Summary
본 프로토콜은 단일 에멀젼 제형 기반 facile 미세 유체 기술을 통해 폴리 (락틱-코-글리콜 산) 기반 고도로 개방 된 다공성 미세 구체 (HOPM)의 제조를 설명합니다. 이 마이크로스피어는 조직 공학 및 약물 스크리닝에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.
Abstract
벌크 스캐폴드 및 세포 단독 직접 주입과 비교할 때, 주사 가능한 모듈식 장치는 세포 포장의 편의성, 향상된 세포 보유 및 최소 침습성으로 인해 오작동하는 조직을 복구하는 데 엄청난 관심을 받았습니다. 또한, 이러한 마이크로 스케일 캐리어의 다공성 형태는 매체 교환을 향상시키고 영양소 및 산소 공급 수준을 향상시킬 수 있습니다. 본 연구는 세포 전달 응용 분야를 위한 손쉬운 미세유체 기술에 의한 폴리(락틱-코-글리콜산) 기반 고도로 개방된 다공성 미세구(PLGA-HOPM)의 편리한 제조를 보여줍니다. 그 결과 단분산 PLGA-HOPM은 ~400μm의 입자 크기와 상호 연결 창이 있는 ~50μm의 열린 기공을 가졌습니다. 간단히 말해서, 7.5%(w/v) 젤라틴 수용액으로 싸인 유화 오일 방울(디클로로메탄 중 PLGA 용액, DCM)을 맞춤형 미세 유체 설정에서 동축 노즐을 통해 1%(w/v) 연속 흐르는 폴리(비닐 알코올)(PVA) 수용액에 도입했습니다. 그 후, 마이크로스피어는 용매 추출 및 동결건조 절차를 거쳐 HOPM을 생성했습니다. 특히, 다양한 제형(PLGA 및 포로겐의 농도) 및 처리 매개변수(유화력, 바늘 게이지 및 분산상의 유속)는 결과 PLGA HOPM의 품질과 특성에 중요한 역할을 합니다. 또한, 이러한 아키텍처는 확장 된 약물 발견 및 조직 재생 응용 분야를 위해 성장 인자와 같은 다양한 다른 생화학 적 단서를 잠재적으로 캡슐화 할 수 있습니다.
Introduction
세포-함유 마이크로스피어는 향상된 제자리 세포 보유 능력, 세포의 효율적인 전달 및 생체내1에서의 세포 증식의 후속 능력과 같은 유리한 이점을 제공한다. 현재까지 조직 재생 또는 약물 스크리닝 응용 프로그램을 위한 세포에 도움이 되는 환경을 지원하기 위해 성공적인 스캐폴딩 구조를 개발하기 위한 수많은 연구가 진행되었습니다2. 그러나 저산소증 환경은 영양소/산소 공급 부족 및 대사성 폐기물 축적으로 인해 내부에서 불가피한 경우가많습니다3. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 다양한 생체재료(4,5,6)를 이용하여 고다공성 마이크로스피어(PM)가 개발되었다. 추가적으로, 동적 배양에서, 스캐폴드는 과도한 전단 응력7을 겪고, 배양 배지의 불안정한 상태는 PM의 충실도를 깨뜨릴 수 있다. 대안적으로, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)는 동적 배양1을 위해 우수한 기계적 강도를 갖는 PM을 처리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 우리는 체적 근육 손실을 치유하기 위해 마우스 근원 세포 (C2C12)가 함유 된 PLGA 고도로 개방 PM (HOPM)과 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)가 함유 된 폴리 (에틸렌 글리콜) 중공 마이크로 로드의 동시 주입을 입증하여 현장 골격근 재생의 현저한 개선을 달성했습니다8.
