Summary
マイクロフルイディクスは、診断テストを開発するための強力なツールです。ただし、高価な機器と材料、および面倒な製造と取り扱い技術がしばしば必要とされます。ここでは、低コストで使いやすい設定での磁気マイクロおよびナノ粒子ベースのイムノアッセイ用のアクリルマイクロ流体デバイスの製造プロトコルについて詳しく説明します。
Abstract
マイクロ流体システムは、イムノアッセイ技術を大幅に改善しました。しかし、多くの微細加工技術は、特殊な、高価、または複雑な装置を必要とするため、製造コストがかかり、大量生産と互換性がなく、ポイントオブケアテスト(POCT)を低リソース環境で採用するための最も重要な前提条件の1つです。この研究では、コンピューター数値制御(CNC)マイクロミリング技術を使用したナノ粒子結合酵素イムノアッセイ試験用のアクリル(ポリメチルメタクリレート、PMMA)デバイスの製造プロセスについて説明します。マイクロ流体デバイスの機能は、100nm磁性ナノ粒子に結合したモデル抗原としてリゾチームを使用して市販の抗体を検出するイムノアッセイを行うことによって示されます。このデバイスは、高さわずか5μmの物理的な千鳥制限を統合し、外部磁石を配置することによって磁気トラップを構成する磁性微粒子を捕捉するために使用されます。このようにして、コンジュゲートナノ粒子の免疫支持体にかかる磁力は、それらを捕捉し、流れの抗力に抵抗するのに十分である。このマイクロ流体デバイスは、イムノアッセイ性能の精度を損なうことなく、低コストの大量生産に特に適しています。
Introduction
近年、マイクロフルイディクスはイムノアッセイ技術において重要な役割を果たしています1。小型化技術には、サンプルと試薬の消費量の削減、インキュベーション時間の短縮、効率的な溶液交換、高度な統合と自動化など、従来のイムノアッセイと比較して多くの優れた利点があります2。
さらに、イムノアッセイにおけるマイクロ流体システムは、免疫支持体としての磁性ナノ粒子と会合して、インキュベーション時間を大幅に短縮し、表面対体積比の増加により高い検出感度を達成します3。粒子のブラウン運動は、抗原抗体複合体4,5の形成中の反応速度を改善する。さらに、ナノ粒子の磁気特性は、さまざまなマイクロ流体デバイス構成に統合する汎用性を提供し、小型化されたオンチップバイオセンシングシステムにおけるシグナル伝達および分子捕捉の理想的な候補となります5。しかし、磁力は表面対体積比が高いため、ナノメートルスケールの抗力よりも大幅に弱くなります6。したがって、洗浄や検出などの重要なイムノアッセイステップのためにナノ粒子を捕捉することは困難な場合があり、従来の磁石では不十分です4。
ナノ粒子を操作する効率的な方法は、マイクロ流体構造体3に充填された鉄微粒子によって形成されたマイクロ流体磁気トラップの使用である。したがって、外部の磁石が近づくと、磁化された多孔質媒体内で磁力と磁束力の間に複雑な相互作用が生じます。ナノ粒子に作用する磁力は、ナノ粒子を捕捉し、流れの抗力に抵抗するのに十分強い3,4,7。このアプローチでは、微粒子を保持するマイクロメトリック構造を生成するために、数マイクロメートルオーダーの分解能を達成する微細加工技術が必要です。
現在の微細加工技術により、数ミクロンから数百ナノメートルの構造の高解像度製造が可能になります8。ただし、これらの技術の多くは、特殊な、高価な、または複雑な機器を必要とします。主な困難の1つは、金型製造のためのクリーンルームの要件であり、これは依然としてコストと時間のかかる8,9です。最近、マイクロ流体エンジニアは、コストの削減、ターンアラウンドタイムの短縮、材料とツールの安価化、機能性の向上など、さまざまな利点を備えたさまざまな代替製造方法を開発することで、この欠点を克服しています8。このように、新しい微細加工技術の開発により、10μm8という低い分解能を達成する低コストの非クリーンルーム法がもたらされました。パターニングは、高価な成形パターンを生成することなく基板上に直接使用できるため、時間のかかるプロセスを回避できます。直接製造方法には、CNCフライス盤、レーザーアブレーション、および直接リソグラフィーが含まれます8。これらの方法はすべて、硬度9に関係なく、幅広い材料で高アスペクト比チャネルを製造するのに適しており、マイクロ流体デバイス8で新しく有利な形状、物理的挙動、および品質を可能にします。
CNCマイクロミリングは、基板からバルク材料を除去する切削工具を使用してマイクロスケール構造を作成し、マイクロ流体デバイス10,11の効果的な製造方法です。マイクロミリング技術は、マイクロ流体アプリケーションでマイクロチャネルと機能を作業面に直接作成するのに役立ち、ワークピースを短時間で(30分未満)製造でき、設計からプロトタイプまでのターンアラウンドタイムを大幅に短縮できるという主な利点を提供します12。さらに、さまざまな材料、サイズ、および形状の切断アクセサリが広く利用できるため、CNCフライス盤は、多くの種類の低コストの使い捨て材料でさまざまな機能の製造を可能にする適切なツールになります13。
マイクロミリングで一般的に使用されるすべての材料の中で、熱可塑性プラスチックは、その多くの好ましい特性と生物学的用途との互換性のために、依然として主要な選択肢です10,14。熱可塑性プラスチックは、低コストの使い捨て分析システムを開発するための大きな利点があるため、マイクロ流体システムにとって魅力的な基板です9。また、大量生産プロセスへの適応性が高く、製品化や量産に適しています。これらの理由から、PMMAなどの熱可塑性プラスチックは、マイクロフルイディクスの初期から信頼性が高く堅牢な材料と見なされてきました10。熱可塑性プラスチックの閉チャネルを製造するためのさまざまなプロトコル、例えば、溶剤接合15、熱接合16、および紫外線(UV)/オゾン表面処理接合17が記載されている。
