Summary
微流体是开发诊断测试的强大工具。然而，通常需要昂贵的设备和材料，以及费力的制造和处理技术。在这里，我们详细介绍了在低成本和易于使用的环境中用于磁性微粒和纳米颗粒免疫测定的丙烯酸微流体装置的制造方案。
Abstract
微流体系统极大地改进了免疫测定技术。然而，许多微细加工技术需要专门、昂贵或复杂的设备，这使得制造成本高昂且与大规模生产不兼容，这是在资源匮乏的环境中采用即时检测 （POCT） 的最重要先决条件之一。这项工作描述了使用计算机数控（CNC）微铣削技术进行纳米颗粒偶联酶免疫测定测试的丙烯酸（聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA）装置的制造过程。微流体装置的功能通过执行免疫测定来显示，以使用溶菌酶作为偶联到100nm磁性纳米颗粒的模型抗原来检测商业抗体。该设备集成了高度仅为 5 μm 的物理交错限制，用于通过放置外部磁铁来捕获构成磁阱的磁性微粒。这样，共轭纳米颗粒免疫载体上的磁力足以捕获它们并抵抗流动阻力。这种微流体装置特别适用于低成本的大规模生产，而不会损失免疫测定性能的精度。
Introduction
近年来，微流体在免疫测定技术中发挥了重要作用1。与传统免疫分析相比，小型化技术具有许多突出的优势，例如减少样品和试剂消耗、缩短孵育时间、高效的溶液交换以及更高的集成度和自动化程度2。
此外，免疫测定中的微流体系统与磁性纳米颗粒作为免疫支持物相结合，大大减少了孵育时间，由于增加了表面体积比3，实现了高检测灵敏度。颗粒的布朗运动改善了抗原-抗体复合物4，5形成过程中的反应动力学。此外，纳米颗粒的磁性提供了集成到不同微流体器件配置中的多功能性，使其成为小型化片上生物传感系统中信号传导和分子捕获的理想候选者5。然而，由于高表面体积比6，磁力明显弱于纳米尺度的阻力。因此，捕获纳米颗粒用于关键的免疫测定步骤（如洗涤和检测）可能具有挑战性，而传统的磁铁是不够的4.
操纵纳米颗粒的一种有效方法是使用由铁微粒形成的微流体磁阱，铁微粒包装在微流体结构3中。因此，当外部磁铁接近时，在磁化多孔介质内，磁力和磁通力之间会产生复杂的相互作用。作用在纳米颗粒上的磁力足够强，可以捕获它们并抵抗流动阻力3，4，7。这种方法需要微细加工技术，达到几微米量级的分辨率，以产生保留微粒的微度量结构。
目前的微细加工技术允许高分辨率制造从几微米到数百纳米的结构8。然而，其中许多技术需要专门的、昂贵的或复杂的设备。主要困难之一是需要用于模具制造的洁净室，这仍然昂贵且耗时8，9。最近，微流体工程师通过开发各种替代制造方法克服了这一缺点，这些方法具有降低成本、缩短周转时间、更便宜的材料和工具以及增加的功能等各种优势8。通过这种方式，新的微细加工技术的发展带来了低成本、非洁净室的方法，其分辨率低至 10 μm8。图案可以直接在基板上使用，而不会产生昂贵的成型图案，从而避免了耗时的过程。直接制造方法包括CNC铣削，激光烧蚀和直接光刻8。所有这些方法都适用于在各种材料中生产高纵横比通道，无论其硬度如何9，从而在微流体装置中实现新的有利几何形状，物理行为和质量8。
CNC微铣削使用从基板上去除块状材料的切削工具创建微尺度结构，是微流体装置的有效制造方法10，11。微铣削技术可用于微流体应用，可直接在工作表面上创建微通道和特征，具有关键优势：可以在短时间内（不到 30 分钟）制造工件，从而显着缩短从设计到原型的周转时间12.此外，不同材料、尺寸和形状的切割配件的广泛可用性使数控铣床成为一种合适的工具，可以在多种类型的低成本一次性材料中制造不同的功能13。
在微铣削中常用的所有材料中，热塑性塑料由于其许多有利的性能和与生物应用的兼容性而仍然是首选10，14。热塑性塑料是微流体系统的一种有吸引力的基材，因为它们在开发低成本、一次性分析系统方面具有显著优势9.此外，这些材料非常适合大批量制造工艺，使其适合商业化和大规模生产。由于这些原因，自微流体10早期以来，PMMA等热塑性塑料一直被认为是可靠和坚固的材料。已经描述了不同的协议来制造热塑性塑料中的闭合通道，例如溶剂键合15，热键合16和紫外线（UV）/臭氧表面处理粘合17。