특히, PM은 넓은 표면적 및 높은 다공성을 특징으로 하며, 이는 최소 침습세포 전달을 향한 세포 부착 및 성장에 특히 관심이 있습니다9. 이러한 측면의 관점에서, 다양한 생체적합성 재료가 PM(10, 11)을 제조하기 위해 사용되었다. 세포와 공동 배양된 이들 설계가능한 PM은 우수한 접착력, 상당한 기계적 강도 및 고도로 상호 연결된 윈도우를 제공하여 손상된 조직을 복구하기 위한 세포 증식을 개선할 수 있다12. 이와 관련하여, 다공성 구체(13,14)를 제작하기 위한 다양한 기술들이 또한 개발되었다. 한편으로, PM은 불충분한 상호연결성15,16,17로 인해 억제된NH4HCO3와 같은 가스 형성제를 사용하여 제조되었다. 반면에, PM은 유화 후 직접 전단되어 다중 분산 PM18을 유도했다. 결국, 에멀젼-템플릿화 접근법에 기초한 액적 마이크로유체 기술은 종종 균일한 크기의 입자(19)를 생성하기 때문에 PM을 구축하기 위한 효율적인 방법일 것이다. 특히, 마이크로스피어의 형태학적 특성은 종종 생성된 에멀젼 액적(즉, 유중수, W/O 또는 수중유, O/W)의 품질에 의존하며, 이는 생체 재료(20)의 속성에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 미리 설계된 미세유체 플랫폼을 적용하여 극세사 또는 미세구를 생성할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 한 예에서, Yu 등은 모세관-기반 미세유체 플랫폼에 기초한 세포-함유 미세섬유 구조의 생산을 입증하였으며, 이는 천연 조직을 모방하기 위한 세포 네트워크를 조립하는데 사용될 수 있다(21). 다른 예에서, Ye 등은 마이크로유체 기술을 통한 실리카 콜로이드 결정 비드의 주형 복제에 의해 광결정 마이크로캡슐을 제조했으며, 이는 복잡한 라벨링 및 특정 장치(22)를 필요로 하는 현재 기술의 많은 한계를 극복할 수 있다.
실제로 이 기술을 활용하는 이유는 본질적으로 용이하고 정교한 장비가 필요하지 않으며 세포 전달 및 재생 의학 응용 분야를 위한 균일한 크기의 PM을 합성하는 편리함과 같은 다양한 이점 때문입니다. 이러한 맥락에서, 에멀젼-템플릿의 사전 설계된 구성 요소를 사용하여, 높은 다공성 및 상호 연결성을 갖는 PM은 폴리(염화비닐)(PVC) 튜브, 유리 모세관 및 바늘로부터 조립된 미세유체 장치로부터 편리하게 얻을 수 있다. W/O 에멀젼-전구체는 젤라틴 수용액과 PLGA의 유기 용액을 균질화함으로써 제조된다. 에멀젼의 적용가능한 부분을 미세유체 플랫폼에 선택적으로 주입함으로써, 균일한 입자 크기 및 표면 전체에 걸쳐 내부로 상호 연결된 기공을 갖는 PM이 제조된다. 본 프로토콜은 마이크로유체 플랫폼에서 에멀젼 템플릿화에 의해 PLGA-HOPM을 제조하는 것을 목표로 한다. 이 프로토콜은 PLGA-HOPM의 재현 가능한 생산을 허용하며 잠재적으로 조직 공학 및 약물 스크리닝의 관련 분야에 적용될 수 있다고 믿어집니다.
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Protocol
1. 용액 준비
- PVA 용액을 80°C 수조에서 가열하여 미리 PVA 원액을 준비하고, 이어서 4°C의 냉장고에 둔다. 실험적 사용을 위해 실온(RT)으로 냉각합니다.
- 수성 젤라틴 용액 (1 mL, 7.5 %, w / v)을 PLGA의 유기상 (2 mL, 2 %, 디클로로 메탄, DCM 중 w / v)에 첨가하여 에멀젼 전구체를 제조한다 ( 재료 표 참조).
참고: 일반적으로 미세유체 기술은 미세구를 형성하기 위해 여러 단계를 포함합니다. 연속 또는 수집 상은 수성 폴리 (비닐 알코올) (PVA, 600 mL, 1 %, w / v)를 포함한다.
2. PLGA-HOPM의 액적 미세 유체 장치 조립 및 제조
참고: 이 조립품에 필요한 소모품은 재료 표에 나열되어 있습니다.