多くの場合、従来のマイクロミリングマシンで達成される位置決め分解能は、10μm未満の構造を必要とする一部のマイクロ流体アプリケーションでは十分ではありません。ハイエンドのマイクロミリングには十分な解像度があります。残念ながら、価格が高いため、その使用は少数のユーザーに限定されています12。以前、私たちの研究グループは、従来のフライス盤の解像度を克服して、10μm未満の構造を加工できる低コストの工具の製造と操作を報告しました12。フィクスチャは、3つの圧電アクチュエータを含む、シンプルな電子機器で3D印刷によって製造されたプラットフォームです。表面にはヒンジ状のジョイントが含まれており、圧電素子が同時に作用するときに持ち上げることができます。Z軸変位は、500nmの分解能と±1.5μmの精度で制御できます12。
この論文では、マイクロミリング技術によるアクリルデバイス(PMMA)の製造プロセスのステップを紹介します。チップ設計は、幅200μm、高さ200μmのメインチャネルと、試薬の流れをパージするための同じ寸法のサイドチャネルで構成されています。中央領域では、このグループ12によって製造された3Dプリントされた圧電プラットフォームで製造された高さわずか5μmの物理的制限によってチャネルが中断され、外部磁石を配置することによってナノ粒子の磁気トラップを構成する磁性微粒子を捕捉する。100 nm磁性ナノ粒子に結合したモデル抗原としてリゾチームを用いて市販の抗体を検出するイムノアッセイを行うことによるマイクロ流体デバイスの動作を示す。このデバイスは、それをユニークにするさまざまな機能を兼ね備えています4:免疫サポートとして磁性ナノ粒子を使用すると、合計テスト時間が数時間から数分に短縮されます。検出に蛍光発生酵素を使用すると、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)に匹敵する検出限界が可能になります。また、熱可塑性プラスチックを製造材料として使用することで、従来のマイクロ流体ナノ粒子の磁気トラップ3にはなかった大量生産に対応でき、POCTの開発に最適な候補となります。
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Protocol
1.マイクロミリング
- 平面研削
- マイクロフライス盤と圧電コントローラーの電源を入れます。それぞれの制御ソフトウェア12を起動する。
- 必要なエンドミルビット(直径200 μmおよび800 μm)を選択します。フライス盤の適切なコンパートメントに配置します(図1)。
- 厚さ1.3 mmのPMMAの9 mm x 25 mmの長方形を800 μmのエンドミルビットでカットします。これらの長方形の1つを両面粘着テープで圧電プラットフォームに慎重に取り付けます(図2)。
注意: アクリルの長方形は常に同じ位置に配置して、角の1つが加工用のx軸とy軸の原点座標と一致するようにしてください。 - Zセンサーを接続して、PMMA長方形の表面に配置します。検出ピンを選択し、センサー表面上に移動します。センサーに接触せずに手動でピンを下げます。 Z0検出 モードをアクティブにします(図3)。
- 200 μm エンドミルビットを選択し、x、y 原点に移動します。Zセンサーを取り外します。アクリル面に接触せずにビットを慎重に下げます。
- 200 μmエンドミルビットを14,500 rpmで回転させます。z軸上の原点座標(z = 0)までゆっくりと下げます。原点の30μm下のz軸をリセットします。この座標を新しい Z 原点として設定します。
メモ: ビットが回転していない場合は、絶対に下げないでください。そうしないと、破損する危険があります。 - マイクロミリングマシンソフトウェアのカットボタンをクリックして、カットパネルをアクティブにします。[追加]ボタンをクリックし、アクリル表面の研削用に以前に作成したコードを含む.txtファイル(補足コーディングファイル1)を選択します。[出力]ボタンをクリックしてプロセスを開始します。
- エンドミルビットを、制限が加工される座標に移動します。この座標に達したら、エンドミルビットが地面から浮き上がるのを防ぐには、「 一時停止」(Pause ) ボタンをクリックします。それ以外の場合は、エンドミルビットをこの座標に手動で再配置します(図4A)。
- 5 μm制限のフライス加工
- エンドミルビットの回転速度を 11,000 rpm に設定します。圧電プラットフォームのインターフェースでプラットフォームを6.5μm上げます(補足図S1)。エンドミルビットをY軸に沿って500μm移動します。圧電プラットフォームを制御インターフェースを使用してz軸の初期値に戻します。
- マイクロチャネルのフライス加工
- 設計ソフトウェアから以前に作成した設計ファイル(補足設計ファイル1)を開きます。[ 印刷 ]ボタンをクリックします。 [プロパティ ]メニューにアクセスし、加工するデザインを含むレイヤーに対応するカラーウィンドウをクリックします。 [ツール ]パネルで、 補足図 S2 で指定されているように製造パラメータを設定します。
- 不要なレイヤーを非アクティブ化するには、[ツール] プルダウン メニューの [なし] オプションを選択します。
- 穴のフライス加工
- 800 μmエンドミルビットに切り替えます。対応するカラーウィンドウをクリックして、直径1.2mmの穴のデザインレイヤーをアクティブにします。
- 手順 1.3.2 を繰り返しますが、この場合は、穴の 補足図 S3A の説明に従って、対応する製造パラメータを設定します。
注意: 機械加工された穴の深さは、アクリルの厚さの半分です。 - 長方形の反対側の角に2つの追加の穴を加工して、新しいプラットフォームでアクリルを逆さまに位置合わせします(図4B)。圧電プラットフォームからアクリル長方形をはがします。アクリルを裏返し、機械加工されたピラーを備えたアダプターの上に両面粘着テープでテープで留めます(図4C、D)。
- 設計ソフト(補足設計ファイル2)から反対側の面の穴の設計を含むファイルを開きます。 補足図S3Bの説明に従って、対応する製造パラメータを設定します。試薬の入口と出口の穴の残りの半分を直径1.5 mm、深さ0.7 mmで粉砕します(補足図S3C)。
