लिए एक स्क्रू के माध्यम से रखा और तय किया जाता है। (बी) प्रत्येक एंड मिल बिट को स्वचालित चयन के लिए माइक्रोमिलिंग मशीन के विशिष्ट डिब्बे में रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पीजोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म। मंच 3 डी प्रिंटिंग द्वारा निर्मित है और इसमें दो हेक्सागोनल बेस होते हैं जो हिंज से जुड़े होते हैं जो तीन पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर द्वारा नियंत्रित जेड-अक्ष में एक ठीक विस्थापन की अनुमति देते हैं। एक ऐक्रेलिक एडाप्टर भी देखा जाता है, जिस पर पीएमएमए आयत जुड़ी होती है, और जो निर्देशांक के संरेखण कोने की स्थापना की अनुमति देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: जेड-अक्ष अंशांकन। जेड-अक्ष अंशांकन के चरण विस्तृत हैं। (ए) जेड-सेंसर में एक केबल शामिल है जो माइक्रोमिलिंग मशीन में प्लग करता है। (बी) सेंसर को मशीनीकृत करने के लिए सीधे सतह पर रखा जाता है। (सी) डिटेक्शन पिन में एक धातु की पट्टी होती है जिसे अंत मिल बिट्स के बगल में एक विशेष डिब्बे में रखा जाता है। (डी) जब दोनों सामान संपर्क में आते हैं, तो माइक्रोमिलिंग मशीन स्वचालित रूप से जेड-अक्ष पर मूल समन्वय की गणना करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: संशोधित ऐक्रेलिक सतह। (A) 200 μm व्यास का एंड मिल बिट ऐक्रेलिक आयत की पूरी सतह को साफ करता है, लगभग 30 μm ऊंची परत को हटा देता है। (बी) छवि पहले से संशोधित ऐक्रेलिक के चेहरे पर मिली विभिन्न संरचनाओं को दिखाती है। अभिकर्मक इनलेट और आउटलेट के लिए चैनल और छेद देखे जाते हैं। 5 μm प्रतिबंध को नग्न आंखों से नहीं देखा जा सकता है। (सी) संरेखण छेद के साथ माइक्रोमिल्ड सतह और विपरीत कोनों पर संरेखण स्तंभों के साथ एडाप्टर। (डी) ऐक्रेलिक को स्तंभों के साथ एडाप्टर पर उल्टा संरेखित किया जाता है, जिसमें संरेखण छेद फिट होते हैं। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. चैनल सीलिंग

  1. ऐक्रेलिक सफाई
    1. स्तंभ एडाप्टर प्लेटफॉर्म से ऐक्रेलिक आयत निकालें। एक और अनमशीन्ड ऐक्रेलिक आयत लें। दोनों ऐक्रेलिक शीट को आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) के साथ धोएं और आसुत जल से कुल्ला करें। दस्ताने पहनें और आईपीए के संपर्क से बचें।
    2. ऐक्रेलिक को 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक स्नान में डुबोएं (चित्रा 5 ए, बी)।
  2. गैसीय क्लोरोफॉर्म एक्सपोजर
    1. दोनों ऐक्रेलिक शीट को पूरी तरह से सुखाएं। उन्हें दो तरफा टेप के साथ ग्लास पेट्री डिश ढक्कन के अंदर टेप करें। मशीन चैनल के किनारे को उजागर करना सुनिश्चित करें (चित्रा 5 सी)। दस्ताने पहनें और ऐक्रेलिक सतह को सीधे छूने से बचें।
    2. ग्लास पेट्री डिश के आधार को एक बड़े ग्लास पेट्री डिश (चित्रा 5 डी) के अंदर रखें। पेट्री डिश के आधार में 1 एमएल क्लोरोफॉर्म डालें। जल्दी से ढक्कन को आंतरिक पक्ष से जुड़े ऐक्रेलिक शीट के साथ रखें।
    3. पेट्री डिश ढक्कन के स्तर तक बड़े पेट्री डिश के आधार पर तुरंत आसुत पानी जोड़ें। ऐक्रेलिक को 1 मिनट के लिए क्लोरोफॉर्म गैस के संपर्क में आने दें (चित्रा 5 ई)।
      नोट: विचार करें कि क्लोरोफॉर्म के लिए एक लंबा एक्सपोजर समय ऐक्रेलिक सतह पर हमला करेगा, और 5 μm प्रतिबंध पिघल जाएगा, इसकी ऊंचाई को संशोधित करेगा, या पूरी तरह से गायब हो जाएगा।
    4. बनाई गई पानी की सील को तोड़ने के लिए पेट्री डिश को झुकाएं। पेट्री डिश को उजागर करके क्लोरोफॉर्म से ऐक्रेलिक को तुरंत हटा दें। सावधान रहें कि पानी न बहे।
      सावधानी: इस प्रक्रिया को फ्यूम हुड में करें और दस्ताने का उपयोग करें क्योंकि क्लोरोफॉर्म अत्यधिक विषाक्त है।
  3. दबाकर और गर्म करके संबंध बनाना
    1. डबल-साइडेड टेप से दोनों ऐक्रेलिक प्लेटों को छील लें।
    2. दोनों ऐक्रेलिक्स को उन पक्षों के साथ संरेखित करें जो गैसीय क्लोरोफॉर्म के संपर्क में थे, जिससे एक सैंडविच बनता है। ऐक्रेलिक्स को प्रेस में 18 kgf/cm2 और 90 °C के तापमान पर रखें (चित्र 5F, G)।
      नोट: ऐक्रेलिक अनुदैर्ध्य रूप से संरेखित करने और बेहतर सील के लिए 2 मिनट के बाद इसके संरेखण को बदलने की सिफारिश की जाती है। यदि, इस समय के बाद, सील अपर्याप्त है, तो इसे 1 मिनट से अधिक के अंतराल के लिए प्रेस में वापस रखें। स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके, चैनलों की स्थिति और प्रतिबंध की जांच करें। विचार करें कि, दबाव के समय से अधिक होने के मामले में, प्रतिबंध को समाप्त करने का जोखिम है।
  4. नली अनुलग्नक
    1. नली की लंबाई 2-3 सेमी काट लें। पूरी तरह से सीधा कट बनाएं। प्रत्येक नली को तत्काल सुखाने वाले तरल चिपकने वाले (चित्रा 6 ए) के साथ डिवाइस के छेद से संलग्न करें। चिपकने वाले को चिप के अंदर जाने से रोकें।

