Microfresagem de Controle Numérico Computacional de um Dispositivo Acrílico Microfluídico com uma Restrição Escalonada para Imunoensaios Magnéticos Baseados em Nanoppartículas

Summary

A microfluídica é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de testes de diagnóstico. No entanto, equipamentos e materiais caros, bem como técnicas de fabricação e manuseio trabalhosas, são frequentemente necessários. Aqui, detalhamos o protocolo de fabricação de um dispositivo microfluídico acrílico para imunoensaios magnéticos baseados em micro e nanopartículas em um ambiente de baixo custo e simples de usar.

Abstract

Os sistemas microfluídicos melhoraram muito as técnicas de imunoensaio. No entanto, muitas técnicas de microfabricação exigem equipamentos especializados, caros ou complicados, tornando a fabricação cara e incompatível com a produção em massa, que é uma das pré-condições mais importantes para que os testes no local de atendimento (POCT) sejam adotados em ambientes com poucos recursos. Este trabalho descreve o processo de fabricação de um dispositivo acrílico (polimetilmetacrilato, PMMA) para teste de imunoensaio enzimático conjugado com nanopartículas utilizando a técnica de microfresagem de controle numérico computadorizado (CNC). O funcionamento do dispositivo microfluídico é demonstrado pela realização de um imunoensaio para detectar um anticorpo comercial usando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo integra uma restrição física escalonada de apenas 5 μm de altura, usada para capturar micropartículas magnéticas que compõem uma armadilha magnética colocando um ímã externo. Desta forma, a força magnética sobre o imunosuporte de nanopartículas conjugadas é suficiente para capturá-las e resistir ao arrasto de fluxo. Este dispositivo microfluídico é particularmente adequado para produção em massa de baixo custo sem a perda de precisão para o desempenho do imunoensaio.

Introduction

Nos últimos anos, a microfluídica tem desempenhado um papel importante nas técnicas de imunoensaio¹. A tecnologia de miniaturização tem muitas vantagens notáveis em comparação com os imunoensaios tradicionais, como consumo reduzido de amostras e reagentes, tempos de incubação mais curtos, troca eficiente de soluções e maior integração e automação².

Além disso, sistemas microfluídicos em imunoensaios, em associação com nanopartículas magnéticas como imunosuporte, reduzem consideravelmente os tempos de incubação, alcançando alta sensibilidade de detecção devido ao aumento da relação superfície-volume³. O movimento browniano das partículas melhora a cinética de reação durante a formação do complexo antígeno-anticorpo ^4,5. Além disso, as propriedades magnéticas das nanopartículas proporcionam a versatilidade para serem integradas em diferentes configurações de dispositivos microfluídicos, tornando-as um candidato ideal para sinalização e captura de moléculas em sistemas de biossensoriamento miniaturizados on-chip⁵. No entanto, as forças magnéticas são significativamente mais fracas do que as forças de arrasto na escala nanométrica devido à alta relação superfície-volume⁶. Portanto, a captura de nanopartículas para etapas cruciais de imunoensaio, como lavagem e detecção, pode ser um desafio, e um ímã convencional é insuficiente⁴.

Uma maneira eficiente de manipular as nanopartículas é o uso de uma armadilha magnética microfluídica formada por micropartículas de ferro, que são embaladas em uma estrutura microfluídica³. Portanto, quando um ímã externo se aproxima, uma interação complexa é criada dentro do meio poroso magnetizado entre as forças magnéticas e de fluxo. A força magnética que atua sobre as nanopartículas é forte o suficiente para capturá-las e resistir ao arrasto do fluxo ^3,4,7. Essa abordagem requer técnicas de microfabricação que atinjam resoluções da ordem de alguns micrômetros para gerar estruturas micrométricas que retenham as micropartículas.

As técnicas atuais de microfabricação permitem a fabricação de estruturas de alta resolução de alguns mícrons a centenas de nanômetros⁸. No entanto, muitas dessas técnicas exigem equipamentos especializados, caros ou complicados. Uma das principais dificuldades é a exigência de uma sala limpa para fabricação de moldes, que continua dispendiosa e ^{demorada 8,9}. Recentemente, os engenheiros microfluídicos superaram essa desvantagem desenvolvendo uma variedade de métodos alternativos de fabricação, com várias vantagens, como custos reduzidos, tempos de resposta mais rápidos, materiais e ferramentas mais baratos e maior funcionalidade⁸. Desta forma, o desenvolvimento de novas técnicas de microfabricação trouxe métodos de baixo custo, não limpos, que alcançam resoluções tão baixas quanto 10 μm⁸. A padronização pode ser usada diretamente em um substrato sem gerar um padrão de moldagem caro, evitando assim um processo demorado. Os métodos de fabricação direta incluem fresamento CNC, ablação a laser e litografia direta⁸. Todos esses métodos são adequados para a produção de canais de alta relação de aspecto em uma ampla gama de materiais, independentemente de sua dureza⁹, possibilitando novas e vantajosas geometrias, comportamentos físicos e qualidades em dispositivos microfluídicos⁸.

A microfresagem CNC cria estruturas em microescala utilizando ferramentas de corte que removem material a granel de um substrato e é um método de fabricação eficaz para dispositivos microfluídicos^10,11. A técnica de microfresagem pode ser útil em aplicações microfluídicas para criar microcanais e recursos diretamente na superfície de trabalho, oferecendo uma vantagem fundamental: uma peça de trabalho pode ser fabricada em um curto espaço de tempo (menos de 30 min), reduzindo significativamente o tempo de resposta desde o projeto até o protótipo¹². Além disso, a ampla disponibilidade de acessórios de corte de diferentes materiais, tamanhos e formas torna as fresadoras CNC uma ferramenta adequada que permitiu a fabricação de diferentes características em muitos tipos de materiais descartáveis de baixo custo¹³.

Dentre todos os materiais comumente utilizados na micromoagem, os termoplásticos continuam sendo uma escolha líder devido às suas muitas propriedades favoráveis e compatibilidade com aplicações biológicas^10,14. Os termoplásticos são um substrato atraente para sistemas microfluídicos devido às suas vantagens significativas para o desenvolvimento de sistemas analíticos descartáveis de baixo custo⁹. Além disso, esses materiais são altamente passíveis de processos de fabricação de alto volume, tornando-os adequados para comercialização e produção em massa. Por essas razões, termoplásticos como o PMMA têm sido considerados materiais confiáveis e robustos desde os primórdios da microfluídica¹⁰. Diferentes protocolos têm sido descritos para fabricar canais fechados em termoplásticos, como a ligação por solvente¹⁵, a ligação por calor¹⁶ e a ligação ultravioleta (UV)/ozônio para tratamento superficial¹⁷.