- 액적 발생기 어셈블리를 사용자 지정합니다.
- 유리 모세관(OD, 1mm), PVC 튜브(ID, 1mm) 및 26G 디스펜싱 바늘을 사용하여 공류 미세유체 발생기를 구성합니다.
- 유리 모세관을 PVC 튜브의 끝에 연결 한 다음 위 구조의 연결부에서 바늘로 뚫습니다.
- 액적이 생성되는 동안 PVC 튜브의 다른 쪽 끝을 연속 단계로 놓습니다. UV 접착제를 사용하여 경화 후 조인트의 틈새를 밀봉하십시오.
알림: 바늘은 PVC 튜브에서 편리하게 피어싱하기 위해 약 45° 구부러져 있어야 하며 바늘 지점은 동축 구조를 형성하기 위해 모세관으로 뻗어 있어야 합니다.
- 액적 미세유체 플랫폼을 준비한다.
- 그림 1과 같이 두 개의 시린지 펌프를 사용하십시오. 50mL 주사기를 사용하여 연속상을 로드하고 에멀젼 형성을 위해 5mL 주사기를 사용합니다.
- 연속 및 분산상의 유속을 각각 2mL/분 및 0.08mL/분으로 설정합니다.
- 500mL 비커를 얼음 욕조에 넣고 미리 냉각된 PVA 수용액으로 채웁니다(단계 1.1).
알림: 유리 모세관의 끝은 수집 단계에 잠겨 있어야합니다. 플랫폼에서 에멀젼 액적 형성 후에 유리 막대로 수집 단계의 상청액을 교반(1 h, 60 rpm)하는 것이 제안된다. 에멀젼 방울은 바늘 끝에서 생성됩니다. 일반적으로 바늘의 게이지는 PM의 크기에 영향을 미치며, 더 작은 게이지는 PM의 더 작은 크기에 해당합니다. 또한, 기공 직경은 주로 다공질 농도와 상관 관계가 있으며, 적절한 젤라틴 농도1로 증가 할 수 있습니다.
- 유화 및 액적 생성을 수행하십시오.
- 아래 단계에 따라 에멀젼을 준비하십시오.
- 수성 젤라틴 용액을 PLGA의 DCM 용액으로 즉시 디캔팅하고(단계 1.2) 초음파 장치를 사용하여 유화함으로써 에멀젼을 제조한다( 재료 표 참조).
- 초음파 전력을 400W로 조정하고 프로브의 위치를 수동으로 지속적으로 변경하는 것과 함께 총 처리 시간을 90초(간격 2초, 초음파 처리 1초)로 설정합니다.
- 약 20분 내에 주사기 흡입 및 액적 생성을 위해 생성된 에멀젼을 안정화합니다.
알림: 초음파 셀 차단기의 프로브를 오일-물 인터페이스에 놓습니다. 초음파 프로브가 용기에 닿지 않도록하는 것이 좋습니다.
- 액적 생성을 수행합니다.
- 초음파 처리 후 제조된 에멀젼(단계 2.3.1)을 미세유체 플랫폼의 5mL 주사기에 빠르게 로딩한다.
- 불안정한 W/O 에멀젼(상 분리 과정에 있음)을 불연속상으로 미세 유체 장치에 도입합니다. 동시에 PVA 수용액을 연속상으로 사용하십시오.
- 에멀젼의 적절한 부분을 미세 유체 장치에 주입 한 후 수집 비커 바닥에 에멀젼이 들어있는 마이크로 스피어 (PVA, 1 %, w / v)를 수집합니다.
- 추가 안정화를 위해 샘플을 밤새 4°C에 두십시오.
- 아래 단계에 따라 준비된 마이크로스피어(PLGA-HOPM)를 헹구고 동결건조합니다.
참고: 생성된 PLGA-HOPM에는 내부와 표면에 임의의 기공이 있습니다.- 마이크로스피어를 RT로 정규화하기 전에 4°C에서 보관하고 유리 막대(1h, 60rpm)로 교반하여 잔류 DCM을 제거한다.
