Summary
يصف هذا البروتوكول تصنيع الميكروسفير المسامي عالي الانفتاح القائم على البولي (حمض اللاكتيك - كو غليكوليك) (HOPMs) عبر تقنية الموائع الدقيقة السطحية القائمة على صيغة مستحلب واحد. هذه الميكروسفير لها تطبيقات محتملة في هندسة الأنسجة وفحص الأدوية.
Abstract
بالمقارنة مع السقالات السائبة والحقن المباشر للخلايا وحدها ، اكتسبت الوحدات المعيارية القابلة للحقن اهتماما هائلا بإصلاح الأنسجة المعطلة، بسبب الراحة في تغليف الخلايا، وتحسين الاحتفاظ بالخلايا، والحد الأدنى من التوغل. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي التشكيل المسامي لهذه الناقلات الدقيقة إلى تعزيز التبادل المتوسط وتحسين مستوى العناصر الغذائية وإمدادات الأكسجين. توضح هذه الدراسة التصنيع المريح للميكروسفير المسامي عالي الانفتاح القائم على البولي (حمض اللاكتيك - كو غليكوليك) (PLGA-HOPMs) بواسطة تقنية الموائع الدقيقة السهلة لتطبيقات توصيل الخلايا. تمتلك PLGA-HOPMs أحادية التشتت الناتجة أحجام جسيمات ~ 400 ميكرومتر ومسام مفتوحة تبلغ ~ 50 ميكرومتر مع نوافذ متصلة. باختصار ، تم إدخال قطرات الزيت المستحلب (محلول PLGA في ثنائي كلورو الميثان ، DCM) ، ملفوفة بمرحلة الجيلاتين المائية 7.5٪ (w / v) ، في محلول مائي متعدد (كحول الفينيل) (PVA) متدفق باستمرار بنسبة 1٪ (w / v) من خلال الفوهة المحورية في إعداد الموائع الدقيقة المخصصة. وفي وقت لاحق، خضعت الميكروسفير لإجراءات استخراج المذيبات والتجفيد، مما أدى إلى إنتاج HOPMs. ومن الجدير بالذكر أن التركيبات المختلفة (تركيزات PLGA والبوروجين) ومعلمات المعالجة (قوة الاستحلاب ، ومقياس الإبرة ، ومعدل تدفق الطور المشتت) تلعب أدوارا حاسمة في صفات وخصائص PLGA HOPMs الناتجة. علاوة على ذلك، قد تغلف هذه البنى العديد من الإشارات الكيميائية الحيوية الأخرى، مثل عوامل النمو، لاكتشاف الأدوية الموسعة وتطبيقات تجديد الأنسجة.
Introduction
توفر الميكروسفير المحملة بالخلايا مزايا مواتية ، مثل تعزيز قدرة الاحتفاظ بالخلايا في الموقع ، والتسليم الفعال للخلايا ، والقدرة اللاحقة على تكاثر الخلايا في الجسم الحي1. حتى الآن ، تم طرح العديد من التحقيقات لتطوير هيكل سقالات ناجح لدعم بيئة مواتية للخلايا لتجديد الأنسجة أو تطبيقات فحص الأدوية2. ومع ذلك ، فإن بيئة نقص الأكسجة غالبا ما تكون حتمية في المناطق الداخلية بسبب عدم كفاية إمدادات العناصر الغذائية / الأكسجين وتراكم النفايات الأيضية3. للتغلب على هذه المشاكل ، تم تطوير الميكروسفير المسامي للغاية (PMs) باستخدام مواد حيوية مختلفة4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، في الثقافة الديناميكية ، تعاني السقالات من إجهاد القص المفرط7 ، وقد تكسر الحالة غير المستقرة لوسط الاستزراع إخلاص PMs. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام poly (حمض اللاكتيك - co-glycolic) (PLGA) لمعالجة PMs بقوة ميكانيكية جيدة للثقافة الديناميكية1. على سبيل المثال ، أظهرنا الحقن المشترك للفأر myoblast (C2C12) المحمل ب PLGA PMs (HOPMs) والخلية البطانية الوريدية السري البشرية (HUVEC) المحملة بالبولي (الإيثيلين غليكول) المجوفة لعلاج فقدان العضلات الحجمي ، وتحقيق تحسن ملحوظ في تجديد العضلات الهيكلية في الموقع 8.