Figure 5
चित्र 5: डिवाइस की सीलिंग प्रक्रिया। (A) ऐक्रेलिक शीट्स में से प्रत्येक को आसुत पानी के साथ एक पुनर्जल योग्य बैग में रखा जाता है और अल्ट्रासोनिक स्नान में डुबोया जाता है। (B) बाईं ओर की छवि निर्माण के ठीक बाद चैनल दिखाती है, और दाईं ओर की छवि IPA और अल्ट्रासोनिक स्नान से धोने के बाद उसी उपकरण को दिखाती है। जो माइक्रोचैनल से सभी अशुद्धियों और ऐक्रेलिक अवशेषों को हटा देता है। प्रतिबंध के किनारे जो 200 μm के केंद्रीय चैनल को बाधित करते हैं, देखे जाते हैं, जो सफल मिलिंग प्रक्रिया की पुष्टि करता है। स्केल सलाखों = 500 μm. (C) दोनों ऐक्रेलिक को सुखाया जाता है और ढक्कन पर ग्लास प्लेटफॉर्म का पालन किया जाता है। (डी) पेट्री डिश का आधार बड़े व्यास के एक अन्य पकवान के अंदर रखा गया है। (ई) पेट्री डिश को बंद करते समय, पानी की सील गैसीय क्लोरोफॉर्म को बाहर निकलने से रोकती है। (एफ) 5 किलो के वजन के साथ लीवर के तत्वों का विवरण। (जी) खुले लीवर की छवि, लाल रंग में उस क्षेत्र को दिखाती है जहां ऐक्रेलिक रखा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. डिवाइस तैयारी

  1. एक सिरिंज का उपयोग करके आसुत जल के साथ चैनलों को भरें। सुनिश्चित करें कि प्रवाह के लिए कोई रिसाव या प्रतिरोध नहीं है। चैनलों के अंदर किसी भी शेष ऐक्रेलिक, चिपकने वाला या अवांछित सामग्री को हटाने के लिए डिवाइस को 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक स्नान में डुबोएं।
  2. डिवाइस चैनलों के अंदर पानी खाली करें। 5% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ तैयार एक ब्लॉकिंग समाधान पेश करने के लिए सिरिंज का उपयोग करें, जिसे 1x Tris-बफर्ड सलाइन (TBS) में पतला किया गया है और पहले 0.2 μm पॉलीएथरसल्फोन (PES) सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया है।
  3. 5% बीएसए में 7.5 μm व्यास के लोहे के माइक्रोपार्टिकल्स का निलंबन तैयार करें।
    नोट: माइक्रोपार्टिकल्स को पहले सिलिका-पॉलीथीनग्लाइकोल (पीईजी) परत के साथ कार्यात्मक किया जाता है जो प्रोटीन अवशोषण के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है।
  4. कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए ब्लॉकिंग समाधान के साथ चिप और माइक्रोपार्टिकल निलंबन को इनक्यूबेट करें। यदि संभव हो, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अवरुद्ध करने की अनुमति दें।

4. माइक्रोपार्टिकल ट्रैप गठन

  1. साइड चैनल आउटलेट नली के माध्यम से सिरिंज सुई के साथ चिप में माइक्रोपार्टिकल्स डालें। चिप को लंबवत रखें और साइड चैनल के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण के प्रभाव के तहत माइक्रोपार्टिकल्स को बहने दें। चिप को 90° के दो चरणों में 180° घुमाएं और माइक्रोपार्टिकल्स को 5 μm प्रतिबंध पर लक्षित और कॉम्पैक्ट करने की अनुमति दें।
  2. साइड चैनल की ओर 45° घूमने वाले गुरुत्वाकर्षण द्वारा अतिरिक्त माइक्रोपार्टिकल्स को हटा दें।
  3. माइक्रोपार्टिकल ट्रैप को पूर्ववत करने से बचने के लिए डिवाइस को सीधा रखें। माइक्रोपार्टिकल ट्रैप गठन प्रक्रिया के सारांश के लिए चित्रा 6 बी देखें।

5. इम्यूनोएसे

  1. नैनोपार्टिकल तैयारी
    1. लाइसोजाइम (एंटीजन मॉडल) के साथ संयुग्मित 100 एनएम नैनोकणों के निलंबन का 2 μL लें। इसे ब्लॉकिंग समाधान के 100 μL के साथ 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. वॉश बफर के 150 μL जोड़ें (1x TBS, 0.05% ट्वीन 20)।
    3. चुंबकीय विभाजक में 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें। नैनोकणों के पृथक्करण की अनुमति देने के लिए 15 मिनट तक रखें (पूरक चित्रा एस 4)।
      नोट: चुंबकीय विभाजक के लिए न्यूनतम आयतन 200 μL है। छोटी मात्रा का उपयोग करने से बचें।
    4. माइक्रोपिपेट के साथ ट्यूब से तरल निकालें। ट्यूब की दीवार के संपर्क से बचें जहां नैनोपार्टिकल गोली का गठन किया गया था।
    5. ताजा वॉश बफर के 250 μL जोड़ें। ट्यूब को 15 मिनट के लिए आंदोलन के तहत रखें।
    6. चरण 5.1.3.-5.1.5 दोहराएँ। 2 गुना अधिक, केवल 5 मिनट के लिए हिलाएं।
    7. प्राथमिक एंटी-लाइसोजाइम एंटीबॉडी की वांछित एकाग्रता जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। एंटीबॉडी डिल्यूएंट (1x TBS, 1% बीएसए, 0.05% ट्वीन 20) में 100 μL की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर अतिरिक्त 15 मिनट के लिए हिलते रहें।
    9. वाशिंग चरण 5.1.2.-5.1.6 दोहराएँ।
    10. एंटीबॉडी डिल्यूएंट के 100 μL जोड़ें। हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-युग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (एचआरपी-एबीआईआई) जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) 1: 500 के कमजोर पड़ने पर।
    11. वाशिंग चरण 5.1.2.-5.1.6 दोहराएँ।
    12. नैनोकणों को एंटीबॉडी डिल्यूएंट के 50 μL की अंतिम मात्रा में रखें।

6. प्रायोगिक माउंटिंग

  1. पानी के साथ दो 100 μL ग्लास सिरिंज भरें, प्रत्येक सिरिंज से 6.5 सेमी लंबी नली कनेक्ट करें, नली के अंत में एक धातु पिन डालें, और दोनों सिरिंज को कंप्यूटर-नियंत्रित सिरिंज पंप पर रखें।
  2. गर्मी के साथ ऐक्रेलिक डिवाइस के सभी नली को सील करें।
  3. इनलेट नली को काटें और केवल कुछ मिलीमीटर रखें। वितरण सुई को वॉश बफर से भरें और इसे कटी हुई नली में डालें। डिवाइस तक हवा की पहुंच को रोकने के लिए सुई को डिवाइस से कनेक्ट करने से पहले समाधान को ड्रिप करने की अनुमति दें।
  4. पार्श्व चैनल से आउटलेट नली काटें। सिरिंज पंप से कनेक्ट करें। इसके बाद, मुख्य चैनल आउटलेट नली के लिए एक ही प्रक्रिया करें।
    नोट: चरण 6.3.-6.4 निष्पादित करना महत्वपूर्ण है। इस क्रम में माइक्रोपार्टिकल ट्रैप को अनपैक करने से बचने के लिए। यदि संभव हो, तो मैग्निफाइंग ग्लास की मदद से इन चरणों के दौरान जाल की स्थिति को सत्यापित करें।
  5. माइक्रोस्कोप स्टेज पर एक ग्लास स्लाइड रखें। चुंबक को डबल-साइडेड टेप के साथ स्लाइड में संलग्न करें और चिप किनारों को ग्लास में ठीक करने के लिए प्रत्येक तरफ टेप का एक छोटा टुकड़ा रखें।
  6. सिरिंज पंप नियंत्रक में प्रवाह दर और इकाइयों टैब के माध्यम से 50 μL / h की प्रवाह दर सेट करें। निकासी मोड का चयन करें और वॉश बफर के प्रवाह को सक्रिय करने के लिए स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
  7. सावधानी से, क्षैतिज तरीके से चुंबक के साथ स्लाइड की ओर डिवाइस से संपर्क करें ताकि जाल युक्त चिप का क्षेत्र चुंबक से संपर्क करे।
  8. आंदोलन को रोकने के लिए डिवाइस के किनारों को डबल-साइडेड टेप के साथ ग्लास से चिपकाएं। माइक्रोस्कोपी के लिए ऑप्टिकल पथ को बाधित करने से बचें (चित्रा 6 सी)।