在许多情况下，对于某些需要小于10μm结构的微流体应用，使用传统微铣床实现的定位分辨率是不够的。高端微铣具有足够的分辨率。不幸的是，由于价格高昂，它的使用仅限于少数用户12。此前，我们的研究小组报告了一种低成本刀具的制造和操纵，该刀具允许加工小于10μm的结构，克服了传统铣床的分辨率12。该夹具是通过3D打印制造的具有简单电子设备的平台，包含三个压电致动器。表面包含铰链形接头，当压电元件同时作用时，可以将其抬起。Z轴位移可以控制在500nm的分辨率和±1.5μm12的精度下。
本文介绍了通过微铣削技术制造丙烯酸设备（PMMA）的过程步骤。芯片设计由一个宽 200 μm 、高 200 μm 的主通道和一个相同尺寸的侧通道组成，用于吹扫试剂的流动。在中心区域，通道被高度仅为5μm的物理限制中断，该限制由该组12制造的3D打印压电平台制造，以捕获构成纳米颗粒磁性陷阱的磁性微粒通过放置外部磁铁。我们通过执行免疫测定来显示微流体装置的操作，以使用溶菌酶作为偶联到100nm磁性纳米颗粒的模型抗原来检测商业抗体。该设备结合了使其独特的不同功能4：使用磁性纳米颗粒作为免疫支持将总测试时间从几小时减少到几分钟;使用荧光酶进行检测可实现与标准酶联免疫吸附测定（ELISA）相当的检测限;并且使用热塑性塑料作为制造材料使其与大规模生产兼容，这是以前的微流体纳米颗粒的磁性陷阱3所没有的，并使其成为开发POCT的绝佳候选者。
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Protocol
1. 微铣
- 平面磨削
- 打开微铣床和压电控制器。启动各自的控制软件12.
- 选择所需的立铣刀钻头（直径 200 μm 和 800 μm）。将它们放在铣床的适当隔间中（图1）。
- 用 800 μm 立铣刀钻头切割 9 mm x 25 mm 矩形的 1.3 mm 厚 PMMA。用双面胶带小心地将这些矩形之一连接到压电平台上（图2）。
注意： 确保始终将亚克力矩形放置在相同位置，以便其中一个角与加工的 x 轴和 y 轴上的原点坐标重合。 - 连接 z 传感器并将其放置在 PMMA 矩形的表面上。选择检测引脚并将其移到传感器表面上。在不接触传感器的情况下手动降低引脚。激活 Z0感应 模式（图3）。
- 选取 200 μm 立铣刀钻头并将其移动到 x， y 原点。卸下 z 传感器。小心地降低钻头，不要接触丙烯酸表面。
- 以 14，500 rpm 的速度旋转 200 μm 立铣刀钻头。慢慢将其降低到 z 轴上的原点坐标 （z = 0）。将 z 轴重置在原点下方 30 μm。将此坐标设置为新的 z 原点。
注：如果钻头不旋转，切勿降低钻头。否则，它有破裂的风险。 - 单击微铣机软件中的切割按钮以激活切割面板。单击“添加”按钮并选择.txt文件（补充编码文件1），其中包含先前创建的用于研磨丙烯酸表面的代码。点击 输出量 按钮开始该过程。
- 将立铣刀钻头带到将加工限制的坐标。通过单击“ 暂停 ”按钮，防止立铣刀钻头在到达此坐标后从地面抬起。否则，手动将立铣刀钻头重新定位到此坐标（图 4A）。
- 铣削 5 μm 限制
- 将立铣刀钻头的转速设置为 11，000 rpm。用压电平台的界面将平台升高6.5μm（补充图S1）。沿 y 轴将立铣刀钻头移动 500 μm。使用控制接口将压电平台返回到其在z轴上的初始值。
- 微通道铣削
- 从设计软件中打开先前创建的设计文件（补充设计文件 1）。单击 “打印 ”按钮。访问 “属性 ”菜单，然后单击与包含要加工设计的图层相对应的颜色窗口。在 “工具” 面板中设置补充 图 S2 中指定的制造参数。
- 通过选择工具下拉菜单中的无选项来停用不需要的图层。
- 铣削孔
- 切换到 800 μm 立铣刀钻头。通过单击相应的颜色窗口激活直径为 1.2 mm 的孔的设计层。
- 重复步骤1.3.2.，但在这种情况下，按照 孔的补充图S3A 中所述设置相应的制造参数。
注意： 机加工孔的深度是亚克力厚度的一半。 - 在新平台上以倒置方式在矩形的对角上加工两个额外的孔，以倒置方式对齐丙烯酸（图4B）。从压电平台上剥离丙烯酸矩形。翻转亚克力，用双面胶带将其粘在带有机加工支柱的适配器上（图 4C，D）。
- 从设计软件中打开包含对面孔设计的文件（补充设计文件 2）。按照 补充图S3B中所述设置相应的制造参数。铣削直径为1.5毫米，深度为0.7毫米的试剂入口和出口孔的剩余一半（补充图S3C）。
图 1：立铣刀钻头放置。 （A） 将 200 μm 和 800 μm 立铣刀钻头放置并通过螺钉固定到钢支架上。（B）每个立铣刀钻头放置在微铣床的特定隔间内，以便自动选择。请点击此处查看此图的大图。