Em muitos casos, a resolução de posicionamento alcançada com microfresadoras convencionais não é suficiente para algumas aplicações microfluídicas que exigem estruturas menores que 10 μm. A microfresagem de alta qualidade tem resolução suficiente. Infelizmente, devido aos altos preços, seu uso é limitado a um punhado de usuários¹². Anteriormente, nosso grupo de pesquisa relatou a fabricação e manipulação de uma ferramenta de baixo custo que permite usinagem de estruturas inferiores a 10 μm, superando a resolução de fresadoras convencionais¹². O acessório é uma plataforma fabricada por impressão 3D com eletrônica simples, contendo três atuadores piezoelétricos. A superfície contém juntas em forma de dobradiça que permitem que ela seja levantada quando os elementos piezoelétricos agem simultaneamente. O deslocamento do eixo Z pode ser controlado com uma resolução de 500 nm e uma precisão de ±1,5 μm¹².

Este trabalho apresenta as etapas do processo de fabricação de um dispositivo acrílico (PMMA) através de uma técnica de microfresagem. O projeto do chip consiste em um canal principal de 200 μm de largura e 200 μm de altura e um canal lateral com as mesmas dimensões para purgar o fluxo dos reagentes. Na região central, o canal é interrompido por uma restrição física de apenas 5 μm de altura, fabricada com a plataforma piezoelétrica impressa em 3D feita por esse grupo¹², para capturar micropartículas magnéticas que compõem uma armadilha magnética para nanopartículas através da colocação de um ímã externo. Mostramos o funcionamento do dispositivo microfluídico através da realização de um imunoensaio para detectar um anticorpo comercial usando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo combina diferentes características que o tornam único⁴: o uso de nanopartículas magnéticas como suporte imunológico reduz o tempo total de teste de horas para minutos; a utilização de uma enzima fluorogénica para detecção permite limites de detecção comparáveis aos dos ensaios imunoenzimáticos padrão (ELISAs); e o uso de um termoplástico como material de fabricação o torna compatível com a produção em massa, o que não foi o caso das armadilhas magnéticas³ das nanopartículas microfluídicas anteriores, e o torna um excelente candidato para o desenvolvimento do POCT.

Protocol

1. Micromoagem

1. Moagem de superfície
   1. Ligue a microfresadora e o controlador piezoelétrico. Inicie seu respectivo software de controle¹².
   2. Selecione os bits finais do moinho necessários (diâmetros de 200 μm e 800 μm). Colocá-los no compartimento apropriado da fresadora (Figura 1).
   3. Corte retângulos de 9 mm x 25 mm de PMMA de 1,3 mm de espessura com o bit final do moinho de 800 μm. Anexe cuidadosamente um desses retângulos com fita adesiva dupla face à plataforma piezoelétrica (Figura 2).
      NOTA: Certifique-se de colocar sempre o retângulo acrílico na mesma posição para que um dos cantos coincida com as coordenadas de origem nos eixos x e y para usinagem.
   4. Conecte e coloque o sensor z na superfície do retângulo PMMA. Selecione o pino de detecção e mova-o sobre a superfície do sensor. Abaixe o pino manualmente sem entrar em contato com o sensor. Ative o modo de detecção Z0 (Figura 3).
   5. Selecione o bit final do moinho de 200 μm e mova-o para a origem x, y. Remova o z-sensor. Abaixe a mordida com cuidado sem entrar em contato com a superfície acrílica.
   6. Gire o bit final do moinho de 200 μm a 14.500 rpm. Abaixe lentamente até a coordenada de origem no eixo z (z = 0). Redefina o eixo z 30 μm abaixo da origem. Defina essa coordenada como a nova origem z.
      Observação : nunca abaixe o bit se ele não estiver girando. Caso contrário, corre o risco de quebrar.
   7. Clique no botão Cortar no software da microfresadora para ativar o painel Cortar . Clique no botão Adicionar e selecione o arquivo de .txt (Arquivo de Codificação Suplementar 1) com um código criado anteriormente para a moagem da superfície acrílica. Clique no botão Saída para iniciar o processo.
   8. Traga o bit final do moinho para a coordenada onde a restrição será usinada. Evite que o bit do moinho final se levante da superfície do solo assim que essa coordenada for alcançada clicando no botão Pausar . Caso contrário, reposicione manualmente o bit do moinho final para essa coordenada (Figura 4A).
2. Moagem da restrição de 5 μm
   1. Defina a velocidade de rotação do bit do moinho final para 11.000 rpm. Elevar a plataforma 6,5 μm com a interface da plataforma piezoelétrica (Figura suplementar S1). Mova o bit do moinho final ao longo do eixo y em 500 μm. Retorne a plataforma piezoelétrica ao seu valor inicial no eixo z com a interface de controle.
3. Fresagem de microcanais
   1. Abra o arquivo de design criado anteriormente no software de design (Arquivo de Design Suplementar 1). Clique no botão Imprimir . Acesse o menu Propriedades e clique na janela de cores correspondente à camada que contém o desenho a ser usinado. Defina os parâmetros de fabricação no painel Ferramenta conforme especificado na Figura suplementar S2.
   2. Desative camadas indesejadas selecionando a opção Nenhuma no menu suspenso Ferramentas .
4. Moagem de furos
   1. Mude para o bit final do moinho de 800 μm. Ative a camada de design dos orifícios de 1,2 mm de diâmetro clicando na janela de cores correspondente.
   2. Repita a etapa 1.3.2., mas, neste caso, defina os parâmetros de fabricação correspondentes, conforme descrito na Figura Suplementar S3A para os furos.
      NOTA: A profundidade dos orifícios usinados é metade da espessura acrílica.
   3. Máquina dois orifícios adicionais em cantos contralaterais do retângulo para o alinhamento do acrílico de forma invertida em uma nova plataforma (Figura 4B). Retire o retângulo acrílico da plataforma piezoelétrica. Vire o acrílico e cole-o com fita adesiva de dupla face sobre o adaptador com os pilares usinados (Figura 4C,D).
   4. Abra o arquivo com o design dos orifícios para a face oposta do software de design (Arquivo de Design Suplementar 2). Defina os parâmetros de fabricação correspondentes, conforme descrito na Figura Suplementar S3B. Moer a metade restante dos orifícios de entrada e saída do reagente com um diâmetro de 1,5 mm e uma profundidade de 0,7 mm (Figura suplementar S3C).