図1:エンドミルビットの配置 。 (A)200 μmおよび800 μmのエンドミルビットを配置し、ネジを介してスチールサポートに固定します。(B)各エンドミルビットは、自動選択のためにマイクロミリングマシンの特定のコンパートメントに配置されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:圧電プラットフォーム。 プラットフォームは3D印刷によって製造され、3つの圧電アクチュエータによって制御されるz軸の微細な変位を可能にするヒンジによって結合された2つの六角形のベースで構成されています。PMMA長方形が取り付けられ、座標の位置合わせコーナーの設定を可能にするアクリルアダプターも観察されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Z軸キャリブレーション。 z軸キャリブレーションの手順が詳しく説明されています。(A)zセンサーには、マイクロミリングマシンに差し込むケーブルが含まれています。(B)センサーは、機械加工する表面に直接配置されます。(C)検出ピンは、エンドミルビットの隣の特別なコンパートメントに配置された金属バーで構成されています。(D)両方のアクセサリが接触すると、マイクロミリングマシンはz軸上の原点座標を自動的に計算します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:整流されたアクリル表面 。 (A)直径200μmのエンドミルビットは、アクリル長方形の表面全体を掃引し、高さ約30μmの層を除去します。(B)画像は、以前に整流されたアクリルの表面にフライス加工されたさまざまな構造を示しています。試薬の入口と出口のチャネルと穴が観察されます。5μmの制限は肉眼では見ることができません。(C)アライメント穴のあるマイクロミル表面と、反対側のコーナーにアライメントピラーを備えたアダプター。(D)アクリルは、位置合わせ穴が収まるピラー付きのアダプター上で逆さまに位置合わせされます。スケールバー= 500μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.チャネルシーリング
- アクリル洗浄
- ピラーアダプタープラットフォームからアクリル長方形を取り外します。別の機械加工されていないアクリル長方形を取ります。両方のアクリルシートをイソプロピルアルコール(IPA)で洗い、蒸留水ですすいでください。手袋を着用し、IPAとの接触を避けてください。
- アクリルを超音波浴に10分間浸します(図5A、B)。
- ガス状クロロホルム曝露
- 両方のアクリルシートを完全に乾かします。両面テープでガラスのペトリ皿の蓋の内側にそれらをテープで留めます。機械加工されたチャネルの側面を露出させてください(図5C)。手袋を着用し、アクリル面に直接触れないようにしてください。
- ガラスのペトリ皿のベースを大きなガラスのペトリ皿の中に置きます(図5D)。1mLのクロロホルムをペトリ皿のベースに注ぎます。内側にアクリルシートを取り付けた状態ですばやく蓋をします。
- すぐに蒸留水を大きなペトリ皿の底にペトリ皿の蓋の高さまで加えます。アクリルをクロロホルムガスに1分間さらします(図5E)。
注意: クロロホルムへの暴露時間を長くするとアクリル表面が損傷し、5μmの制限が溶けて高さが変化するか、完全に消えることを考慮してください。 - ペトリ皿を傾けて、作成されたウォーターシールを破ります。ペトリ皿のカバーを外して、クロロホルムからアクリルをすぐに取り除きます。水をこぼさないように注意してください。
注意: クロロホルムは非常に有毒であるため、ヒュームフードでこのプロセスを行い、手袋を使用してください。
- プレスと加熱による接合
- 両面テープから両方のアクリル板をはがします。
- 両方のアクリルをガス状のクロロホルムにさらされた側面に向かい合わせ、サンドイッチを形成します。アクリルを18 kgf / cm2 、90°Cの温度でプレスに入れます(図5F、G)。
注意: シールを改善するために、アクリルを縦方向に揃え、2分後に位置合わせを変更することをお勧めします。この時間が経過してもシールが不十分な場合は、1分以内の間隔でプレスに戻します。ステレオスコープを使用して、チャンネルのステータスと制限を確認します。プレス時間を超えた場合、制限がなくなるリスクがあることを考慮してください。
- ホースアタッチメント
- ホースの長さを2〜3 cmカットします。完全にまっすぐにカットします。各ホースを瞬間乾燥液体接着剤でデバイスの穴に取り付けます(図6A)。接着剤がチップ内に入らないようにしてください。
図5:デバイスのシーリングプロセス。 (a)各アクリルシートを蒸留水と共に再封可能な袋に入れ、超音波浴に浸す。 (B)左の画像は製造直後のチャンネルを示し、右の画像はIPAと超音波浴で洗浄した後の同じデバイスを示しています。 マイクロチャネルからすべての不純物とアクリル残留物を除去します。200μmの中央チャネルを中断する制限のエッジが観察され、フライス加工が成功したことが確認されます。スケールバー = 500 μm。 (C)両方のアクリルを乾燥させ、蓋のガラスプラットフォームに接着します。(D)シャーレのベースは、より大きな直径の別のディッシュの内側に配置されます。(E)ペトリ皿を閉じるとき、ウォーターシールはガス状のクロロホルムが逃げるのを防ぎます。(F)重量5kgのレバーの要素の説明。(G)アクリルが置かれている領域を赤で示す開いたレバーの画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3.デバイスの準備
- 注射器を使用してチャネルを蒸留水で満たします。漏れや流れに対する抵抗がないことを確認してください。デバイスを超音波浴に10分間浸して、チャネル内に残っているアクリル、接着剤、または不要な材料を取り除きます。