图 2：压电平台。 该平台由3D打印制造，由两个由铰链连接的六边形底座组成，铰链允许由三个压电致动器控制的z轴上的精细位移。还观察到一个丙烯酸适配器，其上附有PMMA矩形，并允许设置坐标的对齐角。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：Z 轴校准。 详细介绍了 z 轴校准的步骤。（A） z传感器包括一根插入微铣床的电缆。（B） 将传感器直接放置在待加工的表面上。（C） 检测销由放置在立铣刀钻头旁边的特殊隔间中的金属棒组成。（D）当两个附件接触时，微铣机自动计算z轴上的原点坐标。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：精馏的丙烯酸 表面。 （A） 直径为 200 μm 的立铣刀钻头扫过丙烯酸矩形的整个表面，去除约 30 μm 高的层。（B）图像显示了在先前精馏的丙烯酸表面铣削的不同结构。观察试剂入口和出口的通道和孔。5 μm 的限制是肉眼看不到的。（C） 带有对准孔的微铣表面和在相对角带有对准柱的适配器。（D）亚克力在带有柱子的适配器上倒置对齐，对准孔适合该柱子。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
2. 通道密封
- 亚克力清洗
- 从支柱适配器平台上取下亚克力矩形。取另一个未加工的丙烯酸矩形。用异丙醇（IPA）清洗两张丙烯酸片，然后用蒸馏水冲洗。戴上手套，避免接触异丙醇。
- 将丙烯酸浸入超声波浴中10分钟（图5A，B）。
- 气态氯仿暴露
- 完美干燥两张亚克力板。用双面胶带将它们粘在玻璃培养皿盖的内部。确保将加工通道的一侧暴露在外（图5C）。戴上手套，避免直接接触亚克力表面。
- 将玻璃培养皿的底座放在较大的玻璃培养皿内（图5D）。将1mL氯仿倒入培养皿的底部。快速将盖子盖上，将亚克力板连接到内侧。
- 立即将蒸馏水添加到较大的培养皿的底部，直至培养皿盖的水平。让丙烯酸暴露于氯仿气体1分钟（图5E）。
注意：考虑到较长的氯仿暴露时间会侵蚀丙烯酸表面，并且5μm的限制会熔化，改变其高度或完全消失。 - 倾斜培养皿以打破产生的水封。通过揭开培养皿立即从氯仿中去除丙烯酸。小心不要洒水。
注意：在通风橱中进行此过程并使用手套，因为氯仿具有剧毒。
- 通过压制和加热粘合
- 从双面胶带上剥离两个亚克力板。
- 将两种丙烯酸树脂与暴露于气态氯仿的侧面面对面对齐，形成三明治。将丙烯酸树脂置于18 kgf / cm2 和90°C温度的压榨机中（图5F，G）。
注意：建议将丙烯酸纵向对齐，并在 2 分钟后改变其对齐方式以获得更好的密封效果。如果在此时间之后密封不足，请将其放回压力机中不超过1分钟。使用立体镜检查通道的状态和限制。考虑到，如果超过压制时间，则存在取消限制的风险。
- 软管附件
- 剪下2-3厘米长的软管。完全直切。用瞬干液体粘合剂将每根软管连接到设备的孔上（图 6A）。防止粘合剂进入芯片内部。
图 5：设备的密封过程。 （A）将每块亚克力板放入装有蒸馏水的可重新密封的袋子中，并浸入超声波浴中。 （B）左图显示了制造后的通道，右图显示了用IPA和超声波浴洗涤后的同一设备， 从微通道中去除所有杂质和丙烯酸残留物。观察到中断200μm中心通道的限制边缘，这证实了成功的铣削过程。比例尺 = 500 μm。 （C）两种丙烯酸树脂都干燥并粘附在盖子上的玻璃平台上。（D）将培养皿的底部放置在另一个直径较大的培养皿内。（E）关闭培养皿时，水封可防止气态氯仿逸出。（F） 重量为 5 kg 的杠杆元件的说明。（G） 打开杠杆的图像，以红色显示放置丙烯酸的区域。请点击此处查看此图的大图。
3. 设备准备
- 使用注射器用蒸馏水填充通道。确保没有泄漏或流动阻力。将设备浸入超声波浴中10分钟，以去除通道内任何残留的丙烯酸，粘合剂或不需要的材料。
- 清空设备通道内的水。使用注射器引入用5%（w / v）牛血清白蛋白（BSA）制备的封闭溶液，该溶液在1x Tris缓冲盐水（TBS）中稀释，然后通过0.2μm聚醚砜（PES）注射器过滤器过滤。
- 在5%BSA中制备直径为7.5μm的铁微粒悬浮液。
注意：微粒先前用二氧化硅-聚乙二醇（PEG）层进行功能化，该层赋予蛋白质吸收阻力4。 - 将芯片和微粒悬浮液与封闭溶液在室温下孵育至少1小时。如果可能，允许在4°C下阻塞过夜。
4. 微粒捕集器的形成