Figura 1: Colocação do bit final do fresamento. (A) Os bits do fresamento final de 200 μm e 800 μm são colocados e fixados através de um parafuso ao suporte de aço. (B) Cada bit de fresagem final é colocado no compartimento específico da microfresadora para seleção automática. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Plataforma piezoelétrica. A plataforma é fabricada por impressão 3D e consiste em duas bases hexagonais unidas por dobradiças que permitem um deslocamento fino no eixo z controlado por três atuadores piezoelétricos. Um adaptador acrílico também é observado, no qual o retângulo PMMA é anexado e que permite a configuração do canto de alinhamento das coordenadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Calibração do eixo Z. As etapas da calibração do eixo z são detalhadas. (A) O sensor z inclui um cabo que se conecta à microfresadora. (B) O sensor é colocado diretamente na superfície a ser usinada. (C) O pino de detecção consiste em uma barra de metal colocada em um compartimento especial ao lado de bits de fresagem finais. (D) Quando ambos os acessórios entram em contato, a microfresadora calcula automaticamente a coordenada de origem no eixo z. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Superfície acrílica retificada . (A) A broca final do moinho de 200 μm de diâmetro varre toda a superfície do retângulo acrílico, removendo uma camada de aproximadamente 30 μm de altura. (B) A imagem mostra as diferentes estruturas fresadas na face do acrílico previamente retificado. Canais e orifícios para entrada e saída de reagentes são observados. A restrição de 5 μm não pode ser vista a olho nu. (C) Superfície microfresada com orifícios de alinhamento e adaptador com pilares de alinhamento em cantos opostos. (D) O acrílico é alinhado de cabeça para baixo no adaptador com pilares, nos quais os orifícios de alinhamento se encaixam. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Vedação do canal

1. Limpeza acrílica
   1. Remova o retângulo acrílico da plataforma do adaptador pilar. Pegue outro retângulo acrílico não usinado. Lave ambas as folhas de acrílico com álcool isopropílico (IPA) e enxágue com água destilada. Use luvas e evite o contato com IPA.
   2. Mergulhe o acrílico em um banho ultra-sônico por 10 min (Figura 5A,B).
2. Exposição gasosa ao clorofórmio
   1. Seque ambas as folhas de acrílico perfeitamente. Cole-os no interior de uma tampa de placa de Petri de vidro com fita adesiva de dupla face. Certifique-se de colocar o lado do canal usinado exposto (Figura 5C). Use luvas e evite tocar diretamente na superfície acrílica.
   2. Coloque a base da placa de Petri de vidro dentro de uma placa de Petri de vidro maior (Figura 5D). Despeje 1 mL de clorofórmio na base da placa de Petri. Coloque rapidamente a tampa com as folhas de acrílico presas ao lado interno.
   3. Adicione imediatamente água destilada à base da placa de Petri maior até o nível da tampa da placa de Petri. Permitir a exposição do acrílico ao gás clorofórmio por 1 min (Figura 5E).
      NOTA: Considere que um tempo de exposição mais longo ao clorofórmio atacará a superfície acrílica, e a restrição de 5 μm derreterá, modificando sua altura ou desaparecendo completamente.
   4. Incline a placa de Petri para quebrar o selo de água criado. Remova imediatamente o acrílico do clorofórmio, descobrindo a placa de Petri. Tenha cuidado para não derramar a água.
      CUIDADO: Faça este processo no exaustor e use luvas, pois o clorofórmio é altamente tóxico.
3. Colagem por prensagem e aquecimento
   1. Descasque ambas as placas de acrílico da fita dupla face.
   2. Alinhe ambos os acrílicos com os lados que foram expostos ao clorofórmio gasoso face a face, formando um sanduíche. Colocar os acrílicos na prensa a 18 kgf/cm² e a uma temperatura de 90 °C (Figura 5F,G).
      NOTA: Recomenda-se colocar o acrílico alinhado longitudinalmente e alterar seu alinhamento após 2 min para uma melhor vedação. Se, após esse tempo, o selo for insuficiente, coloque-o de volta na prensa por intervalos não superiores a 1 min. Usando o estereoscópio, verifique o status dos canais e a restrição. Considere que, em caso de exceder o tempo de preparo, existe o risco de eliminar a restrição.
4. Acessório de mangueira
   1. Corte 2-3 cm de comprimento de mangueira. Faça um corte completamente reto. Fixar cada mangueira aos orifícios do dispositivo com adesivo líquido de secagem instantânea (Figura 6A). Evite que o adesivo entre no chip.

Figura 5: Processo de selagem do dispositivo. (A) Cada uma das folhas de acrílico é colocada em um saco re-selável com água destilada e imersa no banho ultra-sônico. (B) A imagem à esquerda mostra os canais logo após a fabricação, e a imagem à direita mostra o mesmo dispositivo após a lavagem com IPA e o banho ultra-sônico, que remove todas as impurezas e resíduos acrílicos do microcanal. As bordas da restrição que interrompe o canal central de 200 μm são observadas, o que confirma o processo de fresagem bem-sucedido. Barras de escala = 500 μm. (C) Ambos os acrílicos são secos e aderidos à plataforma de vidro na tampa. (D) A base da placa de Petri é colocada dentro de outro prato de maior diâmetro. (E) Ao fechar a placa de Petri, o selo de água impede que o clorofórmio gasoso escape. (F) Descrição dos elementos da alavanca com um peso de 5 kg. (G) Imagem da alavanca aberta, mostrando em vermelho a área onde o acrílico é colocado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação do dispositivo

1. Encha os canais com água destilada usando uma seringa. Certifique-se de que não há vazamentos ou resistência ao fluxo. Mergulhe o dispositivo em um banho ultra-sônico por 10 minutos para remover qualquer material acrílico, adesivo ou indesejado restante dentro dos canais.
2. Esvazie a água dentro dos canais do dispositivo. Utilizar uma seringa para introduzir uma solução de bloqueio preparada com albumina sérica bovina (BSA) a 5% (p/v) diluída em solução salina tamponada com Tris (TBS) e previamente filtrada através de um filtro de seringa de polietersulfona (PES) de 0,2 μm.
3. Preparar uma suspensão de micropartículas de ferro de 7,5 μm de diâmetro em BSA a 5%.
   NOTA: As micropartículas são previamente funcionalizadas com uma camada de sílica-polietilenoglicol (PEG) que confere resistência à absorção de proteínas⁴.
4. Incubar o cavaco e a suspensão de micropartículas com a solução de bloqueio durante, pelo menos, 1 h à temperatura ambiente. Se possível, permitir o bloqueio durante a noite a 4 °C.