- 500mL 비커에서 수집상을 조심스럽게 여과하고 수집된 마이크로스피어를 탈이온수로 세 번 세척하여 PMs 표면의 잔류 PVA를 씻어냅니다.
- PLGA 마이크로스피어를 37°C 수조에 넣고 30분 동안 PLGA 골격에 싸인 젤라틴을 용해시킨다.
- 생성된 PLGA-HOPM을 탈이온수로 2회 헹구어 잔류 젤라틴을 제거하고 -80°C에서 24시간 동안 동결건조를 위해 예비냉각합니다.
- 추가 실험을 위해 건조 PLGA-HOPM을 -20°C에 보관합니다.
- 아래 단계에 따라 에멀젼을 준비하십시오.
3. 주사전자현미경(SEM) 이미징
- PLGA-HOPM을 RT에서 SEM의 샘플 스테이지( 재료 표 참조)에 증착하고 샘플 스테이지를 마그네트론 스퍼터의 스퍼터 셀에 넣습니다. 변압기와 마그네트론을 하나씩 켭니다. 1분 동안 금으로 스퍼터 코팅된 후 샘플을 SEM에 도입합니다.
- 가속 전압을 5kV로 설정하여 SEM 이미지를 얻습니다.
- 또한 SEM 이미징의 가변 필드에서 100PM을 사용하여 PLGA-HOPM의 입자 크기를 정량화합니다. 대표적인 결과를 측정하여 공극 크기 분포를 정량화하였다.
- 이미지 J로 그래픽을 열고 "직선"을 사용하여 SEM 이미지의 스케일 바를 일치 시키면 소프트웨어가 픽셀 대 길이를 식별합니다.
- 분석을 클릭하고 축척> 설정하고 "알려진 거리"를 SEM 이미지의 축척 막대로 설정한 다음 전역 > 확인을 클릭합니다.
- ROI 관리자> 분석 > 도구를 클릭하여 PLGA PM의 기공 또는 입자 크기를 측정하고 추가를 클릭합니다. 요구 사항에 따라 샘플 수를 측정합니다.
- 측정을 클릭하여 추가 계산을 위해 그래픽의 정량적 데이터를 가져옵니다.
4. 세포 배양 및 형광 이미징
참고 : 쥐 골수 중간 엽 줄기 세포 (BMSC)가 본 작업에 사용되었습니다. 세포는 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 재료 표 참조).
- L- 글루타민 (DMEM / F-12), 10 % (v / v) 태아 소 혈청 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 Dulbecco의 변형 된 Eagle 배지에서 세포를 배양합니다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이션한다.
- 합류의 1%에 도달한 후 2:90 비율로 쥐 BMSC를 통과시킵니다.
- 아래 단계에 따라 세포 접착을 수행하십시오.
- PLGA-HOPM을 에틸 알코올(5mL, 70%, v/v)과 함께 배양하고 RT에서 10분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 멸균합니다.
- 멸균된 PLGA-HOPM을 인산염 완충용액으로 2회 세척한다.
- PLGA-HOPM에 대한 BMSCs 부착을 위한 동적 배양 하에 멸균 원심분리 튜브(50mL)에서 세포 현탁액(5mL, 1 x 10 5 세포/mL)과 함께 HOPM(5 개)을 배양합니다.
- 밀봉된 50mL 원심분리 튜브를 쉐이커에 배치하여 항온식 무균 쉐이커(37°C, 90rpm)에서 동적 배양을 수행합니다( 재료 표 참조).
참고: 동적 배양은 PM과 세포를 플라스틱 플레이트에 직접 배양하는 대신 스캐폴드에서 BMSC의 부착률을 향상시키려는 의도입니다. 세포 및 PLGA PM을 50mL 멸균 원심분리 튜브에 첨가하고, 튜브를 항온식 무균 쉐이커(37°C, 90rpm)에서 배양하고, 2일마다 배지를 교체한다.
- 살아있는 것과 죽은 이중 염색 분석을 수행합니다.