والجدير بالذكر أن PMs تتميز بمساحات سطحية كبيرة ومساميات عالية ، وهو أمر ذو أهمية خاصة لالتصاق الخلايا ونموها نحو توصيل الخلايا طفيفة التوغل9. في ضوء هذه الجوانب ، تم استخدام العديد من المواد المتوافقة بيولوجيا لتصنيع PMs10,11. توفر هذه PMs القابلة للتصميم والمزروعة بالخلايا التصاق ممتاز ، وقوة ميكانيكية كبيرة ، ونوافذ مترابطة للغاية ، والتي يمكن أن تحسن تكاثر الخلايا لإصلاح الأنسجة التالفة12. في هذا الصدد ، تم تطوير تقنيات مختلفة أيضا لتصنيع المجالات المسامية13,14. من ناحية ، تم إنتاج PMs باستخدام عوامل تشكيل الغاز ، مثل NH4HCO3 ، والتي تم تقييدها بسبب عدم كفاية الترابط15،16،17. من ناحية أخرى ، تم قص PMs مباشرة بعد الاستحلاب ، مما أدى إلى PMs18 متعدد التشتت. في النهاية ، ربما تكون تقنية الموائع الدقيقة القطيرة القائمة على نهج الاستحلاب طريقة فعالة لبناء PMs ، لأنها غالبا ما تؤدي إلى جزيئات موحدة الحجم19. والجدير بالذكر أن السمات المورفولوجية للميكروسفير غالبا ما تعتمد على جودة قطرات المستحلب المتولدة (أي الماء في الزيت ، W / O ، أو الزيت في الماء ، O / W) ، والتي قد تؤثر بشكل كبير على سمات المواد الحيوية20. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق منصة الموائع الدقيقة المصممة مسبقا لتوليد الألياف الدقيقة أو الميكروسفيرات. في إحدى الحالات ، أظهر Yu et al. إنتاج هياكل ليفية دقيقة محملة بالخلايا تعتمد على منصات الموائع الدقيقة القائمة على الشعيرات الدموية ، والتي يمكن استخدامها لتجميع الشبكات الخلوية لمحاكاة الأنسجة الطبيعية21. وفي حالة أخرى، قام يي وآخرون بتصنيع كبسولات ميكروكبسولات بلورية فوتونية عن طريق تكرار القالب لخرز الكريستال الغروي السيليكا من خلال تكنولوجيات الموائع الدقيقة، والتي يمكن أن تتغلب على العديد من القيود المفروضة على التقنيات الحالية التي تتطلب وضع علامات معقدة وأجهزة محددة22.