Figure 6
चित्रा 6: अंतिम डिवाइस कॉन्फ़िगरेशन. (A) संबंधित इनपुट और आउटपुट से जुड़ी नली के साथ ऐक्रेलिक डिवाइस. पैमाना सेंटीमीटर में डिवाइस के आयामों को दर्शाता है। (बी) माइक्रोपार्टिकल ट्रैप के गठन के लिए प्रोटोकॉल। जब डिवाइस को ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखा जाता है तो माइक्रोपार्टिकल्स गुरुत्वाकर्षण द्वारा चैनल के माध्यम से प्रवाहित होते हैं। माइक्रोपार्टिकल्स 5 μm प्रतिबंध पर केंद्रित हैं। साइड चैनल के माध्यम से चिप को घुमाकर अतिरिक्त माइक्रोपार्टिकल्स को आसानी से हटा दिया जाता है। इम्यूनोएसे से पहले जाल को संरक्षित करने के लिए चिप को ऊर्ध्वाधर रखा जाता है। (सी) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस एक ग्लास स्लाइड पर लगाया गया है जिसमें चुंबक होता है, उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के चरण पर। डिस्पेंसिंग सुई जिसके माध्यम से अभिकर्मकों को जोड़ा जाता है, साथ ही आउटलेट नली जो सिरिंज पंप से जुड़ती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7. इम्यूनोडिटेक्शन

  1. अतिरिक्त बीएसए को हटाने के लिए वॉश बफर को 10 मिनट के लिए 50 μL / घंटा पर प्रवाहित करें।
  2. माइक्रोपिपेट के साथ वितरण सुई से शेष वॉश बफर को हटा दें। नैनोपार्टिकल सस्पेंशन के 50 μL जोड़ें।
  3. नैनोकणों के निलंबन को 7 मिनट के लिए 100 μL / h की प्रवाह दर पर प्रवाहित करें। इसके बाद, प्रवाह दर को 50 μL / h में बदलें और एक और 15 मिनट के लिए प्रवाह करें।
  4. वितरण सुई बदलें। वॉश बफर को 10 मिनट के लिए 50 μL/h पर प्रवाहित करें। वाशिंग स्टेप के दौरान निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट तैयार करें।
  5. माइक्रोपिपेट के साथ वितरण सुई से शेष वॉश बफर को हटा दें। फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट के 100 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट को 6 मिनट के लिए 50 μL/ h पर प्रवाहित करें।
  6. प्रवाह दर (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h, और 10 μL/h) और समय (6 मिनट) माप पैरामीटर संबंधित प्रवाह दर में सेट करें और सिरिंज पंप को नियंत्रित करने वाले इंटरफ़ेस के टाइमर टैब सेट करें । प्रदर्शन किए जाने वाले प्रत्येक माप के लिए निकासी मोड का चयन करना सुनिश्चित करें।
  7. वॉश स्टेप के लिए 50 μL/h पर एक अतिरिक्त फ्लो रेट टैब सेट करें और टाइमर को 3 मिनट पर सेट करें।
  8. सब्सट्रेट के 50 μL / h पर रुकने से 15 सेकंड पहले माइक्रोस्कोप की प्रतिदीप्ति चालू करें। माइक्रोस्कोप कैमरा के सॉफ्टवेयर के साथ छवि कैप्चर शुरू करें 10 सेकंड पहले सब्सट्रेट 1,000 मिलीसेकंड के एक्सपोज़र समय के साथ बंद हो जाता है। 1 फ्रेम /एस (एफपीएस) पर 6 मिनट के लिए इमेजिंग करें।
  9. 50 μL / h पर सब्सट्रेट वॉश प्रवाह दर बंद होने के तुरंत बाद वांछित प्रवाह दर पैरामीटर के प्रारंभ बटन पर क्लिक करें। चयनित माप प्रवाह बंद होने के तुरंत बाद वॉश फ्लो (50 μL/h) के स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
  10. सब्सट्रेट के फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए छवि कैप्चर को रोकें और माइक्रोस्कोप की प्रतिदीप्ति को बंद करें।
  11. चरण 7.8.-7.10 दोहराएँ। उपयोग किए गए प्रत्येक माप प्रवाह दर के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निर्माण प्रोटोकॉल स्थापित करना संभव था जो पारंपरिक माइक्रोमिलिंग तकनीक के संकल्प में सुधार करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, ऊंचाई में 5 μm जितने छोटे चैनल का निर्माण जो 200 μm उच्च चैनल में एक क्रमबद्ध प्रतिबंध के रूप में संचालित होता है, प्राप्त किया जाता है। स्टैगर्ड प्रतिबंध का सरल डिजाइन 7.5 μm व्यास के लोहे के माइक्रोपार्टिकल्स को कैप्चर करता है, जो माइक्रोचैनल में कॉम्पैक्ट होने पर, एक चुंबकीय जाल के निर्माण की अनुमति देता है जब एक बाहरी चुंबक डिवाइस के पास आता है। यह उपकरण इम्यूनोएसे को इम्यूनोलॉजिकल समर्थन के रूप में रुचि के विश्लेषण के साथ संयुग्मित नैनोकणों का उपयोग करके करने की अनुमति देता है। इस काम में, एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी-आधारित पहचान के साथ गैर-प्रतिस्पर्धी अप्रत्यक्ष इम्यूनोएसे किए गए थे। मॉडल एंटीजन (एजी) लाइसोजाइम प्रोटीन था जो 100 एनएम व्यास के नैनोकणों (एनपी) से संयुग्मित था। खरगोश एंटी-लाइसोजाइम आईजीजी का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी (एबीआई) के रूप में किया गया था और खरगोश हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (एचआरपी-एबीआईआई) का उपयोग करके पता लगाया गया था।

ट्रैप से गुजरने पर फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट के साथ एचआरपी-एबीआईआई की बातचीत के बाद प्राप्त प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता में परिवर्तन को सहसंबंधित करके पता लगाया गया था। माप करने के लिए, जाल से पहले एक क्षेत्र और बाद का क्षेत्र निर्धारित किया गया था। चित्र 7ए-डी एंटी-लाइसोजाइम एबी की विभिन्न सांद्रता के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि को दर्शाता है: 0 एनजी / एमएल, 10 एनजी / एमएल, 100 एनजी / एमएल, और 1,000 एनजी / एमएल किसी दिए गए फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट प्रवाह दर (3 μL / h) के लिए। इससे पता चलता है कि सब्सट्रेट फ्लोरेसेंस में परिवर्तन सीधे उपयोग किए गए एबीआई की एकाग्रता के आनुपातिक है।