- PLGA-HOPM에 부착하지 않고 BMSC를 용리하기 위해 세포가 함유된 PM을 세 번 헹굽니다.
- 셀이 포함된 PM을 35mm 유리 바닥 플레이트에 놓습니다. 각각 1μL의 칼세인-AM 및 요오드화프로피듐(PI)을 포함한 1mL의 염색 완충액( 재료 표 참조)을 PBS 사전 세척된 샘플에 추가합니다.
- 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 샘플을 평가합니다( 재료 표 참조). 해당 검출기에서 488nm 및 552nm의 여기광을 켭니다. z-오버레이 분석의 경우 현미경의 z축 이동으로 샘플의 여러 층을 캡처하도록 z 너비를 설정합니다.
알림: 다른 얼룩은 분석에 적절하게 사용될 수 있습니다.
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Representative Results
주요 파라미터1을 최적화한 이전 작업에 기초하여, PLGA를 증발가능한 DCM 용매에 용해시켰다. 1 차 W / O 에멀젼은 초음파 프로브 처리하에 젤라틴으로 균질화하여 제조되었습니다. 맞춤형 공동 흐름 유체 구조는 단순하게 조립되었으며, 주사기를 사용하여 흐름을 지속적으로 도입했습니다. 또한, PLGA 마이크로스피어의 PVA 및 젤라틴을 제거하기 위해 충분한 헹굼 절차가 수행되었다(도 1A, 보충 도 1A,B). 이어서, PLGA-HOPM의 형태학적 특성을 SEM 영상에 의해 관찰하였다. PLGA-HOPM은 임의의 크기의 기공 (10-100 μm)과 상호 연결된 창이있는 큰 크기 (350-500 μm)를 나타내어 산소 / 대사 폐기물 수송에서 높은 효율을 촉진 할 수있는 것으로 관찰되었습니다 (그림 1B). 이러한 형태학적 결과는 보고된 결과와 일치하였다1.
개념 증명으로 BMSC는 PLGA-HOPM 내에서 잠정적으로 배양하는 데 사용되었습니다. PM의 내부 구조는 세포가 동적 배양 동안 증식을 보장하고 증식을 보장 할 수 있다고 믿어졌습니다8. 또한, BMSC를 선택하는 이유는 이들 세포가 다극성 분화를 특징으로 하고 손상된 조직을 복구하고, 또한 다양한 생리활성 물질(23)의 생물학적 거동을 연구하기 위해 일반적으로 사용된다는 것이다. BMSC는 마이크로스피어로 시험관내 마이크로조직을 구성하고 CLSM의 z-분석에 의해 세포 분포 및 생존 상태를 시각화하는 데 사용되었습니다(그림 1C). 많은 수의 세포가 1d에서 스캐폴드에 부착되고 녹색 형광이 유지되어 PLGA-HOPM에서 세포의 광범위한 접착 및 이동 능력을 나타내는 것으로 관찰되었습니다. 세포질은 calcein-AM 염색으로 간접적으로 이미지화되었는데, 이는 아세톡시메틸 에스테르(AM) 그룹이 개선된 소수성을 제공하고 살아있는 세포막을 통한 침투를 촉진하기 때문입니다. calcein-AM은 형광이 없지만 세포 내에서 내인성 에스테라아제에 의해 가수 분해되어 강한 음전하를 가진 극성 분자 칼 세인을 생성하고 강한 녹색 형광을 방출 할 수 있습니다24. 따라서 세포질은 calcein-AM 염색으로 간접적으로 시각화됩니다 (그림 1C, 보충 그림 1C).