والواقع أن الأساس المنطقي وراء استخدام هذه التقنية يرجع إلى مزايا مختلفة، مثل كونها سهلة في طبيعتها، ولا تتطلب معدات متطورة، وملاءمتها في توليف أجهزة إدارة المشاريع موحدة الحجم لتوصيل الخلايا وتطبيقات الطب التجديدي. في هذا السياق ، مع المكونات المصممة مسبقا لمحاكاة المستحلب ، يمكن الحصول على PMs ذات المساميات العالية والترابط بسهولة من جهاز microfluidic تم تجميعه من أنابيب poly (vinyl chloride) (PVC) ، والشعيرات الدموية الزجاجية ، وإبرة. يتم تحضير سلائف مستحلب W/O عن طريق تجانس محلول مائي من الجيلاتين ومحلول عضوي من PLGA. من خلال حقن الجزء القابل للتطبيق من المستحلب بشكل انتقائي في منصة الموائع الدقيقة ، يتم تصنيع PMs ذات أحجام الجسيمات الموحدة والمسام المترابطة في جميع أنحاء السطح إلى الداخل. يهدف هذا البروتوكول إلى تصنيع PLGA-HOPMs عن طريق الاستحلاب في منصة الموائع الدقيقة. ويعتقد أن هذا البروتوكول يسمح بإنتاج PLGA-HOPMs قابل للتكرار ومن المحتمل أن يكون قابلا للتطبيق في المجالات ذات الصلة بهندسة الأنسجة وفحص الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الحلول
- قم بإعداد محلول مخزون PVA مقدما عن طريق تسخين محلول PVA في حمام مائي 80 درجة مئوية ثم وضعه في الثلاجة عند 4 درجات مئوية. بارد إلى درجة حرارة الغرفة (RT) للاستخدام التجريبي.
- تحضير سلائف المستحلب عن طريق إضافة محلول الجيلاتين المائي (1 مل ، 7.5 ٪ ، ث / v) إلى المرحلة العضوية من PLGA (2 مل ، 2 ٪ ، ث / v في ثنائي كلورو الميثان ، DCM) (انظر جدول المواد).
ملاحظة: بشكل عام ، تتضمن تقنية الموائع الدقيقة مراحل مختلفة لتشكيل الميكروسفيرات. تتكون المرحلة المستمرة أو التجميع من بولي مائي (كحول فينيل) (PVA ، 600 مل ، 1٪ ، ث / v).
2. رذاذ جهاز الموائع الدقيقة تجميع وتصنيع PLGA-HOPMs
ملاحظة: يتم سرد العناصر الاستهلاكية المطلوبة لهذا التجميع في جدول المواد.
- قم بتخصيص مجموعة مولد القطرات.
- قم ببناء مولد ميكروفلوليك مشترك التدفق باستخدام شعيرات شعرية زجاجية (OD ، 1 مم) ، وأنابيب PVC (ID ، 1 مم) ، وإبرة توزيع 26 G.
- قم بتوصيل الشعيرات الدموية الزجاجية بنهاية أنبوب PVC ثم اخترق بإبرة عند توصيل الهيكل أعلاه.
- ضع الطرف الآخر من أنبوب PVC في المرحلة المستمرة أثناء توليد القطرات. باستخدام الغراء فوق البنفسجي ، قم بسد الفجوات في المفصل بعد المعالجة.
ملاحظة: يجب ثني الإبرة منحنية حوالي 45 درجة لثقب مريح في أنبوب PVC ، وتمتد الإبرة إلى الأنبوب الشعري لتشكيل البنية المحورية.
- إعداد منصة ميكروفلويديك قطرة.
- استخدم مضختين للحقنة، كما هو موضح في الشكل 1. استخدم حقنة سعة 50 مل لتحميل المرحلة المستمرة ومحقنة سعة 5 مل لتشكيل المستحلب.
- اضبط معدلات التدفق لمرحلتي الاستمرار والتشتت عند 2 مل / دقيقة و 0.08 مل / دقيقة ، على التوالي.
- ضع دورقا سعة 500 مل في حمام ثلجي واملأه بمحلول مائي PVA مبرد مسبقا (الخطوة 1.1).
ملاحظة: يجب غمر نهاية الشعيرات الدموية الزجاجية في مرحلة التجميع. يقترح تحريك (1 ساعة ، 60 دورة في الدقيقة) الفائق لمرحلة التجميع باستخدام قضيب زجاجي بعد تكوين قطرات المستحلب في المنصة. يتم إنتاج قطرات مستحلب في طرف نقطة الإبرة. بشكل عام ، يؤثر مقياس الإبرة على حجم PMs ، حيث يتوافق المقياس الأقل مع الحجم الأصغر ل PMs. علاوة على ذلك ، يرتبط قطر المسام بشكل أساسي بتركيز البوروجين ، القادر على الزيادة بتركيز الجيلاتين المناسب1.