- デバイスチャネル内の水を空にします。シリンジを使用して、1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)で希釈し、0.2 μmポリエーテルスルホン(PES)シリンジフィルターで事前にろ過した5%(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)で調製したブロッキング溶液を導入します。
- 5%BSA中の直径7.5μmの鉄微粒子の懸濁液を調製する。
注:微粒子は、タンパク質吸収に対する耐性を付与するシリカ-ポリエチレングリコール(PEG)層で以前に官能化されています4。 - チップと微粒子懸濁液をブロッキング溶液とともに室温で少なくとも1時間インキュベートします。可能であれば、4°Cで一晩ブロッキングします。
4. 微粒子トラップ形成
- サイドチャネル出口ホースを通してシリンジ針で微粒子をチップに挿入します。チップを垂直に置き、重力の影響下で微粒子がサイドチャネルを通って流れるようにします。チップを90°の2段階で180°回転させ、微粒子を5μmの制限でターゲットにしてコンパクトにします。
- サイドチャネルに向かって45°回転する重力によって余分な微粒子を除去します。
- 微粒子トラップを元に戻さないように、デバイスを直立させてください。微粒子トラップ形成プロセスの概要については 、図6B を参照してください。
5.イムノアッセイ
- ナノ粒子調製
- リゾチーム(抗原モデル)と結合させた100 nmナノ粒子の懸濁液を2 μL取ります。100 μLのブロッキング溶液を入れた1.5 mLの微量遠心チューブに追加します。4°Cで一晩インキュベートします。
- 150 μLの洗浄バッファー(TBS×1、0.05%トゥイーン20)を加えます。
- 1.5 mLのマイクロ遠心チューブを磁気分離器に入れます。ナノ粒子の分離を可能にするために15分間保持する(補足図S4)。
注意: 磁気分離器の最小容量は200μLです。 小さい容量の使用は避けてください。 - マイクロピペットでチューブから液体を取り除きます。ナノ粒子ペレットが形成されたチューブの壁との接触を避けてください。
- 250 μLの新しい洗浄バッファーを追加します。チューブを15分間攪拌します。
- 手順 5.1.3.-5.1.5 を繰り返します。さらに2倍、5分間だけ振とう。
- 所望の濃度の一次抗リゾチーム抗体を添加する( 材料表を参照)。抗体希釈液(TBS1個、BSA1%、トゥイーン200個)で最終容量100 μLに調整します。
- 37°Cで15分間インキュベートします。 室温でさらに15分間振とうを続けます。
- 洗浄手順5.1.2.-5.1.6を繰り返します。
- 抗体希釈液100 μLを加えます。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体(HRP-AbII)( 材料の表を参照)を1:500の希釈率で加えます。
- 洗浄手順5.1.2.-5.1.6を繰り返します。
- ナノ粒子を最終容量50 μLの抗体希釈液に保持します。
6.実験的な実装
- 2本の100μLガラスシリンジに水を入れ、長さ6.5cmのホースを各シリンジに接続し、ホースの端に金属ピンを挿入し、両方のシリンジをコンピューター制御のシリンジポンプに置きます。
- アクリル装置のすべてのホースを熱で密封します。
- インレットホースを切断し、数ミリメートルだけ保ちます。ディスペンシングニードルに洗浄バッファーを満たし、カットホースに挿入します。デバイスへの空気のアクセスを防ぐために、針をデバイスに接続する前に溶液を滴下させます。
- 出口ホースを横方向のチャネルから切り取ります。シリンジポンプに接続します。次に、メインチャネルアウトレットホースについても同じ手順を実行します。
メモ: 手順 6.3.-6.4 を実行することが重要です。この順番で微粒子トラップを開梱しないようにする。可能であれば、虫眼鏡を使用して、これらの手順中にトラップの状態を確認します。 - 顕微鏡ステージにスライドガラスを置きます。両面テープで磁石をスライドに取り付け、両側に小さなテープを貼ってチップの端をガラスに固定します。
- シリンジポンプコントローラーの[流量]タブと[単位]タブから流量を50 μL/hに設定します。引き出しモードを選択し、開始ボタンをクリックして洗浄バッファーのフローをアクティブにします。
- トラップを含むチップの領域が磁石に接触するように、磁石を持ってスライドに向かってデバイスを水平に近づけます。
- 動きを防ぐために、デバイスの端を両面テープでガラスに貼り付けます。顕微鏡検査のために光路を塞ぐことは避けてください(図6C)。
図6:最終的なデバイス構成 。 (A)対応する入力と出力にホースが取り付けられたアクリルデバイス。スケールは、デバイスの寸法をセンチメートルで示します。(B)微粒子トラップの形成のためのプロトコル。微粒子は、装置が垂直位置に配置されると、重力によってチャネルを通って流れる。微粒子は5μmの制限で濃縮されます。余分な微粒子は、サイドチャネルを通してチップを回転させることによって容易に除去される。チップは、イムノアッセイの前にトラップを保存するために垂直に保たれます。(c)倒立型蛍光顕微鏡のステージ上に、磁石を含むスライドガラス上に実装されたマイクロ流体デバイス。試薬が添加される分注針、ならびにシリンジポンプに接続する出口ホースが観察される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
7. 免疫検出
- 洗浄バッファーを50 μL/hで10分間流し続け、余分なBSAを除去します。
- マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り除きます。ナノ粒子懸濁液を50μL添加します。
- ナノ粒子の懸濁液を100 μL/hの流速で7分間流します。その後、流量を50μL/hに変更し、さらに15分間流します。