- 用注射器针头通过侧通道出口软管将微粒插入芯片中。垂直放置芯片，让微粒在重力作用下通过侧通道流动。将芯片以 90° 的两步旋转 180°，并允许微粒在 5 μm 限制下瞄准和压实。
- 通过重力向侧通道旋转 45° 去除多余的微粒。
- 保持设备直立以避免解开微粒捕获器。有关微粒捕集器形成过程的摘要，请参见 图6B 。
5. 免疫分析
- 纳米颗粒制备
- 取 2 μL 先前与溶菌酶（抗原模型）偶联的 100 nm 纳米颗粒的悬浮液。将其加入装有 100 μL 封闭溶液的 1.5 mL 微量离心管中。在4°C孵育过夜。
- 加入 150 μL 洗涤缓冲液（1x TBS，0.05% 吐温 20）。
- 将 1.5 mL 微量离心管放入磁选机中。保持15分钟以允许纳米颗粒的分离（补充图S4）。
注意：磁选机的最小体积为 200 μL。 避免使用较小的体积。 - 用微量移液管从管中取出液体。避免与形成纳米颗粒颗粒的管壁接触。
- 加入 250 μL 新鲜洗涤缓冲液。保持管子搅拌15分钟。
- 重复步骤 5.1.3.-5.1.5。2倍以上，仅摇晃5分钟。
- 加入所需浓度的一抗溶菌酶抗体（参见 材料表）。调整至抗体稀释剂（1x TBS、1% BSA、0.05% 吐温 20）的最终体积 100 μL。
- 在37°C孵育15分钟。 在室温下再摇晃15分钟。
- 重复洗涤步骤5.1.2.-5.1.6。
- 加入 100 μL 抗体稀释剂。加入辣根过氧化物酶偶联二抗（HRP-AbII）（参见 材料表），稀释度为1：500。
- 重复洗涤步骤5.1.2.-5.1.6。
- 将纳米颗粒保存在最终体积为 50 μL 的抗体稀释剂中。
6. 实验安装
- 用水填充两个 100 μL 玻璃注射器，将 6.5 cm 长的软管连接到每个注射器，将金属针插入软管末端，然后将两个注射器放在计算机控制的注射泵上。
- 用热量密封丙烯酸装置的所有软管。
- 切断入口软管，只保留几毫米。用洗涤缓冲液填充分配针，然后将其插入切割软管中。在将针头连接到设备之前，让溶液滴落，以防止空气进入设备。
- 从侧通道切断出口软管。连接到注射泵。接下来，对主通道出口软管执行相同的步骤。
注意：执行步骤 6.3.-6.4 是关键。为了避免拆开微粒捕集器的包装。如果可能，请在这些步骤中借助放大镜验证疏水阀的状态。 - 将载玻片放在显微镜载物台上。用双面胶带将磁铁连接到载玻片上，并在每侧放置一小块胶带，将芯片边缘固定在玻璃上。
- 通过注射泵控制器中的“ 流量 ”和 “单位” 选项卡设置 50 μL/h 的流速。选择 抽出 模式，然后单击 “开始 ”按钮以激活洗涤缓冲液的流动。
- 小心地，以水平方式将设备与磁铁一起接近滑块，以使包含陷阱的芯片区域与磁铁接触。
- 用双面胶带将设备的边缘粘在玻璃上以防止移动。避免阻塞显微镜的光路（图6C）。
图 6：最终设备配置 。 （A） 亚克力装置，软管连接到相应的输入和输出。刻度以厘米为单位显示设备的尺寸。（B）形成微粒捕集器的协议。当设备放置在垂直位置时，微粒通过重力流过通道。微粒在5μm限制下浓缩。通过侧通道旋转芯片，可以轻松去除多余的微粒。芯片保持垂直以在免疫测定之前保留陷阱。（C）安装在装有磁铁的载玻片上的微流控装置，倒置荧光显微镜的载物台上。观察添加试剂的分配针，以及连接到注射泵的出口软管。 请点击此处查看此图的大图。
7. 免疫检测
- 保持洗涤缓冲液以 50 μL/h 流动 10 分钟以去除多余的 BSA。
- 用微量移液器从分配针上取出剩余的洗涤缓冲液。加入 50 μL 纳米颗粒悬浮液。
- 以100μL / h的流速流动纳米颗粒悬浮液7分钟。随后，将流速更改为 50 μL/h 并再流动 15 分钟。
- 更换分配针。以50μL / h流动洗涤缓冲液10分钟。在洗涤步骤中根据制造商的规格制备荧光底物。
- 用微量移液器从分配针上取出剩余的洗涤缓冲液。加入 100 μL 荧光底物（参见 材料表）。以 50 μL/h 的速度流动荧光底物 6 分钟。
- 在控制注射泵的界面的相应流速和设置计时器选项卡中设置流速（1 μL/h、3 μL/h、5 μL/h 和 10 μL/h）和时间（6 分钟）测量参数。确保为要执行的每个测量选择退出模式。
- 将额外的 流速 选项卡设置为 50 μL/h，并将计时器设置为 3 分钟 以进行洗涤步骤。
- 在底物以50μL/h停止前15秒打开显微镜的荧光。在基板停止前10秒，使用显微镜相机的软件开始图像捕获，曝光时间为1，000毫秒。以 1 帧/秒 （FPS） 的速度进行 6 分钟的成像。