- أداء الاستحلاب وتوليد قطرات.
- قم بإعداد المستحلب باتباع الخطوات أدناه.
- تحضير المستحلب عن طريق صب محلول الجيلاتين المائي على الفور في محلول DCM من PLGA (الخطوة 1.2) والاستحلاب باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد).
- اضبط الطاقة بالموجات فوق الصوتية على 400 واط ، واضبط إجمالي وقت المعالجة على أنه 90 ثانية (الفاصل الزمني 2 ثانية ، العلاج بالموجات فوق الصوتية 1 ثانية) ، مصحوبا بتغيير موضع المسبار يدويا باستمرار.
- قم بتثبيت المستحلب الناتج لشفط المحاقن وتوليد القطيرات في حوالي 20 دقيقة.
ملاحظة: ضع مسبار قاطع الخلايا بالموجات فوق الصوتية في واجهة الزيت والماء. يقترح عدم السماح للمسبار بالموجات فوق الصوتية بالاتصال بالحاوية.
- أداء توليد قطرات.
- قم بتحميل المستحلب المحضر (الخطوة 2.3.1) بسرعة في حقنة 5 مل من منصة الموائع الدقيقة بعد العلاج بالموجات فوق الصوتية.
- أدخل مستحلب W/O غير المستقر (الذي هو في سياق فصل الطور) في جهاز الموائع الدقيقة كطور متقطع. في الوقت نفسه ، استخدم المحلول المائي ل PVA كمرحلة مستمرة.
- جمع الميكروسفير الذي يحتوي على المستحلب في الجزء السفلي من كوب التجميع (PVA ، 1 ٪ ، ث / v) بعد حقن أجزاء مناسبة من المستحلب في جهاز الموائع الدقيقة.
- ضع العينة عند 4 درجات مئوية طوال الليل لمزيد من الاستقرار.
- شطف وتجميد الميكروسفير المحضر (PLGA-HOPMs) باتباع الخطوات أدناه.
ملاحظة: تحتوي PLGA-HOPMs التي تم إنشاؤها على مسام عشوائية في الداخل والسطح.- قم بتخزين الميكروسفير عند 4 درجات مئوية قبل التطبيع إلى RT وحرك بواسطة قضيب زجاجي (1 ساعة ، 60 دورة في الدقيقة) للقضاء على DCM المتبقي.
- قم بترشيح مرحلة التجميع في الكأس سعة 500 مل بعناية ، واغسل الميكروسفير الذي تم جمعه ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات لغسل PVA المتبقي على سطح PMs.
- ضع الميكروسفير PLGA في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإذابة الجيلاتين الملفوف في العمود الفقري PLGA.
- اشطف PLGA-HOPMs الناتج مرتين بالماء منزوع الأيونات لإزالة الجيلاتين المتبقي وقم بتبريده مسبقا لتجميده عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- قم بتخزين PLGA-HOPMs الجافة عند -20 درجة مئوية لمزيد من التجارب.
- قم بإعداد المستحلب باتباع الخطوات أدناه.
3. تصوير المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)
- قم بإيداع PLGA-HOPMs في مرحلة العينة من SEM (انظر جدول المواد) في RT ووضع مرحلة العينة في خلية الرذاذ الخاصة ب magnetron sputter. قم بتشغيل المحول والمغنطرون واحدا تلو الآخر. أدخل العينة إلى SEM بعد أن تكون مغلفة بالذهب لمدة 1 دقيقة.
- احصل على صور SEM عن طريق ضبط جهد التسارع عند 5 كيلو فولت.
- بالإضافة إلى ذلك ، قم بقياس حجم الجسيمات من PLGA-HOPMs باستخدام 100 PMs في المجال المتغير لتصوير SEM. قياس النتيجة التمثيلية لقياس توزيع حجم المسام.