- ディスペンシングニードルを交換します。洗浄バッファーを50 μL/hで10分間流します。洗浄ステップ中にメーカーの仕様に従って蛍光発生基質を準備します。
- マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り除きます。蛍光発生基質を100 μL添加 します(材料表を参照)。蛍光発生基質を50 μL/hで6分間流します。
- シリンジポンプを制御するインターフェースの対応する流量タブとタイマー設定タブで、流量(1 μL/h、3 μL/h、5 μL/h、および10 μL/h)と時間(6分)の測定パラメータを設定します。実行する測定ごとに必ず引き出しモードを選択してください。
- 洗浄ステップでは、追加の流量タブを50 μL/hに設定し、タイマーを3分に設定します。
- 基板が50 μL/hで停止する15秒前に顕微鏡の蛍光をオンにします。基板が1,000ミリ秒の露光時間で停止する10秒前に顕微鏡カメラのソフトウェアで画像キャプチャを開始します。1フレーム/秒(FPS)で6分間イメージングを実行します。
- 50 μL/hでの基板洗浄流量が停止した直後に、目的の流量パラメータ の[開始 ]ボタンをクリックします。選択した測定フローが停止した直後に洗浄フロー(50 μL/h) の開始 ボタンをクリックします。
- 画像キャプチャを停止し、顕微鏡の蛍光をオフにして、基板の光退色を防ぎます。
- 手順 7.8.-7.10 を繰り返します。使用した各測定流量について。
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Representative Results
従来のマイクロミリング技術の分解能を向上させる再現性の高い製造プロトコルを確立することができました。このプロトコルを使用して、高さ200 μmのチャネルで互い違いの制限として機能する高さ5 μmの小さなチャネルの作成が達成されます。千鳥状制限のシンプルな設計により、直径7.5μmの鉄微粒子を捕捉し、マイクロチャネルで圧縮すると、外部磁石がデバイスに近づいたときに磁気トラップを作成できます。この装置により、目的の分析物を免疫学的担体として結合させたナノ粒子を用いてイムノアッセイを行うことができます。この研究では、酵素標識抗体ベースの検出による非競合的間接イムノアッセイが実施されました。モデル抗原(Ag)は、直径100 nmのナノ粒子(NP)に結合したリゾチームタンパク質でした。一次抗体としてウサギ抗リゾチームIgG(AbI)を用い、ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(HRP-AbII)を用いて検出を行った。
検出は、トラップを通過した際にHRP-AbIIと蛍光発生基質との相互作用後に得られた蛍光シグナル強度の変化を、トラップされたナノ粒子と相関させることによって行った。測定を行うために、トラップの前の領域と後の領域を決定した。図7A-Dは、異なる濃度の抗リゾチームAbI(所定の蛍光基質流量(3 μL/h)に対する0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、および1,000 ng/mLの蛍光強度の増加を示しています。これは、基質蛍光の変化が、使用されるAbIの濃度に正比例することを示している。
図7:蛍光測定領域。 蛍光測定値は、使用した一次抗リゾチーム抗体のさまざまな濃度について示されています:(A)0 ng / mL、(B)10 ng / mL、(C)100 ng / mL、および(D)1,000 ng / mL。青い円は、基質がHRP標識二次抗体と反応する5 μmの高さ制限によって形成されたトラップの前後の蛍光測定の領域を示しています。すべての画像は3 μL/hの流れに対応しています。略称:HRP =西洋ワサビペルオキシダーゼ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
しかしながら、所与のAbI濃度について、得られる蛍光のレベルは、蛍光発生基質に使用される流速の関数である。したがって、HRP酵素によるこの基質の変換能力は、流速に反比例する。1 μL/h、3 μL/h、5 μL/h、および10 μL/hの異なる基質流量を評価しました。各実験について、磁気トラップを通過する前後の基板によって与えられる蛍光の差に対応する曲線が得られた。図8A-Cは、(A)10 μL/h、(B)3 μL/h、および(C)1 μL/hの3つの異なる流速で100 ng/mLの濃度で得られた曲線を示しています。使用される流速に応じて、磁気トラップに配置されたHRP結合二次抗体による基質の変換容量は変化する。緑色の曲線は、トラップ内に位置するHRPによる変換後の基質の蛍光強度を表す。より高いフラックスでは、得られた蛍光の最大レベルが減衰することが分かる。赤い曲線は、基質がトラップに到達する前の基礎蛍光を表す。トラップのこの領域における基質蛍光の測定は一定のままであり、チャネル表面の効率的な遮断がない場合、その値は非特異的相互作用の程度に依存する。青い曲線で表される両方の曲線の差を計算しました。
図8:蛍光曲線。 一次抗体の濃度100 ng/mL、流速を(A)10 μL/h、(B)3 μL/h、(C)1 μL/hで得られたグラフ。3 つの色付きの曲線は、トラップの前 (赤い曲線) とトラップ後の蛍光 (緑の曲線) と、時間の経過に伴う 2 つの差 (青の曲線) を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9A-Cは、(A)0 ng/mL、(B)10 ng/mL、および(C)1,000 ng/mLのAbI濃度について、免疫反応の前後に測定された蛍光差曲線を統合しています。0 μL/hの流量の測定は、拡散が支配する静的条件下での免疫反応の測定を示します。1,000 ng/mLの濃度の場合、評価されたすべてのフローの蛍光は飽和します。しかしながら、異なる流れにおける蛍光の互い違いパターンは、基板の拡散によるものであり、それは非常に高い変換率と反応し、より小さな流れを克服する。したがって、この蛍光はトラップの上流ゾーンに戻ります。