- 在50μL/h的底物洗涤流速停止后，立即单击所需流速参数的 开始 按钮。在所选测量流量停止后，立即单击洗涤流量（50 μL/h）的 开始 按钮。
- 停止图像捕获并关闭显微镜的荧光，以避免基材的光漂白。
- 重复步骤 7.8.-7.10。对于所使用的每个测量流速。
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Representative Results
有可能建立一个高度可重复的制造方案，以提高传统微铣削技术的分辨率。使用该协议，可以实现在200μm高通道中作为交错限制运行的低至5μm高度的通道的制造。交错限制的简单设计可捕获直径为 7.5 μm 的铁微粒，当在微通道中压实时，当外部磁铁接近设备时，可以创建磁阱。该装置允许使用与目标分析物偶联的纳米颗粒作为免疫学支持物进行免疫测定。在这项工作中，进行了具有基于酶标记抗体的检测的非竞争性间接免疫测定。模型抗原（Ag）是与直径为100 nm的纳米颗粒（NPs）偶联的溶菌酶蛋白。以兔抗溶菌酶IgG为一抗（AbI），使用兔辣根过氧化物酶偶联二抗（HRP-AbII）进行检测。
通过将HRP-AbII与荧光底物在通过陷阱与包埋的纳米颗粒时相互作用后获得的荧光信号强度的变化相关联来进行检测。为了进行测量，确定了疏水阀之前的区域和之后的区域。图7A-D显示了给定荧光底物流速（3 μL/h）下不同浓度抗溶菌酶AbI的荧光强度增加：0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL和1，000 ng/mL。这表明底物荧光的变化与所用AbI的浓度成正比。
图 7：荧光测量区域。 显示了不同浓度的抗溶菌酶一抗溶菌酶抗体的荧光测量结果：（A） 0 ng/mL、（B） 10 ng/mL、（C） 100 ng/mL 和 （D） 1，000 ng/mL。蓝色圆圈表示由5μm高度限制形成的陷阱之前和之后的荧光测量区域，其中底物与HRP偶联的二抗反应。所有图像对应于 3 μL/h 的流量。缩写：HRP = 辣根过氧化物酶。 请点击此处查看此图的大图。
然而，对于给定的AbI浓度，获得的荧光水平是用于荧光底物的流速的函数。因此，HRP酶对该底物的转化能力与流速成反比。评估了1 μL/h、3 μL/h、5 μL/h和10 μL/h的不同底物流速。对于每个实验，获得对应于基板通过磁阱前后给出的荧光差异的曲线。图8A-C显示了三种不同流速下浓度为100 ng/mL时获得的曲线：（A）10 μL/h、（B）3 μL/h和（C）1 μL/h。根据所使用的流速，放置在磁阱中的HRP偶联二抗对底物的转换能力各不相同。绿色曲线表示位于陷阱中的HRP转换后底物的荧光强度。可以看出，在较高的通量下，获得的最大荧光水平衰减。红色曲线表示底物到达陷阱之前的基础荧光。在陷阱的该区域中，底物荧光的测量保持不变，如果通道表面没有有效阻断，其值取决于非特异性相互作用的程度。我们计算了两条曲线之间的差异，由蓝色曲线表示。
图 8：荧光曲线。 在一抗浓度为 100 ng/mL 且流速为 （A） 10 μL/h、（B） 3 μL/h 和 （C） 1 μL/h 时获得的图表。三条彩色曲线表示陷阱之前（红色曲线）和陷阱后（绿色曲线）测量的荧光以及两者之间的差异（蓝色曲线）随时间的变化。 请点击此处查看此图的大图。
图9A-C积分了免疫反应前后测量的荧光差异曲线，用于（A）0 ng/mL、（B）10 ng/mL和（C）1，000 ng/mL的不同流量。流速为 0 μL/h 的测量表示在扩散控制的静态条件下免疫反应的测量。对于 1，000 ng/mL 的浓度，荧光对于评估的所有流量都饱和。然而，不同流下的荧光交错模式是由于底物的扩散，其反应速率如此之高，以至于它克服了较小的流动。因此，该荧光返回到陷阱的上游区域。
图9：荧光差异比。 在 （A） 0 ng/mL、（B） 10 ng/mL 和 （C） 1，000 ng/mL 下使用的不同通量的荧光差异（之后-之前）的汇总曲线。 请点击此处查看此图的大图。
使用该装置获得的测量结果可以为使用溶菌酶作为模型抗原进行的免疫测定生成标准校准曲线。 图10 显示了从磁阱中进行免疫反应之前和之后荧光差异的最大值获得的校准曲线。该协议允许使用1μL / h和10μL / h之间的流量检测浓度为纳克/毫升的主要抗溶菌酶抗体。1μL/h 的高变异性和高荧光水平表明免疫复合物的反应性使得该速率不利于反应底物的流动，并且倾向于在陷阱后积聚，此外设备电阻降低了设备对该流速的分辨率。