그림 1: PLGA-HOPM의 제조 및 세포적합성. (A) PLGA-HOPM의 제조를 개략적으로 보여줍니다. (B) SEM 이미징 (10-100 μm)에 기초한 PM의 기공 직경. 스케일 바 = 100 μm. (C) 24 시간 동안 PLGA-HOPM과 공동 배양 된 BMSC의 살아있는 (칼 세인 -AM, 녹색) 및 죽은 (프로피듐 요오드화물, PI, 빨간색) 염색. 스케일 바 = 250 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 실제 미세유체 플랫폼, 에멀젼 및 세포가 함유된 PLGA-HOPM의 층간 이미징의 그림. (A) 실제 액적 미세 유체 플랫폼의 계획. (B) 초음파 처리에 의해 유화된 W/O 전구체. (C) 24 시간 동안 PLGA-HOPM과 공동 배양 된 BMSC의 살아있는 염색과 죽은 염색의 중간층. 스케일 바 = 250 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에서는 PLGA 기반 아키텍처, 즉 PLGA-HOPM을 제작하는 효율적인 전략에 대해 설명합니다. PLGA의 용매 휘발을 피하고 에멀젼을 준비하는 동안 초음파 전력을 목표 위치로 부드럽게 조정하는 등 몇 가지 중요한 단계를 신중하게 수행해야합니다. 또한, 20 mL 주사기의 액체 배출구는 유화된 전구체의 상분리를 해결하기 위해 어느 정도 조절될 수 있다. 그러나, 제한은 포로겐의 상태가 환경 온도에 의해 영향을 받기 때문에, 에멀젼의 안정성이 바람직하지 않을 수 있다는 것이다. 함께, 액적 미세유체 플랫폼의 편리한 조립은 조직 공학 및 약물 스크리닝 애플리케이션을 위한 세포 함유 마이크로겔의 제조를 실질적으로 용이하게 할 수 있습니다. PLGA는 식품의약국(FDA) 승인 약물 전달 상품(25)이기 때문에 마이크로스피어 제조의 전달 수단으로 자주 적용됩니다. 또한, 지방족 폴리에스터는 시험관내 또는 생체내에서 가수분해를 통해 무해한 분해 특성을 제공하며, 이는 합성 절차26 동안 락티드 산 및 글리콜산의 비율에 의존한다.
PLGA-HOPM을 제조하기 위해 수성 및 유기 상을 균질화하여 초음파 프로브를 사용하여 W/O 에멀젼을 형성했습니다. 그런 다음 W/O 에멀젼을 액적 미세유체 장치에 도입하고 바늘 끝에서 수중유(W/O/W) 액적으로 전개했습니다(그림 1A, 보충 그림 1A, B). 수득된 W/O/W 액적은 수집 단계에서 DCM을 추출하고 증발시킴으로써 응고될 수 있었다. 얼음 수조에서 사전 냉각된 수집 단계는 젤라틴이 소프트 겔 상태로 유지되도록 하여 용매 증발 중에 잘 분산된 에멀젼을 직접 유지하여 추가 동결건조 후 PLGA-HOPM을 생성할 수 있습니다(그림 1B).
또한, 에멀젼-프레이팅 방법은 휘발에 의해 제거될 수 있는 휘발성 유기 용매를 함유한다. 또한, PLGA-HOPM에서 DCM의 잔류물은 가스 크로마토그래피 측정2로부터 계산된 거의 완전히 제거될 수 있었다. 또한, 미세 유체 기술은 PLGA의 세포 / 생체 적합성에 영향을 미치지 않습니다. 사실, 쥐 BMSC로 배양 된 PLGA-HOPM은 살아있는 세포의 수가 광범위하고 소수의 죽은 세포와 늘어나는 형태 만 있음을 보여주었습니다. 또한, 세포질은 살아있는 형광 염료에 의해 이미지화 될 수 있으며, 이는 HOPMs의 스트레칭을 나타냅니다.
함께, 우수한 형태학적 특성을 가진 PLGA-HOPM은 조직 재생 및 다양한 생물의학 응용 분야를 위한 HOPM 전반에 걸쳐 세포 접착 및 확산 능력에 관한 요구 사항을 충족할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
SCL, YW, RKK 및 AZC는 중국 국립 자연 과학 재단(NSFC, 32071323, 81971734 및 U1605225)과 푸젠성 대학의 과학 기술 혁신 연구 팀 프로그램의 재정 지원을 인정합니다. YSZ는 이러한 프로그램의 지원을 받지 않았으며 어떤 유형의 지불도 받지 못했습니다. 대신 브리검 연구소의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