図9:蛍光差比。 (A)0 ng/mL、(B)10 ng/mL、および(C)1,000 ng/mLで使用した異なるフラックスの蛍光差(後-前)の要約曲線。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
この装置で得られた測定値は、リゾチームをモデル抗原として実施するイムノアッセイの標準検量線を生成することを可能にする。 図10 は、磁気トラップで行った免疫反応前後の蛍光の差の最大値から得られる検量線を示す。このプロトコルは、1 μL/hから10 μL/hの間のフローを使用して、ミリリットルあたりナノグラムのオーダーの濃度で一次抗リゾチーム抗体の検出を可能にします。1 μL/hでの高い変動性と高い蛍光レベルは、免疫複合体の反応性が、デバイスの抵抗がこの流量に対するデバイスの分解能を低下させるという事実に加えて、この速度が反応基質の流れに有利にならず、トラップ直後に蓄積する傾向があることを示唆しています。
図10:検量線。グラフは、流速ごとに使用した一次抗体(AB1)の濃度に対して得られた曲線の蛍光強度の差の最大値を示す。I/I satは、各蛍光測定で得られた蛍光値(I)の比に対応し、飽和時に到達する最大蛍光値(Isat)に対して正規化されます。エラーバーは、3つの実験の標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:圧電プラットフォームコントローラインタフェース 左の画像は、圧電プラットフォームのz軸変位を制御するインターフェースを示しています。この制限は、3つの圧電アクチュエータに電圧を印加してプラットフォームを上げることによって作成されます。右の画像は、マイクロフライス盤を制御するソフトウェアのインターフェースを示しており、制限が11,000rpmの速度で加工されるx軸とy軸の正確な座標を観察することができます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:デバイスの設計。 設計ソフトウェアを使用して作成されたデバイスの設計が左側に表示されます。設計は接続された2つのチャネルで構成されており、1つは5μmの高さ制限を含むメインチャネルであり、もう1つは廃棄物出口のサイドチャネルです。チャネルは、200μmのエンドミルビットでマイクロミル加工されています。右側のパネルには、製造パラメータが表示されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:入口穴と出口穴のマイクロミリングパラメータ。 (A)機械加工面に直径1.2mm、深さ0.65mmの穴(アクリルの厚さの半分)をマイクロミル加工します。右側のパネルには、エンドミルビットの変位速度、回転、深さパラメータが表示されます。(B)直径1.5mm、深さ0.7mmの穴は、穴を接続する反対側の面にマイクロミリングされます。右側のパネルには、製造パラメータが表示されます。どちらのケースも、800μmのエンドミルビットでマイクロミル加工されています。(C)試薬入口(右)と出口(左)の穴は、両面を加工した後を示しています。大きい直径の半分の寸法はホースを結合することを可能にし、小さい直径の半分によって作成されたバリアはホースが入口を塞ぐのを防ぎます。スケールバー = 1 mm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:ナノ粒子分離。 市販の磁気分離器を使用すると、100nmのナノ粒子を容易に濃縮して、イムノアッセイ中の洗浄ステップを実行できます。15分後に形成されたペレットを赤丸で囲む。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:アクリル平面研削のコード。 生成されたコードは、x軸とy軸に沿って25 mm x 9 mmのアクリル表面を研削するための指示とともに表示されます。コードの最後の行では、拘束条件が加工される座標にドリルビットを配置します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足設計ファイル1:マイクロチャネルと試薬の入口と出口の穴の設計。 デザインには、以前に研磨されたアクリル面に機械加工された異なる色の構造(黒いチャネルと赤い穴)の2つの層が含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足設計ファイル2:反対側の穴の設計。 設計は、前の面と連絡し、ホースを固定するのに役立つ反対側の面のためのより大きな直径の穴で構成されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ナノ粒子を免疫担体として用いた免疫測定用のアクリルマイクロ流体デバイスをマイクロミリング技術を用いて作製した。基板上で直接製造する方法は、マスターモールドの使用およびこれが意味する時間とコストを回避するという利点を有する。ただし、ラピッドプロトタイピングと大量生産に限定されます。
ここでは、既報の補機用圧電台用フライス盤12を用いた。このプラットフォームは、従来のマイクロミリングマシンの10μm解像度よりも優れた垂直解像度で可変深度チャネルを作成するために3D印刷によって製造されました。200 μmのマイクロ流体チャネルに千鳥状の制限を形成する高さ5 μmまでのチャネルのフライス加工を実現しました。
マイクロ流体デバイスの製造に必要なエンドミルビットは、直径200μmと800μmの2つだけで、手動でビットを変更する必要はありません。使用されるフライス盤モデルは、ビットの交換を自動的に実行し、時間の最適化に役立ちます。また、「Z0センシング」モードでは、フライス盤に含まれるセンサーとピンを接触させることで、z軸の原点を高精度に自動的に判定することができます。