Figure 7
चित्रा 7: प्रतिदीप्ति माप क्षेत्र। फ्लोरेसेंस माप प्राथमिक एंटी-लाइसोजाइम एंटीबॉडी की विभिन्न सांद्रता के लिए दिखाए गए हैं: (ए) 0 एनजी / एमएल, (बी) 10 एनजी / एमएल, (सी) 100 एनजी / एमएल, और (डी) 1,000 एनजी / एमएल। नीले घेरे 5 μm ऊंचाई प्रतिबंध द्वारा गठित जाल से पहले और बाद में प्रतिदीप्ति माप के क्षेत्र को दिखाते हैं, जहां सब्सट्रेट HRP-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करता है। सभी छवियां 3 μL / h के प्रवाह के अनुरूप हैं। संक्षिप्त नाम: एचआरपी = हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हालांकि, किसी दिए गए एबीआई एकाग्रता के लिए, प्राप्त प्रतिदीप्ति का स्तर फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट के लिए उपयोग की जाने वाली प्रवाह दर का एक कार्य है। इस प्रकार, एचआरपी एंजाइम द्वारा इस सब्सट्रेट की रूपांतरण क्षमता प्रवाह दर के व्युत्क्रमानुपाती है। 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h, और 10 μL/h की विभिन्न सब्सट्रेट प्रवाह दरों का मूल्यांकन किया गया। प्रत्येक प्रयोग के लिए, चुंबकीय जाल से गुजरने से पहले और बाद में सब्सट्रेट द्वारा दिए गए प्रतिदीप्ति में अंतर के अनुरूप वक्र प्राप्त किए गए थे। चित्र 8A-C तीन अलग-अलग प्रवाह दरों के लिए 100 ng/mL की सांद्रता के लिए प्राप्त वक्रों को दर्शाता है: (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h, और (C) 1 μL/h। उपयोग की गई प्रवाह दर के आधार पर, चुंबकीय जाल में रखे गए एचआरपी-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा सब्सट्रेट की रूपांतरण क्षमता भिन्न होती है। हरा वक्र जाल में स्थित एचआरपी द्वारा रूपांतरण के बाद सब्सट्रेट की प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। यह देखा जा सकता है कि, उच्च प्रवाह पर, प्राप्त प्रतिदीप्ति का अधिकतम स्तर क्षय होता है। सब्सट्रेट के जाल तक पहुंचने से पहले लाल वक्र बेसल फ्लोरेसेंस का प्रतिनिधित्व करता है। जाल के इस क्षेत्र में सब्सट्रेट फ्लोरेसेंस का माप स्थिर रहता है, और इसका मूल्य गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन की डिग्री पर निर्भर करता है यदि चैनल की सतह का कोई कुशल अवरोध नहीं है। हमने नीले वक्र द्वारा दर्शाए गए दोनों वक्रों के बीच अंतर की गणना की।

Figure 8
चित्र 8: प्रतिदीप्ति वक्र। प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 एनजी / एमएल की एकाग्रता और (ए) 10 μL / h, (B) 3 μL / h, और (C) 1 μL / h की प्रवाह दर पर प्राप्त ग्राफ। तीन रंगीन वक्र जाल (लाल वक्र) से पहले और जाल (हरे वक्र) के बाद मापी गई प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं और समय के साथ दो (नीले वक्र) के बीच का अंतर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 9 ए-सी (ए) 0 एनजी / एमएल, (बी) 10 एनजी / एमएल, और (सी) 1,000 एनजी / एमएल के एबीआई सांद्रता के लिए विभिन्न प्रवाहों के लिए इम्यूनोरिएक्शन से पहले और बाद में मापे गए प्रतिदीप्ति अंतर वक्रों को एकीकृत करता है। 0 μL / h की प्रवाह दर के लिए माप स्थिर परिस्थितियों में इम्यूनोरिएक्शन के माप को इंगित करता है जहां प्रसार नियंत्रित होता है। 1,000 एनजी / एमएल की एकाग्रता के लिए, प्रतिदीप्ति मूल्यांकन किए गए सभी प्रवाहों के लिए संतृप्त होती है। हालांकि, विभिन्न प्रवाहों पर प्रतिदीप्ति का क्रमबद्ध पैटर्न सब्सट्रेट के प्रसार के कारण होता है, जो इतनी उच्च रूपांतरण दर के साथ प्रतिक्रिया करता है कि यह छोटे प्रवाह को दूर करता है। इस प्रकार, जाल के अपस्ट्रीम क्षेत्र में इस प्रतिदीप्ति की वापसी होती है।

Figure 9
चित्रा 9: प्रतिदीप्ति अंतर अनुपात। (ए) 0 एनजी /एमएल, (बी) 10 एनजी / एमएल, और (सी) 1,000 एनजी / एमएल पर उपयोग किए जाने वाले विभिन्न फ्लक्स के लिए प्रतिदीप्ति अंतर (बाद-पहले) के संक्षेप ति वक्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस उपकरण के साथ प्राप्त माप एक मॉडल एंटीजन के रूप में लाइसोजाइम के साथ किए गए इम्यूनोएसे के लिए एक मानक अंशांकन वक्र उत्पन्न करना संभव बनाते हैं। चित्रा 10 चुंबकीय जाल में किए गए इम्यूनोरिएक्शन से पहले और बाद में प्रतिदीप्ति के बीच अंतर के अधिकतम मूल्यों से प्राप्त अंशांकन वक्र को दर्शाता है। यह प्रोटोकॉल 1 μL / h और 10 μL / h के बीच प्रवाह का उपयोग करके नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर के क्रम में सांद्रता के साथ प्राथमिक एंटी-लाइसोजाइम एंटीबॉडी का पता लगाने की अनुमति देता है। 1 μL / h पर उच्च परिवर्तनशीलता और उच्च प्रतिदीप्ति स्तर बताते हैं कि इम्यूनोकॉम्प्लेक्स की प्रतिक्रियाशीलता ऐसी है कि यह दर प्रतिक्रिया करने वाले सब्सट्रेट के प्रवाह के पक्ष में नहीं है और जाल के ठीक बाद जमा हो जाती है, इस तथ्य के अलावा कि डिवाइस का प्रतिरोध इस प्रवाह दर के लिए डिवाइस के रिज़ॉल्यूशन को कम करता है।