4. Formação de armadilhas de micropartículas

1. Insira as micropartículas no chip com uma agulha de seringa através da mangueira de saída do canal lateral. Coloque o chip verticalmente e permita que as micropartículas fluam sob o efeito da gravidade através do canal lateral. Gire o chip 180° em duas etapas de 90° e permita que as micropartículas atinjam e compactem na restrição de 5 μm.
2. Remova o excesso de micropartículas por gravidade girando 45° em direção ao canal lateral.
3. Mantenha o dispositivo ereto para evitar desfazer a armadilha de micropartículas. Veja a Figura 6B para um resumo do processo de formação de armadilhas de micropartículas.

5. Imunoensaio

1. Preparação de nanopartículas
   1. Tomar 2 μL da suspensão de nanopartículas de 100 nm previamente conjugadas com lisozima (modelo de antígeno). Adicionar a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com 100 μL de solução bloqueadora. Incubar durante a noite a 4 °C.
   2. Adicione 150 μL de tampão de lavagem (1x TBS, 0,05% de interpolação 20).
   3. Coloque o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL em um separador magnético. Manter por 15 min para permitir a separação das nanopartículas (Figura Suplementar S4).
      NOTA: O volume mínimo para o separador magnético é de 200 μL. Evite usar um volume menor.
   4. Remova o líquido do tubo com uma micropipeta. Evite o contato com a parede do tubo onde o pellet de nanopartículas foi formado.
   5. Adicionar 250 μL de tampão de lavagem fresco. Mantenha o tubo sob agitação por 15 min.
   6. Repita as etapas 5.1.3.-5.1.5. 2x mais, agitando apenas por 5 min.
   7. Adicione a concentração desejada do anticorpo anti-lisozima primário (ver Tabela de Materiais). Ajustar para um volume final de 100 μL em diluente de anticorpos (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Incubar durante 15 min a 37 °C. Continue agitando por mais 15 minutos à temperatura ambiente.
   9. Repita os passos de lavagem 5.1.2.-5.1.6.
   10. Adicionar 100 μL de diluente de anticorpos. Adicionar o anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rábano (HRP-AbII) (ver Tabela de Materiais) a uma diluição de 1:500.
   11. Repita os passos de lavagem 5.1.2.-5.1.6.
   12. Manter as nanopartículas num volume final de 50 μL de diluente de anticorpos.

6. Montagem experimental

1. Encha as duas seringas de vidro de 100 μL com água, ligue uma mangueira de 6,5 cm de comprimento a cada seringa, insira um pino de metal na extremidade da mangueira e coloque ambas as seringas na bomba de seringa controlada por computador.
2. Sele todas as mangueiras do dispositivo acrílico com calor.
3. Corte a mangueira de entrada e mantenha apenas alguns milímetros. Encha a agulha de dosagem com tampão de lavagem e insira-a na mangueira cortada. Deixe a solução pingar antes de conectar a agulha ao dispositivo para impedir o acesso de ar ao dispositivo.
4. Corte a mangueira de saída do canal lateral. Ligue à bomba da seringa. Em seguida, faça o mesmo procedimento para a mangueira de saída do canal principal.
   Observação : é fundamental para executar as etapas 6.3.-6.4. a fim de evitar a desembalagem da armadilha de micropartículas. Se possível, verifique o estado da armadilha durante estas etapas com a ajuda de uma lupa.
5. Coloque uma lâmina de vidro no palco do microscópio. Prenda o ímã à lâmina com fita dupla face e coloque um pequeno pedaço de fita adesiva de cada lado para fixar as bordas do chip ao vidro.
6. Defina uma vazão de 50 μL/h através das guias Vazão e Unidades no controlador da bomba de seringa. Selecione o modo de retirada e clique no botão Iniciar para ativar o fluxo do buffer de lavagem.
7. Cuidadosamente, aproxime o dispositivo em direção ao slide com o ímã de maneira horizontal para que a área do chip que contém a armadilha entre em contato com o ímã.
8. Cole as bordas do dispositivo no vidro com fita adesiva dupla face para evitar o movimento. Evite obstruir o caminho óptico para microscopia (Figura 6C).

Figura 6: Configuração final do dispositivo . (A) Dispositivo acrílico com as mangueiras conectadas às entradas e saídas correspondentes. A escala mostra as dimensões do dispositivo em centímetros. (B) Protocolo para a formação da armadilha de micropartículas. As micropartículas fluem através do canal por gravidade quando o dispositivo é colocado em uma posição vertical. As micropartículas estão concentradas na restrição de 5 μm. O excesso de micropartículas é facilmente removido girando o chip através do canal lateral. O chip é mantido vertical para preservar a armadilha antes do imunoensaio. (C) Dispositivo microfluídico montado em uma lâmina de vidro contendo o ímã, no estágio do microscópio de fluorescência invertida. A agulha de dosagem através da qual os reagentes são adicionados é observada, bem como as mangueiras de saída que se conectam a uma bomba de seringa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Imunodetecção

1. Mantenha o tampão de lavagem fluindo por 10 minutos a 50 μL/h para remover o excesso de BSA.
2. Remova o tampão de lavagem restante da agulha distribuidora com uma micropipeta. Adicionar 50 μL da suspensão de nanopartículas.
3. Fluir a suspensão de nanopartículas durante 7 min a um caudal de 100 μL/h. Posteriormente, altere a vazão para 50 μL/h e flua por mais 15 min.
4. Troque a agulha de dosagem. Fluidar o tampão de lavagem durante 10 min a 50 μL/h. Prepare o substrato fluorogênico de acordo com as especificações do fabricante durante a etapa de lavagem.
5. Remova o tampão de lavagem restante da agulha distribuidora com uma micropipeta. Adicionar 100 μL do substrato fluorogénico (ver Tabela de Materiais). Fluidifique o substrato fluorogênico por 6 min a 50 μL/h.
6. Defina os parâmetros de medição da vazão (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h e 10 μL/h ) e do tempo (6 min) nas guias correspondentes Vazão e Definir temporizador da interface que controlam a bomba de seringa. Certifique-se de selecionar Modo de retirada para cada uma das medições a serem realizadas.
7. Defina uma guia de vazão adicional em 50 μL/h e defina o temporizador em 3 minutos para a etapa de lavagem.
8. Ligue a fluorescência do microscópio 15 s antes de o substrato a 50 μL/h parar. Inicie a captura de imagem com o software da câmera do microscópio 10 s antes que o substrato pare com um tempo de exposição de 1.000 milissegundos. Realize imagens por 6 min a 1 quadro/s (FPS).
9. Clique no botão Iniciar do parâmetro de vazão desejado imediatamente após a vazão de lavagem do substrato em paradas de 50 μL/h. Clique no botão Iniciar do fluxo de lavagem (50 μL/h) imediatamente após a parada do fluxo de medição selecionado.
10. Pare a captura da imagem e desligue a fluorescência do microscópio para evitar o fotobranqueamento do substrato.
11. Repita as etapas 7.8.-7.10. para cada caudal de medição utilizado.

Representative Results

Foi possível estabelecer um protocolo de fabricação altamente reprodutível que melhora a resolução da técnica de micromoagem convencional. Usando este protocolo, a fabricação de um canal tão pequeno quanto 5 μm de altura que opera como uma restrição escalonada em um canal de 200 μm de altura é alcançada. O design simples da restrição escalonada captura micropartículas de ferro de 7,5 μm de diâmetro que, quando compactadas no microcanal, permitem a criação de uma armadilha magnética quando um ímã externo se aproxima do dispositivo. Este dispositivo permite que imunoensaios sejam realizados utilizando nanopartículas conjugadas com o analito de interesse como suporte imunológico. Neste trabalho, foram realizados imunoensaios indiretos não competitivos com detecção baseada em anticorpos marcados com enzimas. O antígeno modelo (Ag) foi a proteína lisozima conjugada a nanopartículas (NPs) de 100 nm de diâmetro. IgG anti-lisozima de coelho foi utilizado como anticorpo primário (AbI) e a detecção foi realizada usando anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano de coelho (HRP-AbII).

A detecção foi realizada correlacionando-se a mudança na intensidade do sinal de fluorescência obtida após a interação da HRP-AbII com um substrato fluorogênico na passagem pelo purgador com nanopartículas aprisionadas. Para a realização das medições, determinou-se uma região antes e uma região após a armadilha. A Figura 7A-D mostra o aumento da intensidade de fluorescência para diferentes concentrações de antilisozima AbI: 0 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL e 1.000 ng/mL para uma determinada vazão de substrato fluorogênico (3 μL/h). Isso mostra que a mudança na fluorescência do substrato é diretamente proporcional à concentração de AbI utilizada.

Figura 7: Áreas de medição de fluorescência. As medidas de fluorescência são mostradas para diferentes concentrações de anticorpo antilisozima primário utilizado: (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL, (C) 100 ng/mL e (D) 1.000 ng/mL. Os círculos azuis mostram a área de medida de fluorescência antes e depois da armadilha formada pela restrição de altura de 5 μm, onde o substrato reage com o anticorpo secundário conjugado com HRP. Todas as imagens correspondem a um fluxo de 3 μL/h. Abreviação: HRP = peroxidase de rábano. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No entanto, para uma dada concentração de AbI, o nível de fluorescência obtido é uma função da taxa de fluxo utilizada para o substrato fluorogênico. Assim, a capacidade de conversão deste substrato pela enzima HRP é inversamente proporcional à taxa de fluxo. Foram avaliadas diferentes vazões de substrato de 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h e 10 μL/h. Para cada experimento, foram obtidas as curvas correspondentes à diferença de fluorescência dada pelo substrato antes e após a passagem pelo purgador magnético. A Figura 8A-C mostra as curvas obtidas para uma concentração de 100 ng/mL para três diferentes vazões: (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h e (C) 1 μL/h. Dependendo da taxa de fluxo utilizada, a capacidade de conversão do substrato pelo anticorpo secundário conjugado com HRP colocado no purgador magnético varia. A curva verde representa a intensidade de fluorescência do substrato após a conversão pela HRP localizada no purgador. Pode-se observar que, em fluxos mais elevados, o nível máximo de fluorescência obtido decai. A curva vermelha representa a fluorescência basal antes que o substrato atinja a armadilha. A medição da fluorescência do substrato nesta área da armadilha permanece constante, e seu valor depende do grau de interações inespecíficas se não houver bloqueio eficiente da superfície do canal. Calculou-se a diferença entre as duas curvas, representada pela curva azul.

Figura 8: Curvas de fluorescência. Gráficos obtidos na concentração de 100 ng/mL de anticorpo primário e vazões de (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h e (C) 1 μL/h. As três curvas coloridas representam a fluorescência medida antes do trap (curva vermelha) e após o trap (curva verde) e a diferença entre as duas (curva azul) ao longo do tempo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 9A-C integra as curvas de diferença de fluorescência medidas antes e após a imunorreação para os diferentes fluxos para as concentrações de AbI de (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL e (C) 1.000 ng/mL. A medição para uma taxa de fluxo de 0 μL/h indica a medição da imunorreação em condições estáticas em que a difusão governa. Para uma concentração de 1.000 ng/mL, a fluorescência satura para todos os fluxos avaliados. No entanto, o padrão escalonado de fluorescência nos diferentes fluxos é devido à difusão do substrato, que reage com uma taxa de conversão tão alta que supera os fluxos menores. Assim, há um retorno dessa fluorescência para a zona a montante da armadilha.

Figura 9: Razões de diferença de fluorescência. Curvas resumidas das diferenças de fluorescência (após-antes) para os diferentes fluxos utilizados em (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL e (C) 1.000 ng/mL. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As medidas obtidas com este dispositivo permitem gerar uma curva de calibração padrão para imunoensaios realizados com lisozima como antígeno modelo. A Figura 10 mostra a curva de calibração obtida a partir dos valores máximos das diferenças entre a fluorescência antes e após a imunorreação realizada no purgador magnético. Este protocolo permite a detecção do anticorpo anti-lisozima primário com concentrações na ordem de nanogramas por mililitro usando fluxos entre 1 μL/h e 10 μL/h. A alta variabilidade e os altos níveis de fluorescência a 1 μL/h sugerem que a reatividade do imunocomplexo é tal que essa taxa não favorece o fluxo do substrato reagente e tende a se acumular logo após a armadilha, além do fato de que a resistência do dispositivo reduz a resolução do dispositivo para essa vazão.

Figura 10: Curva de calibração. O gráfico mostra o valor máximo das diferenças na intensidade de fluorescência das curvas obtidas em relação à concentração de anticorpos primários utilizados (AB1) para cada vazão. I/I_sat corresponde à razão do valor de fluorescência obtido para cada medida de fluorescência (I), normalizado em relação ao valor máximo de fluorescência atingido na saturação (I_sat). As barras de erro representam o desvio padrão dos três experimentos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Interface do controlador de plataforma piezoelétrica. A imagem à esquerda mostra a interface que controla o deslocamento do eixo z da plataforma piezoelétrica. A restrição é criada pela elevação da plataforma através da aplicação de tensão a três atuadores piezoelétricos. A imagem à direita mostra a interface do software que controla a microfresadora, onde é possível observar as coordenadas precisas nos eixos x e y, onde a restrição é usinada a uma velocidade de 11.000 rpm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S2: Design do dispositivo. O design do dispositivo criado usando o software de design é visto à esquerda. O projeto consiste em dois canais conectados, sendo um o canal principal que contém a restrição de altura de 5 μm e o outro o canal lateral para a saída de resíduos. Os canais são microfresados com um bit de moinho final de 200 μm. O painel à direita mostra os parâmetros de fabricação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S3: Parâmetros de microfresagem dos orifícios de entrada e saída. (A) Os orifícios de 1,2 mm de diâmetro e 0,65 mm de profundidade (metade da espessura acrílica) são microfresados na face usinada. O painel à direita mostra os parâmetros de velocidade de deslocamento, rotação e profundidade do bit do moinho final. (B) Os orifícios de 1,5 mm de diâmetro e 0,7 mm de profundidade são microfresados na face oposta que liga os orifícios. O painel à direita mostra os parâmetros de fabricação. Ambos os casos são microfresados com um bit de moinho final de 800 μm. (C) Os orifícios de entrada (direita) e saída (esquerda) do reagente são mostrados após a usinagem de ambas as faces. As dimensões da metade de diâmetro maior permitem que a mangueira seja acoplada, enquanto a barreira criada pela metade de diâmetro menor impede que a mangueira bloqueie as entradas. Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S4: Separação de nanopartículas. Usando um separador magnético comercial, nanopartículas de 100 nm podem ser facilmente concentradas para realizar as etapas de lavagem durante o imunoensaio. O pellet formado após 15 min é observado no círculo vermelho. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: Código para moagem de superfície acrílica. O código gerado é mostrado com instruções para moer a superfície acrílica de 25 mm x 9 mm ao longo dos eixos x e y. A última linha do código posiciona a broca bem na coordenada onde a restrição será usinada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de Projeto Suplementar 1: Projeto dos orifícios de entrada e saída do microcanal e do reagente. O design contém duas camadas de diferentes estruturas coloridas (canais pretos e buracos vermelhos) que são usinadas na face acrílica previamente moída. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de Projeto Suplementar 2: Projeto dos orifícios do lado oposto. O projeto consiste em furos de maior diâmetro para a face oposta que se comunicam com os anteriores e servem para fixar as mangueiras. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Um dispositivo microfluídico acrílico para imunoensaios utilizando nanopartículas como imunosuporte foi fabricado utilizando uma técnica de microfresamento. O método de fabricação direta no substrato tem a vantagem de evitar o uso de um molde mestre e o tempo e os custos que isso implica. No entanto, é limitado à prototipagem rápida e fabricação de dispositivos de alto volume.

Aqui, utilizou-se uma plataforma piezoelétrica acessória previamente relatada para a fresadora¹². A plataforma foi fabricada por impressão 3D para criar canais de profundidade variável com uma resolução vertical melhor do que a resolução de 10 μm das microfresadoras convencionais. Conseguimos a fresagem de canais de até 5 μm de altura que formam uma restrição escalonada no canal microfluídico de 200 μm.

Apenas dois bits de moinho final de 200 μm e 800 μm de diâmetro são necessários para a fabricação do dispositivo microfluídico, sem qualquer necessidade de alterar manualmente os bits. O modelo de fresadora utilizado realiza a troca de bits automaticamente, o que ajuda na otimização do tempo. Além disso, o modo "Z0 sensing" permite a determinação da origem automaticamente no eixo z com alta precisão, entrando em contato com o sensor e o pino incluído na fresadora.

O design deste dispositivo é simples, consistindo apenas no canal principal interrompido por uma restrição escalonada de 5 μm e um canal acessório que serve como purga e entrada para micropartículas. No entanto, a alta precisão de tais estruturas é necessária para a restrição de reter micropartículas de ferro de 7,5 μm de diâmetro. Uma restrição maior permite que as micropartículas passem sem retenção, o que impede sua captura e a formação da armadilha de micropartículas. Por outro lado, uma restrição menor aumenta muito a resistência ao fluxo do canal e faz com que os reagentes saiam pelo canal lateral em vez de passar pelo meio poroso de micropartículas. O uso de micropartículas de um diâmetro maior para formar a armadilha magnética permitiria fazer uma restrição maior. Por exemplo, partículas com um diâmetro de 40 μm precisam de uma restrição escalonada de ~30 μm. Nesse caso, não é necessário usar a plataforma piezoelétrica, e o protocolo de fabricação é simplificado. No entanto, um meio poroso composto de micropartículas maiores aprisionaria as nanopartículas de forma diferente e impactaria o desempenho do imunoensaio; no entanto, não está claro se seria para o bem ou para o mal. O trabalho está em andamento para estudar esses recursos para otimizar o dispositivo⁷.

Para atingir a precisão necessária, a moagem superficial foi realizada para remover uma camada de 30 μm da superfície acrílica, movendo a broca final do moinho de 200 μm através de toda a superfície acrílica a 14.500 rpm. Este processo permite que uma nova origem seja obtida no eixo z ao longo de toda a superfície para maior precisão em altura. É crucial sempre alinhar o acrílico na mesma posição para que as coordenadas de origem nos eixos x e y (previamente definidos) coincidam com um dos cantos do acrílico. Da mesma forma, deve-se certificar-se de que o acrílico está perfeitamente sentado na base; caso contrário, a superfície pode não se desgastar corretamente, causando problemas nas etapas de montagem a seguir.

Uma vez que o programa conclui o processo de retificação de superfície, ele automaticamente traz o bit final do moinho para uma coordenada específica onde a restrição de 5 μm que forma o purgador será usinada. É fundamental evitar que a parte final do moinho se levante da superfície quando atingir essa coordenada. Recomenda-se identificar se a microfresadora tem uma opção que impede que a broca final do moinho se desprenda da superfície uma vez terminado o processo de moagem. Caso contrário, será necessário reposicionar manualmente o cortador para essa coordenada, o que pode resultar em erros de precisão de localização.

Para usinar a restrição escalonada no acrílico, é necessário superdimensionar em 1,5 μm. Para 5 μm de altura, a plataforma piezoelétrica foi elevada para 6,5 μm, pois o microcanal tende a achatar um pouco no processo de vedação dos canais. Além disso, o comprimento final da restrição no dispositivo é de apenas 50 μm; no entanto, ele é usinado por mais tempo para garantir que ele se comunique com ambas as extremidades do canal principal quando for usinado depois. Em uma etapa, os canais de 200 μm de profundidade são fabricados usando o bit de moinho final de 200 μm de diâmetro e uma velocidade de rotação de 11.000 rpm. Assim, a usinagem dos canais de 200 μm de largura em acrílico leva apenas alguns segundos.

O próximo passo na fabricação do dispositivo é usinar os orifícios que conectam os canais ao exterior. Esses orifícios são usados para colocar as mangueiras que permitem que o dispositivo seja facilmente conectado à bomba de seringa que o executa. Um dos problemas encontrados aqui é a colocação das mangueiras. Uma distância ideal é fundamental para permitir o fluxo de reagentes e evitar a criação de uma vedação com a face do acrílico não usinado. Para superar essa desvantagem, os furos são usinados em duas etapas para criar um limite onde as mangueiras não excedam a profundidade desejada.

Com a extremidade de 800 μm do moinho bit, o padrão de furos foi fresado na mesma face previamente microfresada. Os furos são usinados no final de cada canal com um diâmetro de 1,2 mm e uma profundidade de 0,65 mm, que é metade da espessura do acrílico. Além disso, dois orifícios são usinados nos cantos contralaterais do retângulo, que permitem que o acrílico seja alinhado virado para baixo na plataforma com pilares. É importante usar um raspador ou cortador para remover o acrílico da plataforma piezoelétrica para evitar quebrá-lo. No lado oposto do acrílico, o diâmetro dos orifícios é de 1,5 mm (maior que a metade anterior), o que equivale ao diâmetro da mangueira a ser fixada. A profundidade é de 0,7 mm e deve ser ligeiramente maior que a metade do orifício da face frontal para garantir que ambos os orifícios usinados se comuniquem entre si. A barreira formada pelo orifício de menor diâmetro impede que a mangueira atinja o fundo e bloqueie a entrada. Essa implementação no protocolo melhora muito a colocação das mangueiras de entrada e saída de fluido no chip.

Um passo fundamental na fabricação de dispositivos é a vedação. É necessário selar a face que contém os canais usinados com uma tampa acrílica não usinada com as mesmas dimensões. A vedação das folhas com um método que não se aproxima da temperatura de transição vítrea do acrílico permite a obtenção de canais livres de deformação. Através do método de ligação utilizado, uma fina película de solvente entre as duas folhas de PMMA dissolve uma película fina da superfície da folha de PMMA, depois evapora e, finalmente, reconecta os monômeros das folhas de PMMA a uma temperatura de operação específica.

O método amplamente descrito de exposição ao vapor de clorofórmio foi usado para selar este dispositivo acrílico. Como relatado anteriormente na literatura, o clorofórmio fornece alta resistência de ligação; no entanto, como o clorofórmio ataca o acrílico de forma muito agressiva, o acrílico nunca deve entrar em contato direto com o clorofórmio líquido, apenas com o clorofórmio gasoso. É essencial manter uma distância ideal entre o clorofórmio evaporante e o acrílico. Criamos um sistema simples usando uma placa de Petri de vidro, na qual o acrílico era aderido à tampa. Utilizou-se uma plataforma composta por nove lâminas unidas e presas à tampa da placa de Petri, na qual os acrílicos foram aderidos com fita dupla face para regular a distância. Embora o processo de clorofórmio gasoso seja muito sensível a mudanças na temperatura ambiente, a temperatura das placas de Petri pode ser controlada colocando-as dentro de uma caixa de poliestireno. A vedação de água impede que o clorofórmio evapore muito rapidamente.

Em contraste, existem outros métodos de junção relatados que são mais rápidos e não requerem equipamentos especiais; no entanto, alguns são adequados apenas para unir duas chapas acrílicas sem usinagem. Da mesma forma, é difícil controlar a força de colagem, uma vez que o solvente deve ser derramado diretamente entre ambas as folhas de acrílico¹⁸, com alto risco de fusão de estruturas de pequenas dimensões, como a restrição microfresada de 5 μm.

Utilizando o protocolo aqui descrito, foram obtidas vedações homogêneas com prensa caseira, com a qual a pressão e a temperatura de vedação foram controladas. Para a construção desta prensa, tanto uma estrutura de alumínio quanto uma dobradiça criam uma alavanca que amplifica a força mecânica proveniente de um peso de 5 kg para um fator de 9:1. Os elementos de aquecimento transferem seu calor para placas de alumínio de 2 cm de espessura que estão em contato com as peças de acrílico.

Uma vez que as camadas de acrílico são seladas, a última etapa no processo de fabricação é conectar as mangueiras externas às entradas e saídas correspondentes do dispositivo. O adesivo líquido é aplicado externamente uma vez que as mangueiras estão dentro dos orifícios. Se o diâmetro da mangueira for menor do que os orifícios, o adesivo líquido pode entrar no dispositivo, entupindo os canais.

Os métodos de fabricação direta no substrato, como a microfresagem, apresentam algumas desvantagens, como a rugosidade da superfície usinada e estruturas com bordas mal delimitadas⁹. Apesar da rugosidade da superfície usinada dos canais, nenhum tratamento adicional é necessário para este dispositivo. Um ponto importante a ser observado sobre esse protocolo de ligação é que o clorofórmio permite diminuir a rugosidade dos microcanais fresados polindo as superfícies expostas ao solvente. O polimento da superfície é tão bom que até a qualidade óptica é melhorada¹⁹.

Quando o dispositivo tiver sido fabricado, ele deve estar preparado para ser usado em um imunoensaio. A lavagem ultra-sônica do dispositivo é de grande importância para remover quaisquer detritos acrílicos indesejados que possam entupir os canais e interferir no imunoensaio.

Além disso, deve ser dada especial atenção ao bloqueio correto dos canais para evitar interações não específicas e sinais de alto ruído de fundo. Demonstrou-se que o bloqueio com BSA a 5% reduz o ruído da ligação inespecífica de anticorpos nos canais, e 1 h de incubação é suficiente. As micropartículas de ferro são revestidas com uma camada de sílica-PEG para evitar a ligação inespecífica nelas. Além disso, as micropartículas são bloqueadas com BSA (ao mesmo tempo que os canais) antes de formar a armadilha no dispositivo. A incubação noturna a 4 °C é melhor, o que significa que é necessário 1 dia para a fabricação e incubação do dispositivo antes do imunoensaio. A redução da rugosidade pelo clorofórmio e o bloqueio das superfícies para reduzir as interações não específicas demonstraram funcionar excepcionalmente bem, permitindo que esta plataforma atinja um limite de detecção comparável ao ELISA padrão em um imunoensaio modelo⁴.

A formação da armadilha de micropartículas na restrição de microcanais é um processo manual. Embora não haja um controle preciso do número de micropartículas que entram, contamos com uma estimativa do comprimento das partículas compactadas. É possível tornar a armadilha maior ou remover o excesso facilmente. As partículas descartadas se acumulam no canal lateral e não precisam ser removidas do chip. É crucial evitar que as micropartículas fluam para o canal principal, pois podem interagir com as nanopartículas a montante da armadilha e modificar as medições do imunoensaio.

Como prova de conceito, implementamos a imunodetecção de um complexo formado por proteína lisozima conjugada a nanopartículas de 100 nm de diâmetro por incubação do anticorpo primário específico e do anticorpo secundário marcado com HRP correspondente. O imunocomplexo é formado fora do dispositivo. No entanto, é possível realizar todo o imunoensaio dentro do dispositivo. As propriedades magnéticas das nanopartículas permitem uma fácil manipulação com um separador de ímã permanente de neodímio de alto desempenho. Deve-se simplesmente manter o microtubo de reação por 15 min para permitir que as nanopartículas sejam atraídas pelo ímã para a parede do microtubo, o que facilita as etapas de lavagem do imunoensaio fora do dispositivo.

O destaque deste dispositivo é que ele é simples, rápido (tempo total de ensaio de 40 min 4 em comparação com^4-6 h para ELISA) e barato (comparável ao preço de um teste de fluxo lateral). Todas essas características fazem deste perfil de dispositivo um bom candidato para o desenvolvimento do POCT. Além disso, o dispositivo pode detectar quantitativamente concentrações de analitos semelhantes ao padrão-ouro ELISA⁴, o que é extremamente valioso para estudos epidemiológicos e tomada de decisão em saúde pública. Geralmente, os sistemas microfluídicos para imunoensaios têm bons limites de detecção, mas longos tempos de ensaio, ou têm tempos de ensaio curtos, mas limites de detecção abaixo do ideal⁴. Ao combinar nanopartículas magnéticas como suporte imunológico e enzimas fluorogênicas para detecção, esta plataforma tem um curto tempo de ensaio e um bom limite de detecção (em trabalhos anteriores, encontramos um limite de detecção de 8 pg/mL usando biotina como antígeno, o que é comparável a um ELISA⁴ padrão). Finalmente, esta tecnologia tem uma vantagem importante sobre os testes de fluxo lateral: a possibilidade de dar resultados quantitativos e não apenas qualitativos ("sim" ou "não"). Ao contrário da maioria dos outros sistemas microfluídicos desenvolvidos em laboratórios em que materiais raros são usados, este sistema é feito de acrílico (PMMA), um termoplástico de baixo custo que é altamente compatível com a produção em massa de dispositivos de diagnóstico médico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Endmill	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 Endmill	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
Carbonyl-iron microparticles	Sigma-Aldrich	44890	7 μm
Chloroform	Fermont	6201	Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate
CMOS camera Moment	Teledyne Photometrics		Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Engraving software to design and create the engraving path on the surface
Extraction hood	Unknown	Unknown
Flexible Plastic Tubing	Tygon	AAD04103	ID = 0.020, OD = 0.060
Fluorescence microsope	ZEISS	Axio Vert.A1
High Precision Dispense Needle	Loctite	98612
Homemade piezoelectric controller application	LabView		See reference 12 for more details.
Loctite 495 instant adhesive	Henkel	49503	Apply with micropipette tip or dispensing needle
MagJET Separation Rack	thermoscientific		12 x 1.5 mL
Mechanic press	Home-made
Milling Machine	Roland	MDX-50
Piezoelectric platform	Home-made		See reference 12
Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic	Goodfellow	ME303018/1	Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent
PVCamTest software	Teledyne Photometrics	Version 3.10.107	Image acquisition software
Stereo microscope	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Syringe pump	kd Scientific	KDS200	Can hold up to two syringes
Utrasonic bath	Branson	2800
VPanel software	Windows OS	Version 1.0.3.0	Software for controlling the micromilling machine