图 10：校准曲线。 该图显示了每种流速下所用一抗浓度（AB1）的曲线荧光强度差异的最大值。I/Isat 对应于每次荧光测量（I）获得的荧光值的比值，相对于饱和时达到的最大荧光值（Isat）进行归一化。误差线表示三个实验的标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：压电平台控制器接口。 左图显示了控制压电平台z轴位移的接口。该限制是通过向三个压电致动器施加电压来升高平台而创建的。右图显示了控制微铣床的软件界面，其中可以观察到 x 轴和 y 轴上的精确坐标，其中限制以 11，000 rpm 的速度加工。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：设备的设计。 使用设计软件创建的设备的设计显示在左侧。该设计由两个相连的通道组成，一个是包含 5 μm 高度限制的主通道，另一个是废物出口的侧通道。通道用 200 μm 立铣刀钻头进行微铣削。右侧面板显示了制造参数。 请点击此处下载此文件。
补充图S3：入口和出口孔的微铣削参数。 （A） 在机加工面上对直径 1.2 mm 和深度为 0.65 mm 的孔（丙烯酸厚度的一半）进行微铣。右侧面板显示立铣刀钻头的位移速度、旋转和深度参数。（B） 在连接孔的对面上对直径 1.5 mm 和 0.7 mm 深的孔进行微铣。右侧面板显示了制造参数。两种表壳均用 800 μm 立铣刀钻头进行微铣削。（C） 加工两个面后显示试剂入口（右）和出口（左）孔。较大直径的一半尺寸允许软管耦合，而较小直径的一半产生的屏障可防止软管堵塞入口。比例尺 = 1 mm。 请点击此处下载此文件。
补充图S4：纳米颗粒分离。 使用商用磁选机，可以轻松浓缩100nm纳米颗粒以在免疫测定过程中执行洗涤步骤。在红色圆圈中观察到15分钟后形成的颗粒。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件1：亚克力表面研磨代码。 生成的代码显示了沿 x 轴和 y 轴磨削 25 mm x 9 mm 丙烯酸表面的说明。代码的最后一行将钻头定位在将要加工约束的坐标处。 请点击此处下载此文件。
补充设计文件1：微通道和试剂入口和出口孔的设计。 该设计包含两层不同颜色的结构（黑色通道和红色孔），这些结构在先前研磨的丙烯酸面上加工。 请点击此处下载此文件。
补充设计文件2：设计对面的孔。 该设计由较大直径的孔组成，用于对面，与先前的孔相通并用于固定软管。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
使用微铣削技术制备了一种使用纳米颗粒作为免疫载体的用于免疫测定的丙烯酸微流体装置。在基材上直接制造的方法具有避免使用母模以及这意味着时间和成本的优点。但是，它仅限于快速原型制作和大批量设备制造。
在这里，我们使用了先前报道的铣床12的附件压电平台。该平台通过3D打印制造，以创建垂直分辨率优于传统微铣床10μm分辨率的可变深度通道。我们实现了高达5μm高的通道的铣削，这些通道在200μm的微流体通道中形成交错限制。
制造微流体装置只需要两个直径为 200 μm 和 800 μm 的立铣刀钻头，无需手动更换钻头。所使用的铣床型号自动执行位交换，这有助于时间优化。此外，“Z0感应”模式允许通过接触传感器和铣床中包含的销，在z轴上自动高精度地确定原点。
该装置的设计很简单，仅由被 5 μm 交错限制中断的主通道和一个用作微粒吹扫和入口的附件通道组成。然而，这种结构的高精度对于捕获直径为7.5μm的铁微粒的限制是必需的。较大的限制允许微粒在没有保留的情况下通过，这阻止了它们的捕获和微粒陷阱的形成。相反，较小的限制大大增加了通道的流动阻力，并导致试剂通过侧通道退出而不是通过多孔微粒介质。使用更大直径的微粒形成磁阱将允许进行更大的限制。例如，直径为 40 μm 的颗粒需要 ~30 μm 交错限制。在这种情况下，没有必要使用压电平台，并且简化了制造协议。然而，由较大微粒组成的多孔介质会以不同的方式捕获纳米颗粒，并会影响免疫测定的性能;但是，目前尚不清楚情况是好是坏。研究这些功能以优化设备的工作正在进行中7.
为了达到所需的精度，通过以 14，500 rpm 的速度将 200 μm 立铣刀钻头穿过整个丙烯酸表面，进行了表面磨削以去除 30 μm 的丙烯酸表面层。此过程允许沿整个表面在 z 轴上获得新的原点，以提高高度精度。始终将亚克力对齐在同一位置至关重要，以便 x 轴和 y 轴上的原点坐标（先前设置）与丙烯酸的一个角重合。同样，应确保丙烯酸完美地固定在底座上;否则，表面可能无法正确磨损，从而导致以下组装步骤出现问题。
一旦程序完成平面磨削过程，它会自动将立铣刀钻头带到特定坐标，在该坐标中将加工形成疏水阀的 5 μm 约束。防止立铣刀钻头在到达该坐标后从表面上抬起至关重要。建议确定微铣床是否具有在磨削过程完成后防止立铣刀钻头从表面上脱落的选项。否则，需要手动将刀具重新定位到此坐标，这可能会导致定位精度错误。
为了加工丙烯酸中的交错限制，必须超大1.5μm。对于5μm高度，压电平台升高到6.5μm，因为在密封通道的过程中微通道趋于变平。此外，器件中限制的最终长度仅为50μm;但是，它的加工时间更长，以确保在之后加工时与主通道的两端通信。一步到位，使用 200 μm 直径的立铣刀钻头和 11，000 rpm 的转速制造 200 μm 深的通道。因此，在丙烯酸中加工200 μm宽的通道仅需几秒钟。
该设备制造的下一步是加工将通道连接到外部的孔。这些孔用于放置软管，使设备能够轻松连接到运行它的注射泵。这里遇到的问题之一是软管的放置。最佳距离对于允许试剂流动并避免与未加工的丙烯酸表面形成密封至关重要。为了克服这一缺点，分两步加工孔，以形成软管不超过所需深度的边界。
使用 800 μm 立铣刀钻头，在先前经过微铣削的同一面上铣削孔的图案。在每个通道的末端加工孔，直径为1.2毫米，深度为0.65毫米，是亚克力厚度的一半。此外，在矩形的对侧角上加工了两个孔，这使得亚克力可以在带有柱子的平台上面朝下对齐。使用刮刀或切割器从压电平台上去除丙烯酸以避免损坏它很重要。在亚克力的另一侧，孔的直径为1.5毫米（比前半部分大），等于要固定的软管的直径。深度为 0.7 mm，应略大于正面孔的一半，以确保两个加工孔相互连通。由较小直径的孔形成的屏障可防止软管到达底部并阻塞入口。协议中的这种实现极大地改善了流体入口和出口软管在芯片上的位置。
设备制造的关键步骤是密封。有必要用相同尺寸的未加工亚克力盖密封包含机加工通道的面。用不接近丙烯酸玻璃化转变温度的方法密封板材可以获得无变形通道。通过所使用的粘合方法，两个PMMA片之间的溶剂薄膜从PMMA片表面溶解一层薄膜，然后蒸发，最后在特定的工作温度下重新连接PMMA片的单体。
广泛描述的氯仿蒸汽暴露方法用于密封这种丙烯酸装置。如先前文献报道的那样，氯仿提供高键合强度;然而，由于氯仿非常积极地侵蚀丙烯酸，丙烯酸不应与液态氯仿直接接触，而只能与气态氯仿接触。在蒸发的氯仿和丙烯酸之间保持最佳距离至关重要。我们使用玻璃培养皿创建了一个简单的系统，其中丙烯酸粘附在盖子上。使用由九张载玻片连接并连接到培养皿盖子上的平台，用双面胶带粘附丙烯酸树脂以调节距离。尽管气态氯仿工艺对环境温度的变化非常敏感，但可以通过将它们放置在聚苯乙烯盒中来控制培养皿的温度。水封可防止氯仿蒸发过快。
相比之下，还有其他报道的连接方法更快，不需要特殊设备;但是，有些仅适用于连接两个亚克力板而不进行加工。同样，由于溶剂必须直接倒入两个丙烯酸板18之间，因此很难控制结合力，具有熔化小尺寸结构的高风险，例如微铣削的5μm限制。
使用此处描述的方案，使用自制压力机实现均匀密封，通过该压机控制密封压力和温度。对于该压力机的构造，铝框架和铰链都创建了一个杠杆，可将重量从 5 kg 的机械力放大到 9：1 的系数。加热元件将其热量传递到与亚克力件接触的 2 厘米厚的铝板上。
一旦丙烯酸层密封，制造过程的最后一步是将外部软管连接到设备的相应入口和出口。一旦软管进入孔内，液体粘合剂就会在外部施加。如果软管的直径小于孔，液体粘合剂可能会进入设备，堵塞通道。
基体上的直接制造方法（例如微铣）有一些缺点，例如加工表面的粗糙度和边缘界限不明确的结构9。尽管通道的加工表面粗糙，但该设备不需要额外的处理。关于这种键合方案需要注意的重要一点是，氯仿允许通过抛光暴露于溶剂的表面来降低研磨微通道的粗糙度。表面的抛光非常好，甚至提高了光学质量19.
制造设备后，必须准备将其用于免疫测定。设备的超声清洗对于去除任何可能堵塞通道并干扰免疫测定的不需要的丙烯酸碎片非常重要。
此外，必须特别注意通道的正确阻塞，以避免非特异性相互作用和高背景噪声信号。用5%BSA封闭已被证明可以降低通道中抗体非特异性结合的噪音，孵育1小时就足够了。铁微粒涂有二氧化硅-PEG层，以防止其中的非特异性结合。此外，在设备中形成陷阱之前，微粒被BSA阻挡（与通道同时）。在4°C孵育过夜更好，这意味着在免疫测定之前需要1天来制造和孵育设备。氯仿降低粗糙度和表面堵塞以减少非特异性相互作用已被证明效果非常好，使该平台能够达到与模型免疫测定4中的标准ELISA相当的检测限。
微通道限制中微粒捕集器的形成是一个手动过程。虽然没有精确控制进入的微粒数量，但我们依赖于对压实颗粒长度的估计。可以使疏水阀变大或轻松去除多余的疏水阀。丢弃的颗粒积聚在侧通道中，不需要从芯片中取出。防止微粒流入主通道至关重要，因为它们可以与陷阱上游的纳米颗粒相互作用并修改免疫测定测量。
作为概念验证，我们通过孵育特异性一抗和相应的HRP标记的二抗，对与100nm直径纳米颗粒偶联的溶菌酶蛋白形成的复合物进行了免疫检测。免疫复合物在设备外部形成。但是，可以在设备内执行整个免疫测定。纳米颗粒的磁性允许使用高性能钕永磁分离器轻松操作。必须简单地将反应微管保持15分钟，以使纳米颗粒被磁铁吸引到微管壁上，这有助于在设备外进行免疫测定洗涤步骤。
该设备的亮点是简单，快速（总测定时间为40分钟4，而ELISA为4-6 小时）且便宜（与侧向流动测试的价格相当）。所有这些功能使该器件配置文件成为开发POCT的良好候选者。此外，该设备可以定量检测类似于金标准ELISA4的分析物浓度，这对于流行病学研究和公共卫生决策非常有价值。通常，用于免疫测定的微流体系统具有良好的检测限但检测时间长，或者它们的检测时间短但检测限欠佳4。通过将磁性纳米颗粒作为免疫支持物和荧光酶相结合进行检测，该平台具有较短的测定时间和良好的检测限（在以前的工作中，我们发现使用生物素作为抗原的检测限为8 pg/mL，与标准ELISA4相当）。最后，与侧向层析测试相比，该技术具有重要优势：可以给出定量结果，而不仅仅是定性结果（“是”或“否”）。与使用稀有材料的实验室中开发的大多数其他微流体系统不同，该系统由丙烯酸（PMMA）制成，这是一种低成本的热塑性塑料，与医疗诊断设备的批量生产高度兼容。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了墨西哥国家委员会（CONACYT）在“科学、技术和创新活动方案”的赠款312231支持，以及AMEXCID和墨西哥外交部（SRE）在“SARS-CoV-2的Prueba serológica rápida、barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2”的赠款下。JAHO感谢Conacyt Mexico的博士奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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