Figure 10
चित्रा 10: अंशांकन वक्र। ग्राफ प्रत्येक प्रवाह दर के लिए उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी (एबी 1) की एकाग्रता के संबंध में प्राप्त वक्रों की प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर का अधिकतम मूल्य दिखाता है। I/Isat प्रत्येक प्रतिदीप्ति माप (I) के लिए प्राप्त प्रतिदीप्ति मान के अनुपात से मेल खाता है, संतृप्ति पर पहुंचे अधिकतम प्रतिदीप्ति मान के संबंध में सामान्यीकृत (Isat)। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रयोगों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: पीजोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म नियंत्रक इंटरफ़ेस। बाईं छवि इंटरफ़ेस दिखाती है जो पीज़ोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म के जेड-अक्ष विस्थापन को नियंत्रित करती है। प्रतिबंध तीन पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर के लिए वोल्टेज के आवेदन के माध्यम से मंच को उठाकर बनाया गया है। सही छवि माइक्रोमिलिंग मशीन को नियंत्रित करने वाले सॉफ़्टवेयर के इंटरफ़ेस को दिखाती है, जहां एक्स- और वाई-अक्षों में सटीक निर्देशांक का निरीक्षण करना संभव है जहां प्रतिबंध 11,000 आरपीएम की गति से मशीनीकृत होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: डिवाइस का डिजाइन। डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बनाए गए डिवाइस का डिज़ाइन बाईं ओर देखा जाता है। डिजाइन में दो चैनल जुड़े होते हैं, एक मुख्य चैनल होता है जिसमें 5 μm ऊंचाई प्रतिबंध होता है और दूसरा अपशिष्ट आउटलेट के लिए साइड चैनल होता है। चैनलों को 200 μm एंड मिल बिट के साथ माइक्रोमिलकिया गया है। दाईं ओर पैनल निर्माण मापदंडों को दिखाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: इनलेट और आउटलेट छेद के माइक्रोमिलिंग पैरामीटर। (ए) 1.2 मिमी व्यास और 0.65 मिमी गहराई छेद (ऐक्रेलिक मोटाई का आधा) मशीनी चेहरे पर माइक्रोमिल्ड होते हैं। दाईं ओर पैनल अंतिम मिल बिट के विस्थापन गति, रोटेशन और गहराई मापदंडों को दर्शाता है। (बी) छेदों को जोड़ने वाले विपरीत चेहरे पर 1.5 मिमी व्यास और 0.7 मिमी गहराई छेद किए जाते हैं। दाईं ओर पैनल निर्माण मापदंडों को दिखाता है। दोनों मामलों को 800 μm एंड मिल बिट के साथ माइक्रोमिल्ड किया जाता है। (सी) अभिकर्मक इनलेट (दाएं) और आउटलेट (बाएं) छेद दोनों चेहरों को मशीन िंग करने के बाद दिखाए जाते हैं। बड़े व्यास के आधे के आयाम नली को युग्मित करने की अनुमति देते हैं, जबकि छोटे व्यास आधे द्वारा बनाई गई बाधा नली को इनलेट्स को अवरुद्ध करने से रोकती है। स्केल पट्टियाँ = 1 मिमी . कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: नैनोपार्टिकल पृथक्करण। एक वाणिज्यिक चुंबकीय विभाजक का उपयोग करके, इम्यूनोसे के दौरान धोने के चरणों को करने के लिए 100 एनएम नैनोकणों को आसानी से केंद्रित किया जा सकता है। 15 मिनट के बाद बनने वाली गोली लाल सर्कल में देखी जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: ऐक्रेलिक सतह पीसने के लिए कोड। उत्पन्न कोड को एक्स- और वाई-अक्षों के साथ 25 मिमी x 9 मिमी ऐक्रेलिक सतह को पीसने के निर्देशों के साथ दिखाया गया है। कोड की अंतिम पंक्ति ड्रिल बिट को समन्वय पर ठीक रखती है जहां बाधा को मशीनीकृत किया जाएगा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक डिजाइन फ़ाइल 1: माइक्रोचैनल और अभिकर्मक इनलेट और आउटलेट छेद का डिजाइन। डिजाइन में विभिन्न रंगीन संरचनाओं (काले चैनल और लाल छेद) की दो परतें होती हैं जो पहले जमीन के ऐक्रेलिक चेहरे पर मशीनीकृत होती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक डिजाइन फ़ाइल 2: विपरीत तरफ छेद का डिजाइन। डिजाइन में विपरीत चेहरे के लिए बड़े व्यास के छेद होते हैं जो पिछले लोगों के साथ संवाद करते हैं और नली को ठीक करने के लिए काम करते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इम्यूनोसपोर्ट के रूप में नैनोकणों का उपयोग करके इम्यूनोएसे के लिए एक ऐक्रेलिक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस एक माइक्रोमिलिंग तकनीक का उपयोग करके बनाया गया था। सब्सट्रेट पर प्रत्यक्ष विनिर्माण की विधि में एक मास्टर मोल्ड के उपयोग और समय और लागत से बचने का लाभ है जो इसका तात्पर्य है। हालांकि, यह तेजी से प्रोटोटाइप और उच्च मात्रा वाले डिवाइस निर्माण तक सीमित है।

यहां, हमने मिलिंग मशीन12 के लिए पहले से रिपोर्ट किए गए एक्सेसरी पीजोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म का उपयोग किया। प्लेटफॉर्म को 3 डी प्रिंटिंग द्वारा पारंपरिक माइक्रोमिलिंग मशीनों के 10 μm रिज़ॉल्यूशन से बेहतर ऊर्ध्वाधर रिज़ॉल्यूशन के साथ चर-गहराई चैनल बनाने के लिए बनाया गया था। हमने 5 μm तक के चैनलों की मिलिंग हासिल की जो 200 μm माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में एक क्रमबद्ध प्रतिबंध बनाते हैं।

माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के निर्माण के लिए 200 μm और 800 μm व्यास के केवल दो अंत मिल बिट्स की आवश्यकता होती है, बिना किसी भी बिट्स को मैन्युअल रूप से बदलने की आवश्यकता के। उपयोग किया जाने वाला मिलिंग मशीन मॉडल स्वचालित रूप से बिट्स का आदान-प्रदान करता है, जो समय अनुकूलन में मदद करता है। इसके अलावा, "जेड 0 सेंसिंग" मोड मिलिंग मशीन में शामिल सेंसर और पिन से संपर्क करके उच्च परिशुद्धता के साथ जेड-अक्ष में स्वचालित रूप से उत्पत्ति के निर्धारण की अनुमति देता है।