このデバイスの設計はシンプルで、5μmの千鳥制限によって中断されたメインチャネルと、微粒子のパージおよび入口として機能するアクセサリチャネルのみで構成されています。しかし、直径7.5μmの鉄微粒子を捕捉するには、このような構造の高精度が要求されます。より大きな制限は、微粒子が保持されずに通過することを可能にし、それはそれらの捕獲および微粒子トラップの形成を妨げる。逆に、制限を小さくすると、チャネルの流動抵抗が大幅に増加し、試薬が多孔質微粒子媒体を通過するのではなく、サイドチャネルを通って出ます。より大きな直径の微粒子を使用して磁気トラップを形成すると、より大きな制限を行うことができます。例えば、直径40μmの粒子には、~30μmの千鳥制限が必要です。その場合、圧電プラットフォームを使用する必要がなく、製造プロトコルが簡素化されます。ただし、より大きな微粒子で構成される多孔質媒体は、ナノ粒子を異なる方法でトラップし、イムノアッセイの性能に影響を与えます。しかし、それが良くなるのか悪いのかは明らかではありません。デバイス7を最適化するためにこれらの機能を研究する作業が進行中です。
必要な精度を達成するために、200μmエンドミルビットを14,500rpmでアクリル表面全体に移動させることにより、アクリル表面の30μm層を除去する平面研削を実施しました。このプロセスにより、サーフェス全体に沿ったz軸で新しい原点を取得して、高さの精度を高めることができます。x軸とy軸(以前に設定した)の原点座標がアクリルの角の1つと一致するように、アクリルを常に同じ位置に揃えることが重要です。同様に、アクリルがベースに完全に固定されていることを確認する必要があります。そうしないと、表面が適切に摩耗せず、次の組み立て手順で問題が発生する可能性があります。
プログラムが平面研削プロセスを完了すると、エンドミルビットをトラップを形成する5 μmの拘束条件が加工される特定の座標に自動的に移動します。エンドミルビットがこの座標に到達した後、表面から浮き上がるのを防ぐことが重要です。マイクロフライス盤に、研削プロセスが終了した後にエンドミルビットが表面から外れないようにするオプションがあるかどうかを特定することをお勧めします。そうしないと、カッターをこの座標に手動で再配置する必要があり、位置精度エラーが発生する可能性があります。
アクリルで千鳥状の拘束を加工するには、1.5μmの特大化が必要です。高さ5μmの場合、マイクロチャネルはチャネルをシールする過程で少し平らになる傾向があるため、圧電プラットフォームは6.5μmに上昇しました。さらに、デバイスの制限の最終長さはわずか50μmです。ただし、後で機械加工するときにメインチャネルの両端と通信するように、より長く機械加工されます。1ステップでは、直径200μmのエンドミルビットと11,000rpmの回転速度を使用して、深さ200μmのチャネルが製造されます。したがって、アクリルの200μm幅のチャネルの加工には数秒しかかかりません。
デバイスの製造における次のステップは、チャネルを外部に接続する穴を機械加工することです。これらの穴は、装置を作動させるシリンジポンプに簡単に接続できるようにするホースを配置するために使用されます。ここで遭遇する問題の1つは、ホースの配置です。試薬の流れを可能にし、機械加工されていないアクリルの面でシールを作成しないようにするには、最適な距離が重要です。この欠点を克服するために、穴は2つのステップで機械加工され、ホースが目的の深さを超えない境界が作成されます。
800 μmのエンドミルビットを使用して、以前にマイクロミルしたのと同じ面に穴のパターンをフライス加工しました。各チャンネルの端に直径1.2mm、深さ0.65mm(アクリルの半分の厚さ)の穴を加工します。さらに、長方形の反対側の角に2つの穴が機械加工されており、アクリルを柱のあるプラットフォーム上に裏向きに並べることができます。スクレーパーまたはカッターを使用して圧電プラットフォームからアクリルを取り除き、破損しないようにすることが重要です。アクリルの反対側では、穴の直径は1.5 mm(前の半分よりも大きい)で、これは固定されるホースの直径に等しい。深さは0.7 mmで、機械加工された両方の穴が互いに連絡するように、前面穴の半分よりわずかに大きくする必要があります。小さい直径の穴によって形成されたバリアは、ホースが底に到達して入口を塞ぐのを防ぎます。プロトコルのこの実装により、チップへの流体入口ホースと出口ホースの配置が大幅に改善されます。
デバイス製造の重要なステップはシーリングです。機械加工されたチャネルを含む面を、同じ寸法の機械加工されていないアクリルカバーでシールする必要があります。アクリルのガラス転移温度に近づかない方法でシートを封止することで、変形のないチャネルを得ることができます。使用される接着方法により、2つのPMMAシート間の溶媒の薄膜がPMMAシートの表面から薄膜を溶解し、次に蒸発し、最終的に特定の動作温度でPMMAシートのモノマーを再接続します。
広く説明されているクロロホルム蒸気暴露の方法が、このアクリル装置を密封するために使用された。文献で以前に報告されているように、クロロホルムは高い結合強度を提供します。ただし、クロロホルムはアクリルを非常に攻撃するため、アクリルは液体クロロホルムと直接接触してはならず、気体のクロロホルムとのみ接触する必要があります。蒸発するクロロホルムとアクリルの間の最適な距離を維持することが不可欠です。アクリルを蓋に接着したガラスのペトリ皿を使用して簡単なシステムを作成しました。ペトリ皿の蓋に接合して取り付けられた9つのスライドで構成されるプラットフォームが使用され、その上にアクリルが両面テープで接着されて距離が調整されました。ガス状クロロホルムプロセスは周囲温度の変化に非常に敏感ですが、ペトリ皿の温度はポリスチレンボックス内に置くことで制御できます。ウォーターシールは、クロロホルムの蒸発が速すぎるのを防ぎます。