- افتح الرسومات باستخدام Image J واستخدم "الخط المستقيم" لمطابقة شريط المقياس الخاص بصورة SEM ، مما يجعل البرنامج يحدد البكسل إلى الطول.
- انقر فوق تحليل > المقياس المحدد ، واضبط "المسافة المعروفة" على شريط المقياس لصورة SEM ، وانقر فوق > OK الكلي.
- انقر فوق تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار ... لقياس حجم المسام أو الجسيمات ل PLGA PMs وانقر فوق إضافته. قياس عدد العينات بناء على المتطلبات.
- انقر فوق قياس للحصول على البيانات الكمية للرسومات لمزيد من الحساب.
4. زراعة الخلايا والتصوير الفلوري
ملاحظة: تم استخدام الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفئران (BMSCs) لهذا العمل. تم الحصول على الخلايا من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
- استزرع الخلايا في وسط النسر المعدل من دولبيكو المكمل ب L-glutamine (DMEM / F-12) ، و 10٪ (v / v) مصل البقر الجنيني ، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- مرور BMSCs الفئران بنسبة 1: 2 بعد الوصول إلى 90 ٪ من الالتقاء.
- قم بإجراء التصاق الخلايا باتباع الخطوات أدناه.
- احتضان PLGA-HOPMs مع الكحول الإيثيلي (5 مل ، 70 ٪ ، v / v) وأجهزة الطرد المركزي في 500 × g لمدة 10 دقائق في RT للتعقيم.
- اغسل PLGA-HOPMs المعقم مرتين بمحلول عازل من الفوسفات.
- احتضان HOPMs (خمسة في العدد) مع تعليق الخلية (5 مل ، 1 × 105 خلايا / مل) في أنبوب طرد مركزي معقم (50 مل) تحت ثقافة ديناميكية لالتصاق BMSCs ب PLGA-HOPMs.
- قم بإجراء الثقافة الديناميكية في شاكر معقم ترموستاتي (37 درجة مئوية، 90 دورة في الدقيقة) عن طريق وضع أنبوب طرد مركزي مغلق بسعة 50 مل في الخلاط (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تهدف الثقافة الديناميكية إلى تعزيز معدل التصاق BMSCs على السقالات ، بدلا من احتضان PMs والخلايا مباشرة على اللوحة البلاستيكية. تضاف الخلايا و PLGA PMs إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل ، وتحضن الأنبوب في شاكر معقم ترموستاتي (37 درجة مئوية ، 90 دورة في الدقيقة) وتغيير الوسائط كل 2 أيام.
- قم بإجراء فحص البقع المزدوجة الحية والميتة.
- اشطف PMs المحملة بالخلايا ثلاث مرات للتخلص من BMSCs دون التعلق ب PLGA-HOPMs.
- ضع PMs المحملة بالخلايا على اللوحة الزجاجية السفلية مقاس 35 مم. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ (انظر جدول المواد) ، بما في ذلك 1 ميكرولتر من الكالسين - AM ويوديد البروبيديوم (PI) ، على التوالي ، إلى عينة PBS المغسولة مسبقا.
- تقييم العينات عن طريق الفحص المجهري بالليزر البؤري (انظر جدول المواد). قم بتشغيل ضوء الإثارة البالغ 488 نانومتر و 552 نانومتر في الكاشف المقابل. لتحليل التراكب z، اضبط z-wide لالتقاط الطبقات المختلفة للعينة بواسطة حركة المحور z للمجهر.
ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام البقع الأخرى بشكل مناسب للتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استنادا إلى العمل السابق الذي حسن المعلمات الرئيسية1 ، تم إذابة PLGA في مذيب DCM القابل للتبخر. تم تحضير مستحلب W / O الأساسي عن طريق التجانس مع الجيلاتين تحت معالجة المسبار بالموجات فوق الصوتية. تم تجميع الهيكل الموائع المخصص للتدفق المشترك بشكل مبسط ، حيث تم استخدام حقنة لإدخال التدفقات باستمرار. وعلاوة على ذلك، نفذت إجراءات شطف كافية للقضاء على PVA والجيلاتين من الميكروسفير PLGA (الشكل 1 ألف، الشكل التكميلي 1 ألف وباء). في وقت لاحق ، لوحظت السمات المورفولوجية ل PLGA-HOPMs بواسطة تصوير SEM. ولوحظ أن PLGA-HOPMs تظهر أحجاما كبيرة (350-500 ميكرومتر) مع مسام تعسفية الحجم (10-100 ميكرومتر) ونوافذ مترابطة، مما يمكن أن يسهل الكفاءة العالية في نقل الأكسجين/النفايات الأيضية (الشكل 1 باء). وكانت هذه النتائج المورفولوجية متفقة مع النتائج المبلغ عنها1.
كدليل على المفهوم ، تم استخدام BMSCs للثقافة مؤقتا داخل PLGA-HOPMs. كان يعتقد أن الهيكل الداخلي ل PMs يمكن أن يسمح للخلايا بالالتصاق وضمان الانتشار أثناء الثقافة الديناميكية8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأساس المنطقي لاختيار BMSCs هو أن هذه الخلايا تتميز بالتمايز متعدد الأقطاب وإصلاح الأنسجة التالفة ، كما أنها تستخدم بشكل شائع لدراسة السلوك البيولوجي لمختلف المواد النشطة بيولوجيا23. تم استخدام BMSCs لبناء الأنسجة الدقيقة في المختبر مع الميكروسفير وتوزيع الخلايا المرئية وحالة البقاء على قيد الحياة من خلال تحليل z من CLSM (الشكل 1C). ولوحظ أن عددا كبيرا من الخلايا التزمت بالسقالات في 1 د، وتم الحفاظ على التألق الأخضر، مما يمثل قدرات التصاق وهجرة واسعة النطاق للخلايا في PLGA-HOPMs. تم تصوير السيتوبلازم بشكل غير مباشر مع تلطيخ الكالسيين-AM لأن مجموعة استر الأسيتوكسي ميثيل (AM) توفر كرها محسنا للماء وتسهل الاختراق من خلال غشاء الخلية الحية. على الرغم من أن الكالسيين-AM ليس له تألق ، إلا أنه يمكن تحلله بواسطة الإستراز الداخلي داخل الخلايا لتوليد جزيء الكالسين القطبي بشحنة سالبة قوية وإصدار تألق أخضر قوي24. لذلك ، يتم تصور السيتوبلازم بشكل غير مباشر مع تلطيخ الكالسيين-AM (الشكل 1C ، الشكل التكميلي 1C).
الشكل 1: تصنيع PLGA-HOPMs وتوافقها الخلوي. (أ) مخطط يوضح تصنيع PLGA-HOPMs. (ب) قطر مسام PMs على أساس التصوير SEM (10-100 ميكرومتر). شريط المقياس = 100 ميكرومتر (C) مباشر (كالسيين-AM، أخضر) وميت (يوديد البروبيديوم، PI، أحمر) تلطيخ BMSCs المستزرعة مع PLGA-HOPMs لمدة 24 ساعة. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: رسوم توضيحية لمنصة الموائع الدقيقة الحقيقية والمستحلب والتصوير بين الطبقات ل PLGA-HOPMs المحملة بالخلايا. (أ) مخطط منصة الموائع الدقيقة القطيرات الحقيقية. (ب) سلائف W/O مستحلبة عن طريق العلاج بالموجات فوق الصوتية. (ج) الطبقة البينية للتلطيخ الحي والميت ل BMSCs المستزرعة بالاشتراك مع PLGA-HOPMs لمدة 24 ساعة. شريط المقياس = 250 ميكرومتر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توضح هذه المقالة استراتيجية فعالة لتصنيع البنى المستندة إلى PLGA، وهي PLGA-HOPMs. تجدر الإشارة إلى أنه يجب اتخاذ العديد من الخطوات الحاسمة بعناية ، بما في ذلك تجنب تطاير المذيبات من PLGA والتعديل اللطيف للطاقة فوق الصوتية إلى الموضع المستهدف أثناء إعداد المستحلب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل المخرج السائل لمحقنة 20 مل إلى حد ما لحل الفصل المرحلي للسلائف المستحلبة. ومع ذلك ، فإن القيد هو أنه نظرا لأن حالة البوروجين تتأثر بدرجة الحرارة البيئية ، فقد يكون استقرار المستحلب غير مرغوب فيه. معا ، يمكن للتجميع المريح لمنصة الموائع الدقيقة القطيرات أن يسهل بشكل كبير تصنيع الهلاميات الدقيقة المحملة بالخلايا لهندسة الأنسجة وتطبيقات فحص الأدوية. يتم تطبيق PLGA في كثير من الأحيان كوسيلة توصيل في تصنيع الميكروسفير لأنها سلعة توصيل الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء (FDA)25. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر البوليستر الأليفاتي سمات تحلل غير ضارة عن طريق التحلل المائي إما في المختبر أو في الجسم الحي ، والذي يعتمد على نسبة حمض اللاكتيد وحمض الجليكوليك أثناء إجراءات التوليف26.
لتصنيع PLGA-HOPMs ، تم تجانس المراحل المائية والعضوية لتشكيل مستحلب W / O باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية. بعد ذلك ، تم إدخال مستحلب W / O في جهاز الموائع الدقيقة للقطرات وتطور إلى قطرات ماء في الزيت في الماء (W / O / W) عند طرف الإبرة (الشكل 1A ، الشكل التكميلي 1A ، B). يمكن تصلب قطرات W / O / W التي تم الحصول عليها عن طريق استخراج وتبخير DCM في مرحلة التجميع. يمكن أن تسمح مرحلة التجميع المبردة مسبقا في حمام جليدي للجيلاتين بالبقاء في حالة الهلام اللينة ، مع الاحتفاظ مباشرة بالمستحلب الموزع جيدا أثناء تبخر المذيبات ، مما يؤدي إلى PLGA-HOPMs بعد مزيد من التجفيد (الشكل 1B).
بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي طريقة الاستحلاب على مذيبات عضوية متطايرة ، والتي يمكن إزالتها عن طريق التطاير. أيضا ، يمكن إزالة بقايا DCM في PLGA-HOPMs بالكامل تقريبا ، محسوبة من قياس كروماتوغرافيا الغاز2. وعلاوة على ذلك، فإن تكنولوجيا الموائع الدقيقة لن تؤثر على التوافق الخلوي/البيولوجي ل PLGA. في الواقع ، أظهرت PLGA-HOPMs المستزرعة مع BMSCs الفئران أن عدد الخلايا الحية كان واسعا ، مع عدد قليل فقط من الخلايا الميتة ومورفولوجيا التمدد. علاوة على ذلك ، يمكن تصوير السيتوبلازم بواسطة صبغة الفلورسنت الحية ، مما يشير إلى التمدد على HOPMs.
معا ، PLGA-HOPMs مع سمات مورفولوجية ممتازة يمكن أن تلبي المتطلبات المتعلقة بالالتصاق الخلوي وقدرات الانتشار في جميع أنحاء HOPMs لتجديد الأنسجة والتطبيقات الطبية الحيوية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تعترف SCL و YW و RKK و AZC بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC و 32071323 و 81971734 و U1605225) وبرنامج فريق البحث المبتكر في العلوم والتكنولوجيا في جامعة مقاطعة فوجيان. لم تكن YSZ مدعومة بأي من هذه البرامج ولم تتلق مدفوعات من أي نوع ؛ بدلا من ذلك ، يتم الاعتراف بالدعم المقدم من معهد بريغهام للأبحاث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