इस डिवाइस का डिज़ाइन सरल है, जिसमें केवल 5 μm स्टैगर्ड प्रतिबंध और एक एक्सेसरी चैनल द्वारा बाधित मुख्य चैनल शामिल है जो माइक्रोपार्टिकल्स के लिए एक शुद्ध और इनलेट के रूप में कार्य करता है। हालांकि, व्यास में 7.5 μm के लोहे के माइक्रोपार्टिकल्स को फंसाने के लिए प्रतिबंध के लिए ऐसी संरचनाओं की उच्च परिशुद्धता की आवश्यकता होती है। एक बड़ा प्रतिबंध माइक्रोपार्टिकल्स को प्रतिधारण के बिना गुजरने की अनुमति देता है, जो उनके कब्जे और माइक्रोपार्टिकल ट्रैप के गठन को रोकता है। इसके विपरीत, एक छोटा प्रतिबंध चैनल के प्रवाह प्रतिरोध को बहुत बढ़ाता है और अभिकर्मकों को छिद्रपूर्ण माइक्रोपार्टिकल माध्यम से गुजरने के बजाय साइड चैनल से बाहर निकलने का कारण बनता है। चुंबकीय जाल बनाने के लिए एक बड़े व्यास के माइक्रोपार्टिकल्स का उपयोग करने से एक बड़ा प्रतिबंध बनाने की अनुमति मिलेगी। उदाहरण के लिए, 40 μm के व्यास वाले कणों को ~ 30 μm क्रमबद्ध प्रतिबंध की आवश्यकता होती है। उस स्थिति में, पीजोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करना आवश्यक नहीं है, और निर्माण प्रोटोकॉल सरल है। हालांकि, बड़े माइक्रोपार्टिकल्स से बना एक छिद्रपूर्ण माध्यम नैनोकणों को अलग तरह से फंसाएगा और इम्यूनोएसे के प्रदर्शन को प्रभावित करेगा; हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि यह बेहतर या बदतर के लिए होगा या नहीं। डिवाइस7 को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए इन सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए काम चल रहा है।

आवश्यक सटीकता प्राप्त करने के लिए, 14,500 आरपीएम पर पूरे ऐक्रेलिक सतह के माध्यम से 200 μm एंड मिल बिट को स्थानांतरित करके ऐक्रेलिक सतह की 30 μm परत को हटाने के लिए सतह पीसने का प्रदर्शन किया गया था। यह प्रक्रिया ऊंचाई में अधिक सटीकता के लिए पूरी सतह के साथ जेड-अक्ष पर एक नई उत्पत्ति प्राप्त करने की अनुमति देती है। ऐक्रेलिक को हमेशा एक ही स्थिति में संरेखित करना महत्वपूर्ण है ताकि एक्स- और वाई-अक्षों (पहले सेट) पर मूल निर्देशांक ऐक्रेलिक के कोनों में से एक के साथ मेल खाते हैं। इसी तरह, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ऐक्रेलिक पूरी तरह से आधार पर बैठा है; अन्यथा, सतह ठीक से नहीं घिस सकती है, जिससे निम्न असेंबली चरणों में समस्याएं पैदा हो सकती हैं।

एक बार जब प्रोग्राम सतह पीसने की प्रक्रिया को पूरा कर लेता है, तो यह स्वचालित रूप से अंतिम मिल बिट को एक विशिष्ट समन्वय में लाता है जहां जाल बनाने वाली 5 μm बाधा मशीनीकृत की जाएगी। इस समन्वय तक पहुंचने के बाद एंड मिल बिट को सतह से उठाने से रोकना महत्वपूर्ण है। यह पहचानने की सिफारिश की जाती है कि क्या माइक्रोमिलिंग मशीन में एक विकल्प है जो पीसने की प्रक्रिया समाप्त होने के बाद अंत मिल बिट को सतह से अलग होने से रोकता है। अन्यथा, कटर को मैन्युअल रूप से इस निर्देशांक में पुनर्स्थापित करना आवश्यक होगा, जिसके परिणामस्वरूप स्थान सटीकता त्रुटियां हो सकती हैं।

ऐक्रेलिक में क्रमबद्ध प्रतिबंध को मशीन करने के लिए, 1.5 μm से अधिक आकार लेना आवश्यक है। 5 μm ऊंचाई के लिए, पीज़ोइलेक्ट्रिक प्लेटफ़ॉर्म को 6.5 μm तक बढ़ाया गया था क्योंकि माइक्रोचैनल चैनलों को सील करने की प्रक्रिया में थोड़ा चपटा हो जाता है। इसके अलावा, डिवाइस में प्रतिबंध की अंतिम लंबाई केवल 50 μm है; हालाँकि, यह सुनिश्चित करने के लिए लंबे समय तक मशीनीकृत किया जाता है कि यह मुख्य चैनल के दोनों सिरों के साथ संवाद करता है जब इसे बाद में मशीनीकृत किया जाता है। एक चरण में, 200 μm गहरे चैनल 200 μm व्यास अंत मिल बिट और 11,000 आरपीएम की घूर्णी गति का उपयोग करके बनाए जाते हैं। इस प्रकार, ऐक्रेलिक में 200 μm चौड़े चैनलों की मशीनिंग में केवल कुछ सेकंड लगते हैं।

डिवाइस के निर्माण में अगला कदम उन छेदों को मशीन करना है जो चैनलों को बाहर से जोड़ते हैं। इन छेदों का उपयोग नली को रखने के लिए किया जाता है जो डिवाइस को आसानी से सिरिंज पंप से कनेक्ट करने की अनुमति देता है जो इसे चलाता है। यहां आने वाली समस्याओं में से एक नली का प्लेसमेंट है। अभिकर्मकों के प्रवाह की अनुमति देने और बिना मशीन वाले ऐक्रेलिक के चेहरे के साथ एक सील बनाने से बचने के लिए एक इष्टतम दूरी महत्वपूर्ण है। इस खामी को दूर करने के लिए, छेद को एक सीमा बनाने के लिए दो चरणों में मशीनीकृत किया जाता है जहां नली वांछित गहराई से अधिक नहीं होती है।

800 μm एंड मिल बिट के साथ, छेद का पैटर्न उसी पहले के माइक्रोमिल्ड चेहरे पर मिलाया गया था। छेद को 1.2 मिमी के व्यास और 0.65 मिमी की गहराई के साथ प्रत्येक चैनल के अंत में मशीनीकृत किया जाता है, जो ऐक्रेलिक की मोटाई का आधा है। इसके अलावा, आयत के विपरीत कोनों में दो छेद मशीनीकृत होते हैं, जो ऐक्रेलिक को स्तंभों के साथ मंच पर आमने-सामने संरेखित करने की अनुमति देते हैं। इसे तोड़ने से बचने के लिए पीजोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म से ऐक्रेलिक को हटाने के लिए स्क्रैपर या कटर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। ऐक्रेलिक के विपरीत तरफ, छेद का व्यास 1.5 मिमी (पिछले आधे से बड़ा) है, जो तय की जाने वाली नली के व्यास के बराबर है। गहराई 0.7 मिमी है और यह सुनिश्चित करने के लिए सामने के चेहरे के छेद के आधे से थोड़ा अधिक होना चाहिए कि दोनों मशीनी छेद एक दूसरे के साथ संवाद करते हैं। छोटे व्यास के छेद द्वारा गठित अवरोध नली को नीचे तक पहुंचने और इनलेट को अवरुद्ध करने से रोकता है। प्रोटोकॉल में यह कार्यान्वयन चिप में द्रव इनलेट और आउटलेट नली के प्लेसमेंट में काफी सुधार करता है।