対照的に、より高速で特別な機器を必要としない他の報告された接合方法があります。ただし、機械加工せずに2枚のアクリルシートを接合するのにのみ適しているものもあります。同様に、両アクリルシート18の間に溶媒を直接注ぐ必要があるため、接合力の制御が困難であり、5μmのマイクロミル化などの小さな寸法の構造が溶融する危険性が高いという制限がある。
ここで説明するプロトコルを使用して、シーリング圧力と温度が制御された自家製プレスで均質なシールが達成されました。このプレスの構造では、アルミニウムのフレームワークとヒンジの両方が、5kgの重量から9:1の係数に来る機械的な力を増幅するレバーを作成します。発熱体は、アクリル片と接触している厚さ2cmのアルミニウム板に熱を伝達します。
アクリル層が密封されたら、製造プロセスの最後のステップは、外部ホースをデバイスの対応する入口と出口に接続することです。ホースが穴の中に入ると、液体接着剤が外部から塗布されます。ホースの直径が穴よりも小さい場合、液体接着剤が装置に入り込み、チャネルを詰まらせる可能性があります。
マイクロミリングなどの基板上の直接作製方法には、機械加工された表面の粗さや、エッジが十分に区切られていない構造など、いくつかの欠点があります9。チャネルの機械加工面の粗さにもかかわらず、この装置には追加の処理は必要ありません。このボンディングプロトコルについて注意すべき重要な点は、クロロホルムは溶媒にさらされた表面を研磨することによって粉砕されたマイクロチャネルの粗さを減らすことを可能にするということです。表面の研磨が非常に優れているため、光学品質も向上します19。
装置が作製されたら、イムノアッセイに使用する準備をしなければならない。デバイスの超音波洗浄は、チャネルを詰まらせ、イムノアッセイを妨げる可能性のある不要なアクリル破片を除去するために非常に重要です。
さらに、非特異的な相互作用や高いバックグラウンドノイズ信号を回避するために、チャネルの正しい閉塞に特別な注意を払う必要があります。5%BSAによるブロッキングは、チャネル内の抗体の非特異的結合のノイズを低減することが示されており、1時間のインキュベーションで十分です。鉄微粒子は、それらの非特異的結合を防ぐためにシリカ-PEG層でコーティングされています。さらに、微粒子は、デバイス内にトラップを形成する前に(チャネルと同時に)BSAでブロックされます。4°Cでの一晩のインキュベーションが優れており、イムノアッセイ前のデバイスの作製とインキュベーションに1日かかることを意味します。クロロホルムによる粗さの低減と非特異的相互作用を低減するための表面の閉塞は非常にうまく機能することが示されており、このプラットフォームはモデルイムノアッセイ4の標準的なELISAに匹敵する検出限界を達成することができます。
マイクロチャネル制限における微粒子トラップの形成は、手動プロセスである。入る微粒子の数を正確に制御することはできませんが、圧縮された粒子の長さの推定に依存しています。トラップを大きくしたり、余分なものを簡単に取り除くことができます。廃棄された粒子はサイドチャネルに蓄積し、チップから除去する必要はありません。マイクロ粒子はトラップの上流のナノ粒子と相互作用し、イムノアッセイの測定値を変更する可能性があるため、微粒子がメインチャネルに流入するのを防ぐことが重要です。
概念実証として、直径100 nmのナノ粒子に結合したリゾチームタンパク質によって形成された複合体の免疫検出を、特異的一次抗体と対応するHRP標識二次抗体のインキュベートにより実施しました。免疫複合体は装置の外側に形成される。但し、装置内部で免疫学的測定法全体を行うことができる。ナノ粒子の磁気特性により、高性能ネオジム永久磁石セパレーターで簡単に操作できます。反応マイクロチューブを15分間保持するだけで、ナノ粒子が磁石によってマイクロチューブ壁に引き付けられ、デバイス外のイムノアッセイ洗浄ステップが容易になります。
この装置のハイライトは、シンプルで高速(ELISAの4〜6時間と比較して合計アッセイ時間は40分4)、安価(ラテラルフローテストの価格に匹敵する)であることです。これらすべての機能により、このデバイスプロファイルはPOCTの開発に適した候補になります。さらに、この装置は、ゴールドスタンダードのELISA4と同様の分析物濃度を定量的に検出することができ、公衆衛生における疫学研究や意思決定に非常に役立ちます。通常、イムノアッセイ用のマイクロ流体システムは、検出限界は良好だがアッセイ時間が長いか、アッセイ時間は短いが最適ではない検出限界を有する4。免疫担体としての磁性ナノ粒子と検出用の蛍光発生酵素を組み合わせることにより、このプラットフォームはアッセイ時間が短く、検出限界が良好です(以前の研究では、ビオチンを抗原として使用すると、標準のELISA4に匹敵する8 pg/mLの検出限界が見つかりました)。最後に、この技術はラテラルフローテストに比べて重要な利点を持っています:定性的結果だけでなく定量的な結果を与える可能性(「はい」または「いいえ」)。希少材料が使用されている実験室で開発された他のほとんどのマイクロ流体システムとは異なり、このシステムは、医療診断装置の大量生産との互換性が高い低コストの熱可塑性プラスチックであるアクリル(PMMA)で作られています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、メキシコのConacytが「Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológics y de Innovación」の助成金312231の下で、AMEXCIDとメキシコ外交省(SRE)によって「Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2」の助成金の下で支援されました。JAHOは、コナシットメキシコの博士課程奨学金に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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