डिवाइस निर्माण में एक महत्वपूर्ण कदम सीलिंग है। उस चेहरे को सील करना आवश्यक है जिसमें समान आयामों के साथ एक अनमशीन्ड ऐक्रेलिक कवर के साथ मशीन चैनल होते हैं। शीट्स को एक ऐसी विधि के साथ सील करना जो ऐक्रेलिक के ग्लास संक्रमण तापमान तक नहीं पहुंचता है, विरूपण-मुक्त चैनल प्राप्त करने की अनुमति देता है। उपयोग की जाने वाली बॉन्डिंग विधि के माध्यम से, दो पीएमएमए शीट के बीच विलायक की एक पतली फिल्म पीएमएमए शीट की सतह से एक पतली फिल्म को भंग कर देती है, फिर वाष्पित हो जाती है, और अंत में एक विशिष्ट ऑपरेटिंग तापमान पर पीएमएमए शीट्स के मोनोमर्स को फिर से जोड़ती है।

इस ऐक्रेलिक डिवाइस को सील करने के लिए क्लोरोफॉर्म वाष्प एक्सपोजर की व्यापक रूप से वर्णित विधि का उपयोग किया गया था। जैसा कि पहले साहित्य में बताया गया था, क्लोरोफॉर्म उच्च बंधन शक्ति प्रदान करता है; हालांकि, चूंकि क्लोरोफॉर्म ऐक्रेलिक पर बहुत आक्रामक रूप से हमला करता है, ऐक्रेलिक को कभी भी तरल क्लोरोफॉर्म के साथ सीधे संपर्क में नहीं आना चाहिए, केवल गैसीय क्लोरोफॉर्म के साथ। वाष्पित क्लोरोफॉर्म और ऐक्रेलिक के बीच एक इष्टतम दूरी बनाए रखना आवश्यक है। हमने ग्लास पेट्री डिश का उपयोग करके एक सरल प्रणाली बनाई, जिसमें ऐक्रेलिक को ढक्कन का पालन किया गया था। पेट्री डिश के ढक्कन से जुड़े और जुड़े नौ स्लाइडों से बने एक मंच का उपयोग किया गया था, जिस पर दूरी को विनियमित करने के लिए ऐक्रेलिक को दो तरफा टेप के साथ पालन किया गया था। यद्यपि गैसीय क्लोरोफॉर्म प्रक्रिया परिवेश के तापमान में परिवर्तन के प्रति बहुत संवेदनशील है, पेट्री व्यंजनों के तापमान को पॉलीस्टाइनिन बॉक्स के अंदर रखकर नियंत्रित किया जा सकता है। पानी की सील क्लोरोफॉर्म को बहुत जल्दी वाष्पित होने से रोकती है।

इसके विपरीत, अन्य रिपोर्ट किए गए जुड़ने के तरीके हैं जो तेज हैं और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, कुछ केवल मशीनिंग के बिना दो ऐक्रेलिक शीट में शामिल होने के लिए उपयुक्त हैं। इसी तरह, बॉन्डिंग बल को नियंत्रित करना मुश्किल है क्योंकि विलायक को सीधे दोनों ऐक्रेलिक शीट18 के बीच डाला जाना चाहिए, जिसमें माइक्रोमिल्ड 5 μm प्रतिबंध जैसे छोटे आयामों की संरचनाओं के पिघलने का उच्च जोखिम होता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सजातीय सील को एक घर का बना प्रेस के साथ हासिल किया गया था, जिसके साथ सीलिंग दबाव और तापमान को नियंत्रित किया गया था। इस प्रेस के निर्माण के लिए, एल्यूमीनियम और हिंज दोनों का एक ढांचा एक लीवर बनाता है जो 5 किलोग्राम के वजन से आने वाले यांत्रिक बल को 9: 1 के कारक तक बढ़ाता है। हीटिंग तत्व अपनी गर्मी को 2 सेमी मोटी एल्यूमीनियम प्लेटों में स्थानांतरित करते हैं जो ऐक्रेलिक टुकड़ों के संपर्क में होते हैं।

एक बार ऐक्रेलिक परतों को सील करने के बाद, निर्माण प्रक्रिया में अंतिम चरण बाहरी नली को डिवाइस के संबंधित इनलेट्स और आउटलेट से जोड़ना है। छेद के अंदर नली होने के बाद तरल चिपकने वाला बाहरी रूप से लगाया जाता है। यदि नली का व्यास छेद से छोटा है, तो तरल चिपकने वाला उपकरण में जा सकता है, चैनलों को बंद कर सकता है।

सब्सट्रेट पर प्रत्यक्ष निर्माण विधियां, जैसे कि माइक्रोमिलिंग, के कुछ नुकसान हैं, जैसे मशीनी सतह का खुरदरापन और खराब सीमांकित किनारों वाली संरचनाएं9। चैनलों की मशीनी सतह के खुरदरापन के बावजूद, इस उपकरण के लिए कोई अतिरिक्त उपचार आवश्यक नहीं है। इस बॉन्डिंग प्रोटोकॉल के बारे में ध्यान देने योग्य एक महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि क्लोरोफॉर्म विलायक के संपर्क में आने वाली सतहों को चमकाकर मिल्ड माइक्रोचैनलों के खुरदरापन को कम करने की अनुमति देता है। सतह की पॉलिशिंग इतनी अच्छी है कि ऑप्टिकल गुणवत्ता मेंभी सुधार हुआ है।

जब डिवाइस को गढ़ा गया है, तो इसे इम्यूनोएसे में उपयोग करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। डिवाइस की अल्ट्रासोनिक धुलाई किसी भी अवांछित ऐक्रेलिक मलबे को हटाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है जो चैनलों को बंद कर सकती है और इम्यूनोएसे में हस्तक्षेप कर सकती है।

इसके अलावा, गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन और उच्च पृष्ठभूमि शोर संकेतों से बचने के लिए चैनलों के सही अवरोध पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। 5% बीएसए के साथ ब्लॉकिंग चैनलों में एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन के शोर को कम करने के लिए दिखाया गया है, और इनक्यूबेशन का 1 घंटे पर्याप्त है। लोहे के माइक्रोपार्टिकल्स को सिलिका-पीईजी परत के साथ लेपित किया जाता है ताकि उनमें गैर-विशिष्ट बंधन को रोका जा सके। इसके अलावा, डिवाइस में जाल बनाने से पहले माइक्रोपार्टिकल्स को बीएसए (चैनलों के समान समय) के साथ अवरुद्ध किया जाता है। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन बेहतर है, जिसका अर्थ है कि इम्यूनोसे से पहले डिवाइस के निर्माण और इनक्यूबेशन के लिए 1 दिन की आवश्यकता होती है। क्लोरोफॉर्म द्वारा खुरदरापन में कमी और गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन को कम करने के लिए सतहों की रुकावट को असाधारण रूप से अच्छी तरह से काम करने के लिए दिखाया गया है, जिससे इस प्लेटफॉर्म को मॉडल इम्यूनोएसे4 में मानक एलिसा के बराबर पहचान की सीमा प्राप्त करने की अनुमति मिलती है।

माइक्रोचैनल प्रतिबंध में माइक्रोपार्टिकल ट्रैप का गठन एक मैनुअल प्रक्रिया है। यद्यपि प्रवेश करने वाले माइक्रोपार्टिकल्स की संख्या का कोई सटीक नियंत्रण नहीं है, हम कॉम्पैक्ट कणों की लंबाई के अनुमान पर भरोसा करते हैं। जाल को बड़ा बनाना या अतिरिक्त को आसानी से हटाना संभव है। छोड़े गए कण साइड चैनल में जमा होते हैं और उन्हें चिप से हटाने की आवश्यकता नहीं होती है। माइक्रोपार्टिकल्स को मुख्य चैनल में बहने से रोकना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे जाल के ऊपर नैनोकणों के साथ बातचीत कर सकते हैं और इम्यूनोसे माप को संशोधित कर सकते हैं।

अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और संबंधित एचआरपी-लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के इनक्यूबेशन द्वारा संयुग्मित लाइसोजाइम प्रोटीन द्वारा गठित एक कॉम्प्लेक्स के इम्यूनोडिटेक्शन को लागू किया। इम्यूनोकॉम्प्लेक्स डिवाइस के बाहर बनता है। हालांकि, डिवाइस के अंदर पूरे इम्यूनोसे का प्रदर्शन करना संभव है। नैनोकणों के चुंबकीय गुण एक उच्च प्रदर्शन नियोडिमियम स्थायी चुंबक विभाजक के साथ आसान हेरफेर की अनुमति देते हैं। नैनोकणों को चुंबक द्वारा माइक्रोट्यूब की दीवार पर आकर्षित करने की अनुमति देने के लिए प्रतिक्रिया माइक्रोट्यूब को 15 मिनट के लिए रखना चाहिए, जो डिवाइस के बाहर इम्यूनोसे धोने के चरणों की सुविधा प्रदान करता है।

इस उपकरण का मुख्य आकर्षण यह है कि यह सरल, तेज है (एलिसा के लिए 4-6घंटे की तुलना में 40 मिनट 4 का कुल परख समय), और सस्ता (पार्श्व प्रवाह परीक्षण की कीमत के बराबर)। ये सभी विशेषताएं इस डिवाइस प्रोफाइल को पीओसीटी के विकास के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बनाती हैं। इसके अलावा, डिवाइस मात्रात्मक रूप से स्वर्ण मानक एलिसा4 के समान विश्लेषण सांद्रता का पता लगा सकता है, जो महामारी विज्ञान के अध्ययन और सार्वजनिक स्वास्थ्य में निर्णय लेने के लिए बेहद मूल्यवान है। आमतौर पर, इम्यूनोएसे के लिए माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में पहचान की अच्छी सीमाएं होती हैं लेकिन लंबी परख समय होता है, या उनके पास कम परख समय होता है लेकिन पता लगाने की उप-मानक सीमाएंहोती हैं। चुंबकीय नैनोकणों को प्रतिरक्षा समर्थन और पता लगाने के लिए फ्लोरोजेनिक एंजाइमों के रूप में जोड़कर, इस मंच में एक छोटा परख समय और पहचान की एक अच्छी सीमा है (पिछले काम में, हमने एंटीजन के रूप में बायोटिन का उपयोग करके 8 पीजी / एमएल का पता लगाने की सीमा पाई, जो एक मानक एलिसा4 के साथ तुलनीय है)। अंत में, इस तकनीक का पार्श्व प्रवाह परीक्षणों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है: मात्रात्मक और न केवल गुणात्मक परिणाम देने की संभावना ("हां" या "नहीं")। प्रयोगशालाओं में विकसित अधिकांश अन्य माइक्रोफ्लुइडिक प्रणालियों के विपरीत जिसमें दुर्लभ सामग्रियों का उपयोग किया जाता है, यह प्रणाली ऐक्रेलिक (पीएमएमए) से बनी है, एक कम लागत वाला थर्मोप्लास्टिक जो चिकित्सा नैदानिक उपकरणों के बड़े पैमाने पर उत्पादन के साथ अत्यधिक संगत है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को कोनासाइट, मेक्सिको द्वारा "प्रोग्रामा डी एपोयोस पैरा एक्टिविडेड्स साइंटिफिकास, टेक्नोलोगिकास वाई डी इनोवासियोन" के अनुदान 312231 के तहत और एएमईएक्ससीआईडी और मैक्सिकन विदेश संबंध मंत्रालय (एसआरई) द्वारा अनुदान "प्रुएबा सेरोलोगिका रेपिडा, बराटा और डी अल्टा सेंसिबिलिड पैरा सार्स-सीओवी -2" के तहत समर्थित किया गया था। JAHO अपनी पीएचडी छात्रवृत्ति के लिए Conacyt मेक्सिको को धन्यवाद देता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.008 Endmill KYOCERA SGS  2204 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 Endmill KYOCERA SGS  2228 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
Carbonyl-iron microparticles  Sigma-Aldrich 44890 7 μm 
Chloroform Fermont 6201 Health Hazard: Moderate
Flammability: None
Reactivity: None
Contact Hazard: Moderate 
CMOS camera Moment Teledyne Photometrics Sensor Technology: CMOS
Quantum Efficiency: 73%
Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm
Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software Roland DGA Corporation Engraving software to design and create the engraving path on the surface
Extraction hood Unknown Unknown
Flexible Plastic Tubing Tygon AAD04103 ID = 0.020, OD = 0.060
Fluorescence microsope  ZEISS Axio Vert.A1
High Precision Dispense Needle Loctite 98612
Homemade piezoelectric controller application LabView  See reference 12 for more details.
Loctite 495 instant adhesive Henkel 49503 Apply with micropipette tip or dispensing needle 
MagJET Separation Rack thermoscientific 12 x 1.5 mL
Mechanic press Home-made
Milling Machine Roland MDX-50
Piezoelectric platform  Home-made See reference 12
Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic Goodfellow ME303018/1 Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent
PVCamTest software Teledyne Photometrics Version 3.10.107  Image acquisition software
Stereo microscope Nikon SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads Ocean NanoTech KSC0100 100 nm
Syringe pump kd Scientific  KDS200 Can hold up to two syringes
Utrasonic bath Branson 2800
VPanel software  Windows OS Version 1.0.3.0 Software for controlling the micromilling machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R. Immunoassays in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 991-1007 (2010).
  2. Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
  3. Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
  4. Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
  5. Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
  6. Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
  7. Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
  8. Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
  9. Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
  10. Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
  11. Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
  12. Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
  13. Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
  14. Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
  15. Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
  16. Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
  17. Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
  18. Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
  19. Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).

Tags

इंजीनियरिंग अंक 184 माइक्रोफ्लुइडिक्स माइक्रोमिलिंग ऐक्रेलिक पीजोइलेक्ट्रिक स्टैगर्ड प्रतिबंध चुंबकीय जाल माइक्रोपार्टिकल्स नैनोकणों इम्यूनोसे
चुंबकीय नैनोपार्टिकल-आधारित इम्यूनोएसे के लिए एक क्रमबद्ध प्रतिबंध के साथ माइक्रोफ्लुइडिक ऐक्रेलिक डिवाइस का कंप्यूटर न्यूमेरिकल कंट्रोल माइक्रोमिलिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernández-Ortiz, J. A.,… More

Hernández-Ortiz, J. A., Guevara-Pantoja, P. E., Andrade-Medina, M., Carrillo-Tripp, M., Caballero-Robledo, G. A. Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays. J. Vis. Exp. (184), e63899, doi:10.3791/63899 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter